WO1993025702A1 - Process for producing substance lowering cholesterol level - Google Patents

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WO1993025702A1
WO1993025702A1 PCT/JP1993/000771 JP9300771W WO9325702A1 WO 1993025702 A1 WO1993025702 A1 WO 1993025702A1 JP 9300771 W JP9300771 W JP 9300771W WO 9325702 A1 WO9325702 A1 WO 9325702A1
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cholesterol
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epicolesterol
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epico
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Chiaki Saito
Hideyo Senda
Yoshiharu Yokoo
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/863—Mycobacterium

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cholesterol-reducing substance, a novel cholesterol oxidase used therefor, a novel epicolesterol dehydrogenase, a method for producing them, and an epicotyl using the epicolesterol dehydrogenase.
  • the present invention relates to a method for producing resterol.
  • HEI 3-98541 a method of adsorbing and removing from a flutter using a digitonin-immobilized carrier [Journal of Agriculture 'And' Food 'Chemistry] 3 (9), 1839 (1990)) and 3 cyclodextrins were added to egg yolk fluid or dairy products, and the resulting poorly soluble complex was centrifuged.
  • a method of removing by a separation method Japanese Patent Application Laid-Open No. 1-25252, Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-985853, Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-49647.
  • lipids and scent components other than cholesterol are removed. Lost and reduced food quality.
  • a method of degrading cholesterol by a microorganism [Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-267231, Journal of Food Science (J. of Food Science) 53 (2), 659 (1989)], using cholesterol reductase Methods for converting cholesterol to coprostanol (US Pat. Nos. 4,921,710) are known, such as c- phospholipase (JP-A-5-49414) and protease-lipase (JP-A-5-7631). No. 1) is known to promote the treatment with the above microorganism or enzyme.
  • Cholesterol oxidase (EC1.1.3.6) oxidizes cholesterol to 4-cholesten-3-one, and cholesterol oxidizes cholesterol produced by basidiomycete to 5-cholesten-3-one.
  • Oxidase Japanese Patent Publication No. 60-48159
  • cholesterol dehydrogenase which oxidizes cholesterol to cholestenone
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 690/90 Japanese Patent Application Laid-Open No. 690/90
  • 3 ⁇ -hydroxyxetylide dehydrogenase (EC1.1.1.5.50), which oxidizes a hydroxyl group at the 3- ⁇ -position of cholic acid, is known.
  • An object of the present invention is to provide a novel method for producing a cholesterol-reducing substance.
  • the present invention further provides a novel epicholesterol dehydrogenase and a novel cholesterol oxidase used in the method for producing the above cholesterol-lowering substance, a method for producing them, and an epicholesterol using the novel epicholesterol dehydrogenase.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the same.
  • cholesterol (cholest-5-en-3S-ol) in a substance is converted into epicholesterol (cholest-5-en-3hyol) having a low intestinal absorption.
  • the substances used in the present invention include foods containing cholesterol, specifically meat, eggs, milk, seafood or processed foods containing them, animal feed, poultry feed and fish feed, etc. Say.
  • any of a biochemical method and a chemical method can be used.
  • cholesterol is converted into cholestenone by the action of an enzyme and then further converted into epicholesterol.
  • cholesterol can be converted to epicholesterol by adding a substance having the following enzymatic activity to a substance.
  • cholesterol oxidase and epicholesterol dehydrogenase rain enzymes Perform the following treatment A and treatment B in parallel or perform treatment B after the completion of treatment A.
  • Treatment A Treatment with cholesterol oxidase Cholesterol + 0 2 —Cholesteron + H 2 ⁇ 2
  • Treatment B Treatment with epicholesterol dehydrogenase
  • Treatment C Treatment with cholesterol dehydrogenase
  • enzyme source may be added to the substance as a powder, but it is preferable to dissolve it in water and add it in the form of an aqueous solution ( and, if necessary, NAD (P), A coenzyme such as NAD (P) H or an enzyme such as phospholipase, ribose or protease can be used in combination.
  • NAD NAD
  • a coenzyme such as NAD (P) H
  • an enzyme such as phospholipase, ribose or protease can be used in combination.
  • the enzyme source is injected into the whole egg, or the enzyme source is mixed with the yolk obtained by breaking the egg.
  • the enzyme source is mixed with minced meat, sprinkled on sliced meat, or injected into block meat.
  • the enzyme source is administered within 1 hour before slaughter of these animals.
  • the enzyme source is added to the milk or the milk is passed through a carrier on which the enzyme source is immobilized.
  • an enzyme source may be added when cooking eggs, meat, milk, and seafood.
  • the processing conditions and the amount of enzyme that can convert the enzyme into epicholesterol are selected according to the process of blending the feed.
  • the processing conditions temperature, time, pH
  • the amount of enzyme added are selected to enable the enzyme conversion to terol, but in general, the reaction temperature is 5 to 70 ° C and the pH is 4 to 8. Performed from 0 minutes to 200 hours.
  • Co-less tape roll O Kishida Ichize, cholesterol dehydrogenase, the amount of each enzyme E Pi cholesterol de arsenide Dorogena Ichize is cholesterol 1 g per 1 to 0 4 units, like properly 1 0-1 0 3 units It is.
  • cholesterol oxidase examples include enzymes derived from the following microorganisms belonging to the genus Botrytis, enzymes derived from basidiomycetes (Japanese Patent Publication No. 60-48159), genus Brevibacterium, and Nocardia. Genus, Pseudomonas genus, Streptomyces (Streptomyces) microorganism-derived microorganism (commercially available from Sigma).
  • Cholesterol dehydrogenases derived from microorganisms of the genera Nocardia, Alcaligenes, and Proteus (Japanese Patent Publication No. 2-18064), or those derived from animal liver (JP-A-53-56090).
  • any enzyme having an activity of reducing cholestenone to epicolesterol can be used.
  • enzymes derived from the following microorganisms belonging to the genus Mycobacterium are mentioned.
  • the epicolesterol dehydrogenase of the present invention is a novel enzyme, and its physicochemical properties and production method are as follows.
  • Substrate specificity It acts specifically on epicolesterol and does not act on cholesterol.
  • the stable pH range obtained by allowing the enzyme solution to stand at 37 ° C. for 60 minutes in each pH buffer and measuring the residual activity is 4 to 12.
  • the cholesteronone of the reaction product is measured in the same manner using an enzyme which has been inactivated by heat in advance.
  • One unit is defined as the enzyme activity that produces 1 mol of cholestenone per minute.
  • the enzyme activity value without addition of the inhibitor was 100%, and 1 mM p-chloromethylphenylphenylsulfonate, iodoacetic acid, and ethylenediaminetetraacetate were added.
  • the residual activities after reacting at 0, 37 ° C for 2 hours are 7%, 67%, and 71%.
  • the activity of this enzyme is accelerated when it is reacted in the presence of 0.1 to 1 O mM of magnesium ion or manganese ion, compared to the case where no enzyme is added.
  • the culture is centrifuged to collect wet cells, and the cells are suspended in 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5, containing dithiothreitol ImM).
  • the cells are disrupted by sonication, and the solid content is removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution was dialyzed for 24 hours against 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5, 1 mlV [containing dithiothreitol]) for 24 hours, and then equilibrated with the same buffer.
  • This enzyme is recognized as novel based on the above properties, and if the properties of this enzyme are utilized, it becomes possible to produce epicholesterol from cholesterol-containing substances by an enzymatic method.
  • the cholesterol-containing substance refers to a cholesterol dispersion aqueous solution, a cholesterol micelle aqueous solution, or an aqueous solution in which an organic solvent layer in which cholesterol is dissolved is emulsified.
  • the treatment A and the treatment B or the treatment C and the treatment D given as the biochemical method are performed.
  • the enzyme source is added to the cholesterol content, either as a powder or dissolved in water, in the form of an aqueous solution.
  • the cholesterol-containing substance is passed through a carrier on which the enzyme source is immobilized.
  • coenzymes such as NAD (P) and NAD (P) H can be used in combination.
  • the treatment conditions temperature, time, pH
  • the amount of enzyme to be added are selected so that the enzyme can be converted to epicolesterol, but the reaction temperature is generally 10 to 50 ° C. Performed at pH 4-8 for 30 minutes to 48 hours.
  • the amount of each enzyme Resuterorudehi Dorogena Ichize is, 1 g per 1 to 0 4 units of cholesterol, favored properly is 1 0-1 0 3 units.
  • NAD (P) or NAD (P) H can be added at 1 X 10 to 20 g per g of cholesterol.
