JPH06206843A - 生理活性物質br−011 - Google Patents
生理活性物質br−011Info
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- JPH06206843A JPH06206843A JP4345018A JP34501892A JPH06206843A JP H06206843 A JPH06206843 A JP H06206843A JP 4345018 A JP4345018 A JP 4345018A JP 34501892 A JP34501892 A JP 34501892A JP H06206843 A JPH06206843 A JP H06206843A
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Landscapes
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 低分子量で、服用可能な骨吸収抑制作用を有
する化合物を提供する。 【構成】 式
する化合物を提供する。 【構成】 式
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、骨吸収抑制作用を有す
る生理活性物質に関する。
る生理活性物質に関する。
【0002】
【従来の技術】骨は骨形成と骨吸収(溶解)の均衡が保
たれていることで、その強度が維持されている。骨粗鬆
症は骨吸収が亢進してしまうことで骨が脆くなり、骨折
などを起こし易くなる慢性疾患で、特に閉経後の女性に
多く見られる。従って亢進した骨吸収を抑制する薬剤は
骨粗鬆症治療薬となりうると考えられる。骨吸収を抑制
する薬剤としてはウナギ及びサケのカルシトニンが臨床
的に用いられている。骨粗鬆症のような慢性疾患では服
用できる薬剤が理想的であるが、カルシトニンはアミノ
酸が32個結合した分子量約3,400のペプチドであ
り消化管からの吸収性は低く注射剤として利用している
のが現状である為、服用可能で骨吸収を抑制する薬剤の
出現が待たれている(中村哲朗、「治療学」、ライフサ
イエンス出版株式会社、1991年)。
たれていることで、その強度が維持されている。骨粗鬆
症は骨吸収が亢進してしまうことで骨が脆くなり、骨折
などを起こし易くなる慢性疾患で、特に閉経後の女性に
多く見られる。従って亢進した骨吸収を抑制する薬剤は
骨粗鬆症治療薬となりうると考えられる。骨吸収を抑制
する薬剤としてはウナギ及びサケのカルシトニンが臨床
的に用いられている。骨粗鬆症のような慢性疾患では服
用できる薬剤が理想的であるが、カルシトニンはアミノ
酸が32個結合した分子量約3,400のペプチドであ
り消化管からの吸収性は低く注射剤として利用している
のが現状である為、服用可能で骨吸収を抑制する薬剤の
出現が待たれている(中村哲朗、「治療学」、ライフサ
イエンス出版株式会社、1991年)。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、低分
子量で、服用可能な骨吸収抑制作用を有する化合物を提
供することにある。
子量で、服用可能な骨吸収抑制作用を有する化合物を提
供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の培養物について種々検討した結果、ある種の菌株の生
産する化合物が強い骨吸収抑制作用を有することを見い
だし、本発明を完成するに至った。
の達成のために多数の菌株を土壌より分離し、その菌株
の培養物について種々検討した結果、ある種の菌株の生
産する化合物が強い骨吸収抑制作用を有することを見い
だし、本発明を完成するに至った。
【0005】すなわち、本発明は、
【0006】
【0007】で表わされる化合物(以下、これをBR−
011と称する。)である。
011と称する。)である。
【0008】BR−011を生産する菌株は、本発明者
らが採取した枯死植物から新たに分離した菌株であり、
微生物の名称「Stachybotrys sp. TF-0372」および微生
物寄託番号「微工研菌寄第13323号(FERM P
−13323)」として、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。
らが採取した枯死植物から新たに分離した菌株であり、
微生物の名称「Stachybotrys sp. TF-0372」および微生
物寄託番号「微工研菌寄第13323号(FERM P
