WO1994012458A1 - Saintopin derivative - Google Patents

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WO1994012458A1
WO1994012458A1 PCT/JP1993/001680 JP9301680W WO9412458A1 WO 1994012458 A1 WO1994012458 A1 WO 1994012458A1 JP 9301680 W JP9301680 W JP 9301680W WO 9412458 A1 WO9412458 A1 WO 9412458A1
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culture
medium
methanol
liter
strain
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PCT/JP1993/001680
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French (fr)
Inventor
Hirofumi Nakano
Noboru Fujii
Yoshinori Yamashita
Yutaka Saitoh
Tsutomu Agatsuma
Katsuhiko Ando
Yasushi Nishiie
Katsunori Kita
Naoki Morishima
Katsushige Gomi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C305/00—Esters of sulfuric acids
    • C07C305/26—Halogenosulfates, i.e. monoesters of halogenosulfuric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C305/00—Esters of sulfuric acids
    • C07C305/22—Esters of sulfuric acids having oxygen atoms of sulfate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C50/00—Quinones
    • C07C50/38—Quinones containing —CHO or non—quinoid keto groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P29/00—Preparation of compounds containing a naphthacene ring system, e.g. tetracycline

Definitions

  • the present invention relates to a Saintpin derivative having antibacterial and antitumor effects and useful as an antibacterial and antitumor agent.
  • the present invention provides a compound of the formula (I)
  • R 1 represents hydrogen
  • R 2 represents S ⁇ 2 ⁇ H (hereinafter, referred to as UCE 102 2)
  • IT represents hydrogen (hereinafter, Saintpin E )
  • These compounds can be obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Vecilomyces.
  • Table 1 shows the minimum inhibitory concentrations (MIC) for various bacteria.
  • the antibacterial activity is a medium consisting of bactotryptone (Difco) 3 g / 1, meat extract 3 g / 1, yeast extract 1 g / l, glucose 1 g / l, agar agar 16 g / 1 (pH 7). Was measured by the agar dilution method.
  • Table 1 Name of test bacteria M I C ( ⁇ g / ml)
  • medium A 10% fetal calf serum, the medium consisting 2mM glutamine and MEM medium (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) (hereinafter referred to as medium A) to the He L a S 3 cells prepared in three Zml with (ATCC HTB22) 0. lml by Dispensed into each hole of a 96-well microtiter plate. After culturing the plate in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 hours, 0.1 ml of the test compound appropriately diluted with Medium A is added thereto, and the plate is incubated at 37 ° C in a carbon dioxide incubator for 72 hours. Cultured.
  • 0.1 ml of Balb3T3 / H-ras cells prepared at 2 ⁇ 10 4 cells / ml in F10 medium (manufactured by GIBC0, hereinafter referred to as medium B) consisting of 10% fetal bovine serum, 100 Unit / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin Each was dispensed into each well of a 96-well microtiter plate. After the plate was cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 hours, 0.05 ml of a test compound appropriately diluted with medium B was added thereto, and the plate was cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 72 hours.
  • the concentration of the test compound that inhibits cell proliferation by 50% (IC r ,.) was calculated. Table 3 shows the results.
  • UCE1022 in compound (I) belongs to the genus Vejiromyces, and a microorganism capable of producing UCE1022 is cultured in a culture medium to produce and accumulate UCE1022 in the culture. It can be obtained by collecting UCE1022 from the culture.
  • UCE 102-producing strain As a UCE 102-producing strain, it belongs to the genus Zylomyces and UCE 102 Any strain can be used as long as it has a productivity. Mutants obtained by mutating these strains by an artificial mutation method, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, treatment with a mutagenic agent, etc., or naturally mutated mutants also have the ability to produce UCE1022. Any of these can be used in the present invention.
  • a representative strain is the UOE102 strain isolated from the soil by the present inventors.
  • the mycological properties of UOE1022 are as follows.
  • the optimal growth temperature of this bacterium is 11-34 ° C, and it grows best around 23 ° C. It can grow at a pH of 3 to 10.5, and grows best around pH 6.
  • the following shows the results of observation of this bacterium with an optical microscope when cultured at 25 ° C using malt extract agar medium.
  • Hyphae have partitions and are smooth and well-branched.
  • the conidiophores rise from the mycelium, are colorless and smooth, and branch on the upper part in a ring-like or irregular manner.
  • Two to four phialides are formed at the tip of each branch. In some cases, 1 to 4 phyllides may be formed directly at the tip of the conidiophore.
  • the phiaride is colorless, smooth, with a long neck with a narrow neck.
