WO1994012458A1 - Saintopin derivative - Google Patents

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WO1994012458A1
WO1994012458A1 PCT/JP1993/001680 JP9301680W WO9412458A1 WO 1994012458 A1 WO1994012458 A1 WO 1994012458A1 JP 9301680 W JP9301680 W JP 9301680W WO 9412458 A1 WO9412458 A1 WO 9412458A1
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culture
medium
methanol
liter
strain
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PCT/JP1993/001680
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French (fr)
Inventor
Hirofumi Nakano
Noboru Fujii
Yoshinori Yamashita
Yutaka Saitoh
Tsutomu Agatsuma
Katsuhiko Ando
Yasushi Nishiie
Katsunori Kita
Naoki Morishima
Katsushige Gomi
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C305/00—Esters of sulfuric acids
    • C07C305/26—Halogenosulfates, i.e. monoesters of halogenosulfuric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C305/00—Esters of sulfuric acids
    • C07C305/22—Esters of sulfuric acids having oxygen atoms of sulfate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C50/00—Quinones
    • C07C50/38—Quinones containing —CHO or non—quinoid keto groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P29/00—Preparation of compounds containing a naphthacene ring system, e.g. tetracycline

Definitions

  • the present invention relates to a Saintpin derivative having antibacterial and antitumor effects and useful as an antibacterial and antitumor agent.
  • the present invention provides a compound of the formula (I)
  • R 1 represents hydrogen
  • R 2 represents S ⁇ 2 ⁇ H (hereinafter, referred to as UCE 102 2)
  • IT represents hydrogen (hereinafter, Saintpin E )
  • These compounds can be obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Vecilomyces.
  • Table 1 shows the minimum inhibitory concentrations (MIC) for various bacteria.
  • the antibacterial activity is a medium consisting of bactotryptone (Difco) 3 g / 1, meat extract 3 g / 1, yeast extract 1 g / l, glucose 1 g / l, agar agar 16 g / 1 (pH 7). Was measured by the agar dilution method.
  • Table 1 Name of test bacteria M I C ( ⁇ g / ml)
  • medium A 10% fetal calf serum, the medium consisting 2mM glutamine and MEM medium (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) (hereinafter referred to as medium A) to the He L a S 3 cells prepared in three Zml with (ATCC HTB22) 0. lml by Dispensed into each hole of a 96-well microtiter plate. After culturing the plate in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 hours, 0.1 ml of the test compound appropriately diluted with Medium A is added thereto, and the plate is incubated at 37 ° C in a carbon dioxide incubator for 72 hours. Cultured.
  • 0.1 ml of Balb3T3 / H-ras cells prepared at 2 ⁇ 10 4 cells / ml in F10 medium (manufactured by GIBC0, hereinafter referred to as medium B) consisting of 10% fetal bovine serum, 100 Unit / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin Each was dispensed into each well of a 96-well microtiter plate. After the plate was cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 20 hours, 0.05 ml of a test compound appropriately diluted with medium B was added thereto, and the plate was cultured in a carbon dioxide incubator at 37 ° C for 72 hours.
  • the concentration of the test compound that inhibits cell proliferation by 50% (IC r ,.) was calculated. Table 3 shows the results.
  • UCE1022 in compound (I) belongs to the genus Vejiromyces, and a microorganism capable of producing UCE1022 is cultured in a culture medium to produce and accumulate UCE1022 in the culture. It can be obtained by collecting UCE1022 from the culture.
  • UCE 102-producing strain As a UCE 102-producing strain, it belongs to the genus Zylomyces and UCE 102 Any strain can be used as long as it has a productivity. Mutants obtained by mutating these strains by an artificial mutation method, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, treatment with a mutagenic agent, etc., or naturally mutated mutants also have the ability to produce UCE1022. Any of these can be used in the present invention.
  • a representative strain is the UOE102 strain isolated from the soil by the present inventors.
  • the mycological properties of UOE1022 are as follows.
  • the optimal growth temperature of this bacterium is 11-34 ° C, and it grows best around 23 ° C. It can grow at a pH of 3 to 10.5, and grows best around pH 6.
  • the following shows the results of observation of this bacterium with an optical microscope when cultured at 25 ° C using malt extract agar medium.
  • Hyphae have partitions and are smooth and well-branched.
  • the conidiophores rise from the mycelium, are colorless and smooth, and branch on the upper part in a ring-like or irregular manner.
