WO1993011256A1 - Procede de production d'un norborneol presentant une activite optique - Google Patents

Procede de production d'un norborneol presentant une activite optique Download PDF

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WO1993011256A1
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norborneol
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ester
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Bunji Kageyama
Masanori Nakae
Takayasu Sonoyama
Kyozo Kawata
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Shionogi Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/004—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of alcohol- or thiol groups in the enantiomers or the inverse reaction
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    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi
    • Y10S435/94—Saccharomyces

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing optically active norborneol by treating an oxanol-portal-type ester with a microorganism.
  • norbornane is used as a starting material to react with an organic acid to form an ester form of norbornane.
  • a method for chemically deacetylating an ester form to obtain norpolneol There is known a method for chemically deacetylating an ester form to obtain norpolneol.
  • four kinds of stereoisomers ((+, one)-(endo, ⁇ ) -norborneol) are generated, so that optically active norborneol is chemically synthesized. This requires a complicated reaction process.
  • the present invention provides a high-purity optically active norborneol by treating an exo-norpornan type ester using a microorganism. Provide a way to get
  • R represents an acyl group
  • a and B each represent a waterline or a bond taken together.
  • (2S) -exo-norbornane-type alcohol or (2R) -exo-norbornane-type ester is fractionated from the reaction solution.
  • R represents an acyl group
  • a and B each represent hydrogen or a bond in the form of a bond.
  • the acyl group is an aliphatic acyl group having 2 to 10 carbon atoms, preferably an aliphatic acyl group having 2 to 7 carbon atoms, for example, acetyl, Propioyl, butyryl, isoptyryl, pentanoyl, hexyl / hexyl, particularly preferably holmyl, acetyl, provyl or isoptiryl.
  • the aryl group may alternatively be a 4- to 10-carbon cycloalkylcarbonyl group, preferably a 4- to 7-cycloalkylcarboxy group, for example, Cyclopropane carbonyl, cyclobutane carbonyl, cyclopentane carbole and cyclohexane carbyl. Or an arylcarbonyl group, preferably having 7 to 11 carbon atoms, such as benzyl, P-toluoyl, and naphthyl. Can be done.
  • Such compounds can be used commercially or can be easily produced by chemical synthesis.
  • norbornane is reacted with a suitable organic acid (eg, acetic acid, drunk acid, bromoponic acid, ⁇ acid, etc.) in the presence of an acid catalyst, or is reacted with a vinyl ester of a suitable organic acid.
  • Dealer Cyclopentagen By subjecting it to the Ruder (Diels-AUer) reaction, the desired (soil) exo-norbornane ester (I) can be obtained in high yield.
  • microorganisms belonging to Pseudomonas II, Acetobacter II, Earth Lombarder II, Rhodotorula II, or Saccharomyces can be used.
  • Pseudoaonas aeruei nosa) case ⁇ cetobacter pasteurianus, arthrobacter esb, Rhodotorula pall Ida, Rhodotorula rubra or Rhodotorula rubra or Saccharo sp.
  • SLZi i SP. May be used. Particularly at high speeds, Acetobacter • 'Strain (Acetobacter pasteurianus) and Arthrobacter sp. (Arthrobacter s £.) Are used. Specifically, Pseudoaonas aerugi nosa IFO 12582, Acetob acter pasteurianus ATCC 9432, Acetobacter pasteurianus ATCC 12873, Arthrobacter s £ .SHS-0145 Strains such as Rhodo torula rubra IPO 1101, Rhodotoru la rubra ATCC 2510 and Saccharonyces so, SHS-20030 (FERM BP-4061) are used. Above, Arthrobacter SP.
  • SHS-05 and Saccharomyces SP. SHS-20030, respectively, are in accordance with the Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms on Patent Rules, and are based on November 2, 1932, to the Institute of Technology No. 4060 (FEBM BF-4060) and No. 4061 (FERM BP-4061) have been deposited.
  • microorganisms mentioned above are commonly used for the growth of microorganisms such as glucose, sucrose, molasses, polypeptide, meat extract, and yeast: c-kiss, pork flour, soy flour, phosphoric acid, mugs, and so on. Grow on a medium containing nutrients.
  • (Sat) exo-norbornanester is infested with the microbial cells or the treated cells.
  • (Sat) exo-bornorbornane-type ester (I) is added directly to the culture solution of the above microorganism so as to have a concentration of 0.5 to 10% and further cultivated.
  • the ester is hydrolyzed to obtain norbornane-type alcohol 2S— (II) and norbornane-type ester 2R— (I).