  • the length of the phialid is 7-12 mm, the width is 2-3 mm near the base of the phialid, the tip is narrow and about 0.5 mm wide.
  • the ontogeny of conidia is endogenous budding.
  • the oral conidium is unicellular, spindle-shaped or lemon-shaped, colorless, smooth, 3-4.5 strokes in length, 1.5-2.5 mm in width. You. Conidia are formed in a chain longer than the tip of the phiaid. In this strain, only the anamorph described above is observed, and no teleomorph is observed.
  • the taxonomic position of the fungus was determined by The Genera of Fungi Sporulating in Pure Cul , 2nd ed. Cramer, Vaduz, JA von Arx, 1974), it was found that this strain belongs to the genus Paecilomyces, a filamentous incomplete fungus.
  • Saint-pin E belongs to the genus Peridiomyces, and a microorganism having the ability to produce Saint-Pin E is cultured in a medium, and Saint-Pin E is produced and accumulated in the culture, and Saint-Pin is collected from the culture. Can be obtained by
  • any strain can be used as long as it belongs to the genus Veiromyces and has a Stintvin E producing ability.
  • these strains are mutated by an artificial mutation method, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, treatment with a mutagenic agent, etc. It can be used for the invention.
  • a representative strain is SPC-13780 strain.
  • strain has been deposited as FERM BP-2256 under the Budapest Treaty with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (Faculty of Industrial Science and Technology, FERM BP-2256) (Original deposit date: January 24, 2001) ).
  • the medium may be a synthetic medium, if the medium contains assimilable carbon sources, nitrogen sources, inorganic and necessary growth and production promoting substances. Any natural medium can be used.
  • carbon source glucose, starch, dextrin, mannose, fructose, sucrose, lactose, xylose, arabinose, mannitol, molasses and the like are used alone or in combination. Furthermore, depending on the assimilation ability of the bacteria, hydrocarbons, alcohols, organic acids, and the like are also used.
  • nitrogen source ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn 'Steep' liquor, soybean powder, casamino acid, etc. are used alone or in combination.
  • inorganic salts such as salt, potassium chloride, magnesium sulfate, magnesium phosphate, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, ferrous sulfate, calcium chloride, manganese sulfate, zinc sulfate, copper sulfate, etc.
  • a trace component that promotes the growth of the used bacteria and the production of the centpin derivative can be added.
  • a liquid culture method particularly a submerged stirring culture method, is suitable.
  • the cultivation is carried out at a temperature of 16 to 37 ° C, preferably 25 to 32 ° C, H4 to 10, preferably pH 6 to 8.
  • the target substance is produced and accumulated in the culture by culturing for 1 to 7 days.
  • Ammonia water or ammonium carbonate solution is used for adjusting the pH of the medium. Stop the culture when the production in the culture reaches the maximum.
  • Isolation and purification of the target substance from the culture are performed according to a method commonly used for isolating and purifying a microbial metabolite from the culture.
  • the culture is separated into a culture filtrate and cells by filtration, and the cells are extracted with methanol, acetone, or the like.
  • the extract and the culture filtrate are combined and passed through a polystyrene-based adsorbent, for example, Diaion HP 20 (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), to adsorb the active ingredient, and then to ethyl acetate, acetone or the like. Elute.
  • the eluate is concentrated, and the target substance is obtained by column chromatography on silica gel, high-performance liquid chromatography, or the like.
  • the trend of the target substance during the culturing and purification operations can be tracked using the ultraviolet absorption of the target substance as a guide.
  • Vegillomyces' SP UOE1022 strain (FERM BP-4066) was used as the inoculum.
  • the strain was inoculated into 300 ml of a seed medium (the following composition) in an Erlenmeyer flask having a capacity of 2 Liters, and cultured with shaking at 25 for 48 hours.
  • Seed medium composition in 1 liter: Peptone (Farto Pharmaceutical Co., Ltd.) 5 g, Dried yeast Ebios 5 g, Glucose 10 g, V8 vegetable juice (Nippon Kyambell Co., Ltd.) 200 m and Mgn (P0,) 2 -8H 2 0 0.5 g (Before sterilization ⁇ 6.0)
  • the obtained seed culture solution was transferred at a ratio of 5% (volume) to a fermentation medium 18 Liter having the following composition in a 3 OLiter-capacity jar arm mentor, and aerated and stirred at 25 ° C (rotation speed 300 rpm, aerated).
  • the culture was carried out according to the following method.
  • Fermentation medium composition (in 1 Liter):. Soluble Starch 5 0 g, cone 'steep Li car (Nippon Food Processing) 3 0 g, KH 2 P0 4 0. 5 g, MgSO ⁇ 7H 2 0 0. 5 g ,
  • the culture was performed for 144 hours without any special control of the pH of the medium.