  • Two to four phialides are formed at the tip of each branch. In some cases, 1 to 4 phyllides may be formed directly at the tip of the conidiophore.
  • the phiaride is colorless, smooth, with a long neck with a narrow neck.
  • the length of the phialid is 7-12 mm, the width is 2-3 mm near the base of the phialid, the tip is narrow and about 0.5 mm wide.
  • the ontogeny of conidia is endogenous budding.
  • the oral conidium is unicellular, spindle-shaped or lemon-shaped, colorless, smooth, 3-4.5 strokes in length, 1.5-2.5 mm in width. You. Conidia are formed in a chain longer than the tip of the phiaid. In this strain, only the anamorph described above is observed, and no teleomorph is observed.
  • the taxonomic position of the fungus was determined by The Genera of Fungi Sporulating in Pure Cul , 2nd ed. Cramer, Vaduz, JA von Arx, 1974), it was found that this strain belongs to the genus Paecilomyces, a filamentous incomplete fungus.
  • Saint-pin E belongs to the genus Peridiomyces, and a microorganism having the ability to produce Saint-Pin E is cultured in a medium, and Saint-Pin E is produced and accumulated in the culture, and Saint-Pin is collected from the culture. Can be obtained by
  • any strain can be used as long as it belongs to the genus Veiromyces and has a Stintvin E producing ability.
  • these strains are mutated by an artificial mutation method, for example, ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, treatment with a mutagenic agent, etc. It can be used for the invention.
  • a representative strain is SPC-13780 strain.
  • strain has been deposited as FERM BP-2256 under the Budapest Treaty with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (Faculty of Industrial Science and Technology, FERM BP-2256) (Original deposit date: January 24, 2001) ).
  • the medium may be a synthetic medium, if the medium contains assimilable carbon sources, nitrogen sources, inorganic and necessary growth and production promoting substances. Any natural medium can be used.
  • carbon source glucose, starch, dextrin, mannose, fructose, sucrose, lactose, xylose, arabinose, mannitol, molasses and the like are used alone or in combination. Furthermore, depending on the assimilation ability of the bacteria, hydrocarbons, alcohols, organic acids, and the like are also used.
  • nitrogen source ammonium chloride, ammonium nitrate, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea, peptone, meat extract, yeast extract, dried yeast, corn 'Steep' liquor, soybean powder, casamino acid, etc. are used alone or in combination.
  • inorganic salts such as salt, potassium chloride, magnesium sulfate, magnesium phosphate, calcium carbonate, potassium dihydrogen phosphate, ferrous sulfate, calcium chloride, manganese sulfate, zinc sulfate, copper sulfate, etc.
  • a trace component that promotes the growth of the used bacteria and the production of the centpin derivative can be added.
  • a liquid culture method particularly a submerged stirring culture method, is suitable.
  • the cultivation is carried out at a temperature of 16 to 37 ° C, preferably 25 to 32 ° C, H4 to 10, preferably pH 6 to 8.
  • the target substance is produced and accumulated in the culture by culturing for 1 to 7 days.
  • Ammonia water or ammonium carbonate solution is used for adjusting the pH of the medium. Stop the culture when the production in the culture reaches the maximum.
  • Isolation and purification of the target substance from the culture are performed according to a method commonly used for isolating and purifying a microbial metabolite from the culture.
  • the culture is separated into a culture filtrate and cells by filtration, and the cells are extracted with methanol, acetone, or the like.
  • the extract and the culture filtrate are combined and passed through a polystyrene-based adsorbent, for example, Diaion HP 20 (manufactured by Mitsubishi Kasei Co., Ltd.), to adsorb the active ingredient, and then to ethyl acetate, acetone or the like. Elute.
  • the eluate is concentrated, and the target substance is obtained by column chromatography on silica gel, high-performance liquid chromatography, or the like.
  • the trend of the target substance during the culturing and purification operations can be tracked using the ultraviolet absorption of the target substance as a guide.
  • Vegillomyces' SP UOE1022 strain (FERM BP-4066) was used as the inoculum.
  • the strain was inoculated into 300 ml of a seed medium (the following composition) in an Erlenmeyer flask having a capacity of 2 Liters, and cultured with shaking at 25 for 48 hours.
