JPH06228144A - ベンズアルデヒド系化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＬＤＬ取り込み促進作用を有する新規な化合
物を提供し、ひいては脂質低下剤として動脈硬化性疾患
の治療に役立てること。 【構成】 式 で表されるベンズアルデヒド系化合物。本発明の化合物
はＨＥＰ Ｇ２細胞（ヒト肝癌細胞）に対してＬＤＬ取
り込み促進活性を有するので、脂質低下剤として有用で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＬＤＬ取り込み促進作
用を有するベンズアルデヒド系化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明の生理活性物質ベンズアルデヒド
化合物の類似化合物として、ＳＩ−４２２８（特開和５
８−１１６６８６号）が知られている。しかしながら、
この化合物にはＬＤＬ取り込み促進作用を有することは
知られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＬＤ
Ｌ取り込み促進作用を有する新規な化合物を提供し、ひ
いては脂質低下剤として動脈硬化性疾患の治療に役立て
ることにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、血中にお
ける脂質低下作用を有する新規物質を土壌分離菌の中か
ら得るべく探索研究を重ねた結果、本発明者らの見出し
た特定の微生物が、ＨＥＰＡＴＯＭＡ Ｇ２培養細胞
（以下、ＨＥＰ Ｇ２と略す）（ヒト肝癌細胞）に対
し、ＬＤＬ取り込み促進作用を有する新規な生理活性物
質を生産することを見いだし本発明を完成するに至っ
た。すなわち、本発明は、式

【０００５】

【０００６】で表されるベンズアルデヒド系化合物（以
下、これをＭＣ−０９３と称する。）である。

【０００７】本発明の化合物を生産する菌株は、本発明
者らが新潟県湯沢市で採取した土壌より新たに分離した
菌株であり、微生物の名称「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＴＡ−１８９」および微生物
受託番号「ＦＥＲＭ Ｐ−１３３８２」として工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されている。

【０００８】この菌株の菌学的性状を以下に示す。 １．形態 栄養菌糸は合成寒天培地および天然寒天培地においてよ
く発達し、不規則に分枝する。また隔壁は認められな
い。胞子はスターチ・無機塩寒天培地およびオートミー
ル寒天培地などで栄養菌糸より伸長した気菌糸の先端に
良好に形成される。顕微鏡で観察すると、胞子形成菌糸
の分枝方法は単純分枝で、胞子は通常気菌糸の先端に屈
曲状に形成される。胞子は１０個以上連鎖し、表面は平
滑である。胞子の形状は、円筒形でその大きさは１．２
〜１．０μｍ×０．６〜０．５μｍである。菌糸、胞子
のう、ベン毛胞子は観察されない。

【０００９】２．培地上での生育状態 各種培地上で２８℃、１４日間培養したときの肉眼によ
る観察結果を表１に示す。

【００１０】

【表１】

【００１１】３．生理的性質 （１）生育温度範囲 イースト・麦芽エキス培地で２６〜３３℃の範囲で良好
に生育する。１７℃以下、３８℃以上の温度では生育し
ない。 （２）生化学的性質 （ａ）好気性、嫌気性の区別：好気性 （ｂ）ゼラチンの液化：陽性 （ｃ）脱脂乳の凝固：陰性 （ｄ）脱脂乳のペプトン化：陽性 （ｅ）スターチの加水分解：陽性 （ｆ）メラニン様色素の生成：陰性 （ｇ）細胞壁の型：Ｉ型 （ｈ）メナキノン組成：［ＭＫ−９（Ｈ₆），ＭＫ−９
（Ｈ₈）］ （３）炭素源の利用（プリドハム・ゴドリーブ寒天培地
上） 利用する：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−フラクトース、イノシトール、Ｌ−ラム
ノース、Ｄ−マンニット わずかに利用する：ラフィノース 利用しない：シュクロース

【００１２】以上の性状から本菌株が放線菌中、ストレ
プトミセス属に属することが明らかとなったので、上記
諸性状をＩ．Ｓ．Ｐ．「ジ・インターナショナル・スト
レプトミセス・プロジェクト」、ワックスマン著「ジ・
アクチノミセテス」第２巻（１９６１年）および「マニ
ュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー」
第４巻（１９８９年）に報告されている多くの既知菌株
と比較した結果、本菌株はストレプトミセス・オリエン
タレス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｒｉｅｎｔａｌ
ｉｓ）に最も近い性状を示していたので本菌株をストレ
プトミセス オリエンタレス ＴＡ−１８９（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＴＡ−１８
９）と命名した。

【００１３】ＭＣ−０９３の生産は大略一般の発酵生産
物を生産する場合に準じ、各種の栄養物を含む培地でＳ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ＴＡ
−１８９株を好気的条件下で培養することにより行な
う。