  • the fermentation broth 7.5 Liter was filtered, the methanol fraction was added with methanol 1 OLiter, and the mixture was stirred to extract UCE 102.
  • Water 3 OLiter was added to the methanol extract, and the active substance was adsorbed by passing through a non-ionic porous resin Diaion HP 20 (manufactured by Mitsubishi Kasei) of 0.5 Liter. After eluting the impurities with methanol: water (30:70, V / V), the active substance was eluted with methanol: water (50:50, OL5 Liter. Concentrate the eluted active fraction.
  • Giromyces sp. SPC-13780 strain (FERM BP-2256) was used as the inoculum Was. The strain was inoculated into 30 Oml of a seed medium (the following composition) in a 2-liter Erlenmeyer flask, and cultured at 30 ° C for 48 hours with shaking (200 rpm).
  • Seed medium composition (in 1 Liter): peptone 5 g, dry yeast Ebiosu 5 g, Darko one scan 1 0 g, V 8 vegetable juice 2 0 Oml, Mg ⁇ 0 4) 2 ⁇ 8 ⁇ 2 0 0. 5 g ( before sterilization ⁇ ⁇ 6.0) Transfer the obtained seed culture at a ratio of 5 Ler 5% (volume) of fermentation medium of the following composition in a 30 Liter volume jar fermenter, and agitate at 30 ° C (rotation). The culture was carried out using a method of several 400 rpm, aeration rate of 15 Liters / min).
  • Fermentation medium composition (in 1 Liter): glycerol 3 5 g, glucose 3 5 g, dry yeast 1 5 g, KH 2 P0 4 0.5g, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0.5g, Mg 3 (P0 4) 2 ⁇ 8H 20 0.5g (pH 7.0 before sterilization, adjusted with NaOH)
  • the culture was performed for 80 hours without any special control of the pH of the medium.
  • acetone 5 Liter was added to the obtained cells and stirred.
  • the cells and the precipitate were separated by filtration to obtain a filtrate 5 Liter.
  • To the filtrate were added 15 Liter of ethyl acetate and 0.5 Liter of ammonia, and after stirring, the mixture was passed through a silica gel column 2 Liter to adsorb the active substance.
  • the active substance was eluted by developing with an acetone: ethyl acetate: ammonia (1: 1, 0.05 v / v) solution.
