JPH07138257A - 骨吸収抑制物質ｂｒ−０４０及びｂｒ−０４２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 骨吸収抑制作用を有する新規な生理活性物質
を提供する。 【構成】 式

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨吸収抑制作用を有す
る化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨は骨形成と骨吸収（溶解）の均衡が保
たれていることで、その強度が維持されている。骨粗鬆
症は骨吸収が亢進してしまうために骨が脆くなり、骨折
などを起こし易くなる慢性疾患で、特に閉経後の女性に
多く見られる。従って、亢進した骨吸収を抑制する薬剤
は骨粗鬆症薬になりうると考えられる。

【０００３】骨吸収を抑制する薬剤としては、ウナギ及
びサケのカルシトニンが臨床的に用いられている。とこ
ろが、カルシトニンはアミノ酸が３２個結合した分子量
約３，４００のペプチドであり、消化管からの吸収性が
低いので注射剤として利用されているのが現状である。
骨粗鬆症のような慢性疾患では服用できる薬剤が理想的
であり、服用可能で骨吸収を抑制する薬剤の出現が待た
れている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、骨吸
収抑制作用を有する新規な生理活性物質を提供すること
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために自然界より多数の菌株を分離し、その菌
株の培養物について種々検討した結果、ある種の菌株の
生産する化合物が強い骨吸収抑制作用を有することを見
いだし、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、式（Ｉ）

【０００７】

【０００８】（式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示
す。）で表わされる化合物である（以下、Ｒが水素原子
の場合をＢＲ−０４０、Ｒがメチル基の場合をＢＲ−０
４２と称する）。

【０００９】ＢＲ−０４０及びＢＲ−０４２を生産する
菌株は、本発明者らが自然界から新たに分離した菌株で
あり、微生物の名称「Streptomyces hygroscopicus va
r. ossamyceticus TA-0247」及び微生物寄託番号「FERM
P−１３９２３」として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されている。

【００１０】この菌株の菌学的性状を以下に示す。 １）形態 栄養菌糸は合成寒天培地及び天然寒天培地においてよく
発達し、不規則に分枝する。また、隔壁は認められな
い。胞子はスターチ・無機塩、イースト・麦芽、オート
ミール寒天培地などで栄養菌糸より伸長した気菌糸の先
端に形成される。顕微鏡で観察すると、胞子形成菌糸の
分枝方法は単純分枝で、胞子は通常気菌糸の先端にらせ
ん状に形成される。胞子は10個以上連鎖し、表面は平滑
である。胞子の形状は、亜球形から円筒形でその大きさ
は０．７〜１．３μｍ×０．６〜０．８μｍである。な
お、胞子のう、ベン毛胞子は観察されない。 ２）培地上での生育状態 各種培地上で２８℃、７日間培養したときの肉眼による
観察結果を表１に示す。

【表１】

【００１１】

【００１２】３）生理的性質 生育温度範囲 イースト・麦芽エキス培地で１７〜４４℃の範囲で生育
し、最適生育温度は２６〜３１℃である。 生化学的性質 ａ．好気性、嫌気性の区別：好気性 ｂ．ゼラチンの液化 ：陰性 ｃ．脱脂乳の凝固 ：陽性 ｄ．脱脂乳のペプトン化 ：陰性 ｅ．澱分の加水分解 ：陽性 ｆ．メラニン様色素の生産：陽性 炭素源の利用 （プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上） 強く利用する：Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルコース、Ｄ
−フラクトース、シュクロース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−
マンニット 利用する：イノシトール 疑わしい：Ｄ−キシロース 利用しない：ラフィノース 以上の性状から、本菌株が放線菌中、Streptomyces属に
属することが明らかとなったので上記諸性状をＩ.Ｓ.
Ｐ.「ジ・インターナショナル・ストレプトミセス・プ
ロジェクト」、「マニュアル・オブ・システマティック
・バクテリオロジー」第４巻（1989年）及びワックスマ
ン著「ジ・アクチノミセテス」第２巻（1961年）、H.Sc
hmitz et.al., The Journal of Antibiotics, ser. A,
18, PP 82-88 (1965)に報告されている多くの既知菌株
と比較した結果、コロニー表面（気生菌糸）の色調が白
色から灰色系を示す点、hygroscopic である点、ペプト
ンイースト鉄寒天中でメラニン様色素を生産する点、胞
子鎖形態が spiralesで胞子表面性状が滑面、ゼラチン
の液化性が陰性等の点で S. hygroscopicus var. ossam
yceticus の特徴と最もよく一致した。なお、上記の菌
種では試験した全ての炭素源を利用できるのに対し、本
菌はキシロースで（+/-）、ラフィノースで（−）であ
る点、脱脂乳の凝固性が本菌の場合陽性である点等にお
いて異なっていたが、別種にするほどではないと判断
し、本菌を Streptomyces hygroscopicus var. ossamyc
eticus TA-0247と命名した。

【００１３】ＢＲ−０４０及びＢＲ−０４２の生産は大
略一般の発酵生産物を生産する場合に準じ、各種の栄養
物を含む培地で Streptomyces hygroscopicus var. oss
amyceticus TA-0247株を好気的条件下で培養することに
より行なう。

