WO1995006646A1 - Substances br-050 et br-051 inhibant la resorption osseuse - Google Patents

Substances br-050 et br-051 inhibant la resorption osseuse Download PDF

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WO1995006646A1
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methanol
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culture
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Inventor
Terumi Kagamizono
Akiko Maejima
Akira Kawashima
Tomoko Akiyama
Tsutomu Ando
Kazuhide Isogai
Shigeo Morimoto
Original Assignee
Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/34—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D309/36—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with oxygen atoms directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/38—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having three or more double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with oxygen atoms directly attached to ring carbon atoms one oxygen atom in position 2 or 4, e.g. pyrones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to a compound having a bone resorption inhibitory action c
  • calcitonin is a peptide having a molecular weight of about 3,400 in which 32 amino acids are bound, its absorption from the gastrointestinal tract was low, and it had to be used as an injection.
  • an orally administrable drug, rather than an injection is ideal for patients, and its appearance has been awaited. Have been. Disclosure of the invention
  • the present inventors have isolated a large number of strains from nature and studied various cultures of the strains.As a result, they have found that a compound produced by a certain strain has a strong bone resorption inhibiting action, and It was completed.
  • Is a compound represented by H ⁇ _H FC (hereinafter, BR- 050, A when A is c u is referred to when BR- 051 of c o).
  • strains that produce BR-050 and BR-051 are newly isolated strains from plants collected by the present inventors in Awano-cho, Kamitsuga-gun, Tochigi Prefecture, and have the name of microorganism, fPenicil lifer superimpositus TF-0402J and accession number. Deposited as "FE RM BP-4755" with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. The bacteriological properties of this strain are shown below.
  • This strain grows well on potato-glucose, oatmeal, malt extract, Yp Ss ⁇ Sablo agar medium, etc., and forms spores with potato-glucose, oatmeal, YpSs, cornmeal, LCA (Miura) Good or moderate on agar medium. Observation by an optical microscope of colonies formed by this strain on LC A (Miura) agar medium at 26 ° C for 17 days shows that the hyphae are highly branched with septa, and the conidiophores are aerial mycelia. It is unbranched and rarely branched in rare cases, and a single or 3 to 6 conidium-forming cells (fiaraids) grow from its tip.
  • Conidiophores are colorless, surface is smooth, width is 3.5-5.5 m at base, length is 55-125 im for unbranched, 100-225 m2 for branched and rarely more Obviously Obviously, Fiaraid is colorless, smooth surface, tapered cylindrical shape, length 20 ⁇ 47 / zm, width 2.5 ⁇ 4.5 111 at base, 1.0 ⁇ 1.5 at tip
  • Conidia are colorless, one septum, rarely lacks a septum, surface is smooth, spindle-shaped, 8-24 / m in length, 1.5-4.2 m, diagonally displaced slightly from the tip of the phialid It sticks and chains, but rarely becomes a sticky mass.
  • the culture was extended to 3 weeks, but no form of teleomorph was observed.
  • Table 1 shows the results of macroscopic observations when the cells were cultured on various media for 26 and 14 days.
  • the colors used are based on the system color names in the Japan Standards Association and JIS Color Name Book (1985).
  • This strain grows in Sabouraud's liquid medium at pH 6.0 in the range of 9-31 ° C, and the optimal temperature is 25-29 ° C.
  • This strain grows in ⁇ 2 ⁇ 10 at 26 ° C in Yp S s liquid medium,
  • the optimal pH is 6-7.
  • this strain Based on the above morphological characteristics and culture characteristics, this strain
  • the strain was closest to superimpositus and was found to exhibit properties.
  • the strain was named fPenicil lifer suTDerimpositus TF-0402.
  • BR-050 and BR-501 are similar to the production of general fermentation products, and the Penicilliier super impositus TF-0402 strain is cultured under aerobic conditions in a medium containing various nutrients. It is done by doing.
  • a liquid medium is mainly used as a medium, and glucose, sucrose, molasses, starch, etc. are used alone or in combination as a carbon source.
  • a nitrogen source meat extract, oatmeal, yeast extract, soybean powder, polypeptone, etc. are used alone or in combination.