  • the target substance epicholesterol
  • the microorganism used for producing the enzyme may be any microorganism belonging to the genus Mycobacterium and capable of producing the above-mentioned epicolysterol dehydrogenase, or a variant or a variant of these microorganisms. It may be a mutant strain.
  • a specific example of a microorganism belonging to the genus Mycobacterium and having an ability to produce epicholesterylhydrogenase is Mycobacterium sp. EPI-40.
  • Mycobacterium sp. EP 1 -40 is a strain newly obtained by the present inventor from soil, and its mycological properties are as follows.
  • Amino acid composition of cell wall peptide doglycan It has the meso-form of diaminopimelic acid as diamino acid of cell wall peptide glycan.
  • the strain was determined to be a bacterium belonging to the genus Mycobacterium belonging to Section 16 (The Mycobacteria) of Vol.2 (1986), and the EPI-40 strain was transformed into a bacterium, SP1 EP-40 (Mycobacterium). sp. EPI-40). This strain has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (FRI) under the accession number FERM BP-4306.
  • any of a synthetic medium or a natural medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like can be used.
  • the carbon source various carbohydrates such as glucose, glycerol, molasses, and epicholesterol are used, and the amount of the carbohydrate is preferably about 5 to 70 g / g.
  • Nitrogen sources include, for example, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium acetate, or petone, yeast extract, corn steep liquor, and casein. Hydrolysates and nitrogen-containing organic substances such as meat flakes are used.
  • the cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the cultivation temperature may be any temperature at which the bacteria grow and the epicolesosterol dehydrogenase is produced, and is preferably 25 to 37 ° C.
  • the cultivation time varies depending on the conditions, but the cultivation may be carried out up to the time at which the maximum amount of epicole restoraldehyde hydrogenase is produced, and is usually about 3 to 7 days.
  • the cholesterol oxidase of the present invention is a novel enzyme, and its physicochemical properties and production method are as follows.
  • Substrate specificity 3 —; specifically acts on cholesterol having a hydroxyl group at position 3, but does not act on epicolesterol.
  • 0.3 ml of 2 mM mM citrate buffer (pH 6.0) is mixed with 0.1 ml of an imm cholesterol micelle solution containing 0.3% Triton X-100 After adding 0.05 ml of the enzyme solution to the mixture and reacting at 37 ° C for 10 minutes, the reaction was stopped by adding 0.05 ml of holorom to extract sterol. .
  • cholesterone produced in the reaction solution was quantified using TLC / FID diatroscan (manufactured by Diatron).
  • the reaction product was measured in the same manner using a heat-inactivated enzyme as a control. 1 minute One unit is the enzyme activity that produces 1 mo 1 of cholestenone in between.
  • the enzyme activity value without addition of the inhibitor was 100%, and ImM p-chloromerkilyphenylsulfonate, iodoacetic acid, and ethylenediaminetetraacetate were added, respectively.
  • the residual activities after a reaction at 6.0 and 37 ° C for 10 minutes are 100%, 89% and 93%, respectively.
  • the enzyme is reacted in the presence of 0.1 to 1 OmM of iron ion, copper ion, and magnesium ion, the activity is promoted as compared to the case where no enzyme is added.
  • the culture is centrifuged to obtain a culture supernatant. Ethanol was added to the supernatant to 50 V / V%, and the resulting precipitate was collected by centrifugation, suspended in 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 8.0), and suspended in the same buffer. After dialysis for 24 hours, adsorb to DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) equilibrated with the same buffer. Then, the above buffer solution in which the salt concentration is continuously increased to 0 to 1.0 M is allowed to flow, and an active fraction is collected.
  • the molecular weight of this enzyme is determined by high performance liquid chromatography (Superose6, As a result of measurement by gel filtration according to Lumasia Co., Ltd., the value was about 450,000.
  • this enzyme is recognized as a novel cholesterol oxidase. Utilizing the properties of this enzyme, it converts cholesterol to 5-cholesten-3-one over a wide temperature range and a wide pH range. It becomes possible.
  • the method for producing the enzyme is described below.
  • the microorganism used for producing the enzyme may be any microorganism that belongs to the genus Botrytis and has the above-mentioned cholesterol oxidase-producing ability, and a variant or a variant of these microorganisms. It may be a strain. Specific examples of microorganisms belonging to the genus Botrytis and capable of producing cholesterol oxidase include, for example, Botrytis cinerea
  • Botrytis cinerea CO-33 The mycological properties of Botrytis cinerea CO-33 are as follows.
  • Conidia are colorless to pale yellow-brown, 6-26 ⁇ m in length, 4-1-1 1 ⁇ in width, smooth, and mostly oval-inverted, pearless, and sometimes irregular in shape.
  • this strain was identified as Botrytis cinerea.
  • the mycological properties of Botrytis cinerea are described in more detail on page 17.9 of DeMatiashias. I have.
  • This strain was named "Botrytis cinerea CO-33" and was deposited with FRI under accession number FERM BP-4307. ing.
  • any of a synthetic medium and a natural medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like can be used.
  • the carbon source various carbohydrates such as glucose, glycerol, molasses, vegetable juice, and starch are used, and the amount of use is preferably about 5 to 70 g / mol.
  • the nitrogen source include ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium acetate, or nitrogen such as peptone, yeast extract, corn 'steep' liquefaction, casein hydrolyzate, and meat-ex.
  • Organic substances and the like are used, and the amount used is preferably about 5 to 20 g /.
  • inorganic substances for example, sodium chloride, potassium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, calcium carbonate, etc. are used. About 5 to 5 gZ ⁇ is preferable.
  • the cultivation is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the cultivation temperature may be any temperature at which the bacteria grow and new cholesterol oxidase is produced, preferably
  • the cultivation time varies depending on the conditions, but it is sufficient to culture until the time when the new cholesterol oxidase is produced in the largest amount. Usually, it is about 5 to 8 days.
  • FIG. 1 is a diagram showing a gas chromatographic analysis of lipids extracted from a cholesterol-reduced egg yolk powder sample in Example 9, the best mode for carrying out the invention.
  • the cells obtained by centrifuging the culture solution 10 were washed once with 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5, containing dithiothreitol ImM), and then washed with the same buffer.
  • the suspension was made up to a volume of 200 ml.
  • This cell suspension was treated with a 20 KHz ultrasonic sonicator for 10 minutes and centrifuged to remove solids to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution was passed through a 0.02 M Tris-HCl buffer (pH 7.5, containing 1 mM dithiothreitol) for 24 hours, and then equilibrated with the same buffer. It was adsorbed on Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Then, the salt concentration was continuously increased from 0 to 0.3 M for elution.
  • V8 Vegetable juice manufactured by Campbell 2 £ and 30 g of calcium carbonate are added to deionized water to make 10 £, the pH is adjusted to 7.2, and 300 ml is dispensed into 2 ⁇ Erlenmeyer flasks did.
  • the medium was sterilized at a temperature of 120 ° C for 15 minutes, inoculated with Botrytis cinerea C0-33, and cultured with shaking at a temperature of 25 ° C for 5 days. After completion of the culture, the culture solution 10 was centrifuged to obtain a culture supernatant. Ethanol was added to the supernatant to 50 V /%, and the protein precipitate was collected by centrifugation.
  • Example 2 5 ml of water was added to 5 g of egg yolk of a commercial chicken egg to adjust the pH to 4, and 200 units of cholesterol oxidase obtained in Example 2 were added thereto.
  • Epicholesterol obtained in Example 1 5 units of dehydrogenase and 7 g of NAD HO were added and reacted at 37 ° C for 5 hours.
  • the conversion of the obtained preparation into epipicolesterol was measured and found to be 72.3%. 72.3% of the cholesterol could be obtained with reduced yolk.
  • the conversion rate of meat to epicholesterol was measured according to the method of Example 3, and the result was 23.1%. Beef with a reduced cholesterol content of 23.1% was obtained.
  • the yolk was filtered through gauze and freeze-dried to obtain a powder sample.
  • This sample Disperse 20 g in 14 O ml of ether while heating at 40 ° C, add 66 mg of anhydrous sodium acetate, dissolve, and add 3.5 ml of bromine (Br 2 ). 8 O ml of the added acetic acid was added dropwise. Then, the mixture was immediately cooled on ice, dispersed in water (1), and centrifuged to obtain a precipitate.