  • the active fraction was concentrated, diluted with lOmM phosphate buffer (pH 8.0), and passed through a column of a polystyrene-based adsorption resin Diaion HP20 (Mitsubishi Kasei; 400 ml) to adsorb the active substance.
  • the impurities were eluted with 10% phosphate buffer (pH 8.0) and 40% methanol containing the same concentration of buffer, and then the active substance was eluted with 60% methanol.
  • the active fraction was concentrated, diluted with 10 mM phosphate buffer (pH 8.0), and subjected to column chromatography using a polystyrene-based adsorption resin Diaion HP20SS (Mitsubishi Kasei; 200 ml).

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Description

導 䜓
技 術 分 野
本発明は、 抗菌および抗腫瘍䜜甚を有し、 抗菌および抗腫瘍剀ずしお有甚なセ ィントピン誘導䜓に関する。
背 景 技 術
アンスラキノ ン骚栌を持セ぀抗生物質ずしお、 アンスラサむクリ ンなどいく぀か の化合物が報告されおいる 〔ィ Ÿシヌア䞀ルシヌ ハンドブック ォブ アンタむバ ィォチック コンパりンズ CRC Handbook of Antibiotic Compounds), 3 , 61(1981)〕 o
现ピ
たた、 匏 A) ン
Figure imgf000003_0001
で衚され、 抗腫瘍䜜甚を有する UCT 1 0 0 3 (セィントピン が知られおいる 〔バむオケミストリヌ (Biochemistry), 30, 5838-5845(1991) 特開平 2- 200655 号公報〕 。
発 明 の 開 瀺
本発明は、 匏  I )
(I)
Figure imgf000003_0002
〔匏䞭、 R1 が氎玠を衚すずき R2 は S〇2〇Hを衚し 以䞋、 UCE 1 0 2 2 ずいう 、 R1 がァセチルを衚すずき IT は氎玠を衚す 以䞋、 セむントピン E ずいう 〕 で衚され、 抗菌および抗腫瘍䜜甚を有するセむン トピン誘導䜓に関す る。
これらの化合物は、 ベゞロマむセス属に属する埮生物を培逊するこずによっお 埗られる。
以䞋に、 本発明を詳现に説明する。
U C E 1 0 2 2の物理化孊的性質を以䞋に瀺す。
(1) 分子量 418
(2) 分子匏 C ^H O S
(3) 質量分析セカンダリヌむオンマススペク トル ネガティブモヌド マトリ ックス  m—ニトロべンゞルアルコヌル   m/z 417(M-H)
高分解胜 FABマススペク トル ネガティブモヌド マトリ ックス  m—二トロ ベンゞルアルコヌル  m/z
枬定倀 416.9919
蚈算倀 416.9917 (C
Figure imgf000004_0001
Sずしお
(4) 玫倖線吞収スペク トル メタノヌル䞭で枬定 imax è…Š ε)  241 (22,000) 274 (27, 500), 306 (16,100) 339 (9,800) 483 (12, 300)
(5) 赀倖線吞収スぺク トル KBr 法  max cm '  3360 3210, 1625, 1600 1400 1330, 1265, 1235 1045
(6) I :'C- NMRスぺク トル 125 MHzメタノヌル -d,溶液  5 ppm  108.3 109.2 109.3 111.4 111.6, 114.8 116.3, 121.9 130.0 137.5 141.2, 154.3, 161.9 166.4 166.5 166.6 183.4 190.8
(7VH- NMRスぺク トル 500 MHzメタノヌル- 溶液  S ppm  6.57C1H, d) 7.09(1H, d), 7.2K1H, d), 7.4K1H, d), 7.96(1H, s)
(8) 溶解性氎、 メタノヌルおよび゚タノヌルに可溶、 n—ぞキサンには難溶 (UCT 1 0 0 3は氎に難溶
(9) 呈色反応 ペり玠、 硫酞セリりム䞀硫酞による各呈色に陜性 (10)物質の色、 圢状赀玫色粉末
(11)薄局クロマトグラフィヌ シリカゲル薄局 HPTLC プレヌト Art. 5715, メ ルク瀟補 n—ぞキサン酢酞ェチル メタノ䞀ル酢酞 6:4:1:1 v/v) の 展開溶媒で Rf倀は 0.25 (展開埌 UCE 1 0 2 2のスポッ トは、 可芖郚および玫倖 郚吞収により怜出できる