【００１４】培地は主として液体培地を用い、炭素源と
してはグルコース、シュウクロース、廃糖蜜、スターチ
などを単独または混合して用いる。窒素源としては肉エ
キス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプト
ンなどを単独または混合して用いる。その他、本菌株の
生育を助けＢＲ−０４０及びＢＲ−０４２の生産を促進
する有機物及び無機塩を必要により添加することができ
る。消泡剤としては、アデカノール、シリコンなどを用
いることができる。

【００１５】培養方法は振盪培養、通気攪拌培養などの
好気的培養が適しており、ｐＨ２〜１０、１７〜４４℃
で３〜６日間、望ましくはｐＨ６〜７、２６〜３１℃で
４日間培養する。

【００１６】この培養により生産されたＢＲ−０４０及
びＢＲ−０４２を単離するには発酵生産物を採取する一
般的な方法に準じて行えばよい。たとえば、次の方法が
効果的である。

【００１７】すなわち、培養終了後、培養液をアセトン
などの有機溶媒で抽出する。次いでこの抽出液を濃縮
後、酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムなどの非水溶
性有機溶媒に転溶し、これを濃縮してシロップ状とす
る。

【００１８】このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチ
ル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶
媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過カラムクロマトグラフィー及び高速液体カラムク
ロマトグラフィーに付すことにより本発明化合物を精製
単離することができる。

【００１９】以上の精製法によって得られたＢＲ−０４
０及びＢＲ−０４２の理化学的性質を以下に示す。 １）ＢＲ−０４０ （ａ）元素分析値： 実測値（％）Ｃ ６０．２５，Ｈ ７．５２，０ ２
７．７５，Ｎ ２．４９ 理論値（％）Ｃ ６１．３５，Ｈ ７．７２，０ ２
８．２８，Ｎ ２．７５ （Ｃ₂₆Ｈ₃₇ＮＯ₈・Ｈ₂Ｏとして計算） （ｂ）質量分析値：ＦＡＢマススペクトル ｍ／ｚ ４
９０（Ｍ−Ｈ） （ｃ）分子量：４９１ （ｄ）融点：７３〜７６℃ （ｅ）比旋光度： ［α］_D ²⁵：−１６０°（ｃ＝０．０２，メタノール） （ｆ）紫外線吸収スペクトル： λmax ｎｍ（ε）２０４（１７０００） （メタノー
ル） （ｇ）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果
を図１に示す。 （ｈ） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：アセトン−ｄ₆中、４
００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。 （ｉ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：アセトン−ｄ₆中、１
００ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。 （ｊ）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、酢酸エチ
ル、メタノールに可溶 ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶 水に不溶 （ｋ）呈色反応： 陽性：Ｉ₂，Ｈ₂ＳＯ₄ 陰性：ニンヒドリン，ＦｅＣｌ₃ （ｌ）塩基性、酸性、中性の区別：中性 ２）ＢＲ−０４２ （ａ）元素分析値： 実測値（％）Ｃ ５９．２０，Ｈ ７．３８，０ ３
１．０６，Ｎ ２．３６ 理論値（％）Ｃ ５９．９４，Ｈ ８．２９，０ ３
２．５３，Ｎ ２．５９ （Ｃ₂₇Ｈ₃₉ＮＯ₈・２Ｈ₂Ｏとして計算） （ｂ）質量分析値： ＦＡＢマススペクトル ｍ／ｚ ５０４（Ｍ−Ｈ） （ｃ）分子量：５０５ （ｄ）融点：８０〜８３℃ （ｅ）比旋光度： ［α］_D ²⁵：−６４°（ｃ＝０．０２，メタノール） （ｆ）紫外線吸収スペクトル： λmax ｎｍ（ε）２０５（１４０００） （メタノー
ル） （ｇ）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ法で測定した結果
を図４に示す。 （ｈ） ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：アセトン−ｄ₆中、４
００ＭＨｚで測定した結果を図５に示す。 （ｉ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：アセトン−ｄ₆中、１
００ＭＨｚで測定した結果を図６に示す。 （ｊ）溶剤に対する溶解性：クロロホルム、酢酸エチ
ル、メタノールに可溶 ｎ−ヘキサン、ベンゼンに難溶 水に不溶 （ｋ）呈色反応： 陽性：Ｉ₂，Ｈ₂ＳＯ₄ 陰性：ニンヒドリン，ＦｅＣｌ₃ （ｌ）塩基性、酸性、中性の区別：中性