−13323)」として、工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。
【0009】この菌株の菌学的性状を以下に示す。 [形態]本菌株は、オ−トミ−ル寒天培地、YpSs寒
天培地等で良好に生育し、また胞子の形成は上記2種の
培地に加えバレイショ・ブドウ糖寒天培地においても極
めて良好である。本菌株がバレイショ・ブドウ糖寒天培
地上、26℃、14日間の培養で形成したコロニ−を光
学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を有し高度に分岐し
ており、分生子柄は気生菌糸から側生し、単生か稀に基
部にて分岐する。表面はわずかに粗面、隔壁を有し、高
さは25〜42μm、幅は3.2〜4.0μmである。
フィアライドは分生子柄の先端に複数個形成され、棍棒
形、表面は滑面、大きさは8.0〜12.0×4.0〜
5.0μmである。分生子は楕円形から両端が丸みを帯
びた円筒形、黒色、表面は滑面、大きさは8.2〜1
4.2×3.8〜6.0μm、フィアライドの先端で粘
球状の塊となる。なお、培養を3週間に延長したが有性
生殖器官の形成は認められなかった。 [培地上での諸性状]各種培地上で、26℃、14日間
培養した場合の肉眼的観察結果を次の表1に示した。な
お色の表示は日本規格協会、JIS色名帳(1985
年)の系統色名を引用した。
天培地等で良好に生育し、また胞子の形成は上記2種の
培地に加えバレイショ・ブドウ糖寒天培地においても極
めて良好である。本菌株がバレイショ・ブドウ糖寒天培
地上、26℃、14日間の培養で形成したコロニ−を光
学顕微鏡で観察すると、菌糸は隔壁を有し高度に分岐し
ており、分生子柄は気生菌糸から側生し、単生か稀に基
部にて分岐する。表面はわずかに粗面、隔壁を有し、高
さは25〜42μm、幅は3.2〜4.0μmである。
フィアライドは分生子柄の先端に複数個形成され、棍棒
形、表面は滑面、大きさは8.0〜12.0×4.0〜
5.0μmである。分生子は楕円形から両端が丸みを帯
びた円筒形、黒色、表面は滑面、大きさは8.2〜1
4.2×3.8〜6.0μm、フィアライドの先端で粘
球状の塊となる。なお、培養を3週間に延長したが有性
生殖器官の形成は認められなかった。 [培地上での諸性状]各種培地上で、26℃、14日間
培養した場合の肉眼的観察結果を次の表1に示した。な
お色の表示は日本規格協会、JIS色名帳(1985
年)の系統色名を引用した。
【0010】
【表1】
【0011】[生理的性質] 1)生育pH範囲及び最適pH 本菌株はYpSs液体培地中26℃においてpH4〜1
0の範囲で生育し、最適pHは3〜5である。 2)生育温度範囲及び最適温度 本菌株はpH6.0のサブロ−液体培地において、11
〜36℃の範囲で生育し、最適温度は24〜31℃であ
る。 3)好気性,嫌気性の区別;好気性
0の範囲で生育し、最適pHは3〜5である。 2)生育温度範囲及び最適温度 本菌株はpH6.0のサブロ−液体培地において、11
〜36℃の範囲で生育し、最適温度は24〜31℃であ
る。 3)好気性,嫌気性の区別;好気性
【0012】以上の形態的特徴および培養上の性状か
ら、本菌株が不完全菌亜門中の、1属菌であることが明
かとなり、宇田川 俊一,椿 啓介編『菌類図鑑』(19
78年)、J. W. Carmichael,W. Bryce Kendrick,I. L.
Conners,Lynne Sigler共著『Genera of Hyphomycete
s』(1980年)、M. B. Ellis 著『DEMATIACEOUS HYPHOM
YCETES』(1971年)及び『MORE DEMATIACEOUS HYPHOMYC
ETES』(1976年)、Jong and Davis,Mycotaxon,第3
巻,409〜485ページ(1976年)並びに S. C. Jon
g and E. E. Davis,Mycotaxon,第3巻,第3号,第4
09〜485頁(1976年)に報告されている多くの既知
菌株と比較検討した。その結果、本菌株は Stachybotry
s 属の一菌種であることが明かとなったが、種を決定す
るには至らなかったので本菌株を「Stachybotrys sp. T
F-0372」 と命名した。
ら、本菌株が不完全菌亜門中の、1属菌であることが明
かとなり、宇田川 俊一,椿 啓介編『菌類図鑑』(19
78年)、J. W. Carmichael,W. Bryce Kendrick,I. L.