  • a liquid extract of a suspended body and a body extract instead of the culture solution of the above K, it is also possible to use a liquid extract of a suspended body and a body extract.
  • the cells are collected from the culture by centrifugation, filtration, etc., and suspended in a small mouth liquid containing an organic solvent. More. Bacterial cell extraction is performed by using cell-lysing enzymes or by using ultrasonic, French blessing or other methods commonly used. S can be removed to produce 3 ⁇ 4.
  • contacting a microorganism with (soil) exo-norbornan type ester means directly adding (soil) exo-norbornane type ester to the culture solution. place
  • contacting a substance means to use a tooth fluid or a cell extract instead of a culture solution.
  • reaction scheme a The reaction steps of the above hydrolysis according to the present invention are shown in the following reaction scheme a:
  • R, A and B are as defined above.
  • 2S— (I) of the exo-norbornan ester was selectively hydrolyzed and the exo-norbornan alcohol was selectively hydrolyzed. 2 Converted to S— (II).
  • Norpolnananan ester 2 (I) remains in the reaction (2) almost unreacted.
  • a reaction solution containing a mixture of norbornane-type alcohol 2S— (II) and norbornane-type ester 2R— (I) is obtained.
  • alcohol 2S- (II) and the exo-norbornane ester 2R- (I) remaining unreacted can be separated by a known method. For example, it is also possible to separate by chromatography. Alternatively, alcohol 2S- (II) may be made water-soluble by a rapid method (eg, by reacting it with an organic acid such as phthalic anhydride to form a half-ester), and then separated by extraction. ffi It is possible to simply obtain the desired optically active norpol-nan-type compound.
  • the process of the present invention To the reaction desired: ⁇ ⁇ Add 0.1 to 2 times the appropriate solvent to extract norbornol (1) -12 and norbornyl acetate (1) -11.
  • a solvent such as black form, dichloromethan, oxyethyl, and n-hexane may be used alone or as a mixture.
  • the extracted norbornene (1) -12 and norrulacetate (1) -11 are appropriately concentrated, and after concentration, 1-2 times the amount of norborneol (1) -12 produced Addition of anhydrides such as maleic anhydride and phthalic anhydride to form a water-soluble adduct of norborneol (I) -12 with an organic acid (such as maleic phthalic acid).
  • aqueous solution of a versatile compound such as sodium bicarbonate is added to the reaction mixture to neutralize it.
  • the organic acid adduct of norborneol J_Ll »_IL is added to the aqueous layer, and norpornyl acetate is added.
  • G is transferred to the organic solvent S.
  • Water JS is separated, subjected to alkaline treatment, extracted with an appropriate organic solvent such as dichloromethan, and concentrated to obtain norborneol (1) -12 with high optical purity. .
  • the organic solvent layer obtained by separating the aqueous layer from the aqueous layer can be recovered by compressing norpornylacetate (h (-)-1 is a solvent). After recovery, optically pure norborneol (+)-2 can be easily obtained by contacting with a commercially available rivase esterase or chemically deacetylating.
  • the (1) exo-norborneol or (10) exo-norborneol obtained in this manner can be obtained by a method described in the literature (Irwin A .. Jones JB: J. Av). . Chen. Soc. 98, 847. 6-8481 (1976)), an optically active substance with higher purity can be easily obtained.
  • an optically active substance with higher purity can be easily obtained.
  • (1) one or (+)-phenylamine is added to each of them to form each phenylamine clay.
  • a high-purity optically active substance containing 98% ee or more can be obtained. Further, it can be purified by a commonly used column chromatography process.
  • Acetobacter pasteuri anus ATCC 9432 was prepared in 3 L of GPBY medium (D-Gnorecose 4X. Polypeptone 2X, Meat extract 2X, Yeast) Ex. 2X. First phosphoric acid 0.2X, magnesium sulfide 0.2X, calcium carbonate Vk, pH 7.0), and cultured at 28 for 24 hours. The culture solution is centrifuged at 1.000 G for 10 minutes to remove solids, and then subjected to high-speed eccentric separation at 20.000 G for 15 minutes. »Collect the body, and then» Fill the body with physiological saline. Washed twice. By this operation, 19.8 g of wet cells were obtained.
  • GPBY medium D-Gnorecose 4X. Polypeptone 2X, Meat extract 2X, Yeast
  • Ex. 2X First phosphoric acid 0.2X, magnesium sulfide 0.2X, calcium carbonate Vk, pH 7.0
  • the culture solution is centrifuged at 1.000 G
  • the SK body was added to 600 ml of a phosphate buffer (0.1 M, pH 6.5) and suspended, and 12.0 g of (Soil) 1 exo was added to the S3 solution.