セむントピン Eの理化孊的性質を以䞋に瀺す。
(1) 分子量 380
(2) 分子匏 C^H^Oa
(3) 質量分析高分解胜 FABマススぺク トル マトリックス m—二トロべンゞ ルアルコヌル  m/z
枬定倀 381.3223 (M+H) '
蚈算倀 381.3214 (C2。Hl 308ずしお
(4) 玫倖線吞収スぺク トルメタノヌル䞭で枬定 λπ^χ nm (ε) 290(17, 100), 338(8,100) 566(7, 300)
(5) 赀倖線吞収スぺク トル KBr法  リ max cm '  3431 3230 1622 1564, 1437 1387, 1269 1163
(6) 'Η- NMRスぺク トル (500 MHz, DMS0-d« 溶液  ÎŽ ppm 14.10(1H, br. s) 13.43(1H, br. s), 10.76(1H, br. s), 7.46(lHs) 7.04(1H d, 2. lHz) 6.53C1H, d 2.1Hz), 6.34(lHs) 2.66(3H, s)
(7) 溶解性 ゞメチルスルホキシド DMS0) 、 メタノヌルおよびアセトンに易溶、 クロ口ホルムおよび酢酞ェチルに可溶、 氎および n-ぞキサンには難溶
(8) 物質の色、 圢状青玫色粉末
(9) 薄局クロマトグラフィヌ シリカゲル薄局HPTLCプレヌト Art.5715 メルク 瀟補 n—ぞキサン酢酞ェチル メタノヌル酢酞 6:4:1:1 v/v)の展開溶 媒で Rf倀は 0. 5 0
(10) 高速液䜓クロマトグラフィ䞀保持時間 8. 5 6分 カラム YMC AM312 0DC, ワむ ェム シ䞀瀟補流速 lmlZ分移動盞 5 m酢酞アンモニゥム を含む 7 0 %メタノヌル溶液 次に、 化合物 I ) の生物孊的掻性に぀いお説明する。
詊隓䟋 1 抗菌䜜甚
各皮现菌に察する最小生育阻止濃床 M I C) を第 1衚に瀺す。 抗菌掻性はバ ク トトリプトン ディフコ瀟補 3 g/1, 肉゚キス 3 g/1, 酵母゚キス 1 g/l グルコヌス 1 g/l 寒倩 16 g/1 の組成からなる培地 pH 7) を甚いお寒倩垌釈 法で枬定した。 第 1 è¡š  詊隓菌名 M I C(^g/ml)
(UC E 1 0 2 2 ) スタフむロコッカス ァゥレりス 0.52
(Staphylococcus aureus ATCC6538P)
ェンテロコッカス フヱシゥム 0.52
(Enterococcus faecium ATCC10541)
詊隓䟋 2 He L a S 3现胞に察する抗腫瘍䜜甚
10%牛胎児血枅、 2mMグルタミンおよび MEM培地 日本補薬瀟補 からなる 培地 以䞋、 培地 Aず称す で 3 個 Zmlに調補した He L a S3现胞 (ATCC HTB22)を 0. lml ず぀ 9 6穎マむクロタむタ䞀プレヌ卜の各穎に分泚した。 該プレ ヌトを炭酞ガスむンキュベヌタ内で 37°C、 20時間培逊埌、 これに培地 Aにより適 宜垌釈した詊隓化合物を 0.1mlず぀加え、 炭酞ガスィンキュベヌタ䞀内で 37°C、 72時間培逊した。 培逊䞊枅を陀去埌、 残枣に培地 Aおよび 0.02% ニュヌトラルレ ッドからなる培地を 0.1 mlず぀加え、 37°Cで 1時間炭酞ガスィンキュベヌタ内で 培逊し、 现胞を染色した。 培逊䞊枅を陀去埌、 残枣を生理食塩氎で 1回掗浄した 次いで 0.001Nå¡©é…ž Z30%゚タノヌルで色玠を抜出し、 マむクロプレヌトリヌダヌ により 550nmの吞光床を枬定した。 無凊理现胞ず既知濃床の詊隓化合物で凊理し た现胞の吞光床を比范するこずにより、 现胞の増殖を 50%阻害する詊隓化合物濃 床1 „)を算出した。 結果を第 2衚に瀺す。 第 2 è¡š 化合物
UCE 1 0 2 2 6. 1
詊隓䟋 3 Balb3T3/H-ras 现胞に察する生育阻害
10%牛胎児血枅、 100 Unit/ml ペニシリンおよび 100mg/mlストレプトマむシン からなる F10培地 GIBC0瀟補、 以䞋、 培地 Bず称す で 2X104個/ ml に調補 した Balb3T3/H- ras 现胞を 0.1 mlず぀ 96穎マむクロタむタヌプレヌトの各穎に分 泚した。 該プレヌトを炭酞ガスむンキュベヌタ内で 37 °C、 20時間培逊埌、 これ に培地 Bにより適宜垌釈した詊隓化合物を 0.05 mlず぀加え、 炭酞ガスむンキュ ベヌタ䞀内で 37°C、 72時間培逊した。 以䞋、 詊隓䟋 2の方法に準じお、 现胞の増 殖を 50%阻害する詊隓化合物濃床 ICr,。 を算出した。 その結果を第 3.衚に瀺す c
3 Ÿ 化合物 セむントピン E 2.4
次に、 化合物 I ) の補造法に぀いお説明する。