Conners,Lynne Sigler共著『Genera of Hyphomycete
s』(1980年)、M. B. Ellis 著『DEMATIACEOUS HYPHOM
YCETES』(1971年)及び『MORE DEMATIACEOUS HYPHOMYC
ETES』(1976年)、Jong and Davis,Mycotaxon,第3
巻,409〜485ページ(1976年)並びに S. C. Jon
g and E. E. Davis,Mycotaxon,第3巻,第3号,第4
09〜485頁(1976年)に報告されている多くの既知
菌株と比較検討した。その結果、本菌株は Stachybotry
s 属の一菌種であることが明かとなったが、種を決定す
るには至らなかったので本菌株を「Stachybotrys sp. T
F-0372」 と命名した。
【0013】BR−011の生産は大略一般の発酵生産
物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地で S
tachybotrys sp. TF-0372 株を好気的条件下で培養する
ことにより行なう。培地は主として液体培地を用い、炭
素源としてはグルコース、シュウクロース、廃糖蜜、ス
ターチなどを単独または混合して用いる。窒素源として
は肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリ
ペプトンなどを単独または混合して用いる。その他、本
菌株の生育を助けBR−011の生産を促進する有機物
及び無機塩を必要により添加することができる。消泡剤
としては、アデカノール、シリコンなどを用いることが
できる。培養方法は振盪培養、通気攪拌培養などの好気
的培養が適しており、pH3〜10、11〜32℃で3
〜6日間、望ましくはpH7〜8、25〜28℃で5日
間培養する。
物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地で S
tachybotrys sp. TF-0372 株を好気的条件下で培養する
ことにより行なう。培地は主として液体培地を用い、炭
素源としてはグルコース、シュウクロース、廃糖蜜、ス
ターチなどを単独または混合して用いる。窒素源として
は肉エキス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリ
ペプトンなどを単独または混合して用いる。その他、本
菌株の生育を助けBR−011の生産を促進する有機物
及び無機塩を必要により添加することができる。消泡剤
としては、アデカノール、シリコンなどを用いることが
できる。培養方法は振盪培養、通気攪拌培養などの好気
的培養が適しており、pH3〜10、11〜32℃で3
〜6日間、望ましくはpH7〜8、25〜28℃で5日
間培養する。
【0014】この培養により生産されたBR−011を
単離するには発酵生産物を採取する一般的な方法に準じ
て行えばよい。たとえば次の方法が効果的である。すな
わち、培養終了後、培養液をアセトンなどの有機溶媒で
抽出する。次いでこの抽出液を濃縮後、酢酸エチル、ベ
ンゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶
し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを
再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、ク
ロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラム
クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー及び高速液体カラムクロマトグラフィーに付すことに
より本発明化合物を精製単離することができる。
単離するには発酵生産物を採取する一般的な方法に準じ
て行えばよい。たとえば次の方法が効果的である。すな
わち、培養終了後、培養液をアセトンなどの有機溶媒で
抽出する。次いでこの抽出液を濃縮後、酢酸エチル、ベ
ンゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶
し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロップを
再度ベンゼン、酢酸エチル、アセトン、メタノール、ク
ロロホルムなどの有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラム
クロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ー及び高速液体カラムクロマトグラフィーに付すことに