  • One norbornyl acetate ((Sat) 11) was added, and the mixture was reacted at 30 ° C for 1 hour with stirring.
  • the pH of the reaction was kept at 6.5 ⁇ 0.2 by adding small amounts of sodium hydroxide 0.1N. After completion of the reaction, take out the reaction mixture, add the clonal form lnl, and extract the reaction products norborneol (1) -12 and norboler acetate (1) -1 to obtain the gaseous mixture.
  • (+) — (1R.2R.4S) exo-norborneol (+) — was detected at 8.5 g / nl and 5.2 og / aU 0.3 ⁇ ag / nl, respectively.
  • Toluene was added to this reaction solution, and extraction was performed twice (300 nl, 100 ml). Combining the toluene layer obtained from the two extractions yielded a 38 O BI toluene solution.
  • This toluene solution was concentrated to about 50 al, and 4.2 g of maleic anhydride was added to the mixture and the mixture was reacted at 115 for 4 hours. Add 30 l of sodium hydroxide, and stir for 5 minutes.
  • the obtained aqueous layer (200 ml) was acidified by adding an acid, extracted with dichloromethane (100), and concentrated to obtain maleic oxide (5.9 g).
  • the resulting maleic acid compound was dissolved in methanol (5 Onl), and then 4.0 g of potassium hydroxide dissolved in 50/1 water was added dropwise thereto. The mixture was reacted at room temperature for 30 minutes. After the reaction is completed, add dichloromethane and extract.
  • colorless crystals one (IS, 2S, 4B) - Interview click source over Bruno Le Borne per le (1) Yield 2. 8 s of 6 4% was an 2), [ ⁇ ] 2 5 D: - 3.0 1 ° CHC1 3), optical purity 9 0% ee.
  • Example 2 The same as in Example 1 from the reaction solution (400 nl) of the cell suspension obtained in the same manner as in Example 1 and (Shi) -exonorubonyl acetate ((Sat) 11) Norvolulacetate and norborneol were extracted with 300 ml of toluene, and the extract was concentrated to about 50 oils. After adding 4% of the acid, the mixture was reacted at 1 15 for 4 hours, then saturated sodium hydrogen carbonate solution (20 Onl) was added, and the mixture was stirred at room temperature for about 5 minutes, and then allowed to stand for 10 minutes.
  • the toluene layer and the aqueous layer were separated, and the toluene layer (50, 1 and water) g 20 O nl was obtained, and the obtained aqueous layer 20 O nl was acidified by adding concentrated hydrochloric acid. Then, 100 ml of dichloromethane was added and extracted, and dichloromethane was retained to obtain 7.3 g of a monoester of phthalic acid. Add 75 ml of ester After dissolving with chilled solution, 3.4 g of (1-)-X-ethyleneamine was added dropwise to obtain 9.0 g of monoesteramine phthalate monohydrate.
  • Example 1 The toluene layer 5 Onl obtained in Example 1 was depressurized under reduced pressure to obtain 4.9 g of oil-like norpolluacetate (1) -11. This norbornyl acetate is dissolved in 5 Oal of methanol, 50% of 8% sodium hydroxide is added dropwise, and the mixture is reacted at 50 for 2 hours. Extracted with tan. The obtained extract was decompressed * boxed and crystallized. 3.1 g of (+)-(1R.2E.4S) hexanoloneborneol (+)-2 was converted to colorless crystals. I got it. Yield 71%. Optical purity 95% ee or more.
  • Example 1 One liter of the GPBY medium IB-coated in Example 1 was placed in a 2 L miniature fermenter, inoculated with Acetobacter oasteurianus ATCC 9432, and cultured at 30 for 24 hours. After the cultivation, 10.0 g of (saturated) sodium porunyl acetate was added, and cultivation was performed for 4 hours. To this culture solution was added a 400: 1 mouth form, extracted, and the extract was subjected to gas chromatography to measure the content of the compound contained.
  • Norpornyl acetate 1 0.3 ng / ik (-) 1 (IS.2S.4R) 1-norbornolneol (1) 1 26.2 iig / nU and (10) 1 (1R.2R.4S ) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (+) 2 1 0.5 B g / ffll.
  • the KBYt GPBY medium 50 strain I prepared in Example 1 was sterilized by placing it in a 50 On 1 volume flask, inoculated with the living organisms shown in Table 1, and cultured at 30 for 24 hours. To this culture was added (soil) exo-ethanol acetate 500 and sealed with a rubber stopper. Thereafter, the cells were cultured for 16 hours.
  • Table 1 shows the results obtained by analyzing the norbornyl acetate and noreborneol, which have been cultivated by gas chromatography, in the same manner as J1.