  • the precipitate was dispersed in acetic acid 2 6 0 ml, whammy the resulting dispersion B Musan'na Application Benefits Umuni hydrate (Na 2 Cr 2 0 7 ⁇ 2H 2 0) 4. was dissolved 2 g 104 ml of acetic acid heated to 90 ° C was added, and the mixture was stirred for 5 minutes. Thereafter, the mixture was ice-cooled for 10 minutes, dispersed in 2 2 of water, and centrifuged to obtain a precipitate.
  • the obtained precipitate was dispersed in ethanol (11 O ml), sodium borohydride (NaBH J, 1.2 g) was added, the mixture was stirred at 25 ° C, and stirred for 3 hours. Acetic acid (50 ml) was added. to decompose excess NaBH 4, after the addition of 5 0 0 ml of water is et dispersed, to obtain a precipitate by centrifugation. to obtain a cholesterol reducing egg yolk powder the precipitate was freeze-dried.
  • sodium borohydride NaBH J, 1.2 g
  • the conversion of cholesterol to epicolesterol was calculated by the gas chromatography method. After extracting lipid from the powder sample with a solution of formaldehyde in methanol (2: 1), use a TC-1701 gas chromatographic column (15m x 0.53mm, manufactured by GL Sciences) from 240 ° C to 280 ° C. A temperature rise analysis of 2 ° C was performed and detected with a flame ionization detector. The results are shown in Fig. 1. From the above, it was possible to obtain egg yolk in which cholesterol was reduced and 48.7% of cholesterol was converted to epipicolesterol. Industrial applicability
  • the quantity of cholesterol in food can be reduced remarkably, without impairing the food texture and flavor of food.

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Description

明 細 書
コ レステロール低減化物質の製造法
技 術 分 野
本発明は、 コ レステロール低減化物質の製造法、 ならびにそれに使 用する新規コ レステロールォキシダーゼ、 新規ェピコ レステロールデ ヒ ドロゲナーゼ、 それらの製造法および該ェピコ レステロールデヒ ド 口ゲナ一ゼを使用するェピコ レステロールの製造法に関する。
コ レステロール含量の高い食品を過剰に摂取することが血清中のコ レステロ一ル値を増大させ、 また高コ レステロール血清濃度が心疾患 の重大な危険因子であることが報告されている 〔ディ リー · カウンシ ル . ダイ ジヱス ト （Dairy Counci 1 Digest) 60(2), 7(1989) 〕 。 そこ で低コ レステロール食品や低コ レステロール飼料の需要が高まってお り、 食品中や飼料中のコ レステロールを選択的に低減する技術が求め られている。 また生理学的研究の材料と して、 簡便で安全な高純度の ェピコレステロールの製造法が求められている。
背 景 技 術
公知のコ レステロール低減化物質の製造法と しては、 食品中に含ま れるコレステロールをへキサンまたはアセ ト ンを用いて抽出する方法 (特公昭 4 6 — 4 2 9 4 4.号公報、 特開昭 4 7 - 1 9 0 6 2号公報）、 超臨界炭酸ガスを用いた抽出方法 （特開昭 5 9 — 1 3· 5 8 4 7号公報、 特開平 2 — 1 6 7 0 3 5号公報、 特開平 3 — 9 8 5 4 1号公報） 、 ジ ギ トニン固定化担体を用いてバタ一から吸着除去する方法 〔ジャーナ ル · ォブ . アグリ カルチャー ' アン ド ' フー ド ' ケ ミ ス ト リ ー（ J. Agric. Food Chem. )38(9), 1839(1990) 〕 、 3サイ ク ロデキス ト リ ン を卵黄液または乳製品に添加後、 生成した難溶性の複合体を遠心分離 法で除去する方法 （特開平 1 — 2 5 2 2 5 9号.公報、 特開平 3 ― 9 8 5 5 3号公報、 特開平 3 — 4 9 6 4 7号公報） が知られている。 上記の抽出法、 吸着法ではコ レステロール以外の脂質や香り成分が 失われて食品の品質が低下する。
微生物により コ レステロールを分解する方法 〔特開昭 63— 267231号 公報、 ジャーナル ' ォブ ' フー ド · サイエンス（J. of Food Science) 53(2), 659(1989)〕 、 コ レステロール還元酵素により コ レステロール をコプロスタノ ールに変換する方法 （USP4, 921， 710) が知られている c ホスホリパーゼ （特開平 5 — 4 9 4 1 4号公報） 、 プロテアーゼゃ リパーゼ （特開平 5 — 7 6 3 1 1号公報） の処理が上記微生物または 酵素による処理を促進することが知られている。
また、 コ レステロールを 4 —コ レステン一 3 —オンに酸化するコ レ ステロールォキシダーゼ （EC1.1.3.6 ) 、 担子菌が生産するコレステ ロールを 5 —コ レステン一 3 —オンに酸化するコ レステロールォキシ ダ一ゼ （特公昭 6 0 - 4 8 1 5 9号公報） 、 コレステロールをコレス テノ ンに酸化するコレステロールデヒ ドロゲナ一ゼ （特公平 2-18064 号公報、 特開昭 5 3 — 5 6 0 9 0号公報） 、 コール酸の 3 — α位の水 酸基を酸化する 3 αハイ ドロキシステロィ ドデヒ ドロゲナーゼ （EC1. 1.1.50) が知られている。
ェピコ レステロールの腸管吸収性が低いことは知られている 〔ジャ ーナル · ォブ · バイオロジカル · ケミ ス ト リ一（J. Biol. Chem. )206 ， 757(1954) 〕 。 食品中のコ レステロールを、 腸管での吸収性の低いェ ピコ レステロールに変換してコ レステロールを低減するコ レステロ一 ル低減化物質の製造法は知られていない。 ェピコ レステロールを N A D ( P ) の存在下、 コ レステノ ンに酸化するェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼは知られていない。 また、 ボ ト リチス（Botrytis)属に属 する微生物が生産する、 コ レステロールを 5 —コ レステン一 3 —オン に酸化するコ レステロールォキシダーゼは知られていない。 コ レステ 口一ルをェピコ レステロールに変換する化学的方法が知られ.ている 〔ジャーナル ' ォブ ' オルガニッ ク ' ケミ ス ト リー（J. Org. Chem. ) 40(9)， 1361(1975) 〕 。 発 明 の 開 示
本発明は、 コレステロール低減化物質の新規製造法を提供するこ と にある。 本発明はさらに上記コレステロール低減化物質の製造法に使 用する新規ェピコレステロールデヒ ドロゲナ一ゼ、 新規コレステロ一 ルォキシダーゼ、 それらの製造法、 ならびに新規ェピコレステロール デヒ ドロゲナーゼを使用するェピコレステロールの製造法を提供する ことにある。