より本発明化合物を精製単離することができる。
【0015】以上の精製法によって得られたBR−01
1の理化学的性質を以下に示す。 (a)元素分析値: 実測値(%)C 73.43,H 8.48,O 1
8.09 理論値(%)C 74.19,H 8.60,O 1
7.20 (C23H32O4として計算) (b)質量分析値: FABマススペクトル m/z 373(M+H) (c)分子量:372 (d)融点:87〜93℃ (e)比旋光度: [α]D 25:±0°(c=0.05,メタノ−ル) (f)紫外線吸収スペクトル:メタノ−ル λmax nm(ε) 230(120000),240
(73000),300(84000),340(30
000) (g)赤外線吸収スペクトル:KBr法で測定した結果
を図1に示す。 (h) 1H−NMRスペクトル:CDCl3中、400
MHzで測定した結果を図2に示す。 (i)13C−NMRスペクトル:CDCl3中、100
MHzで測定した結果を図3に示す。 (j)溶剤に対する溶解性:クロロホルム,酢酸エチ
ル,メタノ−ルに可溶 n−ヘキサン,ベンゼンに難溶 水に不溶 (k)呈色反応: 陽性:I2,H2SO4,FeCl3 陰性:ニンヒドリン (l)塩基性、酸性、中性の区別:酸性
1の理化学的性質を以下に示す。 (a)元素分析値: 実測値(%)C 73.43,H 8.48,O 1
8.09 理論値(%)C 74.19,H 8.60,O 1
7.20 (C23H32O4として計算) (b)質量分析値: FABマススペクトル m/z 373(M+H) (c)分子量:372 (d)融点:87〜93℃ (e)比旋光度: [α]D 25:±0°(c=0.05,メタノ−ル) (f)紫外線吸収スペクトル:メタノ−ル λmax nm(ε) 230(120000),240
(73000),300(84000),340(30
000) (g)赤外線吸収スペクトル:KBr法で測定した結果
を図1に示す。 (h) 1H−NMRスペクトル:CDCl3中、400
MHzで測定した結果を図2に示す。 (i)13C−NMRスペクトル:CDCl3中、100
MHzで測定した結果を図3に示す。 (j)溶剤に対する溶解性:クロロホルム,酢酸エチ
ル,メタノ−ルに可溶 n−ヘキサン,ベンゼンに難溶 水に不溶 (k)呈色反応: 陽性:I2,H2SO4,FeCl3 陰性:ニンヒドリン (l)塩基性、酸性、中性の区別:酸性
【0016】
【発明の効果】本発明の化合物は、骨吸収に対し優れた
抑制作用を有するので、骨粗鬆症、高カルシウム血症な
どの骨代謝異常に基づく疾患の治療薬として有用であ
る。
抑制作用を有するので、骨粗鬆症、高カルシウム血症な
どの骨代謝異常に基づく疾患の治療薬として有用であ
る。
【0017】
【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明を
具体的に説明する。 実施例 (1)300ml容三角フラスコに、100ml当りグ
ルコ−ス2g、ポリペプトン0.5g、酵母エキス0.
2g、リン酸一カリウム0.1g、硫酸マグネシウム
0.05gを含有する液体培地60mlを入れ滅菌後、
Stachybotrys sp. TF-0372株を接種し、26℃、120
時間振とう培養し、種培養とした。次に、5l容ミニジ
ャ−ファ−メンタ−を用いて種培養と同じ組成の無菌培
地3lに前記種培養液300mlを接種し、26℃で9
6時間攪拌通気培養した。培養終了後、3基分9lの培
養液をアセトン4.5lで2回抽出し、抽出液を減圧溜
去後酢酸エチル4.5lで2回抽出した。この酢酸エチ
ル画分を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮乾固し、褐
色の油状物質13.75gを得た。 (2)前項(1)で得られた油状物質をクロロホルム2
0mlに溶解し、シリカゲルを充填したカラム(容量
0.8l,溶媒;クロロホルム)に吸着させた。クロロ
ホルム1.6lで洗浄後クロロホルム−メタノール(9
5:5)の混合溶媒で溶出される画分を除いた。次い
で、クロロホルム−メタノール(90:10)の混合溶
媒で溶出を行い濃縮乾固することにより4.3gの褐色
油状物質を得た。得られた試料をn−ヘキサン−ジクロ
ロメタン−メタノ−ル(3:8:1)で調製したセファ
デックスLH−20(商品名,ファルマシア社製)にて
ゲル濾過を行い活性画分を集めて濃縮乾固し褐色油状物
質587.1mgを得た。
具体的に説明する。 実施例 (1)300ml容三角フラスコに、100ml当りグ
ルコ−ス2g、ポリペプトン0.5g、酵母エキス0.