  • Example 2 One liter of the GPBY medium described in Example 1 was placed in a 2 liter mini-farmer overnight, and Pseudo agriculture onas aeruginosa iFO 12582 and Saccharoayces so.SHS-20030 (FERM BP-4061) were added. Each was contacted and cultured at 30 for 24 hours. Each culture was harvested and washed by centrifugation as described in S3 in Example 1, and the ⁇ 7.0 was adjusted to 0.0 so that the optical density of each cell (Optical Density: 660 ⁇ ) became 10%. The suspension was suspended in 5 ml of a solution of purine acid.
  • This bacterium is a gram-positive bacillus, and its shape and size vary widely. Young cultivation tobacco (grass agar medium, culture for 30 to 8 to 12 hours) forms rods 1.0-1.1 x 3.0-4.0 mm in size, but as culture proceeds, the bacteria become shorter (grass agar). Medium, culture for 30 to 48 hours at 30>, and when the culture enters the arrest period, it becomes spherical (1.0-1. LK broth agar medium, culture for 72-96 hours at 30). No motility is observed.
  • Meat juice static S culture (cultured for 30 days at 30): Culture: It grows thickly on the surface layer, grows moderately over the entire narrow area, and has a very small amount of sediment *. No particular feeling is observed.
  • the growth temperature is 10-37.
  • the optimal growth temperature is 24-32 (peptone water).
  • Heat resistance 63 in skim milk, not viable in 30 minutes.
  • Cell wall composition Beso-MP (Beso-Diaminobimerin II) is not easily detected.
  • Acid production D—Glucose, galactose, D—Mannose, sucrose, trehalose, fructose (weak), and mannit (weak) produce acids, but L-arabinose, D -Almost no acid formation from xylose, and no acid formation from lactose, ribose, sorbose, ramnose, l / sitol, cellobiose and maltose.
  • Bacterial form The book is a spherical or circular 3.5-4.5 X 5-6 ⁇ B yeast » which grows mainly by budding. Budding is multipolarly observed from the cell surface (malt extract agar medium, 28, 3 cell culture) o No hyphae.
  • Spores Slightly oval spores are formed from 1 to 4 spheres in cells (Gorodokowa agar medium, cultured for 28, 10 days).
  • Glucose, galactose, sucrose, maltose, and raffinose are assimilated and fermentable, but lactose, cellobiose, Starch is both assimilated and fermented! No.