  • organic substances and inorganic salts that promote the growth of this strain and promote the production of BR-0500 and BR-051 can be added as necessary.
  • Adekanol, silicon, and the like can be used as the defoaming agent.
  • the cultivation method is aerobic cultivation such as shaking culture and aeration-agitation culture (suitable for pH 2 to 10, 9 to 31 ° C for 3 to 6 days, preferably pH 6 to 7, 25 Incubate at ⁇ 29 ° C for 5 days.
  • aerobic cultivation such as shaking culture and aeration-agitation culture (suitable for pH 2 to 10, 9 to 31 ° C for 3 to 6 days, preferably pH 6 to 7, 25 Incubate at ⁇ 29 ° C for 5 days.
  • BR-0500 and BR-051 produced by this culture may be isolated according to a general method for collecting fermentation products. For example, the following method is effective.
  • the culture solution is extracted with an organic solvent such as acetone.
  • the solution is transferred to a non-water-soluble organic solvent such as ethyl acetate, benzene, or chloroform, and concentrated to a syrup.
  • a non-water-soluble organic solvent such as ethyl acetate, benzene, or chloroform
  • the syrup is dissolved again in an organic solvent such as benzene, ethyl acetate, acetone, methanol, chloroform, and the like, and subjected to silica gel column chromatography, gel filtration, column chromatography, and high-performance liquid chromatography to obtain the compound of the present invention.
  • silica gel column chromatography gel filtration, column chromatography, and high-performance liquid chromatography
  • Fig. 1 shows the results measured by the KBr method.
  • Fig. 4 shows the results measured by the KBr method.
  • FIG. 1 shows an infrared absorption spectrum of BR-050 measured by the KBr method.
  • Figure 13 shows the 13 C-NMR spectrum of 050.
  • FIG. 4 shows the infrared absorption spectrum of BR-051 measured by the KBr method.
  • the culture solution of 200L Jar Amen for 1 unit of 120L and 50L Jar Amentor for 3 units of 90L was filtered and separated into supernatant and cells, and the supernatant was adsorbed.
  • resin Diaion HP-20 (trade name; manufactured by Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd.) 10L]
  • wash with 20L of purified water and elute the fraction eluted with a mixed solution of acetone / water (50:50).
  • the active substance was eluted with 20 L of acetone.
  • the cells were extracted twice with 15 L of acetone.
  • the supernatant-derived acetone eluate and the cell-derived acetone extract were combined, concentrated under reduced pressure, and the obtained residue was extracted twice with 15 L ethyl acetate.
  • the ethyl acetate fraction was dehydrated with anhydrous sodium sulfate and concentrated to dryness to obtain 85.8 g of a brown oily substance.
  • the mixture was eluted with the mixed solvent of 5) and concentrated to dryness to obtain 32.8 g of a brown oily substance.
  • the obtained sample was subjected to gel filtration with SEPHADEX LH-20 (trade name, manufactured by Pharmacia) prepared with n-hexane-dichloromethane-methanol (5: 5: 1), and the active fraction was collected and concentrated to dryness 9 g of a solid, brown oil was obtained.
  • the obtained sample was dissolved in 15 ml of chloroform, and adsorbed on a column (0.8 L, solvent: chloroform) filled with silica gel. After washing with 1.6 L of black-mouthed form, the fraction eluted with a mixed solvent of black-mouthed form-methanol (99: 1) was removed. Then, elution was carried out with a mixed solvent of black form-methanol (98: 2), and the mixture was concentrated to dryness to obtain 4 g of a brown oily substance.
  • SEPHADEX LH-20 trade name, manufactured by Pharmacia
  • Carrier silica gel (Sensyu Chemical Co., Ltd.) Solvent composition 1% methanol, 99% black form
  • Carrier ODS-silica gel (Sensyu Chemical Co., Ltd.) Solvent composition 73% acetonitrile, 27% water
  • the compound of the present invention Since the compound of the present invention has an excellent inhibitory action on bone resorption, it is useful as a therapeutic drug for diseases based on abnormal bone metabolism such as osteoporosis and hypercalcemia.
  • the compounds of the invention can be administered orally in dosage forms such as tablets, pills, capsules, granules and the like, which are manufactured according to conventional pharmaceutical techniques.