2g、リン酸一カリウム0.1g、硫酸マグネシウム
0.05gを含有する液体培地60mlを入れ滅菌後、
Stachybotrys sp. TF-0372株を接種し、26℃、120
時間振とう培養し、種培養とした。次に、5l容ミニジ
ャ−ファ−メンタ−を用いて種培養と同じ組成の無菌培
地3lに前記種培養液300mlを接種し、26℃で9
6時間攪拌通気培養した。培養終了後、3基分9lの培
養液をアセトン4.5lで2回抽出し、抽出液を減圧溜
去後酢酸エチル4.5lで2回抽出した。この酢酸エチ
ル画分を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮乾固し、褐
色の油状物質13.75gを得た。 (2)前項(1)で得られた油状物質をクロロホルム2
0mlに溶解し、シリカゲルを充填したカラム(容量
0.8l,溶媒;クロロホルム)に吸着させた。クロロ
ホルム1.6lで洗浄後クロロホルム−メタノール(9
5:5)の混合溶媒で溶出される画分を除いた。次い
で、クロロホルム−メタノール(90:10)の混合溶
媒で溶出を行い濃縮乾固することにより4.3gの褐色
油状物質を得た。得られた試料をn−ヘキサン−ジクロ
ロメタン−メタノ−ル(3:8:1)で調製したセファ
デックスLH−20(商品名,ファルマシア社製)にて
ゲル濾過を行い活性画分を集めて濃縮乾固し褐色油状物
質587.1mgを得た。
【0018】(3)前項(2)で得た油状物質587.
1mgをメタノ−ル6mlに溶解し、以下の条件で行っ
た高速液体カラムクロマトグラフィーの試料とした。 カラムサイズ 10φ×250mm 担体 ODSシリカゲル(センシュ−科学社
製) 溶媒組成 75%アセトニトリル,25%水 流速 4.7ml/min 温度 50℃ 検出波長 215nm 装置 ウオ−タ−ズ M−600 保持時間8.5〜9.0分の画分を分取し、65.2m
gのBR−011を得た。
1mgをメタノ−ル6mlに溶解し、以下の条件で行っ
た高速液体カラムクロマトグラフィーの試料とした。 カラムサイズ 10φ×250mm 担体 ODSシリカゲル(センシュ−科学社
製) 溶媒組成 75%アセトニトリル,25%水 流速 4.7ml/min 温度 50℃ 検出波長 215nm 装置 ウオ−タ−ズ M−600 保持時間8.5〜9.0分の画分を分取し、65.2m
gのBR−011を得た。
【0019】試験例 (骨吸収抑制作用試験) 骨吸収抑制活性の測定法 Y.Takadaら[Bone and Mineral,第17巻,第347
〜359ベージ(1992年)]の方法に準拠して行った。
〜359ベージ(1992年)]の方法に準拠して行った。
【0020】5日齢の日本白色ウサギより大腿骨及び頸
骨を摘出後ハサミで細切し、5%FBSを含むα−ME
M中で30秒攪拌した。2分間静置後破骨細胞を含む上
清を直径6mm、厚さ150μmにスライスした象牙片
を入れた 96wellプレートに、4×105cel
ls/250μl/wellになるように播種した。3
7℃、5%CO2−95%airインキュベーター中で
2時間放置し破骨細胞を象牙片上に接着させた後、培地
を取り除き、ジメチルスルフォキシドにて所要濃度に調
製した本発明化合物を添加した5%FBSを含むα−M
EMを100μl/well加えた。37℃、10%C
O2−90%airインキュベーター中で24時間培養
した後、培地及び象牙片上の細胞を取り除いた。アシッ
ドヘマトキシリン原液を50μl/well入れ象牙片
上にできた吸収窩を5分間染色した後蒸留水で3回洗浄
した。顕微鏡下で染色された吸収窩の数を計測し、化合
物無添加の対照群で形成された吸収窩の数を100%と
したときの化合物添加群の吸収窩数を算出し、50%骨
吸収抑制濃度(IC50値)を求めた。その結果本発明化
合物のIC50値は4.2μg/mlであった。
骨を摘出後ハサミで細切し、5%FBSを含むα−ME
M中で30秒攪拌した。2分間静置後破骨細胞を含む上
清を直径6mm、厚さ150μmにスライスした象牙片
を入れた 96wellプレートに、4×105cel
ls/250μl/wellになるように播種した。3
7℃、5%CO2−95%airインキュベーター中で
2時間放置し破骨細胞を象牙片上に接着させた後、培地
を取り除き、ジメチルスルフォキシドにて所要濃度に調