本発明によれば、 物質中のコレステロール（cho l es t -5-en- 3 S -o l ) を'腸管吸収性の低いェピコレステロール （cho l es t -5-en-3ひ- o l )に変 換し、 コレステロール濃度を低減させることにより、 物質の性状を損 なう ことなく、 選択的にコ レステロールを低減した物質を提供するこ とができる。
以下に本発明のコレステロール低減化物質の製造法を詳細に説明す ο
本発明で用いられる物質とは、 コ レステロールを含有する食品、 具 体的には肉、 卵、 乳、 魚介類またはそれらを含有する調理加工食品、 ならびに動物用、 家禽用および養魚用飼料などをいう。
本発明における物質中の、 コレステロールのェピコ レステロールへ の変換法としては、 生化学的方法と化学的方法のいずれでも用いられ る。
生化学的方法としては酵素による作用を用いてコ レステロールをコ レステノ ンに変換後さらにこれをェピコ レステロールに変換する方法 があげられる。 たとえば下記の酵素活性を有するものを物質に添加し てコ レステロールをェピコレステロールに変換することができる。 ( 1 ) コレステロールォキシダ一ゼとェピコレステロールデヒ ドロゲ ナーゼの雨酵素を用いる場合 ： 下記処理 Aと処理 Bを並行して行うか または処理 Aの終了後処理 Bを行う。
処理 A ： コレステロールォキシダ一ゼによる処理 コ レステロール + 02 —コ レステノ ン + H2〇 2
処理 B ： ェピコレステロールデヒ ドロゲナ一ゼによる処理
コ レステノ ン + NAD(P)H→ ピコ レステロール + NAD(P) ( 2 ) コ レステロールデヒ ドロゲナーゼとェピコ レステロールデヒ ド 口ゲナーゼの両酵素を用いる場合 ： 処理 Cと処理 Dを並行して行うか、 または処理 Cの終了後処理 Dを行う。
処理 C ： コ レステロールデヒ ドロゲナーゼによる処理
コ レステロール + NAD ( P ) →コ レステノ ン + NAD ( P ) H 処理 D ： ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼによる処理
コ レステノ ン + NAD(P)H→ェピコ レステロール + NAD(P) 上記酵素活性を有するものとしては、 精製酵素、 粗酵素、 該酵素活 性を有する微生物菌体またはその処理物などがあげられる。
上記酵素活性を有するもの （以下酵素源という） は粉体のまま物質 に加えてもよいが、 水に溶かして水溶液の形で加えることが好ま しい ( また、 必要に応じて NAD (P) 、 NAD ( P ) Hなどの補酵素、 あ るいはホスホリパーゼ、 リバ一ゼ、 プロテアーゼなどの酵素を併用す ることができる。
卵の処理においては、 全卵に酵素源を注入し、 または割卵して得た 卵黄に酵素源を混合する。 牛、 豚、 羊、 鶏の肉の処理においては、 酵 素源を挽肉に混ぜるか、 スライ ス肉に散布するか、 ブロッ ク肉に注入 する。 あるいはこれらの動物の屠殺前 1時間以内に酵素源を投与する, 乳の処理においては、 乳に酵素源を添加するか、 酵素源を固定化した 担体に乳を通過させる。 また、 卵、 肉、 乳、 魚介類を調理する際に、 酵素源を添加してもよい。
動物用、 家禽用、 .および養魚用飼料においても同様に、 飼料を配合 する工程に合わせて、 ェピコレステロールへの酵素変換が可能な、 処 理条件および酵素添加量が選ばれる。
上記酵素処理においては、 物質の製造工程に合わせて、 ェピコ レス テロールへの酵素変換が可能な、 処理条件 （温度、 時間、 p H) 、 酵 素添加量が選ばれるが、 一般的には反応温度 5〜 7 0 °C、 p H 4〜 8 で、 3 0分間〜 2 0 0時間行われる。 コ レステロールォキシダ一ゼ、 コレステロールデヒ ドロゲナーゼ、 ェピコレステロールデヒ ドロゲナ 一ゼの各酵素の使用量は、 コ レステロール 1 g当り 1 〜 1 04 単位、 好ま しく は 1 0〜 1 03 単位である。 必要に応じて N A D ( P ) また は NA D ( P ) Hを、 コ レステロール l g当り 1 X 1 0— 4〜 2 0 gを 添加する。 また、 必要に応じて 種ホスホリパーゼをリ ン脂質 1 g当 り 1 X 1 0―1〜 1 X 1 0 5 単位添加する。
コ レステロールォキシダーゼとしては、 下記ボト リチス属微生物由 来の酵素、 担子菌由来の酵素 （特公昭 6 0 - 4 8 1 5 9号公報） 、 ブ レビバクテリウ厶（Brevibacterium)属、 ノカルディア（Nocardia)属、 シュゥ ドモナス (Pseudomonas) 属、 ス ト レプトマイセス (Streptomyces) 属微生物由来のもの （市販品 シグマ社製） があげられる。
コ レステロールデヒ ドロゲナーゼとしては、ノカルディア属、 アル 力 リゲネス （Alcaligenes ) 属、 プロテウス （Proteus ) 属微生物由 来のもの （特公平 2— 1 8 0 6 4号公報） 、 あるいは動物肝臓由来の もの （特開昭 5 3 — 5 6 0 9 0号公報） があげられる。
ェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼとしては、 コレステノ ンをェ ピコ レステロールに還元する活性を有するものであれば、 如何なる酵 素も利用できる。 例えば下記マイコバクテリ ゥム（Mycobacterium) 属 微生物由来の酵素があげられる。
—方、 コレステロールをェピコレステロールに変換する化学的方法 としてはホウ ミナー（Houminer)らの方法 〔ジャーナル · ォブ · オルガ ニッ ク ' ケ ミ ス ト リ ー （J.Org.Chem. ) 40(9), 1361 (1975)〕 が使用で きる。 例えば乾燥してそのままか、 あるいは粉砕したコ レステロール を含有する物質に臭素を付加してコレステロールをコ レステロールジ プロマイ ドとした後、 酸化してジブロモコレスタン一 3 —オンとし、 さらに還元してェピコ レステロールに変換する。 反応液はろ過、 遠心 分離などにより固形物を分離し、 必要により乾燥するこ とによりコ レ ステロール低減化物質が得られる。
本発明のェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼは新規酵素であり、 その理化学的性質および製造法は下記のとおりである。
(a) 作用 ：
次の反応を触媒する。
ェピコ レステロール + NAD (P)^± レステノ ン + NAD(P)H
(b) 基質特異性 ： ェピコ レステロールに特異的に作用し、 コレステロ 一ルには作用しない。
(c) 至適 pH：
ェピコレステロールを基質としてコレステノ ン生成を測定した場合 の至適 p Hは 8〜 1 2である。 5 —コレステン一 3 —オンからェピ コ レステロールを生成する場合の至適 p Hは 4〜 5である。 〔0.1M 酢酸塩酸緩衝液 （PH2-4 ) 、 0.1Mリ ン酸クェン酸緩衝液 （pH4- 7)、 0.1Mト リス塩酸緩衝液 （PH7-9 ) 、 0.1Mグリ シン水酸化ナ ト リ ウム 緩衝液 （PH9-12) の 1 mMジチオスレィ トールを含む各 pH緩衝液を 用いて、 温度 3 7 °Cにて測定。 〕
(d) 安定 pH：
酵素液を各 p H緩衝液で、 3 7 °C、 6 0分間静置し、 残存活性を測 定することによって求めた安定 pH範囲は、 4〜 1 2である。
(e) 力価の測定 ：
0. 3 3 % T r i t o n X - 1 0 0を含有する I mMェピコ レステロ 一ルミ セル溶液 0. 1 m 1 に、 I mMジチオスレィ トールを含有する 2 0 mMト リス塩酸緩衝液（p H8. 0 )0. 3 m l 、 1 0 m M NAD 溶液 0. 1 m 1 および 5 0 m M塩化マグネシウム 0, 0 1 m 1 を混合し- これに酵素液 0. 0 5 m 1 を加え、 3 7。Cで 2時間反応後、 0. 0 5 m l クロロホロムを添加してステロールを抽出して反応を停止する ( 次に高速液体クロマ トグラフィ ーを用いて、 反応液中に生成した コ レステノ ンを定量する。 OD Sカラム（GLサイエンス社製 Inertsil 0DS-2 カラム 4.6 X 250mm ) を用いてメタノールを移動相として分 画定量する。 対照としてあらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に 反応物のコレステノ ンを測定する。 1分間に l m o l のコ レステ ノ ンを生成する酵素活性を 1単位とする。
(f) 作用適温の範囲 ： 4 0〜 5 0 °C
p H8. 0で 5 0 °Cまで温度上昇とともに活性は増大する。
(g) 温度安定性の範囲 ：
5 0 °C、 p H8. 0、 1 0分間の加熱処理で、 処理前の活性の約 8 0 %以上の活性を保持する。