  • dosage forms such as tablets, pills, capsules, granules and the like, which are manufactured according to conventional pharmaceutical techniques.
  • additives such as ordinary bulking agents and binders.
  • the dosage of the compound of the present invention for a treated patient may vary depending on the age of the patient, the type and condition of the disease, and the like. Normally, 0.5 to 700 mg, preferably 1 to 50 mg per day or several times per day. Ability to administer in divided doses ⁇ Can.
  • Test example (Bone resorption inhibitory action)
  • a 5-day-old heron femur and tibia are removed, cut into small pieces with scissors, and 5% fetal blood
  • the mixture was stirred for 30 seconds in ⁇ -minimum essential medium (one MEM) containing Kiyoshi (FBS).
  • ⁇ -minimum essential medium one MEM
  • FBS Kiyoshi
  • the supernatant of the cell suspension containing the separated osteoclasts was placed in a 96-well plate containing ivory slices sliced to a diameter of 6 mm and a thickness of 150 / zm. We sowed to be we1 1.
  • the number of P and pits stained under a microscope was counted, and the number of pits in the compound-added group was calculated assuming that the number of pits formed in the control group without the compound was 100%. It was determined the bone resorption inhibitory concentration (IC 5. value).
  • the compound of the present invention has an IC 5 .
  • the values were 0.01 ⁇ gZml for BR-050 and 0.05 g / m1 for BR-051.

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Description

明 細 書 骨吸収抑制物質 B R— 0 5 0及び B R— 0 5 技術分野
本発明は、 骨吸収抑制作用を有する化合物に関する c
骨吸収を抑制する薬剤としては、 従来ゥナギ及びサケのカルシトニンが臨床的 に用いられている。 カルシトニンは、 アミノ酸が 3 2個結合した分子量 約 3， 4 0 0のべプチドであるため消化管からの吸収性力《低く、 注射剤として利 用するしかなかった。 し力、し、骨粗鬆症、高カルシウム血症などの骨代謝異常に 基づく慢性疾患の治療剤としては、 注射剤ではなく、経口投与可能な薬剤が患者 にとつて理想的であり、 その出現が待たれている。 発明の開示
本発明者らは、 自然界より多数の菌株を分離し、 その菌株の培養物について種 々検討した結果、 ある種の菌株の生産する化合物が強い骨吸収抑制作用を有する ことを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
式
Figure imgf000003_0001
OH
(式中、 Aは c または c = oである。 ）
H 〇H FC で表わされる化合物である （以下、 Aが c u のとき BR— 050、 Aが c = o のとき BR— 051と称する） 。
BR-050及び BR— 051を^する菌株は、 本発明者らが栃木県上都賀 郡粟野町にて採取した植物から新たに分離した菌株であり、微生物の名称 fPenicil lifer superimpositus TF-0402J および受託番号「F E RM BP- 4755」 として、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 この菌株の菌学的性状を以下に示す。
1 ) 形態
本菌株は、 バレイショ ·ブドウ糖、 ォートミ一ル、 麦芽エキス、 Y p S sヽ サ ブロー寒天培地等で良好に生育し、胞子の形成はバレイショ ·ブドウ糖、 ォート ミール、 Yp S s、 コーンミール、 LCA (三浦） 寒天培地等で良好または中程 度である。本菌株が LC A (三浦） 寒天培地上、 26°C 17日間の培養で形成 したコロニーを光学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を有し高度に分岐しており、 分生子柄は気生菌糸から側生し、 多くは非分岐、 まれに輪生状に分岐しており、 その先端から単一もしくは 3〜6本の分生子形成細胞 （フィアラィド） 力輪生す る。 分生子柄は無色、 表面は平滑、 幅は基部で 3.5〜 5.5 mで、 長さは非分 岐のものでは 55〜125 im、分岐しているものでは 100〜225 ΠΙまた はまれにそれ以上となる。 フィアラィドは無色、 表面は平滑、 先細りの円筒形で、 長さは 20〜47/zm、幅は基部で2.5〜4.5 111、先端部で 1.0〜1.5
である。 分生子は無色、 1隔壁、 まれに隔壁を欠き、 表面は平滑、 紡錘形で 長さは 8〜24/ m、幅は 1 ·5~4·2 m、 フィアラィドの先端から各々多少 ずれて斜めに粘着して連鎖するが、 まれに粘塊となる。
なお、培養を 3週間に延長したがテレオモルフの形態は認められなかった。
2) 培地上での生育状態
各種培地上で、 26 、 14日間培養した場合の肉眼的観察結果を次の表 1に 示した。 なお色の表示は日本規格協会、 J I S色名帳 （1985年） の系統色名 を引用した。 先 1表
Figure imgf000005_0001
3)生理的性質 .