  • Seed medium composition in 1 liter: Peptone (Farto Pharmaceutical Co., Ltd.) 5 g, Dried yeast Ebios 5 g, Glucose 10 g, V8 vegetable juice (Nippon Kyambell Co., Ltd.) 200 m and Mgn (P0,) 2 -8H 2 0 0.5 g (Before sterilization ⁇ 6.0)
  • the obtained seed culture solution was transferred at a ratio of 5% (volume) to a fermentation medium 18 Liter having the following composition in a 3 OLiter-capacity jar arm mentor, and aerated and stirred at 25 ° C (rotation speed 300 rpm, aerated).
  • the culture was carried out according to the following method.
  • Fermentation medium composition (in 1 Liter):. Soluble Starch 5 0 g, cone 'steep Li car (Nippon Food Processing) 3 0 g, KH 2 P0 4 0. 5 g, MgSO ⁇ 7H 2 0 0. 5 g ,
  • the culture was performed for 144 hours without any special control of the pH of the medium.
  • the fermentation broth 7.5 Liter was filtered, the methanol fraction was added with methanol 1 OLiter, and the mixture was stirred to extract UCE 102.
  • Water 3 OLiter was added to the methanol extract, and the active substance was adsorbed by passing through a non-ionic porous resin Diaion HP 20 (manufactured by Mitsubishi Kasei) of 0.5 Liter. After eluting the impurities with methanol: water (30:70, V / V), the active substance was eluted with methanol: water (50:50, OL5 Liter. Concentrate the eluted active fraction.
  • Giromyces sp. SPC-13780 strain (FERM BP-2256) was used as the inoculum Was. The strain was inoculated into 30 Oml of a seed medium (the following composition) in a 2-liter Erlenmeyer flask, and cultured at 30 ° C for 48 hours with shaking (200 rpm).
  • Seed medium composition (in 1 Liter): peptone 5 g, dry yeast Ebiosu 5 g, Darko one scan 1 0 g, V 8 vegetable juice 2 0 Oml, Mg ⁇ 0 4) 2 ⁇ 8 ⁇ 2 0 0. 5 g ( before sterilization ⁇ ⁇ 6.0) Transfer the obtained seed culture at a ratio of 5 Ler 5% (volume) of fermentation medium of the following composition in a 30 Liter volume jar fermenter, and agitate at 30 ° C (rotation). The culture was carried out using a method of several 400 rpm, aeration rate of 15 Liters / min).
  • Fermentation medium composition (in 1 Liter): glycerol 3 5 g, glucose 3 5 g, dry yeast 1 5 g, KH 2 P0 4 0.5g, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0.5g, Mg 3 (P0 4) 2 ⁇ 8H 20 0.5g (pH 7.0 before sterilization, adjusted with NaOH)
  • the culture was performed for 80 hours without any special control of the pH of the medium.
  • acetone 5 Liter was added to the obtained cells and stirred.
  • the cells and the precipitate were separated by filtration to obtain a filtrate 5 Liter.
  • To the filtrate were added 15 Liter of ethyl acetate and 0.5 Liter of ammonia, and after stirring, the mixture was passed through a silica gel column 2 Liter to adsorb the active substance.
  • the active substance was eluted by developing with an acetone: ethyl acetate: ammonia (1: 1, 0.05 v / v) solution.
  • the active fraction was concentrated, diluted with lOmM phosphate buffer (pH 8.0), and passed through a column of a polystyrene-based adsorption resin Diaion HP20 (Mitsubishi Kasei; 400 ml) to adsorb the active substance.
  • the impurities were eluted with 10% phosphate buffer (pH 8.0) and 40% methanol containing the same concentration of buffer, and then the active substance was eluted with 60% methanol.
  • the active fraction was concentrated, diluted with 10 mM phosphate buffer (pH 8.0), and subjected to column chromatography using a polystyrene-based adsorption resin Diaion HP20SS (Mitsubishi Kasei; 200 ml).