  • the post-reaction treatment was carried out in exactly the same manner as in Reference Example 1 using (1) -1 (IS.2S, 4R) -exonorborneol obtained in Example 2.
  • the crude product is made into sugar by low-pressure distillation, and Z 3-4 m seismic Hg fraction with boiling range 74-86 is collected and the desired (+)-exo 3 — (2-pro Diphenyl) -bicyclo [2.2,1] heptane 1-2-on was obtained.

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Description

小 明 細 害 光学活性ノ ルポルネ オ ー ルの製造方法 技術分野
本発明は微生物によ り ヱク ソ ー ノ ルポルナ ン型エ ス テ ルを 処理する ことによ り、 光学活性ノ ルボルネ オールを製造する 方法に関する。
背景技術
ノ ルボ ルネ オールの製造方法のう ち化学合成に よ る方法と しては、 ノ ルボル ンを出発^料と して有機酸と作用させノ ルポルナ ンのエ ス テル体と した後、 こ のエ ス テ ル体を化学的 に脱ァセ チル化してノ ルポルネオー ルを得る方法が知られて いる。 このよ うな化学合成による方法では、 4種の立体異性 体 （ （ + , 一） - (endo, ΘΧΟ) — ノ ルボルネ オール〉 が生 じ るので、 光学活性なノ ルボルネオー ルを化学合成的に得るに は、 煩雑な反応工程を必要とする。
ノ ルボルネ オールを生物学的に製造する方法と し ては、 ノ ルポルナ ンのエ ス テル体を微生物と接触あるいは酵素と反応 させ、 該エ ス テルを加水分解する方法が知られてい る。 最近、 オー バーハ ウ セル ら (丁 Oberhauser et al. , Tetrahedron , 3. 3931-3941, 1987) はカ ン ジダ シ リ ン ドラ セァヱ （ ndida cy 1 i ndraceae) 由来の リ パーゼを用いて （土） 一ノ ル ボルニルアセ テー トから （ - ) 一ノ ルボルネ オー ルを製造す る方法を報告している。 さ らに、 ォ リ タ二ら （T. Ori tani e t al. , Agr. Biol. Chen..31(10).1961-19 S4.1974) は、 卜 リ コ デルマ ' エ ス ビー （ Trichoderma S£) 、 ト リ コ デルマ コ ニ ンギ （ Trichoder爾 a koningi) 、 バチ ルス ズブチ リ ス 二ガ 一株 (Bacillus subtilis var. Niger) およびアブシディ 了 ヒ ア ロ スボラ（Absidia hyalospora》の培養狭を用いて、 （ 士） ポル -ルアセテー トおよび、 （土〉 イ ソ ボルュルァセテ ー トから （一） ボルネ オールおよび、 （一） イ ソ ボルネ オ一 ルを製造する方法を報告している。 しかしいずれも S択性が 低ぐ、 光学純度の低いものしか得られていない。 特開平 2 — 2 7 3 1 9 6 には一般に、 ラセ ミ化合物の光学分割を目的と して行う生物的触媒反応で、 銃像異性体の一方の反応を選択 的に阻害する阻害剤を添加する光学分割方法が開示されてお り、 こ のよ う な方法を光学活性ノ ルボルネオールの 製に使 用する こ とも可能である。 しかし、 光学活性ノ ルボルネオ一 ルの選択に有効な阻害剤をス ク リ ー二 ングによ り得る必要が ある うえに、 反応後の分取作 IIにお て阻害剤を除去しなけ ればならず操作が繁雑になる欠点を有する。 上記の様な背景 から、 光学活性ノ ルボルネオールを得るために、 エ ス テル加 水分解の際、 立体還択性の高い微生物あるいは酵素と接舳さ せる生物学的な方法の改蕃が要望されている。
発明の開示
本発明は微生物を利用してェ ク ソ一ノ ルポルナ ン型 Ϊステ ルを処理する こ と により高純度の光学活性ノ ルボルネオール を得る方法を提供する。
本発明の光学活性ノ ルボルネオー ルの製造方法は、 式 （ I )
Figure imgf000005_0001
(式中、 Rはァ シル基を、 Aおよび Bはそれぞれ水索を表わ すかまたは一緒になって結合手を表わす） で示される （士〉 一ェ ク ソ一ノ ルボルナ ン型エ ス テルに シユー ドモ ナ ス厲、 ァ セ トパク ター厲、 アース ロバクター厲、 ロ ド ト ルラ JSおよび サ ッカ ロ ミ セ ス JRに厲する »生物から選択される微生物また はその菌体処理物を接触させる工程を包含する。