①生育温度範囲及び最適温度
本菌株は pH 6.0のサブロー液体培地において、 9〜31°Cの範囲で生育し, 最適温度は 25〜 29 °Cである。
②生育 p H範囲及び最適 p H
本菌株は Yp S s液体培地中 26°Cにおいて ρΗ2~10 の範囲で生育し、 最適 p Hは 6〜7である。
4 ) 好気性、嫌気性の区別 ； 好気性
以上の形態的特徵および培養上の性状から、 本菌株が不完全菌亜門中の
Penicilliier属の 1菌種であることが明かとなり、宇田川 俊一、椿 啓介編 『菌類図鑑』 （1978年） 、 J . . Carmichael , W. Bryce Kendrick, I . L. Conne rs, Lynne Sigler共著『Genera of HyphomycetesJ (1980年）、 T . Matsushima 著 FMicrofungi of the solomon islands and papua-new guinia』 （1971年）及 び 『Icones microfungorum a matsushima lecto誦』 （1975年） に報告されてい る多くの既知菌株と比較検討した。 その結果、 本菌株は Penicilliier
superimpositusに最も近 、性質を示すことが明かとなり本菌株を fPenicil lifer suTDerimpositus TF - 0402」 と命名した。
B R - 0 5 0及び B R— 0 5 1の生産は大略一般の発酵生産物を生産する場合 に準じ、各種の栄養物を含む培地で Penicilliier super impositus TF-0402株を 好気的条件下で培養することにより行なう。
培地は主として液体培地を用い、炭素源としてはグルコース、 シユウクロース、 廃糖蜜、 スターチなどを単独または混合して用いる。 窒素源としては肉エキス、 オートミール、酵母エキス、 大豆粉、 ポリペプトンなどを単独または混合して用 いる。 その他、本菌株の生育を助け B R—0 5 0及び B R— 0 5 1の生産を促進 する有機物及び無機塩を必要により添加することができる。 消泡剤としては、 ァ デカノール、 シリコンなどを用いることができる。
培養方法は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的培養力《適しており、 p H 2〜 1 0、 9〜 3 1 °Cで 3〜 6日間、 望ましくは p H 6〜 7、 2 5 ~ 2 9 °Cで 5日間 培養する。
この培養により生産された B R— 0 5 0及び B R— 0 5 1を単離するには発酵 生産物を採取する一般的な方法に準じて行えばよい。 たとえば次の方法が効果的 である。
すなわち、培養終了後、 培養液をアセトンなどの有機溶媒で抽出する。
次いでこの抽出液を濃縮後、 酢酸ェチル、 ベンゼン、 クロ口ホルムなどの非水 溶性有機溶媒に転溶し、 これを濃縮してシロップ状とする。 このシロップを再度ベンゼン、 酢酸ェチル、 アセトン、 メタノール、 クロ?ホ ルムなどの有機溶媒に溶解し、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー、 ゲル濾過 カラムクロマトグラフィ一及び高速液体力ラムクロマトグラフィーに付すことに より本発明化合物を精製単離することができる。
以上の精製法によって得られた B R— 050及び B R— 051の理化学的性質 を以下に示す。
BR-050
( a )元素分析値：
実測値 {%) C 71.92, H 9.30, 0 18.40
理論値 （％) C 72.65, H 9.42, 0 17.94
(C27H4004 * H20として計算）
( b )質量分析値：
FABマススペクトル mZz 429 (M + H)
( c )分子量 : 428
(d) 融点： 205〜210°C
(e)比旋光度：
[a] D25 : — 143° (c = 0.1, クロ口ホルム）