製した本発明化合物を添加した5%FBSを含むα−M
EMを100μl/well加えた。37℃、10%C
O2−90%airインキュベーター中で24時間培養
した後、培地及び象牙片上の細胞を取り除いた。アシッ
ドヘマトキシリン原液を50μl/well入れ象牙片
上にできた吸収窩を5分間染色した後蒸留水で3回洗浄
した。顕微鏡下で染色された吸収窩の数を計測し、化合
物無添加の対照群で形成された吸収窩の数を100%と
したときの化合物添加群の吸収窩数を算出し、50%骨
吸収抑制濃度(IC50値)を求めた。その結果本発明化
合物のIC50値は4.2μg/mlであった。
【図1】KBr法で測定したBR−011の赤外線吸収
スペクトルを示す。
スペクトルを示す。
【図2】CDCl3中、400MHzで測定したBR−
011の1H−NMRスペクトルを示す。
011の1H−NMRスペクトルを示す。
【図3】CDCl3中、100MHzで測定したBR−
011の13C−NMRスペクトルを示す。
011の13C−NMRスペクトルを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成6年1月12日
【手続補正1】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図3
【補正方法】変更
【補正内容】
【図3】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小野 順子 東京都豊島区高田3丁目24番1号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田3丁目24番1号 大正製 薬株式会社内
Claims (1)
- 【請求項1】 式 で表される化合物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4345018A JPH06206843A (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | 生理活性物質br−011 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4345018A JPH06206843A (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | 生理活性物質br−011 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH06206843A true JPH06206843A (ja) | 1994-07-26 |
Family
ID=18373734
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4345018A Pending JPH06206843A (ja) | 1992-12-25 | 1992-12-25 | 生理活性物質br−011 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH06206843A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2005037760A1 (ja) * | 2003-10-17 | 2006-12-28 | アリジェン株式会社 | 新規フェノール誘導体およびそれらを有効成分とする抗トリパノソーマ予防・治療剤 |
-
1992
- 1992-12-25 JP JP4345018A patent/JPH06206843A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPWO2005037760A1 (ja) * | 2003-10-17 | 2006-12-28 | アリジェン株式会社 | 新規フェノール誘導体およびそれらを有効成分とする抗トリパノソーマ予防・治療剤 |
JP4662851B2 (ja) * | 2003-10-17 | 2011-03-30 | アリジェン製薬株式会社 | 新規フェノール誘導体およびそれらを有効成分とする抗トリパノソーマ予防・治療剤 |
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