(h) 阻害剤、 金属イオンの影響 ：
阻害剤無添加時の酵素活性値を 1 0 0 %とし、 それぞれ 1 mM p 一クロロマ一キュ リ フエニルスルホン酸塩、 ョー ド酢酸、 エチレ ン ジァ ミ ン四酢酸塩を添加し、 p H8. 0、 3 7 °C、 2時間反応した場 合の残存活性は、 7 %、 6 7 %、 7 1 %である。 また、 本酵素は 0. 1〜 1 O mMのマグネシウムイオン、 マンガンイオン存在下で反 応させると無添加の場合に比べ、 活性が促進される。
(i) 精製方法 ：
培養物を遠心分離し湿潤菌体を集菌し、 この菌体を 0. 0 2 Mト リ ス 塩酸緩衝液 （p H7.5、 ジチオスレイ ト一ル I mM含有） に懸濁す る。 超音波処理により菌体を破砕し、 遠心分離にて固形分を除去し、 粗酵素液を得る。 その粗酵素液を 0. 0 2 Mト リス塩酸緩衝液 （ p H 7. 5、 ジチオスレイ ト一ル 1 mlV [含有） に対して 2 4時間透析した 後、 同緩衝液で平衡化した D EAE—セフ ァ ロースフ ァス トフロウ (ファルマシア社製） に吸着させる。 次いで食塩濃度を 0〜0. 3 M に連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、 活性画分を集める。 次い で、 0. 2 M塩化ナ ト リ ゥムを含有した 0. 0 2 Mト リス塩酸緩衝液で 平衡化したゲルろ過カラム （Supe ros e6 、 フ アルマシア社製） にか け、 同緩衝液で溶出し活性画分を集める。 この活性画分を再度、 同 じゲルろ過カラムクロマ トグラフィ ーにかけ、 得られた活性画分を 精製標品とする。
( j ) 分子量
本酵素の分子量は、 2 % T r i t o n X - 1 0 0を含む緩衝液中で 3 0秒間ソニッ ク処理後、 高速液体ク ロマ トグラフ ィ ー（Supe ro se6 フアルマシア社製）によるゲルろ過で測定した結果、 約 2 6 0， 0 0 0 でめった o
(k) —ニコチンアマイ ドアデニンジヌ ク レオチ ド （N A D ) を補酵 素とする。
本酵素は以上の性質から新規と認められ、 本酵素の性質を活用すれ ば、 コレステロール含有物からェピコレステロールを酵素法により製 造することが可能となる。
上記コレステロール含有物とはコレステロールの分散水溶液、 コ レ ステロールミ セル水溶液、 あるいは、 コ レステロールが溶解した有機 溶媒層を乳化させた水溶液のことをいう。
コレステロールをェピコレステロールに変換するためには、 前記の コ レステロール低減化物質の製造法において、 生化学的方法と してあ げられた処理 Aおよび処理 B、 または処理 Cおよび処理 Dを行えばよ く、 酵素源をコ レステロール含有物に、 粉体のまま、 または水に溶か して水溶液の形で加える。 あるいは、 酵素源を固定化した担体にコレ ステロール含有物を通過させる。 また必要に応じて N A D ( P ) 、 N A D ( P ) Hなどの補酵素を併用することができる。
酵素処理は、 ェピコ レステロールへの酵素変換が可能な、 処理条件 (温度、 時間、 p H ) 、'酵素添加量が選ばれる.が、 一般的には反応温 度 1 0〜 5 0 °C、 p H 4〜 8で、 3· 0分間〜 4 8時間行われる。 コ レ ステロールォキシダ一ゼ、 コ レステロ一ルデヒ ドロゲナ一ゼ、 ェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼの各酵素の使用量は、 コレステロール の 1 g当り 1 〜 1 0 4 単位、 好ま しく は 1 0〜 1 0 3 単位である。 必 要に応じて N A D ( P ) または N A D ( P ) Hを、 コ レステロール 1 g当り 1 X 1 0 〜 2 0 g添加できる。
酵素処理したコ レステロール含有物を、 必要に応じてろ過、 遠心分 離などにかけることにより、 目的物であるェピコ レステロールを採取 することができる。
次に新規ェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼの製造法を以下に述 ベる。
本酵素を製造するにあたり使用される微生物としては、 マイ コバク テリ ゥム属に属し、 上記ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼ生産能 を有する微生物であれば如何なるものでもよく、 またこれらの微生物 の変種もしく は変異株でもよい。 マイコバクテリゥム属に属し、 ェピ コレステロ一ルデヒ ドロゲナ一ゼ生産能を有する微生物の具体例と し て、 例えばマイコノくクテリ ゥム ' エスピー（Mycobacterium sp. ) E P I— 4 0があげられる。
上記マイコバクテリ ゥム ' エスピー E P 1 — 4 0 は本発明者が、 土 壌中より新たに検索して得た菌株で、 その菌学的性質は下記のとおり こ ¾>る。
(a) 形態
① 細胞の形及び大きさ ； 桿状
直径 0.5- 1.2 m 、 長さ 1.5 —5.0 m
② 細胞の多形性 ； 多形性有り。短桿〜長桿。稀に分枝形態をとる
③ 運動性 ； なし。 '
④ 胞子 ； 形成しない。
(b) 各培地における生育状態
① 肉汁寒天平板培養 ；
1)生育の様相 ； コロニー形状は不定形で、 波状の外周をもち、 表面は粗。
2)色 ； アイボリ —。
3)光沢 ； なし。
4)拡散性色素 ； 生成しない。
② 肉汁液体培養 ；
1)表面生育 ； なし。
2)濁度 ； あり。
③ 肉汁ゼラチン培養 ；
1)生育の状態 ； 培地の表面に生育する。
2)ゼラチンの液化 ； 培地全体を液化する。
④ リ トマス . ミ ノレク ；
1)反応 ； アルカ リ性。
2)凝固 ； なし。
3)液化 ； なし。
(c) 生理的性質
① グラム染色性 ； 3!¾水酸化力 リ ウム試験ではグラム陽性である が、 酵母エキス肉汁寒天培地上、 18時間培養細胞のグラム染 色性は陰性。
② 硝酸塩の還元 ； 陽性。
③ 脱窒反応 ； 陰性。
④ MRテス ト ； 陰性。
⑤ V Pテス ト ； 陰性。
⑥ イ ン ドールの生成 ； 陰性。
⑦ 硫化水素の生成 ； 陰性。 '
⑧ デンプンの加水分解 ； 陽性。
⑨ クェン酸の利用 ； .（Koser ) 陽性。
(Christensen ) 陽性。
⑩ 無機窒素の利用 ； 硝酸塩 （陽性） 。 アンモニゥム塩 （陽性）
⑪ 色素の生成 ； 陰性。
⑫ ゥ レアーゼ ； 陰性。
ォキシダーゼ ； 陰性。
⑭ カタラーゼ ； 陽性。
⑮ 生育の範囲 ；
(1) H ； p H5.0 - p H11.0。
(2) 温度 ； 1 2〜 3 8 °C。
⑯ 酸素に対する態度 ； 好気性。
⑰ 糖類からの酸およびガスの生成 ；
酸の生成 ガスの生成
Lーァラ ビノース
D—キシロース
D—グルコース + (微弱）
D—マンノ ース + (微弱）
D—フラ ク トース + (微弱）
D -ガラク ト一ス ショ糖 ' ― 一 乳糖 一 一 ト レノヽロース 一 一
D— ソルビッ ト 一 一
D -マンニッ ト ― 一 イノ シッ ト 一 一 グリセ リ ン 一 一 デンプン 一 . 一 (d) 化学分類学的性質
①細胞壁べプチ ドグリカンのア ミ ノ酸組成 ； 細胞壁べプチ ドグリ カ ンのジァ ミ ノ酸と してジア ミ ノ ピメ リ ン酸のメ ソ型を持つ。
②菌体脂質
1)イ ソプレノィ ド · キノ ン ； MK 9 (H2)をメ イ ンに持つ。
2)脂肪酸 （ミ コール酸を含む） ； ミ コール酸 （コ ンプレッ クス 型） を持つ。
以上の菌学的性質を有する菌について、 パー ジヱイのマニュアル ' オフ、 ' · システマチッ ク · くクテリオロ ジー ( Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology) の記載と照合した結果、 グラム陽性 （3¾' 水酸化力 リ ウム試験） で長桿状あるいは短桿状の多形性の形態をとる こと、 好気性で生育し、 嫌気性で生育せず、 細胞壁のジア ミ ノ酸組成 と してメ ソ型のジア ミ ノ ピメ リ ン酸を持ち、 菌体脂質と してコンプレ ッ クス型の ミ コール酸を持つこ と、 また、 主なキノ ンと して MK- 9(H2) を持つこ とより、 本菌株は、 Vol.2(1986) の Section 16 (The Mycobacteria) に属するマイ コバクテ リゥム属に属する細菌であると判断 し、 E P I — 4 0菌株を、 くクテリ ゥム ' エスピー E P 1 —40 (Mycobacterium sp. EPI-40) と命名 した。 本菌株は、 通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所 （FRI ) に受託番号 FERM BP- 4306と し て寄託されている。