本発明によれば、 上纪 ( I ) 式の （土〉 一エ ク ソ一ノ ルボ ナ ン型ヱ ステル類を上 βの微生物またはその ¾体処理物と接 胜させる ことによ って、 （ 2 S ) — ェ ク ソ一ノ ルボルナ ン型 エ ス テルが選択的に加水分解される。 こ れに よ り対応する光 学活性なアルコールと未変化の （ 2 R) — ェ ク ソ一ノ ルボル ナ ン型エ ス テルが分離される。
上記方法により、 反応液から （ 2 S ) — ェ ク ソ一ノ ルボル ナ ン型ア ルコ ール、 または （ 2 R) — ェ ク ソ一ノ ルボルナ ン 型エ ス テルが分取される。
本発明に使用する （土〉 一ェ ク ソ一ノ ルボルナ ン型エ ス テ ルは式 ( I ) で表される。
Figure imgf000006_0001
(式中、 Rはァシル基を、 Aおよび Bはそれぞれ水素を表わ すかまたは一猪になつて結合手を表わす）
式 （ I ) において、 ァ シル基は、 炭素数が 2 から 1 0個の脂 肪族ァ シル基であり、 好ま し く は、 炭素数 2 から 7個の脂肪 族ァシル基、 例えば、 ァセチル、 プロ ピオ -ル、 ブチ リ ル、 イ ソプチ リ ル、 ペンタ ノ ィル、 へキサ / ィル、 特に好ま し く は、 ホル ミ ル、 ァセチル、 プロ ビ才ュルまたはイ ソプチ リ ル である。 このァ 'ンル基はあるいは炭索数 4から 1 0個のシク 口アルキルカルポニル基であってもよく、 好ま し く は、 炭索 数 4 ない し 7個のシク ロ アルキルカルボ -ル基、 例えば、 シ ク ロプロバンカルボニル、 シク ロブタ ンカルボュル、 シク ロ ペンタ ンカルボ-ル、 シク ロへキサ ンカルボュルである。 あ るいはァ リールカルボニル基であり、 好ま し く は炭素数 7 な い し 1 1 個のァ リ ""ルカルポ -ル基例えば、 ベンゾィ ル、 P- ト ルオイ ル、 ナフ トイ ルをあげる こ とができ る。
この様な化合物は市販のものが使用され得、 あるいは化学 合成によっても簡単に製造され得る。 例えば、 ノ ルボルネ ン を、 酸触媒の存在下で適当な有機酸 （例えば、 珐酸、 醉酸、 ブロ ピオ ン酸、 κ酸等） と反応させるか、 または適当な有機 酸の ビニルエ ス テルと シク ロペ ンタ ジェ ンをディ ールス · ァ ルダー （ Diels-AUer〉 反応に付すこ とによ り、 所望の （土） 一ェ ク ソ一ノ ルボルナ ン型エ ス テ ル （ I ) を高収率で得る こ とができ る。
本発明においては、 シユー ドモ ナ ス厲、 ァセ ト パク タ ー厲、 アー ス ロ バク ター厲、 ロ ド ト ルラ厲またはサ ッ カ ロ ミ セ ス屈 に属する微生物が使用され得、 好適には、 シユー ドモナ ス . エ ルジノ ーサ Pseudoaonas aeruei nosa) 、 ァセ 'ク タ一 <ス ア ヌ ス ( cetobacter pasteurianus) 、 アー ス パ ク タ ー · エ ス ビー （ Arthrobacter . ) 、 ロ ド ト ルラ . パ リ ダ （ Rhodotorula pall Ida) 、 ロ ド ト ル ラ . ルブラ （ Rhodo torula rubra) ま たはサ ツ カ ロ ミ セ ス ' エ ス ピー （ Saccharo
SLZi i SP. ) が使用され得る。 特に好速には、 ァセ ト パク ター • ' ス ト リ ア ヌ ス ( Acetobacter pasteurianus) およびァー ス ロ バク タ一 · エ ス ピー （ Arthrobacter s£. ) が使用される。 具体的には、 Pseudoaonas aerugi nosa IFO 12582、 Acetob acter pasteurianus ATCC 9432、 Acetobact er pasteurianus ATCC 12873、 Arthrobacter s£. SHS-0145 微ェ研条寄第 406 0号（FERM BP-4060) Rhodotorula pallida IFO 0715、 Rhodo torula rubra IPO 1101, Rhodotoru la rubra ATCC 2510およ び Saccharonyces so, SHS-20030 (FERM BP-4061 )な どの菌株 が使用される。 上圮、 Arthrobacter SP. SHS-0 5および Sac charomyces SP. SHS-20030はそれぞれ、 特許手統上の微生物 の寄託の国際的承認に関するブタ ペス ト条約に従い、 曰本国 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に 1932年 11月 2曰 付で寄託番号第微ェ研条寄第 4060号（FEBM BF-4060)および同 第 4 0 6 1号（FERM BP-4061)と して寄託されている。