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Description

導 体
技 術 分 野
本発明は、 抗菌および抗腫瘍作用を有し、 抗菌および抗腫瘍剤として有用なセ ィントピン誘導体に関する。
背 景 技 術
アンスラキノ ン骨格を持セつ抗生物質として、 アンスラサイクリ ンなどいくつか の化合物が報告されている 〔ィ ¾シーア一ルシー ハンドブック ォブ アンタイバ ィォチック コンパウンズ （CRC Handbook of Antibiotic Compounds), 3 , 61(1981)〕 o
細ピ
また、 式 （A) ン
Figure imgf000003_0001
で表され、 抗腫瘍作用を有する UCT 1 0 0 3 (セィントピン） が知られている 〔バイオケミストリー (Biochemistry), 30, 5838-5845(1991) ；特開平 2- 200655 号公報〕 。
発 明 の 開 示
本発明は、 式 （ I )
(I)
Figure imgf000003_0002
〔式中、 R1 が水素を表すとき R2 は S〇2〇Hを表し （以下、 UCE 1 0 2 2 という） 、 R1 がァセチルを表すとき IT は水素を表す （以下、 セイントピン E という） 〕 で表され、 抗菌および抗腫瘍作用を有するセイン トピン誘導体に関す る。
これらの化合物は、 ベジロマイセス属に属する微生物を培養することによって 得られる。
以下に、 本発明を詳細に説明する。
U C E 1 0 2 2の物理化学的性質を以下に示す。
(1) 分子量： 418
(2) 分子式： C ^H O S
(3) 質量分析：セカンダリーイオンマススペク トル ネガティブモード （マトリ ックス ： m—ニトロべンジルアルコール ） ： m/z； 417(M-H)
高分解能 FABマススペク トル ネガティブモード （マトリ ックス ： m—二トロ ベンジルアルコール） ： m/z
測定値： 416.9919
計算値： 416.9917 (C
Figure imgf000004_0001
Sとして）
(4) 紫外線吸収スペク トル： （メタノール中で測定） ；imax 腦 （ε) ； 241 (22,000)， 274 (27, 500), 306 (16,100)， 339 (9,800)， 483 (12, 300)
(5) 赤外線吸収スぺク トル （KBr 法） ： max cm ' ； 3360， 3210, 1625, 1600， 1400， 1330, 1265, 1235， 1045
(6) I :'C- NMRスぺク トル （125 MHz，メタノール -d,溶液） ： 5 ppm ； 108.3， 109.2， 109.3， 111.4， 111.6, 114.8， 116.3, 121.9， 130.0， 137.5， 141.2, 154.3, 161.9， 166.4， 166.5， 166.6， 183.4， 190.8
(7VH- NMRスぺク トル （500 MHz，メタノール- 溶液） ： S ppm ； 6.57C1H, d) 7.09(1H, d), 7.2K1H, d), 7.4K1H, d), 7.96(1H, s)
(8) 溶解性：水、 メタノールおよびエタノールに可溶、 n—へキサンには難溶 (UCT 1 0 0 3は水に難溶）
(9) 呈色反応： ヨウ素、 硫酸セリウム一硫酸による各呈色に陽性 (10)物質の色、 形状：赤紫色粉末
(11)薄層クロマトグラフィー： シリカゲル薄層 （HPTLC プレート Art. 5715, メ ルク社製） n—へキサン：酢酸ェチル： メタノ一ル：酢酸 （6:4:1:1 v/v) の 展開溶媒で Rf値は 0.25 (展開後 UCE 1 0 2 2のスポッ トは、 可視部および紫外 部吸収により検出できる）
セイントピン Eの理化学的性質を以下に示す。
(1) 分子量： 380
(2) 分子式： C^H^Oa
(3) 質量分析：高分解能 FABマススぺク トル （マトリックス： m—二トロべンジ ルアルコール） ： m/z
測定値： 381.3223 (M+H) '
計算値： 381.3214 (C2。Hl 308として）
(4) 紫外線吸収スぺク トル（メタノール中で測定）： λπ^χ nm (ε)； 290(17, 100), 338(8,100)， 566(7, 300)
(5) 赤外線吸収スぺク トル （KBr法） ： リ max cm ' ； 3431， 3230， 1622， 1564, 1437， 1387, 1269， 1163