本発明のェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼを生産する微生物の 培養に用いられる培地と しては、 炭素源、 窒素源、 無機物などを含有 する合成培地または天然培地のいずれも使用できる。 炭素源と しては. 例えばグルコース、 グリセロール、 糖蜜、 ェピコ レステロールなどの 種々の炭水化物が用いられ、 その使用量は 5〜 7 0 g / 程度が好ま しい。 また窒素源と しては例えば硫酸ァクモ二ゥム、 リ ン酸アンモニ ゥム、 炭酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 あるいはぺプ.ト ン、 .酵 母エキス、 コーン . スティ 一プ ' リ カー、 カゼイ ン加水分解物、 肉ェ キスなどの窒素含有有機物などが用いられ、 その使用量は、 5〜 2 0 gZ 程度が好ま しい。 さ らに無機物と しては、 例えば、 塩化ナ ト リ ゥム、 リ ン酸第一水素カ リ ウム、 リ ン酸第二カ リ ウム、 硫酸マグネシ ゥム、 塩化マグネシウム、 などが用いられ、 その使用量は 0. 0 5 ~ 5 gZ 程度が好ま しい。 また、 必要に応じて界面活性剤を添加する。 培養は、 振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下に行われる。 培養温度は菌が生育し、 ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼが生成 する温度であればよく、 好ま しく は 2 5〜 3 7 °Cである。 培養時間は 条件により異なるが、 ェピコ レステロ一ルデヒ ドロゲナ一ゼが最大量 に生産される時間まで培養すればよく、 通常 3 ~ 7 日間程度である。 本発明のコレステロールォキシダーゼは新規酵素であり、 その理化 学的性質および製造方法は下記のとおりである。
(a) 作用 ：
次の反応を触媒する。
コ レステロール + 02 → 5 —コ レステン一 3 —オン + Η 2Ο 2
(b) 基質特異性 ： 3 — ;3位に水酸基を有するコ レステロールに特異的 に作用し、 ェピコ レステロールには作用しない。
(c) 至適 pH 3〜 7。
(d) 安定 pH 酵素液を各 p H緩衝液で、 3 7 °C、 6 0分間静置し、 残 存活性を測定することによつて求めた安定 pH範囲は、 2〜 8である。
(e) 力価の測定
0. 3 3 % T r i t o n X - 1 0 0を含有する I mMコ レステロール ミセル溶液 0. 1 m 1 に、 2 O mMリ ン酸クェン酸緩衝液 （ p H6. 0 ) 0. 3 m l を混合し、 これに酵素液 0. 0 5 m l を加え、 3 7 °Cで 1 0 分間反応後、 0. 0 5 m 1 クロ口ホロムを添加してステロ一ルを抽出 ' して反応を停止した。
. 次に T L C / F I Dィャ トロスキャ ン （ダイアヤ ト ロ ン社製） を 用いて、 反応液中に生成したコ レステノンを定量した。 対照と して あらかじめ熱失活した酵素を用いて同様に反応物を測定した。 1分 間に 1 m o 1 のコ レステノ ンを生成する酵素活性を 1単位とする。
(f) 作用適温の範囲 ：
3 0〜 6 0 °C。 p H6. 0で 6 0 °Cまで温度上昇とともに活性は増 大する。
(g) 温度安定性の範囲 ：
6 0 °C、 1 0分間の加熱処理で、 処理前の活性の約 8 0 %以上の 活性を保持する。
(h) 阻害剤、 金属イオ ンの影響 ：
阻害剤無添加時の酵素活性値を 1 0 0 %と し、 それぞれ I mM p - ク ロ ロマーキユ リ フ ヱニルスルホ ン酸塩、 ョー ド酢酸、 エチ レ ンジ ア ミ ン四酢酸塩を添加し、 pH 6.0、 3 7 °C、 1 0分間反応した場合 の残存活性は、 1 0 0 %、 8 9 %、 9 3 %である。 また、 本酵素は 0. 1 〜 1 O mMの鉄イオン、 銅イオン、 マグネシウムイオン存在下 で反応させると無添加の場合に比べ、 活性が促進される。
(i) 精製方法 ：
培養物を遠心分離して培養上清を得る。 この上清液に 5 0 V /V % までエタノールを添加し、 生成した沈澱を遠心分離にて集め、 0.02 M ト リ ス塩酸緩衝液 （ p H8. 0 ) に懸濁して同緩衝液に対して 2 4 時間透析した後、 同緩衝液で平衡化した D E A E—セフ ァ ロースフ ァ ス トフロウ （フアルマシア社製） に吸着させる。 次いで食塩濃度 を 0〜1. 0 Mに連続的に上昇させた上記緩衝液を流し、 活性画分を 集める。 次いで、 0. 2 M塩化ナ ト リウムを含有した 0. 0 2 M ト リ ス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム （Sup rose6 、 フアルマ シァ社製） にかけ、 同緩衝液で溶出し活性画分を集める。 この活性 画分を再度、 同じゲルろ過カラムクロマ トグラフィ ーにかけ、 得ら れた活性画分を精製標品とする.。 ·'
(j) 分子量 ：
本酵素の分子量は高速液体クロマ トグラフィ一 （Superose6 、 ファ ルマシア社製） によるゲルろ過で測定した結果、 約 4 5， 0 0 0であ つた。
本酵素は以上の性質から新規コ レステロールォキシダーゼと認めら れ、 本酵素の性質を活用すれば、 広い温度範囲と広い p H範囲でコ レ ステロールを 5 —コ レステン一 3 —オンに変換することが可能となる。 以下に、 本酵素の製造法を述べる。
本酵素を製造するにあたり使用される微生物と しては、 ボト リチス 属に属し、 上記コ レステロールォキシダーゼ生産能を有する微生物で あれば如何なるものでもよく、 またこれらの微生物の変種もしく は変 異株でもよい。 ボ ト リチス属に属し、 コ レステロールォキシダ一ゼ生 産能を有する微生物の具体例と して、 例えばボ ト リチス · シネレア
(Botrytis cinerea ) CO- 33 があげられる。
ボト リチス · シネレア CO- 33の菌学的性質は次の通りである。
麦芽エキス寒天培地を用いて、 2 5 °Cで培養したとき、 集落は灰色 から暗緑色がかった灰色を呈する。 菌糸は隔壁を有し、 平滑、 無色か ら淡褐色でよく分枝する。 分生子柄は菌糸から直立し、 長さ 2 mmあ るいはそれ以上に達する。 幅は 1 5〜 3 0 /zm で、 平滑、 隔壁を有す る。 分生子柄は単生、 その上部において疎に分枝し、 各々の先端部に 分生子を多数形成する。 分生子の個体発生様式は外生出芽型で、 その 形成様式は単生の房状出芽型である。 分生子は、 無色〜淡黄褐色、 長 さ 6〜 2 6 〃m 、 幅 4〜 1 1 〃πι 、 平滑で、 多く は楕円形〜倒卵形、 洋なし形、 ときに不定形を呈する。 本菌株は、 上述したアナモルフの み観察され、 テレオモルフは観察されない。 以上の観察の結果、 本菌 株は、 ボ ト リチス · シネレアと同定された。 ボ ト リチス · シネレアに ついての菌学的性質は、 エリ ス（M. B. Ellis)著、 「デマチアシァス . ハイフォ ミセテス 「1971年] (DEM.ATIACEOUS HYPH0MYCETES [1.971] ) 」 の 1 7.9頁に詳しく記載されている。 本菌株は " Botrytis cinerea CO- 33 " と命名され、 F R I に受託番号 FERM BP- 4307と して寄託され ている。
本発明の新規コレステロールォキシダーゼを生産する微生物の培養 に用いられる培地としては、 炭素源、 窒素源、 無機物などを含有する 合成培地または天然培地のいずれも使用できる。 炭素源としては、 例 えばグルコース、 グリセロール、 糖蜜、 野菜ジュース、 澱粉などの種 々の炭水化物が用いられ、 その使用量は 5 — 7 0 gノ^程度が好ま し い。 また窒素源としては例えば硫酸アンモニゥ厶、 リ ン酸アンモニゥ ム、 炭酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 あるいはペプ ト ン、 酵母 エキス、 コーン ' スティープ ' リカ一、 カゼイ ン加水分解物、 肉ェキ スなどの窒素含有有機物などが用いられ、 その使用量は、 5〜20g/ 程度が好ま しい。 さらに無機物としては、 例えば、 塩化ナ ト リ ウム、 リ ン酸第一水素力 リウム、 リ ン酸第二力 リ ウム、 硫酸マグネシウム、 塩化マグネシウム、 炭酸カルシウムなどが用いられ、 その使用量は 0. 0 5〜 5 g Z ^程度が好ましい。 培養は、 振盪培養または通気攪拌 培養などの好気的条件下で行われる。 培養温度は菌が生育し、 新規コ レステロールォキシダ一ゼが生成する温度であればよく、 好ま しく は