前述した微生物は、 グルコース、 蔗糖、 廃糖蜜、 ボ リ ぺプ ト ン-、 肉エキス、 酵母： cキス、 豚肉粉、 大豆粉、 燐酸、 マグ 本 ゥム、 铁など通常微生物の生育に用いられる栄養源を含 む培地に生育させる。
本発明方法においては、 （土） 一ェク ソ一ノ ルボルナ ンェ ステルに上記微生物菌体も し く は菌体処理物を接蝕させる。 具体的には、 例えば、 上圮微生物の培養液に直接 （土） ーェ ク ソーノ ルボルナ ン型エステル （ I ) を 0. 5— 1 0 %の濃 ¾ になるよ うに加えさ らに培蹇を行な う ことによ り、 該エステ ルが加水分解され、 ノ ルボルナン型アルコール 2 S — ( II) とノ ルボルナ ン型エステル 2 R— （ I ) とを得る こ とができ る。 この加水分解には、 上 Kの培養液の代わりに «体懸 S狭、 ¾体抽出液も用いるこ とができる。 菌体懸菊欲は、 培養液よ り遠心分離 · ろ ¾などの方法で ¾体を集め、 反応に適した PH となる緩銜液ゃ有機溶媒を含む緩銜液に懸 Sする こ とによ り 得られる。 菌体抽出硖は、 集菌した菌体を細胞溶解酵素を用 いるか、 超音波 · フ レンチブレスその他一般に使用される » 体破砕機を用いて破砕後、 遠心分離等の方法で »体破砕残 S を除去して ¾製するこ とができる。
本明細害において、 （土） 一ェク ソ一ノ ルボルナ ン型エス テルに微生物を接触させるとは、 培養液に直接 （土〉 ーヱク ソーノ ルボルナ ン型エステルを添加する こ とをいい、 菌体処 理物を接胜させる とは、 培養液の代わり に歯体 液または 菌体抽出狭を用いるこ とをいう。
反応を効率よ く行なわせるために、 添加する （土 ） 一エ ス テル （ I 〉 を、 1 0— 7 5 %にな る よ う に n—へキサ ン な ど の疎水性溶媒や ジメ チ ルスルホキ シ ド、 メ タ ノ ー ル、 ェ 夕 ノ ールなど親水性の溶媒に溶解して用いる こと もでき る。
本発明による上圮加水分解の反応工程を下記反応工程図 a に示す：
Figure imgf000009_0001
( 1》 ラセミ体 2 S—（I〉 2 R - ( I )
Figure imgf000009_0002
2 S— ） 2 R -( I )
上 3己工程図中、 R、 Aおよび Bはそれぞれ前記と同意義。 上 K工程図に示すよ う に、 ェク ソ ー ノ ルポルナ ン型エ ステ ルのう ち 2 S— （ I ) のみが選択的に加水分解され、 ェ ク ソ 一ノ ルボルナ ン型アルコ ール 2 S— (II) に変換される。 ノ ルポルナ ン型エ ス テル 2 ( I ) はほとんど未反応のまま 反応硖中に残存する。 こ の う に、 ノ ルボルナ ン型アルコー ル 2 S— (II) とノ ルボルナ ン型エ ス テル 2 R— （ I ) の混 合物を含む反応液が得られる。
得られたアルコ ール 2 S— (II) と未反応のま ま残ったェ ク ソ ーノ ルボルナ ン型エ ステル 2 R— （ I ) は公知の方法に 従って分離し得る。 例えば、 ク ロマ ト グラフ ィーによって分 雌するこ とも可能である。 またアルコ ール 2 S— (II) を速 当な方法 （無水フタル酸等の有機酸と反応させて、 ハ ーフエ ステルとするなど） により水溶性にした後、 抽出操作によ り 分離すれば ffi単に目的の光学活性なノ ルポルナ ン型化合物を 得ることができる。
以下、 （土） 一ェク ソ一ノ ルボュ ルア セテー ト を使用した 場合を例にと り、 本発明を説明する。
(以下余白）
(反応工程図 b；)
'XXDCH,
Figure imgf000011_0001
3 OCOCHg
(±)- 《 +〉- 1 (-〉 - 1
( 1 S, 2 S.4 R》 ( 1 .2 R.4 S )
一 分取
アル力リ加水分解
Figure imgf000011_0002
0Η
( + )- 2
( 1 R.2 R, 4 S)
上記反応工程図 bに示すよ う に、 本発明の処理によ って得 られた反応欲に: ¾当な溶媒を 0. 1〜 2倍量加えてノ ルボルネ オール (一） 一 2 とノ ルボルニルァセテー ト丄一） 一 1 を抽 出する。 溶媒と してはク ロ 口ホルム、 ジク ロ ロ メ タ ン、 酸 ェチル、 n—へ丰サンなどの溶媒を単独または混合して使用 すれば良い。 抽出されたノ ルボルネ才ール （一） 一 2 とノ ル ルュルアセテー ト （一） 一 1 は、 適当に濃縮した後、 生成 したノ ルボルネオール （一） 一 2 に対して 1〜 2 倍量の無水 マ レイ ン酸ゃフタ ル酸などの無水有接酸を加え、 ノルボルネ オール （ 一） 一 2 と有機酸 （マ レイ ン酸 フタル酸等） との 水溶性付加物を形成させ、 さ らにこ の反応狭に炭酸水素ナ ト リ ウムのような堪基性化合物の水溶液を加え、 中和する とノ ルボルネオール J_ Ll»_IL の有機酸付加物は水溶硖層に、 ノ ルポルニルアセテー ト ^は有機溶媒 Sに各々移行す る。 水 JSを分離し、 アルカ リ処理を行なった後、 ジク ロ ロ メ タ ンなどの適当な有機溶媒で抽出 ， 濃箱する と、 光学純度の 高いノ ルボルネオ一ル （一） 一 2 が得られる。 水層と分液し て得られた有機溶媒層のノ ルポルニルァセテ一 h (- ) - 1 は溶媒) ¾を«縮するこ とによ って回収できる。 回収の後、 市 - 販の リバーゼゃエステ ラーゼと接触させるか化学的に脱ァセ チル化するこ とによ って簡単に光学純度の高いノ ルボルネオ ール （ + ) — 2が得られる。