(6) 'Η- NMRスぺク トル (500 MHz, DMS0-d« 溶液） ： δ ppm； 14.10(1H, br. s)， 13.43(1H, br. s), 10.76(1H, br. s), 7.46(lH，s)， 7.04(1H， d, 2. lHz)， 6.53C1H, d， 2.1Hz), 6.34(lH，s)， 2.66(3H, s)
(7) 溶解性： ジメチルスルホキシド （DMS0) 、 メタノールおよびアセトンに易溶、 クロ口ホルムおよび酢酸ェチルに可溶、 水および n-へキサンには難溶
(8) 物質の色、 形状：青紫色粉末
(9) 薄層クロマトグラフィー： シリカゲル薄層（HPTLCプレート Art.5715， メルク 社製） n—へキサン：酢酸ェチル： メタノール：酢酸 （6:4:1:1 v/v)の展開溶 媒で Rf値は 0. 5 0
(10) 高速液体クロマトグラフィ一：保持時間； 8. 5 6分 （カラム； YMC AM312 0DC, ワイ ェム シ一社製：流速； lmlZ分：移動相； 5 m酢酸アンモニゥム を含む 7 0 %メタノール溶液） 次に、 化合物 （I ) の生物学的活性について説明する。
試験例 1 抗菌作用
各種細菌に対する最小生育阻止濃度 （M I C) を第 1表に示す。 抗菌活性はバ ク トトリプトン （ディフコ社製） 3 g/1, 肉エキス 3 g/1, 酵母エキス 1 g/l， グルコース 1 g/l， 寒天 16 g/1 の組成からなる培地 （pH 7) を用いて寒天希釈 法で測定した。 第 1 表 ， 試験菌名 M I C(^g/ml)
(UC E 1 0 2 2 ) スタフイロコッカス ァゥレウス 0.52
(Staphylococcus aureus ATCC6538P)
ェンテロコッカス フヱシゥム 0.52
(Enterococcus faecium ATCC10541)
試験例 2 He L a S 3細胞に対する抗腫瘍作用
10%牛胎児血清、 2mMグルタミンおよび MEM培地 （日本製薬社製） からなる 培地 （以下、 培地 Aと称す） で 3 個 Zmlに調製した He L a S3細胞 (ATCC HTB22)を 0. lml ずつ 9 6穴マイクロタイタ一プレー卜の各穴に分注した。 該プレ ートを炭酸ガスインキュベータ内で 37°C、 20時間培養後、 これに培地 Aにより適 宜希釈した試験化合物を 0.1mlずつ加え、 炭酸ガスィンキュベータ一内で 37°C、 72時間培養した。 培養上清を除去後、 残渣に培地 Aおよび 0.02% ニュートラルレ ッドからなる培地を 0.1 mlずつ加え、 37°Cで 1時間炭酸ガスィンキュベータ内で 培養し、 細胞を染色した。 培養上清を除去後、 残渣を生理食塩水で 1回洗浄した 次いで 0.001N塩酸 Z30%エタノールで色素を抽出し、 マイクロプレートリーダー により 550nmの吸光度を測定した。 無処理細胞と既知濃度の試験化合物で処理し た細胞の吸光度を比較することにより、 細胞の増殖を 50%阻害する試験化合物濃 度（1 „)を算出した。 結果を第 2表に示す。 第 2 表 化合物
UCE 1 0 2 2 6. 1
試験例 3 Balb3T3/H-ras 細胞に対する生育阻害：
10%牛胎児血清、 100 Unit/ml ペニシリンおよび 100mg/mlストレプトマイシン からなる F10培地 （GIBC0社製、 以下、 培地 Bと称す） で 2X104個/ ml に調製 した Balb3T3/H- ras 細胞を 0.1 mlずつ 96穴マイクロタイタープレートの各穴に分 注した。 該プレートを炭酸ガスインキュベータ内で 37 °C、 20時間培養後、 これ に培地 Bにより適宜希釈した試験化合物を 0.05 mlずつ加え、 炭酸ガスインキュ ベータ一内で 37°C、 72時間培養した。 以下、 試験例 2の方法に準じて、 細胞の増 殖を 50%阻害する試験化合物濃度 （ICr,。） を算出した。 その結果を第 3.表に示す c
3 ¾ 化合物 セイントピン E 2.4
次に、 化合物 （I ) の製造法について説明する。
化合物（I)中の UCE 1 0 2 2は、 ベジロマイセス属に属し、 UCE 1 0 2 2 を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、 培養物中に UCE 1 0 2 2を生 成蓄積させ、 該培養物から UCE 1 0 22を採取することによって得ることがで きる。
UC E 1 0 2 2生産菌株としては、 ぺジロマイセス属に属し、 UCE 1 0 2 2 生産能を有する菌株であればいずれの菌株でも用いることができる。 また、 これ らの菌株を人工的変異法、 例えば紫外線照射、 X線照射、 変異誘起剤処理などに よって変異させた変異株あるいは自然的に変異した変異株でも U C E 1 0 2 2生 産能を有するものであれば本発明に用いることができる。 代表的菌株として、 本 発明者らが土壌から分離した U O E 1 0 2 2株があげられる。