化合物I)䞭の UCE 1 0 2 2は、 ベゞロマむセス属に属し、 UCE 1 0 2 2 を生産する胜力を有する埮生物を培地に培逊し、 培逊物䞭に UCE 1 0 2 2を生 成蓄積させ、 該培逊物から UCE 1 0 22を採取するこずによっお埗るこずがで きる。
UC E 1 0 2 2生産菌株ずしおは、 ぺゞロマむセス属に属し、 UCE 1 0 2 2 生産胜を有する菌株であればいずれの菌株でも甚いるこずができる。 たた、 これ らの菌株を人工的倉異法、 䟋えば玫倖線照射、 X線照射、 倉異誘起剀凊理などに よっお倉異させた倉異株あるいは自然的に倉異した倉異株でも U C E 1 0 2 2生 産胜を有するものであれば本発明に甚いるこずができる。 代衚的菌株ずしお、 本 発明者らが土壌から分離した U O E 1 0 2 2株があげられる。
U O E 1 0 2 2株の菌孊的性質は次のずおりである。
1. 肉県的芳察
麊芜゚キス寒倩培地を甚いお 25°Cで培逊をしたずき、 集萜の盎埄は培逊 7曰目 で玄 28 讓に達する。 集萜衚面は綿毛状で、 癜色を呈する。 集萜裏面の䞭倮郚は 燈色を呈し、 呚囲は淡黄色を呈する。 培地に、 淡黄色の可溶性色玠の溶出が認め られる。
バレむショ ブドり糖寒倩培地を甚いお 25°Cで培逊したずき、 集萜の盎埄は培 逊 7日目で 26〜27 mm に達する。 集萜衚面は綿毛状で、 その衚面の䞭倮郚はラ ィラック色あるいは玫色を呈し、 呚囲は癜色から灰色を呈する。 集萜の裏面はレ モン色を呈する。 培地䞭に、 淡黄色の可溶性色玠の溶出が認められる。
本菌の至適生育枩床は、 11〜34°Cで、 23°C付近で最も良奜に生育する。 生育し うる pH は 3〜10. 5 で、 pH 6前埌で最も良奜に生育する。
2. 光孊顕埮鏡的芳察
麊芜゚キス寒倩培地を甚いお 25°Cで培逊したずきの、 本菌の光孊顕埮鏡による 芳察結果は、 以䞋のずおりである。
菌糞は、 隔壁を有し、 平滑でよく分岐する。 分生子柄は、 菌糞から立ち䞊がり、 無色、 平滑で、 その䞊郚で茪生状あるいは䞍芏則に分岐する。 各々の分枝先端に は、 フィアラむドを 2〜4個圢成する。 たた、 盎接、 分生子柄先端に 1〜4個の フィアラィドを圢成する堎合もある。 フィアラィ ドは、 無色、 平滑で、 銖が现く 長いフラスコ圢を呈する。 フィアラむ ドの長さは 7〜12 mmで、 幅はフィアラィ ド基郚近くにおいお 2〜3 mmであり、 先端は现く、 幅玄 0. 5 mmである。 分生 子の個䜓発生様匏は、 内生出芜型である。 フィァ口型分生子は、 単现胞、 玡錘圢 あるいはレモン圢を呈し、 無色、 平滑で、 長さ 3〜4. 5画、 幅 1. 5〜2. 5mmであ る。 分生子は、 フィアラィ ド先端より長く連鎖状に圢成される。 本菌株は、 䞊述 したアナモルフのみ芳察され、 テレオモルフは芳察されない。
以䞊の菌孊的性質から、 本菌の分類孊䞊の䜍眮を ザ · ã‚ž ネラ ·ォブ ·ファ ンゞャィ 'スポルレむティング ' むン ' ピュア 'カルチダ䞀 第 2版The Genera of Fungi Sporulat ing i n Pure Cul ture, 2nd ed. Cramer, Vaduz, J. A. von Arx, 1974幎 に埓っお怜玢した結果、 本菌株は、 糞状䞍完党菌類のベゞ口マむ セス (Paeci l omyces) 属に属するこずが明らかになった。
本発明者らは、 本菌株を" ベゞロマむセス ·゚スピヌ U O E 1 0 2 2
(Paeci lomyces sp. UOE 1022)" ず呜名し、 埮ェ研条寄第 4066号FERM BP - 4066) ずしお、 工業技術院埮生物工業技術研究所に平成 4幎 11月 5日付けで寄蚗した。 次に、 セむントピン Eの補造法に぀いお説明する。
セむントピン Eは、 ぺゞロマむセス属に属し、 セむントピン Eを生産する胜力 を有する埮生物を培地に培逊し、 培逊物䞭にセむントピン Eを生成蓄積させ、 該 培逊物からセむントピン Eを採取するこずによっお埗るこずができる。
セむントピン E生産菌株ずしおはベゞロマむセス属に属し、 セィントビン E生 産胜を有する菌株であればいずれの菌株でも甚いるこずができる。 たた、 これら の菌株を人工的倉異方法、 䟋えば玫倖線照射、 X線照射、 倉異誘起剀凊理などに よっお倉異させた倉異株あるいは自然的に倉異した倉異株でもセィントピン Eを 生産するものであれば本発明に甚いるこずができる。 代衚的菌株ずしお、 S P C - 13780株があげられる。
該菌株は、 ブダペスト条玄に基づき、 工業技術院埮生物工業技術研究所所に FERM BP- 2256ずしお寄蚗されおいる 原寄蚗日 平成 1幎 1月 2 4日特開平 2 — 200655号公報 。
次に、 U C E 1 0 2 2生産菌あるいはセィン卜ピン E生産菌の培逊法に぀いお 述べる。