(f )紫外線吸収スぺクトル：
Amax nm (ε) 210 (18000) ， 240 (s h) ,
290 (7000) (メタノール）
(g)赤外線吸収スぺクトル：
K B r法で測定した結果を第 1図に示す。
(h) i —NMRスペクトル：
CDC 13： CD3OD=9： 1中、 40 OMH zで測定した結果を第 2 図に示す。
( i ) 13C— NMRスぺク トル：
' CDC 13： CD3OD = 9： 1中、 10 OMH zで測定した結果を第 3 図に示す。 ―
(j)溶剤に対する溶解性： クロ口ホルム、 酢酸ェチル、 メタノールに可溶 ， n—へキサン、 ベンゼンに難溶
水に不溶
(k) 呈色反応：
陽性： ヨウ素、硫酸、塩化第二鉄
陰性：ニンヒドリン
( 1 ) 塩基性、酸性、 中性の区別：酸性
BR-051
( a ) 元素分析値：
実測値 ( ) C 73.07, H 8.76, 0 1 8.1 7
理論値 (%) C 72.97, H 9.01, 0 1 8.02
(C27H3804 * H20として計算）
( b ) 質量分析値：
FABマススペクトル mZz 427 (M + H)
(c) 分子量： 426 '
(d) 融点： 151〜154。C
(e) 比旋光度：
0] D 28 :— 36° (c = 0.1, クロ口ホルム）
(f ) 紫外線吸収スぺクトル：
Amax nm (e) 21 0 (26000) , 240 (s h) ,
290 (9000) (メタノール）
(g) 赤外線吸収スぺクトル：
KB r法で測定した結果を第 4図に示す。
(h) iH— NMRスペクトル：
- CDC 1 a： CD3OD = 9 ： 1中、 40 OMH zで測定した結果を第 5 図に示す。
( i ) 13C— NMRスぺクトル：
CDC 13： CD3OD = 9 ： 1中、 1 00 MH zで測定した結果を第 6 図に示す。 . (j)溶剤に対する溶解性：
クロ口ホルム、詐酸ェチル、 メタノールに可溶
n—へキサン、 ベンゼンに難溶
水に不溶 ·
(k)呈色反応：
陽性：ヨウ素、硫酸、塩化第二鉄
陰性：ニンヒドリン
( 1 ) 塩基性、酸性、 中性の区別：酸性 図面の簡単な説明
第 1図は、 K B r法で測定した B R— 050の赤外線吸収スぺクトルを示す。 第 2図は、 CDC ls: CD3OD = 9 ： 1中、 400MHzで測定した BR—
050の1 H— NMRスぺクトルを示す。
第 3図は、 CDC 13： CD3OD = 9 ： 1中、 10 OMH zで測定した B R—
050の13 C— NMRスぺクトルを示す。
第 4図は、 KB r法で測定した BR— 051の赤外線吸収スぺクトルを示す。 第 5図は、 CDC 13： CD3OD = 9： 1中、 40 OMH zで測定した BR—
051の1 H— NMRスべクトルを示す。
第 6図は、 CDC 13: CD30D = 9 : 1中、 10 OMH zで測定した BR—
051の13 C— NMRスぺクトルを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、実施例を挙げて本発明化合物の製造方法を更に詳細に説明する。
実施例 1
(1) 50 Om 1容三角フラスコを用いて、 100m 1当りグルコース 2 g、 ポ リペプトン 0.5 g、酵母エキス 0.2 g、 リン酸一力リウム 0.1 g、硫酸マグ ネシゥム 0.05 gを含む無菌液体培地に Penicilliier superimpositus TF-0402 株を接種し、 26°C、 120時間振盪培養し、 種培養とした。 次に、 200 L容 ジャーフアーメン夕一と 50 L容ジャ一ファーメンターを用いて種培養と同 組 成の無菌培地に前記種培養液を接種し、 26 °Cで 96時間攪拌通気培養した。 