U O E 1 0 2 2株の菌学的性質は次のとおりである。
1. 肉眼的観察
麦芽エキス寒天培地を用いて 25°Cで培養をしたとき、 集落の直径は培養 7曰目 で約 28 讓に達する。 集落表面は綿毛状で、 白色を呈する。 集落裏面の中央部は 燈色を呈し、 周囲は淡黄色を呈する。 培地に、 淡黄色の可溶性色素の溶出が認め られる。
バレイショ ，ブドウ糖寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、 集落の直径は培 養 7日目で 26〜27 mm に達する。 集落表面は綿毛状で、 その表面の中央部はラ ィラック色あるいは紫色を呈し、 周囲は白色から灰色を呈する。 集落の裏面はレ モン色を呈する。 培地中に、 淡黄色の可溶性色素の溶出が認められる。
本菌の至適生育温度は、 11〜34°Cで、 23°C付近で最も良好に生育する。 生育し うる pH は 3〜10. 5 で、 pH 6前後で最も良好に生育する。
2. 光学顕微鏡的観察
麦芽エキス寒天培地を用いて 25°Cで培養したときの、 本菌の光学顕微鏡による 観察結果は、 以下のとおりである。
菌糸は、 隔壁を有し、 平滑でよく分岐する。 分生子柄は、 菌糸から立ち上がり、 無色、 平滑で、 その上部で輪生状あるいは不規則に分岐する。 各々の分枝先端に は、 フィアライドを 2〜4個形成する。 また、 直接、 分生子柄先端に 1〜4個の フィアラィドを形成する場合もある。 フィアラィ ドは、 無色、 平滑で、 首が細く 長いフラスコ形を呈する。 フィアライ ドの長さは 7〜12 mmで、 幅はフィアラィ ド基部近くにおいて 2〜3 mmであり、 先端は細く、 幅約 0. 5 mmである。 分生 子の個体発生様式は、 内生出芽型である。 フィァ口型分生子は、 単細胞、 紡錘形 あるいはレモン形を呈し、 無色、 平滑で、 長さ 3〜4. 5画、 幅 1. 5〜2. 5mmであ る。 分生子は、 フィアラィ ド先端より長く連鎖状に形成される。 本菌株は、 上述 したアナモルフのみ観察され、 テレオモルフは観察されない。
以上の菌学的性質から、 本菌の分類学上の位置を ザ · ジ ネラ ·ォブ ·ファ ンジャィ 'スポルレイティング ' イン ' ピュア 'カルチヤ一 第 2版（The Genera of Fungi Sporulat ing i n Pure Cul ture, 2nd ed. Cramer, Vaduz, J. A. von Arx, 1974年） に従って検索した結果、 本菌株は、 糸状不完全菌類のベジ口マイ セス (Paeci l omyces) 属に属することが明らかになった。
本発明者らは、 本菌株を" ベジロマイセス ·エスピー U O E 1 0 2 2
(Paeci lomyces sp. UOE 1022)" と命名し、 微ェ研条寄第 4066号（FERM BP - 4066) として、 工業技術院微生物工業技術研究所に平成 4年 11月 5日付けで寄託した。 次に、 セイントピン Eの製造法について説明する。
セイントピン Eは、 ぺジロマイセス属に属し、 セイントピン Eを生産する能力 を有する微生物を培地に培養し、 培養物中にセイントピン Eを生成蓄積させ、 該 培養物からセイントピン Eを採取することによって得ることができる。
セイントピン E生産菌株としてはベジロマイセス属に属し、 セィントビン E生 産能を有する菌株であればいずれの菌株でも用いることができる。 また、 これら の菌株を人工的変異方法、 例えば紫外線照射、 X線照射、 変異誘起剤処理などに よって変異させた変異株あるいは自然的に変異した変異株でもセィントピン Eを 生産するものであれば本発明に用いることができる。 代表的菌株として、 S P C - 13780株があげられる。
該菌株は、 ブダペスト条約に基づき、 工業技術院微生物工業技術研究所所に FERM BP- 2256として寄託されている （原寄託日 ：平成 1年 1月 2 4日）（特開平 2 — 200655号公報） 。
次に、 U C E 1 0 2 2生産菌あるいはセィン卜ピン E生産菌の培養法について 述べる。
本発明のセィントピン誘導体生産菌の培養においては、 通常の糸状菌の培養法 が一般に用いられる。 培地としては、 使用菌株の資化可能な炭素源、 窒素源、 無 機物および必要な生育、 生産促進物質を程よく含有する培地であれば、 合成培地、 天然培地いずれでも使用可能である。