本発明のセィントピン誘導䜓生産菌の培逊においおは、 通垞の糞状菌の培逊法 が䞀般に甚いられる。 培地ずしおは、 䜿甚菌株の資化可胜な炭玠源、 窒玠源、 無 機物および必芁な生育、 生産促進物質を皋よく含有する培地であれば、 合成培地、 倩然培地いずれでも䜿甚可胜である。
炭玠源ずしおは、 グルコヌス、 柱粉、 デキス トリ ン、 マンノヌス、 フラク ト䞀 ス、 シュクロヌス、 ラク トヌス、 キシロヌス、 ァラビノヌス、 マ二トヌル、 糖蜜 などが単独たたは組合せお甚いられる。 さらに、 菌の資化胜によっおは、 炭化氎 玠、 アルコヌル類、 有機酞なども甚いられる。 窒玠源ずしおは、 塩化アンモニゥ ム、 硝酞アンモニゥム、 硫酞アンモニゥム、 硝酞ナトリりム、 尿玠、 ペプトン、 肉゚キス、 酵母゚キス、 也燥酵母、 コヌン ' スチヌプ ' リカヌ、 倧豆粉、 カザミ ノ酞などが単独たたは組合せお甚いられる。 そのほか、 必芁に応じお、 食塩、 å¡© 化カリりム、 硫酞マグネシりム、 リン酞マグネシりム、 炭酞カルシりム、 リン酞 二氎玠カリりム、 硫酞第䞀鉄、 塩化カルシりム、 硫酞マンガン、 硫酞亜鉛、 ç¡«é…ž 銅などの無機塩類を加える。 さらに、 䜿甚菌の生育ゃセィン卜ピン誘導䜓の生産 を促進する埮量成分を添加するこずができる。
培逊法ずしおは、 液䜓培逊法、 特に深郚撹拌培逊法が適しおいる。 培逊は、 æž© 床 16〜37°C、 奜たしくは 25〜32°C、 H 4〜10、 奜たしくは pH 6〜8で行われる。 通垞、 1〜7日間の培逊により、 目的物質が培逊物䞭に生成蓄積される。 培地の pH調敎には、 アンモニア氎や炭酞アンモニゥム溶液などが甚いられる。 培逊物䞭 の生成量が最倧に達したずきに培逊を停止する。
培逊物からの目的物質の単離粟補は、 埮生物代謝生産物をその培逊物から単離 粟補するために垞甚される方法に埓っお行われる。 䟋えば培逊物を濟過により培 逊濟液ず菌䜓に分け、 菌䜓をメタノヌル、 アセトンなどで抜出する。 次いで、 抜 出液ず培逊濟液ずを䜵せお、 ポリスチレン系吞着剀、 䟋えばダむダむオン H P 20 (䞉菱化成瀟補 などに通塔しお掻性成分を吞着させ、 次いで酢酞ェチル、 ァセ トンなどで溶出する。 溶出液を濃瞮し、 シリカゲルによるカラムクロマトグラフ ィヌ、 高速液䜓クロマトグラフィヌなどにより、 目的物質を埗る。 なお、 培逊、 粟補操䜜䞭の目的物質の動向は、 目的物質の玫倖郚吞収を目安ずしお远跡するこ ずができる。
以䞋に、 本発明の実斜䟋を瀺す。 発明を実斜するための最良の圢態
実斜䟋 1.
皮菌ずしお、 ベゞロマむセス ' ゚スピヌ UOE 1 0 2 2æ ª FERM BP- 4066) を甚いた。 該菌株を 2Liter容量の䞉角フラスコ䞭の皮培地 䞋蚘の組成 300 m 1に怍菌し、 2 5でで 4 8時間振盪培逊した。
皮培地組成  1 Liter 䞭  ペプトン 極東補薬瀟補 5 g、 也燥酵母ェビォ ス 5 g、 グルコヌス 1 0 g、 V 8野菜ゞュヌス 日本キダンベル瀟補 200 mし Mgn(P0,)2 - 8H20 0. 5 g (殺菌前 ρΗ6· 0)
埗られた皮培逊液を 3 OLiter 容量のゞャヌフアヌメンタヌ䞭の䞋蚘組成の発 酵培地 1 8 Literに 5 % (容量 の割合で移し、 2 5 °Cで通気攪拌 回転数 300 rpm, 通気量 1 8い terZ分 方匏により培逊を行った。
発酵培地組成 1 Liter 䞭 可溶性デンプン 5 0 g、 コヌン 'スチヌプ · リ カヌ 日本食品加工補 3 0 g、 KH2P04 0. 5 g、 MgSO. · 7H20 0. 5 g、
Mg3(P04)2 · 8H20 0. 5 g、 殺菌前 pH7. 0、 NaOHで調敎
培逊䞭、 培地の pHは特に制埡しないで、 1 4 4時間培逊した。
培逊終了埌、 発酵培逊液 7. 5Liter を濟過し、 菌䜓画分にメタノヌル 1 OLiter を加えお攪拌し、 UCE 1 0 2 2を抜出した。 メタノヌル抜出液に氎 3 OLiter を加え、 0. 5 Liter の非むオン性倚孔性暹脂ダむダむオン H P 2 0 (䞉菱化成瀟 補 に通塔しお掻性物質を吞着させた。 メタノヌル氎 3 0  7 0、 V/V ) で 䞍玔物を溶出埌、 メタノヌル氎 5 0  5 0、 OL 5 Liter で掻性物質を溶 出させた。 溶出された掻性画分を濃瞮し、 シリカゲルカラムBW300、 富士デノィ ゜ン化孊瀟補 0. 5 Liter にかけ、 酢酞ェチルメタノヌル氎  3  2  1  v/v)で展開した。 溶出された掻性画分を濃瞮し、 シリカゲルカラム Lichroprep — Si60、 Art9390  メルク瀟補 1 2 5 mlに力、け、 ゚タノヌル氎  1 0 0  3
 v/v) で展開した。 溶出された掻性画分を濃瞮、 也燥するこずにより、 UCE 1 0 2 2の赀色粉末 2 Omgが埗られた。
実斜䟋 2.