【００１４】培地は主として液体培地を用い、炭素源と
してはグルコース、シュウクロース、廃糖密、スターチ
などを単独または混合して用いる。窒素源としては肉エ
キス、オートミール、酵母エキス、大豆粉、ポリペプト
ンなどを単独または混合して用いる。その他、本菌株の
生育を助けＭＣ−０９３の生産を促進する有機物および
無機塩を必要により添加することができる。消泡剤とし
ては、アデカノール、シリコンなどを用いることができ
る。

【００１５】培養方法は振盪培養、通気攪拌培養などの
好気的培養が適しており、ｐＨ４〜８、２５〜３５℃で
２〜５日間、望ましくはｐＨ６〜７、２７〜２９℃で４
日間培養する。

【００１６】この培養により生産されたＭＣ−０９３を
単離するには発酵生産物を採取する一般的な方法に準じ
て行えばよい。すなわち、培養終了後、遠心分離または
濾過により菌体と上清に分け、菌体に蓄積された本発明
化合物を低級アルコール、アセトン等の有機溶媒で抽出
する。一方、上清に含まれる本発明化合物はポリスチレ
ン樹脂に吸着させた後、低級アルコール、アセトン等の
有機溶媒でこれを溶出する。菌体抽出液および上清から
得られた溶出液をあわせ濃縮後、酢酸エチル、ベンゼ
ン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒に転溶し、こ
れを濃縮してシロップ状とする。

【００１７】このシロップを再度ベンゼン、酢酸エチ
ル、アセトン、メタノール、クロロホルムなどの有機溶
媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過カラムクロマトグラフィーおよび高速液体カラム
クロマトグラフィーに付すことにより本発明化合物を精
製単離することができる。

【００１８】以上の精製法によって得られた本発明の目
的物質であるＭＣ−０９３は、その元素分析値、分子
量、紫外線吸収スペクトル、¹Ｈ−ＮＭＲ、¹³Ｃ−ＮＭ
Ｒスペクトル等の解析結果より構造が決定された。

【００１９】ＭＣ−０９３の理化学的性質は以下の通り
である。 （ａ）元素分析値：（Ｃ₂₄Ｈ₃₄Ｏ₉として計算） 実測値（％） Ｃ ６１．８５，Ｈ ７．３７，Ｏ ３
０．７８ 理論値（％） Ｃ ６１．７８，Ｈ ７．３５，Ｏ ３
０．８７ （ｂ）質量分析値： 陽イオンＦＡＢマススペクトル ｍ／ｚ ５０５（Ｍ＋
Ｋ）⁺ 陰イオンＦＡＢマススペクトル ｍ／ｚ ４６５（Ｍ−
Ｈ）^- （ｃ）分子量：４６６ （ｄ）融点：９５〜９８℃ （ｅ）比旋光度：［α］_D ²⁷：＋１．６°（ｃ＝０．５
６、クロロホルム） （ｆ）紫外線吸収スペクトル： λ_Max ３３８ｎｍ（ε＝ ７７００） ２７２ｎｍ（ε＝１５７００） ２５２ｎｍ（ε＝１９６００） （メタノール溶液中で測定） （ｇ）赤外線吸収スペクトル：ＫＢｒ錠中で測定した結
果を図１に示す。 （ｈ）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル：重クロロホルム中、４
００ＭＨｚで測定した結果を図２に示す。 （ｉ）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル：重クロロホルム中、１
００ＭＨｚで測定した結果を図３に示す。 （ｊ）溶剤に対する溶解性：水に不溶。メタノール、ク
ロロホルム、アセトン、酢酸エチルに易溶。 （ｋ）呈色反応： 陽性：硫酸、ヨウ素、塩化第二鉄 陰性：ニンヒドリン （ｌ）塩基性、酸性、中性の区別：弱酸性

【００２０】

【発明の効果】本発明の化合物はＨＥＰ Ｇ２細胞（ヒ
ト肝癌細胞）に対してＬＤＬ取り込み促進活性を有する
ので、脂質低下剤として有用である。

【００２１】

【実施例】以下、実施例および試験例を挙げて本発明を
具体的に説明する。

【００２２】実施例 （１）１００ｍｌ当り、グルコース４ｇ、ポリペプトン
０．１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、コーンスティプリカー
０．０３ｇ、塩化ナトリウム０．０８ｇ、リン酸二カリ
ウム０．１８ｇからなるｐＨ６．８の無菌液体培地にス
トレプトミセスオリエンタレス ＴＡ−１８９株を接種
し、２８℃、６０時間振とう培養した。次に内容量２０
０ｌの培養槽を用いて種培地と同じ組成の無菌培地１２
０ｌに前記培養液１．２ｌを接種し、３０℃、６４時間
通気攪拌培養した。

【００２３】培養終了後、培養液１２０ｌを上清と菌体
に分離した後、菌体には５０ｌのアセトンを加え抽出
し、上清は３．６ｌのＨＰ−２０（商品名，三菱化成社
製）に吸着させた後、アセトン８ｌで溶出した。各々の
アセトン溶液を合わせ、アセトンを溜去後、残渣の半量
の酢酸エチルで２回抽出した。この酢酸エチル画分を無
水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧濃縮乾固し、褐色油状
物質２４．３ｇを得た。