培養終了後、 200L容ジャーフアーメン夕一 1基分 120Lと、 50L容ジ ヤーフアーメンター 3基分 90Lの培養液を合わせて濾過し上清と菌体に分けた, 上清については、 吸着樹脂 [ダイヤイオン HP— 20 (商品名；三菱化成工業 社製） 10L] に吸着させた後精製水 20 Lで洗浄し、 アセトン一水 （50： 50) の混合液で溶出される画分を除いた後ァセトン 20 Lで活性物質を溶出し た。 菌体についてはアセトン 15 Lで 2回抽出した。 上清由来アセトン溶出液 と菌体由来ァセトン抽出液を合わせて減圧濃縮し、 得られた残渣を 15 L酢酸ェ チルで 2回抽出した。 この酢酸ェチノレ画分を無水硫酸ナトリウムで脱水後、 濃縮 乾固し、褐色の油状物質 85.8 gを得た。
( 2 )前項で得られた油状物質 85.8gをクロ口ホルム 30mlに溶解し、 シリカゲルを充填したカラム （容量 1.0L、 溶媒；クロ口ホルム） に吸着させ た。 クロ口ホルム 2.0Lで洗浄後クロ口ホルム一メタノール （98 : 2) の混 合溶媒で溶出される画分を除いた。 次いで、 クロ口ホルム一メタノール （95 ：
5) の混合溶媒で溶出を行い濃縮乾固することにより 32.8 gの褐色油状物質 を得た。
得られた試料を n—へキサンージクロロメタン一メタノール （5： 5 ： 1) で 調製したセフアデックス LH— 20 (商品名、 フアルマシア社製） にてゲル濾過 を行い活性画分を集めて濃縮乾固し褐色油状物質 9 gを得た。 得られた試料をク ロロホルム 15m 1に溶解し、 シリカゲルを充填したカラム （容量 0.8L、 溶 媒；クロ口ホルム） に吸着させた。 クロ口ホルム 1.6 Lで洗浄後クロ口ホルム 一メタノール （99 : 1) の混合溶媒で溶出される画分を除いた。 次いで、 クロ 口ホルム一メタノール （98： 2) の混合溶媒で溶出を行い濃縮乾固することに より 4 gの褐色油状物質を得た。
(3)前項の油状物質 4 gをメタノール 2 Omlに溶解し、 以下の条件で行つ た高速液体カラムク口マトグラフィ一の試料とした。
カラムサイズ 100X25 Omm
担体 シリカゲル （センシユー化学社製） 溶媒組成 1%メ夕ノール、 99%クロ口ホルム
流速 4.5m 1 / m i n
25°C
検出 254 nm
ウォーターズ M— 600
保持時間 4.4〜 5.6分の画分を分取し、 減圧下溶媒を留去し、 白色粉末とし て 500mgの BR— 050を得た。 実施例 2
(1) 500ml容三角フラスコを用いて、 10 Om 1当りグルコース 2 g、 ポリペプトン 0.5 g、 酵母エキス 0.2 g、 リン酸一カリウム 0.1 g、 硫酸マ グネシゥム 0.05 gを含む無菌液体培地に Penicilliier superimpositus TF- 0402株を接種し、 26°C、 120時間振盪培養し、 種培養とした。 次に、 5 L容 ジャーファーメンターを用いて種培養と同じ組成の無菌培地に前記種培養液を接 種し、 26 で 96時間攪拌通気培養した。
培養終了後、 5L容ジャ一フアーメンター 2基分 6Lの培養液をァセトンで抽 出した。 このアセトン抽出液を減圧濃縮し、 得られた残渣を 3 L 酸ェチルで 2 回抽出した。 この酢酸ェチル画分を無水硫酸ナトリウムで脱水後、 濃縮乾固し、 褐色の油状物質 2.9 gを得た。
( 2 ) 前項の油状物質 2.9gをメタノール 15mlに溶解し、 以下の条件で 行つた高速液体力ラムクロマトグラフィーの試料とした。
カラムサイズ 400X250 mm
担体 ODS—シリカゲル （センシユー化学社製） 溶媒組成 73%ァセトニトリル、 27%水
流速 21. Om 1 /m i n
25°C
出汲; 215 nm
ォーターズ M—600
保持時間 15.6〜18.2分の画分を分取し、 減圧留去した後酢酸ェチル抽出 して、 白色粉末 194.2mgを得た。 . (3) 前項で得られた白色粉末を n—へキサンージクロロメタン一メタノール
(8 : 3 : 1) で調製したセフアデックス LH— 20 (商品名、 フアルマシア社 製） にてゲル濾過を行 ヽ活性画分を集めて濃縮乾固し白色粉末 164 · 4 m gを ί守た。