炭素源としては、 グルコース、 澱粉、 デキス トリ ン、 マンノース、 フラク ト一 ス、 シュクロース、 ラク トース、 キシロース、 ァラビノース、 マ二トール、 糖蜜 などが単独または組合せて用いられる。 さらに、 菌の資化能によっては、 炭化水 素、 アルコール類、 有機酸なども用いられる。 窒素源としては、 塩化アンモニゥ ム、 硝酸アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 硝酸ナトリウム、 尿素、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 乾燥酵母、 コーン ' スチープ ' リカー、 大豆粉、 カザミ ノ酸などが単独または組合せて用いられる。 そのほか、 必要に応じて、 食塩、 塩 化カリウム、 硫酸マグネシウム、 リン酸マグネシウム、 炭酸カルシウム、 リン酸 二水素カリウム、 硫酸第一鉄、 塩化カルシウム、 硫酸マンガン、 硫酸亜鉛、 硫酸 銅などの無機塩類を加える。 さらに、 使用菌の生育ゃセィン卜ピン誘導体の生産 を促進する微量成分を添加することができる。
培養法としては、 液体培養法、 特に深部撹拌培養法が適している。 培養は、 温 度 16〜37°C、 好ましくは 25〜32°C、 H 4〜10、 好ましくは pH 6〜8で行われる。 通常、 1〜7日間の培養により、 目的物質が培養物中に生成蓄積される。 培地の pH調整には、 アンモニア水や炭酸アンモニゥム溶液などが用いられる。 培養物中 の生成量が最大に達したときに培養を停止する。
培養物からの目的物質の単離精製は、 微生物代謝生産物をその培養物から単離 精製するために常用される方法に従って行われる。 例えば培養物を濾過により培 養濾液と菌体に分け、 菌体をメタノール、 アセトンなどで抽出する。 次いで、 抽 出液と培養濾液とを併せて、 ポリスチレン系吸着剤、 例えばダイヤイオン H P 20 (三菱化成社製） などに通塔して活性成分を吸着させ、 次いで酢酸ェチル、 ァセ トンなどで溶出する。 溶出液を濃縮し、 シリカゲルによるカラムクロマトグラフ ィー、 高速液体クロマトグラフィーなどにより、 目的物質を得る。 なお、 培養、 精製操作中の目的物質の動向は、 目的物質の紫外部吸収を目安として追跡するこ とができる。
以下に、 本発明の実施例を示す。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1.
種菌として、 ベジロマイセス ' エスピー UOE 1 0 2 2株 （FERM BP- 4066) を用いた。 該菌株を 2Liter容量の三角フラスコ中の種培地 （下記の組成） 300 m 1に植菌し、 2 5でで 4 8時間振盪培養した。
種培地組成 （ 1 Liter 中） ： ペプトン （極東製薬社製） 5 g、 乾燥酵母ェビォ ス 5 g、 グルコース 1 0 g、 V 8野菜ジュース （日本キヤンベル社製） 200 mし Mgn(P0,)2 - 8H20 0. 5 g (殺菌前 ρΗ6· 0)
得られた種培養液を 3 OLiter 容量のジャーフアーメンター中の下記組成の発 酵培地 1 8 Literに 5 % (容量） の割合で移し、 2 5 °Cで通気攪拌 （回転数 300 rpm, 通気量 1 8い terZ分） 方式により培養を行った。
発酵培地組成 （1 Liter 中） ：可溶性デンプン 5 0 g、 コーン 'スチープ · リ カー （日本食品加工製） 3 0 g、 KH2P04 0. 5 g、 MgSO. · 7H20 0. 5 g、
Mg3(P04)2 · 8H20 0. 5 g、 （殺菌前 pH7. 0、 NaOHで調整）
培養中、 培地の pHは特に制御しないで、 1 4 4時間培養した。
培養終了後、 発酵培養液 7. 5Liter を濾過し、 菌体画分にメタノール 1 OLiter を加えて攪拌し、 UCE 1 0 2 2を抽出した。 メタノール抽出液に水 3 OLiter を加え、 0. 5 Liter の非イオン性多孔性樹脂ダイヤイオン H P 2 0 (三菱化成社 製） に通塔して活性物質を吸着させた。 メタノール：水 （3 0 ： 7 0、 V/V ) で 不純物を溶出後、 メタノール：水 （5 0 ： 5 0、 OL 5 Liter で活性物質を溶 出させた。 溶出された活性画分を濃縮し、 シリカゲルカラム（BW300、 富士デヴィ ソン化学社製） 0. 5 Liter にかけ、 酢酸ェチル：メタノール：水 （ 3 ： 2 ： 1 ； v/v)で展開した。 溶出された活性画分を濃縮し、 シリカゲルカラム （Lichroprep — Si60、 Art9390 ； メルク社製） 1 2 5 mlに力、け、 エタノール：水 （ 1 0 0 ： 3
； v/v) で展開した。 溶出された活性画分を濃縮、 乾燥することにより、 UCE 1 0 2 2の赤色粉末 2 Omgが得られた。
実施例 2.