【００２４】（２）（１）で得られた油状物質をクロロ
ホルム２０ｍｌに溶解し、シリカゲル［ワコーゲルＣ−
２００（商品名、和光純薬社製）］を充填したカラム
（容量０．５ｌ，溶媒：クロロホルム）に吸着させた。
クロロホルム０．５ｌで洗浄後、クロロホルム：メタノ
ール（９９：１）混合溶媒、および（９７：３）の混合
溶媒で溶出される区分を除いた。次いで、クロロホル
ム：メタノール（９５：５）の混合溶媒で溶出される区
分を、減圧濃縮乾固することにより３．６ｇの褐色油状
物質を得た。

【００２５】（３）（２）で得られた油状物質をｎ−ヘ
キサン：アセトン（９０：１０）で溶解しシリカゲルを
充填したカラム［容量０．２ｌ，溶媒：ｎ−ヘキサン：
アセトン（９０：１０）］に吸着させた。ｎ−ヘキサ
ン：アセトン（９０：１０）０．４ｌで洗浄後、ｎ−ヘ
キサン：アセトン（８０：２０）０．２ｌの混合溶媒で
溶出される区分を除いた。次いでｎ−ヘキサン：アセト
ン（７０：３０）０．２ｌの混合溶媒で溶出される区分
を減圧濃縮乾固することにより０．６５ｇの褐色油状物
質を得た。

【００２６】（４）（３）で得られた油状物質０．６５
ｇをクロロホルム：ｎ−ヘキサン：メタノール（５：
５：１）で調製したセファデックスＬＨ−２０（商品
名，ファルマシア社製）を充填した３００ｍｌのカラム
に吸着させ、前記混合溶媒にてゲル濾過を行った。１フ
ラクション１ｇづつ分画し、ＬＤＬ取り込み促進活性を
有する画分を集めて減圧濃縮乾固し、粗粉末１３０ｍｇ
を得た。

【００２７】（５）（４）で得られた粗粉末１３０ｍｇ
をアセトニトリル１ｍｌに溶解した。この溶液を５５％
アセトニトリルを移動相とした分取高速液体カラムクロ
マトグラフィー［使用装置：センシュー科学社製ＳＳＣ
−３１００，カラム：ＯＤＳ−５２５１−Ｎ，（２０φ
×２５０ｍｍ）］を用い、ＵＶ吸収２１５ｎｍでモニタ
ーし、流速１０ｍｌ／ｍｉｎの条件で保持時間３０〜３
２分の画分を分取した。分取した画分を減圧濃縮し、ア
セトニトリルを除去した後、半量の酢酸エチルで２回抽
出した。この酢酸エチル抽出区分を合わせ無水硫酸ナト
リウムで脱水後、減圧濃縮乾固してＭＣ−０９３の白色
粉末４４ｍｇを得た。

【００２８】試験例［ＨｅＰ Ｇ２を用いたＬＤＬ取り
込み促進作用］ （検体）実施例で得られたＭＣ−０９３ １ｍｇをエタ
ノールに溶解し、目的濃度となるように調製したものを
用いた。

【００２９】（試験細胞） Ｈｅｐ Ｇ２ ヒト肝癌細胞 （使用した培地） ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）

【００３０】（試験方法）前記培養液を用いて、Ｈｅｐ
Ｇ２細胞を４×１０⁵／ｍｌの濃度に調製した培養液
を、直径２０ｍｍの２４穴プレート（コーニング社製）
に０．５ｍｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス培養器
内で４８時間培養した。次いで目的濃度にあらかじめ希
釈した検体１０μｌを加えた、１０％ＬＰＤＳ（国際バ
イオ社）を含むＤＭＥＭ０．３ｍｌで培地交換し、さら
に２４時間培養した。１μｇのＤｉＩ−ＬＤＬ（フナコ
シ薬品）を添加して４時間培養したのち培地を除去し、
２ｍＭ ＳＤＳ溶液０．４ｍｌで細胞を溶解した。細胞
溶解液の０．３ｍｌを精製水で２倍に希釈して蛍光光度
計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＲＦ−５０００）で蛍光強度を
測定し、残る０．１ｍｌをＬｏｗｒｙ法にて蛋白定量に
供した。取り込まれたＤｉＩ−ＬＤＬ量は蛍光強度から
検量線にて算出し、コントロールに対する単位蛋白量あ
たりの比活性を取り込み促進活性として表した。

【００３１】（結果）結果を表２に示した。

【００３２】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】臭化カリウム錠中で測定したＭＣ−０９３の赤
外線吸収スペクトルを示す。

【図２】重クロロホルム中、４００ＭＨｚで測定したＭ
Ｃ−０９３の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。

【図３】重クロロホルム中、１００ＭＨｚで測定したＭ
Ｃ−０９３の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 小林 明央 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内 (72)発明者 花田 和紀 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式 で表されるベンズアルデヒド系化合物。