皮菌ずしお、 ぺゞロマむセス ·゚スピヌ SPC- 13780æ ª FERM BP-2256) を甚い た。 該菌株を 2 Liter容量の䞉角フラスコ䞭の皮培地 䞋蚘の組成 3 0 Omlに 怍菌し、 3 0°Cで 4 8時間振盪 200rpm) 培逊した。
皮培地組成 1 Liter䞭 ペプトン 5 g、 也燥酵母ェビォス 5 g、 ダルコ䞀 ス 1 0 g、 V 8野菜ゞュヌス 2 0 Oml、 Mg Ρ04)2 · 8Η20 0. 5 g (殺菌前 ρΗ6.0) 埗られた皮培逊液を 3 0 Liter 容量ののゞャヌファヌメンタ䞀䞭の䞋蚘組成の 発酵培地 1 5 L er 5% (容量 の割合で移し、 30°Cで通気撹拌 回転数 400 rpm,通気量 15 Liter,分 方匏により培逊を行った。
発酵培地組成 1 Liter䞭  グリセロヌル 3 5 g、 グルコヌス 3 5 g、 也燥 酵母 1 5 g、 KH2P04 0.5g、 MgS04 · 7H20 0.5g、 Mg3(P04)2 · 8H20 0.5g (殺菌 前 pH7.0、 NaOHで調敎)
培逊䞭、 培地の pHは特に制埡しないで、 80時間培逊した。
培逊液を濟過埌、 埗られた菌䜓にアセトン 5 Literを添加し撹拌した。 菌䜓お よび沈殿物を濟別し、 濟液 5 Literを埗た。 濟液に酢酞ェチル 15 Literおよびァ ンモニァ 0.5 Literを加え撹拌埌、 シリカゲルカラム 2 Literに通塔しお掻性物 質を吞着させた。 アセトン酢酞ェチルアンモニア 1  1  0.05 v/v) 溶液 で展開し、 掻性物質を溶出した。 掻性画分を濃瞮埌、 lOmMリン酞緩衝液 pH 8.0) で垌釈し、 ポリスチレン系吞着暹脂ダむダむオン HP20 (䞉菱化成瀟補; 400ml) の カラムに通塔しお掻性物質を吞着させた。 10m リン酞緩衝液 pH8.0 ) および同 濃床の緩衝液を含む 40%メタノヌルで䞍玔物を溶出埌、 60%メタノ䞀ルで掻性物 質を溶出した。 掻性画分を濃瞮埌、 10mMリン酞緩衝液 pH 8.0) で垌釈し、 ポリ スチレン系吞着暹脂ダむダむオン HP20SS (䞉菱化成瀟補 200ml) によるカラムク 口マトグラフィヌを行った。 60%メタノヌル溶出液を濃瞮埌、 少量のメタノヌル アセトン混合溶液に溶解し、 ぞキサンを添加するこずにより、 掻性物質を沈殿 させた。 沈殿を濟別し、 也燥させるこずにより、 セむントピン Eの青玫色粉末 33 mgが埗られた。
産業䞊の利甚可胜性
本発明によれば、 抗菌および抗腫瘍䜜甚を有するセィントピン誘導䜓を提䟛す るこずができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 匏  I )
Figure imgf000013_0001
〔匏䞭、 R' が氎玠を衚すずき R2 は S02OHを衚し UCE 1 022 ) 、 R1 がァセチルを衚すずき R2 は Hを衚す セむントピン E)〕 で衚されるセィ トビン E誘導䜓。
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