2 0〜 3 0 °Cである。 培養時間は条件により異なるが、 新規コレステ ロールォキシダーゼが最も大量に生産される時間まで培養すればよ く . 通常 5〜 8 日間程度である。
図面の簡単な説明
第 1 図は、 実施例 9 において、 コ レステロール低減化卵黄粉末試料 中から抽出した脂質のガスクロマ トグラフィ ー分析を示した図である, 発明を実施するための最良の形態
実施例 1
ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼの製造 ：
ブイヨン顆粒 （極東製薬製） 2 7 0 gおよび酵母エキス （D i f c o.社 製） 7 0 gを脱イオン水 1 0 に溶解し、 p Hを 7. 0 に調整し、 ί 三角フラスコに 3 0 0 m l ずつ分注した。 この培地を温度 1 2 0でで 1 5分間殺菌後、 マイコバクテリ ゥム ' エスピー E P I — 4 0を接種 し、 温度 2 8 で 7 2時間振とう培養した。
培養終了後培養液 1 0 を遠心分離して得られた菌体を 0. 0 2 M ト リス塩酸緩衝液 （ p H7. 5、 ジチオスレィ トール I mM含有） で 1 回 洗浄後、 同緩衝液に懸濁し液量を 2 0 0 m l とした。 この菌体懸濁液 を 2 0 KH zの超音波破砕機で 1 0分間処理して遠心分離し、 固形分 を除去し、 粗酵素液を得た。 その粗酵素液を 0. 0 2 Mト リ ス塩酸緩衝 液 （ p H7. 5、 ジチオスレイ ト一ル 1 mM含有） に対して 2 4時間透 析した後、 同緩衝液で平衡化した D E A E—セフ ァロースフ ァス ト フ ロウ （ファルマシア社製） に吸着させた。 次いで食塩濃度を 0〜0. 3 Mに連続的に上昇させ溶出を行った。
次いで、 0. 2 M塩化ナ ト リウムおよび I mMジチオスレィ トールを 含有した ト リス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム
(Superose6、 フアルマシア社製） にかけ、 高速液体クロマ トグラフィ 一により、 同緩衝液で溶出し活性画分を集めた。 この活性画分を再度、 同じゲルろ過カラムにかけ、 高速液体クロマ トグラフィ ーにより集め た活性画分を精製酵素液とした。 本酵素の蛋白質濃度をプロティ ン · アツセィキッ ト （バイオラ ッ ド社製） により測定し、 活性を測定した ところ、 比活性 1. 0 8単位 Zm g蛋白質であった。
実施例 2
コ レステロールォキシダーゼの製造 ：
V8 野菜ジュース （キヤ ンベル社製） 2 £および炭酸カルシウム 30 gに脱イオン水を加えて 1 0 £ とし、 p Hを 7. 2に調整し、 2 ^三角 フラスコに 3 0 0 m l ずつ分注した。 この培地を温度 1 2 0 °Cで 1 5 分間殺菌後、 ボト リチス · シネレア C 0— 3 3を接種し、 温度 2 5 °C で 5 日間振とう培養した。 垮養終了後培養液 1 0 を遠心分離して培 養上清を得た。 この上清液に 5 0 V / %までエタノールを添加し、 蛋白質の沈澱を遠心分離により集めた。 沈澱を 0. 0 2 M ト リス塩酸緩 衝液 （p H7. 5、 ジチオスレィ トール 1 mM含有） に懸濁し、 同緩衝 液に対して 2 4時間透析した後、 その遠心分離の上清を同緩衝液で平 衡化した D EAE—セファ ロースフ ァス トフロウ （フ アルマシア社製） に吸着させた。 次いで食塩濃度を 0〜1.0 Mに連続的に上昇させ溶出 ¾τ ττつに
次いで、 0. 2 M塩化ナ ト リウムおよび 1 mMジチオスレィ トールを 含有した 0. 0 2Mト リス塩酸緩衝液で平衡化したゲルろ過カラム
(Superose6. フアルマシア社製） にかけ、 高速液体クロマ トグラフィ 一により、 同緩衝液で溶出し活性画分を集めた。 この活性画分を再度、 同じゲルろ過カラムにかけ、 高速液体クロマ トグラフィ ーにより集め た活性画分を精製酵素液とした。 本酵素の蛋白質濃度をプロティ ン · アツセィキッ ト （バイオラッ ド社製） により測定し、 活性を測定したと ころ、 比活性 10.4単位 g蛋白質であった。
実施例 3
0. 3 3 % T r i t o n X - 1 0 0を含有する I mMコ レステロール ミセル溶液 1 0 m l に、 I mMジチオスレィ トールを含有する 1 0 0 mMリ ン酸クェン酸緩衝液 （p H4. 0 ) 3 0 m l と 1 O mM NAD H溶液 1 0 m l を混合しこれに実施例 2で得られたコ レステロールォ キシダーゼ 1. 0単位と実施例 1で得られたェピコレステロールデヒ ド ロゲナーゼ 0.2単位を加え、 3 7°Cで 3時間反応後、 1 0 m l 'のク ロ 口ホルムを添加してステロールを抽出した。 高速液体クロマ トグラフ ィ ーを用いて、 生成したェピコレステロールを定量した。 OD Sカラ ム （G Lサイエンス社製 Inertsil ODS- 2 カラム 4.6 x 250mm)を用 いてメタノールを移動相として分画定量しェピコレステロールの変換 率を測定した結果 92. 5 %であった。
実施例 4
0. 3 3 % T r i t o n X - 1 0 0を含有する 1 m Mコ レステロール ミセル溶液 1 0 m l に、 I mMジチオスレィ トールを含有する 1 0 0 mMト リス塩酸緩衝液 （ p H8. 0 ) 3 0 m l と 3 0 mM NAD溶液 1 0 m l を混合しこれにコ レステロールデヒ ドロゲナーゼ （天野製薬 製 CHDH "Amano" I) 2 0 0単位を加え 3 7 °Cで 2時間反応した。 コ レステロールデヒ ドロゲナーゼの活性測定法は特公平 2 - 18064 号 公報記載の方法に従った。 反応終了後 1 0 m lのへキサンを加えステ ロールを抽出し乾固させた。 さらに、 0. 3 3 %T r i t o n X - 100 と I mMジチオスレィ トールを含有する 1 0 O mMリ ン酸クェン酸緩 衝液 （p H4. 0 ) 3 0 m l に得られたステロールを分散させた後、 1 0 mM NADH溶液 1 0 m lを混合しこれに実施例 1で得られた ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼ 0.2単位を加え 3 7 °Cで 2時間 反応した。 反応終了後 1 0 m 1のクロ口ホルムを添加してステロール を抽出した。 実施例 3の方法に従い、 得られた標品のェピコレステロ ールへの変換率を測定した結果 58. 8 %であった。
実施例 5
市販鶏卵の卵黄 5 gに 5 m lの水を添加して p H 4に調整し、 これ に実施例 2で得られたコレステロールォキシダーゼ 2 0 0単位、 実施. 例 1で得られたェピコレステロールデヒ ドロゲナ一ゼ 5単位、 NAD HO. 7 gを添加し 3 7 °Cで 5時間反応した。 反応後 p H 7に調整した c 処理済みの卵黄を凍結乾燥し、 得られた試料より脂質画分を溶媒 （ク ロロホルム ： メタノール = 2 ： 1 ) で抽出し分取した。
実施例 3の方法に従い、 得られた標品のェピコ レステロールへの変換 率を測定した結果 72.3 %であった。 コ レステロールの 72. 3 %が低 減された卵黄を得ることができた。
実施例 6
市販牛肉のミ ンチ 5 gを p H 4に調整し、 ホスホリパーゼ D 2 5単 位、 実施例 2で得られたコ レステロールォキシダーゼ 3 0単位、 実.施 例 1で得られたェピコレステロ一ルデヒ ドロゲナ一ゼ 0.2単位、 N A D H 1 7 m gを添加し 3 7てで 5時間反応した。 反応後 p H 7に調整 した。 処理済みの肉を凍結乾燥し、 得られた試料より脂質画分を溶媒 (クロ口ホルム ： メタノール = 2 ： 1 ) で抽出し分取した。
実施例 3の方法に従い肉のェピコレステロールへの変換率を測定した 結果 2 3. 1 %であった。 コレステロールの 2 3. 1 %が低減された牛肉 を得ることができた。
実施例 7
市販牛乳の 5 0 m l に実施例 2で得られたコ レステロールォキシダ ーゼ 1 0 0単位、 実施例 1 で得られたェピコレステロールデヒ ドロゲ ナーゼ 1. 0単位、 N A D H O. 1 gを添加し、 p H 4、 3 7 °Cで 5時間 反応した。 反応後 P H 7に調整した。 処理済みの牛乳を凍結乾燥し、 得られた試料より脂質画分を溶媒 （クロ口ホルム ： メタノール = 2 : 1 ) で抽出し分取した。 実施例 3の方法に従い牛乳のェピコレステロ ールへの変換率を測定した結果 1 5. 3 %であった。