得られた試料をクロ口ホルム 2m 1に溶解し、 薄層扳 [キーセルゲル一 6 OF— 254 (メルク社製） ， 20X20 cm, 厚さ 0.5 mm] に吸着させた。 これ をクロ口ホルム一メタノール （9 ： 1) の混合溶媒で展開し、 1¾ 値0.57〜 0.62の画分をかきとった。 かきとったシリ力ゲル粉末を酢酸ェチルで抽出し、 抽出液を濾過後濃縮乾固して白色粉末として 87.5mgの BR— 051を得た。 産業上の利用可能性 ¾
本発明のィ匕合物は、骨吸収に対し優れた抑制作用を有するので、 骨粗鬆症、高 カルシウム血症などの骨代謝異常に基づく疾患の治療薬として有用である。
この目的のためには、本発明化合物を慣用的な製剤技術に従って製造される錠 剤、 丸剤、 カプセル剤、顆粒剤などの投与型で経口的に投与すること力できる。 上記の各製剤においては、通常の増量剤、結合剤などの添加剤を用いること力で きる。
本発明化合物の治療患者に対する投与量は、患者の年齢、疾病の種類および状 態などにより変動し得る力 通常、 1日あたり 0.5~700mg、 好ましくは、 1〜50 Omgを 1日 1回または数回に分けて投与すること力 <できる。
次に試験例を挙げて本発明化合物の骨吸収 制作用の結果を示す。 試験例 （骨吸収抑制作用）
ボン アンド ミネラル 〔第 17巻、 第 347〜359頁、 1992年〕 に準 じて試験を行った。
(1) 骨吸収抑制活性の測定法
5日齢のゥサギょり大腿骨及び頸骨を摘出後ハサミで細切し、 5 %ゥシ胎児血 清 （FBS) を含む α—ミニマムエッセンシャルメジゥム （ 一 MEM) 中で.3 0秒攪拌した。 3分間静置後、 分離した破骨細胞を含む細胞懸濁液の上清を直径 6mm、厚さ 150 /zmにスライスした象牙片を入れた 96 we 1 1プレー卜に、 4X 10V250 μ 1 /w e 1 1になるように播種した。 37°CN 5%C02ィ ンキュベータ一中で 2時間放置し細胞を象牙片上に接着させた後、 上清を取り除 き、 ジメチルスルホォキシドにて所要濃度に調製した本発明化合物を添加した 5 %FBSを含む 一 MEMを 100 μ 1 / e 1 1加えた。 37°C、 1 % C 02ィンキュベータ一中で 24時間培養した後、 上清及び象牙片上の細胞を取 り除いた。 ァシッドへマトキシリン原液を 50 1/we 1 1入れ、 象牙片上に できた吸収窩を 5分間染色した後蒸留水で 3回洗浄した。 顕微鏡下で染色された P及収窩の数を計測し、化合物無添加の対照群で形成された吸収窩の数を 100% としたときの化合物添加群の吸収窩数を算出し、 50%骨吸収抑制濃度 （I C5。 値） を求めた。
その結果、 本発明化合物の I C5。値は、 BR— 050が 0.01 ^ gZm l及 び BR— 051が 0.05 g/m 1となった。

Claims

1. 式
-5青 の
Figure imgf000014_0001
囲
0H
(式中、 Aは c または c = oである。 ）
Ή
で表される化合物
PCT/JP1994/001445 1993-09-03 1994-09-01 Substances br-050 et br-051 inhibant la resorption osseuse WO1995006646A1 (fr)

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WO2005090326A1 (ja) * 2004-03-24 2005-09-29 The Kitasato Institute 抗生物質ｆｋｉ−１７７８およびその製造法

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JPS4913392A (ja) * 1972-04-05 1974-02-05

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