【００２０】

【発明の効果】本発明の化合物は、骨吸収に対し優れた
抑制作用を有するので、骨粗鬆症、高カルシウム症など
の骨代謝異常に基づく疾患の治療薬として有用である。

【００２１】

【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明を
具体的に説明する。 実施例 （１）５００ｍｌ容三角フラスコを用いて、１００ｍｌ
当りオートミール２ｇ、グルコース２ｇ、塩化ナトリウ
ム０．３ｇ、肉エキス０．３ｇ、塩化マンガン０．０４
ｇ、硫酸第二鉄０．０４ｇ、炭酸カルシウム０．３ｇ無
菌液体培地に Streptomyces hygroscopicus var. ossam
yceticus TA-0247株を接種し、２８℃、９６時間振盪培
養した。培養終了後、４０本分４Ｌの培養液をアセトン
２Ｌで２回抽出し、抽出液を減圧溜去後、得られた残渣
を２Ｌ酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル画分
を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮乾固し、褐色の油
状物質３．０８ｇを得た。

【００２２】（２）前項で得られた油状物質をクロロホ
ルム４ｍｌに溶解し、シリカゲルを充填したカラム（容
量０．２Ｌ、溶媒；クロロホルム）に吸着させた。クロ
ロホルム０．４Ｌで洗浄後クロロホルム−メタノール
（９５：５）の混合溶媒で溶出される画分を除いた。次
いで、クロロホルム−メタノール（９０：１０）の混合
溶媒で溶出を行い、濃縮乾固することにより３９４．１
ｍｇの褐色油状物質を得た。得られた試料をメタノール
で調製したセファデックスＬＨ−２０（商品名、ファル
マシア社製）にてゲル濾過を行い、活性画分を集めて濃
縮乾固し褐色油状物質１７０．１ｍｇを得た。

【００２３】（３）前項の油状物質１７０．１ｍｇをメ
タノール１．７ｍｌに溶解し、以下の条件で行った高速
液体カラムクロマトグラフィーの試料とした。

【００２４】カラムサイズ １０φ×２５０ｍｍ 担体 ＹＭＣ−ＡＱ（ワイエムシー社製） 溶媒組成 ４０％アセトニトリル、６０％水 流速 ４．７ｍｌ／ｍｉｎ 温度 ５０℃ 検出波長 ２１５ｎｍ 装置 ウオーターズ Ｍ−６００ 保持時間３．６〜４．４分の画分を分取し、減圧下溶媒
を留去した後、酢酸エチルで抽出し、濃縮乾固すること
により白色粉末として６．５ｍｇのＢＲ−０４０を得
た。さらに、保持時間７．２〜８．２分の画分を分取
し、減圧下溶媒を留去した後、酢酸エチルで抽出し、濃
縮乾固することにより白色粉末として１７．１ｍｇのＢ
Ｒ−０４２を得た。

【００２５】試験例 （骨吸収抑制作用） ［骨吸収抑制活性の測定法］５日齢のウサギより大腿骨
及び頸骨を摘出後ハサミで細切し、５％ウシ胎児血清を
含むα−ミニマムエッセンシャルメジウム中で３０秒攪
拌した。３分間静置後、分離した破骨細胞を含む細胞懸
濁液の上清を直径６ｍｍ、厚さ１５０μｍにスライスし
た象牙片を入れた９６ｗｅｌｌプレートに、４×１０⁵
／２５０μｌ／ｗｅｌｌになるように播種した。３７
℃、５％インキュベーター中で２時間放置し、細胞を象
牙片上に接着させた後、上清を取り除き、ジメチルスル
ホオキシドにて所要濃度に調製した本発明化合物を添加
した５％ウシ胎児血清を含むα−ミニマムエッセンシャ
ルメジウムを１００μｌ／ｗｅｌｌ加えた。３７℃、１
０％インキュベーター中で２４時間培養した後、上清及
び象牙片上の細胞を取り除いた。アシッドヘマトキシリ
ン原液を５０μｌ／ｗｅｌｌ入れ、象牙片上にできた吸
収窩を５分間染色した後、蒸留水で３回洗浄した。顕微
鏡下で染色された吸収窩の数を計測し、化合物無添加の
対照群で形成された吸収窩の数を１００％としたときの
化合物添加群の吸収窩数を算出し、５０％骨吸収抑制濃
度（ＩＣ₅₀値）を求めた。

【００２６】その結果、ＢＲ−０４０のＩＣ₅₀値は５０
μｇ／ｍｌ、ＢＲ−０４２のＩＣ₅₀値は２５μｇ／ｍｌ
となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＫＢｒ法で測定したＢＲ−０４０の赤外線吸収
スペクトルを示す。

【図２】アセトン−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定したＢ
Ｒ−０４０の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】アセトン−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定したＢ
Ｒ−０４０の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図４】ＫＢｒ法で測定したＢＲ−０４２の赤外線吸収
スペクトルを示す。

【図５】アセトン−ｄ₆中、４００ＭＨｚで測定したＢ
Ｒ−０４２の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図６】アセトン−ｄ₆中、１００ＭＨｚで測定したＢ
Ｒ−０４２の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 新屋敷 景子 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 川嶋 朗 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 森本 繁夫 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 陳 曽湘 中華人民共和国四川省成都市杉板橋路９号 国家医薬管理局四川抗菌素工業研究所内 (72)発明者 胡 潤茂 中華人民共和国四川省成都市杉板橋路９号 国家医薬管理局四川抗菌素工業研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 （式中、Ｒは水素原子またはメチル基を示す。）で表さ
   れる化合物