コ レステロールの 1 5. 3 %が低減された牛乳を得ることができた。 実施例 8
市販鶏卵の卵黄 5 gに 5 m 1 の水を加え p H 8に調整した後、 コ レ ステロールデヒ ドロゲナーゼ （天野製薬製 CHDH "Amano" 1 ) 2 0 0 単位、 N A D O. 3 gを添加して 3 7 °Cで 3時間反応した。 反応後、 p H 4 に調整し、 実施例 1 で得られたェピコレステロールデヒ ドロゲ ナ一ゼ 9. 0単位、 N A D H 0. 7 gを添加し 3 7 °Cで 4時間反応した。 反応後 p H 7に調整した。
処理済みの卵黄を凍結乾燥し、 得られた試料より脂質画分を溶媒 (ク ロ口ホルム ： メタノール = 2 ： 1 ) で抽出し分取した。 実施例 3 の方法に従い卵黄のェピコ レステロールへの変換率を測定した結果 10. 5 %であつた。 コ レステロールの 1 0. 5 %が低減された卵黄を得るこ と ができた。
実施例 9
卵黄をガーゼで濾過後、 凍結乾燥して粉末試料を得た。 この試料 2 0 gを 1 4 O m l のエーテルに 4 0 °Cに加温しながら分散させ、 無 水酢酸ナ ト リ ウム 6 6 0 m gを加えて溶解した後に臭素 （Br 2 )3. 5 ml を加えた酢酸 8 O m l を滴下した。 その後、 直ちに氷冷して 1 の水 に分散後、 遠心分離して沈澱を得た。
この沈澱を酢酸 2 6 0 m l に分散させて、 得られた分散液に重ク ロ ム酸ナ ト リ ゥムニ水和物 （Na2Cr207 · 2H20) 4. 2 gを溶解し 9 0 °Cに 加熱した酢酸 1 0 4 m l を添加し、 5分間攪拌した。 その後 1 0分間 氷冷し、 これを 2 ^の水に分散後、 遠心分離して沈澱を得た。
得られた沈澱をエタノール 1 1 O m l に分散させ、 水素化ホウ素ナ ト リ ウム （NaBH J1. 2 gを加えて 2 5 °Cに保ち 3時間攪拌した。 酢酸 5 0 m 1 を添加して過剰の NaBH4 を分解し、 さ らに 5 0 0 m l の水を 添加し分散後、 遠心分離して沈澱を得た。 この沈殿を凍結乾燥してコ レステロール低減化卵黄粉末を得た。
コ レステロールのェピコ レステロールへの変換率はガスク ロマ トグ ラフィ一法で算出した。 粉末試料より クロ口ホルム一メ タノール （2: 1)溶液で脂質を抽出後、 TC- 1701 ガスクロカラム （15m X 0.53mm G Lサイエンス社製） で 2 4 0 °Cから 2 8 0 °Cまで毎分 2 °Cの昇温分析 を行い、 水素炎イオン化検出器で検出した。 その結果を第 1 図に示す, 以上より、 コ レステロールの 48. 7 %がェピコ レステロールに変換 された、 コレステロールが低減化された卵黄を得ることができた。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 食品の食感、 風味を損なう ことなく食品中のコ レ ステロールの量を著量に低減化することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
(1) コ レステロール （choles卜 5- en- 3 - ol ) を含有する物質中のコ レステロールをェピコ レステロール （cholest- 5- en- 3α - ol ) に変換 してコ レステロール濃度を低減させることを特徴とするコレステロ一 ル低減化物質の製造法。
(2) コレステロールを含有する物質をコレステロールォキシダーゼで 処理後あるいはそれと同時に、 ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼ で処理して、 コ レステロールをェピコ レステロールに変換してコレス テ口一ル濃度を低減させることを特徴とするコ レステロール低減化物
- 質の製造法。
(3) コレステロールを含有する物質をコ レステロールデヒ ドロゲナ一 ゼで処理後あるいはそれと同時に、 ェピコレステロ一ルデヒ ドロゲナ ーゼで処理して、 コ レステロールをェピコ レステロ一ルに変換してコ レステロール濃度を低減させることを特徴とするコ レステロール低減 化物質の製造法。
(4) 物質が肉、 卵、 乳、 魚介類、 およびそれらを含む調理用加工食品 または動物用、 家禽用および養魚用飼料である請求項 1、 2 または 3 記載の方法。
(5) 下記の理化学的性質を有するコ レステロールォキシダーゼ
(a) 作用 ： 次の反応を触媒する。
コ レステロール + 02 → 5 —コ レステン一 3 —オン + H 202
(b) 基質特異性 ： 3 — ^位に水酸基を有するコ レステロールに特異 的に作用 し、 ェピコ レステロールには作用しない。
(c) 至適 pH： 3〜 7
(d) 安定 pH： 2〜 8
(e) 作用.適温の範囲 ： 3 0〜 6 0 °C
. (f) 温度安定性の範囲 ： 6 0 °C、 1 0分間の加熱処理で、 処理前の 活性の約 8 0 %以上の活性を保持する。 (g) 金属イオンの影響
鉄イオン、 銅イオン、 マグネシウムイオンによって反応が促進さ れる
(h) 分子量 ： 約 45， 0 0 0 (ゲルろ過法による） 。
(6) ボ ト リチス属に属する菌株が生産する請求項 5 に記載のコ レステ 口一ルォキシダ一ゼ。
(7) ボ ト リチス属に属し、 コ レステロールを酸化して 5 —コレステン 一 3 —オンと過酸化水素とを生成する反応を触媒するコ レステロール ォキシダ一ゼを生産する能力を有する菌株を培地に培養し、 培養物中 に該コ レステロールォキシダーゼを生成させ、 該培養物より、 該コ レ ステロールォキシダーゼを採取することを特徴とするコ レステロール ォキシダ一ゼの製造法。
(8) 下記反応を触媒するェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼ
ェピコ レステロール + N A D (P：)^ ^コ レステノ ン + N A D (P)H
(9) 下記の理化学的性質を有するェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼ
(a) 作用 ： 次の反応を触媒する。
ェピコ レステロール + N A D (P ) コ レステノ ン + N A D (P )H
(b) 基質特異性 ： ェピコ レステロールに特異的に作用し、 コ レステ ロールには作用しない。
(c) 至適 pH： ェピコ レステロールからの酸化反応では p H 8〜 1 2 5 —コ レステン— 3 —オンからの還元反応では p H 4〜 5
(d) 安定 pH : 4〜 1 2
(e) 作用適温の範囲 ： 4 0〜 5 0 °C
(f) 温度安定性の範囲 ： 5 0 °C、 p H8. 0、 1 0分間の加熱処理で、 処理前の活性の約 8 0 %以上の活性を保持する。
(g) . 阻害剤、 金属イオンの影響 ：
一クロロマ一キュ リ フエニルスルホン酸塩、 ョー ド酢酸、 ェチ レンジア ミ ン四酢酸塩によつて活性が阻害される。 マグネシゥム イオン、 マンガンイオンによって活性が促進される。
(h) 分子量 ： 約 2 6 0， 0 0 0 (ゲルろ過法による） 。
( i ) 捕酵素
β —ニコチ ン了マイ ドアデニンジヌ ク レオチ ド （N A D ) を補酵 素とする。
(10) マイ コバクテリ ゥム属に属する菌株が生産する請求項 8 に記載の ェピコ レステロ一ルデヒ ドロゲナ一ゼ。
(11) マイ コバクテ リ ゥム属に属し、 ェピコ レステロ一ルデヒ ドロゲナ ーゼを生産する能力を有する菌株を培地に培養し、 培養物中に該ェピ コ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼを生成させ、 該培養物より、 該ェピ コ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼを採取することを特徴とするェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼの製造法。
(12) コ レステロ一ルー含有物をコ レステロールォキシダーゼで処理後 あるいはそれと同時に、 ェピコ レステロールデヒ ドロゲナーゼで処理 して、 コ レステロールをェピコ レステロールに変換し、 該含有物から ェピコ レステロールを採取するこ とを特徴とするェピコ レステロール の製造法。
(13) コ レステロール含有物をコ レステロールデヒ ドロゲナーゼで処理 後あるいはそれと同時に、 ェピコ レステロールデヒ ドロゲナ一ゼで処 理して'、 コ レステロールをェピコ レステロールに変換し、 該含有物か らェピコ レステロールを採取することを特徴とするェピコ レステロ一 ルの製造法。
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