種菌として、 ぺジロマイセス ·エスピー SPC- 13780株 （FERM BP-2256) を用い た。 該菌株を 2 Liter容量の三角フラスコ中の種培地 （下記の組成） 3 0 Omlに 植菌し、 3 0°Cで 4 8時間振盪 （200rpm) 培養した。
種培地組成 （1 Liter中） ：ペプトン 5 g、 乾燥酵母ェビォス 5 g、 ダルコ一 ス 1 0 g、 V 8野菜ジュース 2 0 Oml、 Mg Ρ04)2 · 8Η20 0. 5 g (殺菌前 ρΗ6.0) 得られた種培養液を 3 0 Liter 容量ののジャーファーメンタ一中の下記組成の 発酵培地 1 5 L er 5% (容量） の割合で移し、 30°Cで通気撹拌 （回転数 400 rpm,通気量 15 Liter,分） 方式により培養を行った。
発酵培地組成 （1 Liter中） ： グリセロール 3 5 g、 グルコース 3 5 g、 乾燥 酵母 1 5 g、 KH2P04 0.5g、 MgS04 · 7H20 0.5g、 Mg3(P04)2 · 8H20 0.5g (殺菌 前 pH7.0、 NaOHで調整)
培養中、 培地の pHは特に制御しないで、 80時間培養した。
培養液を濾過後、 得られた菌体にアセトン 5 Literを添加し撹拌した。 菌体お よび沈殿物を濾別し、 濾液 5 Literを得た。 濾液に酢酸ェチル 15 Literおよびァ ンモニァ 0.5 Literを加え撹拌後、 シリカゲルカラム 2 Literに通塔して活性物 質を吸着させた。 アセトン：酢酸ェチル：アンモニア （1 ： 1 ： 0.05 v/v) 溶液 で展開し、 活性物質を溶出した。 活性画分を濃縮後、 lOmMリン酸緩衝液 （pH 8.0) で希釈し、 ポリスチレン系吸着樹脂ダイヤイオン HP20 (三菱化成社製; 400ml) の カラムに通塔して活性物質を吸着させた。 10m リン酸緩衝液 （pH8.0 ) および同 濃度の緩衝液を含む 40%メタノールで不純物を溶出後、 60%メタノ一ルで活性物 質を溶出した。 活性画分を濃縮後、 10mMリン酸緩衝液 （pH 8.0) で希釈し、 ポリ スチレン系吸着樹脂ダイヤイオン HP20SS (三菱化成社製； 200ml) によるカラムク 口マトグラフィーを行った。 60%メタノール溶出液を濃縮後、 少量のメタノール ：アセトン混合溶液に溶解し、 へキサンを添加することにより、 活性物質を沈殿 させた。 沈殿を濾別し、 乾燥させることにより、 セイントピン Eの青紫色粉末 33 mgが得られた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 抗菌および抗腫瘍作用を有するセィントピン誘導体を提供す ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 式 （ I )
Figure imgf000013_0001
〔式中、 R' が水素を表すとき R2 は S02OHを表し （UCE 1 022 ) 、 R1 がァセチルを表すとき R2 は Hを表す （セイントピン E)〕 で表されるセィ トビン E誘導体。
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