この様にして得た （一） 一ェク ソ一ノ ルポルネ オールまた は （十〉 一ェク ソ一ノ ルボルネオールは所望によ り文献記載 の方法 ( Irwin A.. Jones J. B.： J. Av. Chen. Soc. 98, 847 6-8481 ( 1976)) 等公知の方法に従って精製すれば、 容易に更 に高純度の光学活性体が得られる。 例えば、 これ らの化合物 を前記の方法で水溶性化合物に変換した後、 それぞれに （一） 一または （+ ) —フ * ネ チルァ ミ ンを加え、 それぞれの フ ネチルア ミ ン埴を形成させる こ とによ り 9 8 %ee含置以上の 高純度の光学活性体を得るこ とがで き る。 また、 通常用いら れるカ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ー処理を行なって精製する こ と もできる。
以下の绪実施例および参考例によ り本発明をさ らに詳し く 說明するが、 本発明はこれらによ り何ら制頃される ものでは ない。
荬施例 1
Acetobacter pasteuri anus ATCC 9432 を、 5 L容の小型ジ ヤ ーフ ァ ー メ ン夕 一に予め準備した 3 L の GPBY培地 （D-グノレ コース 4X. ポ リ ペプ ト ン 2X, 肉エキス 2X, 酵母エキ ス 2X . 第 1 燐酸カ リ 0.2X, 硫化マ グネ シ ウ ム 0.2X, 炭酸カ ル シ ゥ ム Vk、 pH 7.0) に植菌し、 2 8でで 2 4時間培 ¾した。 培 養液を 1.000G, 1 0分閉の遠心分離を行ない固形物を除いた 後、 20.000 G, 1 5分間高速違心分離を行ない »体を集め、 さ らに »体を生理食堪水で 2 回洗浄した。 こ の操作で 1 9 . 8 gの湿菌体を得た。 こ の SK体を 6 0 0 mlの燐酸バ ッ フ ァ ー ( 0 . 1 M . pH 6.5) に加えて懸 Sさせ、 この想 S3液に 1 2 . 0 gの （土〉 一ェ ク ソ一ノ ルボルニ ルアセテー ト （ （土 ）一 1 ) を添加し、 携拌しながら 3 0てで 1 時間反応した。 反応中、 0 · 1 N水酸化ナ ト リ ゥムを少量づっ加えて、 反応狭の pHを 6 ， 5 ± 0. 2 に保った。 反応終了後、 反応硖 l nlをと り ク ロ 口 ホ ルム l nlを加え、 反応生成物ノ ルボルネ オール （一） 一 2 およびノ ルボルエルァ セテ一 ト (一 ） - 1 を抽出 し、 ガス ク 口マ ト グ ラ フィー U & W 社製 光学分割用カ ラ ム C D X— B型 （ 0.2 5 aia X 3 0 m) 、 カ ラム温度 5 0で一 2 1 0 で〉 で分析したと こ ろ ェ ク ソ一ノ ルボルニルアセ テー ト、 （ 一） 一 ( IS.2S.4R) 一工 ク ソ一ノ ルボルネオール （一） 一 2、
( + ) — (1R.2R.4S) 一ェ ク ソ一ノ ルボルネ オール （ + ) — がそれぞれ 8. 5蘿 g/nl、 5.2 og/aU 0 · .3 ag/nl検出され た。 この反応液に ト ルエ ンを添加して、 2回抽出 （ 3 0 0 nl、 1 0 0 ml) 操作を行なった。 2回の抽出で得た ト ル Xン層を 合わせる と 3 8 O BIの ト ルエ ン溶液が得られた。 こ の ト ルェ ン溶液を約 5 0 alまで濃箱し、 こ の澳铕した被に無水マレイ ン酸 4. 2 gを加えて 1 1 5 でで 4時間反応を行なわせた後、 飽和炭酸水索ナ ト リ ウ ム谀を 3 0 ひ nl添加し、 5分間拢拌後、
1 0分間静置した。 反応後、 水 Λίと ト ルエ ン Sを分狭し、 水 jg約 3 0 0，1と ト ルエ ン S約 5 O nlを得た。
得られた水層 2 0 0 mlに、 酸を加えて酸性と した後、 ジク ロ ロ メ タ ン 1 0 0 で抽出し、 濃縮してマレ イ ン酸化合 物 5. 9 gを得た。 得られたマレイ ン酸化合物をメ タ ノ ール 5 O nlに溶解し、 これに水酸化カ リ ウ ム 4， 0 gを 5 0，1の 水 に溶解した水酸化カ リ ウ ムを滴下し、 室温で 3 0分反応させ た。 反応終了後、 ジク ロ ロメ タ ンを加えて抽出 ' *縮して、 無色結晶の （一） 一 （ IS, 2S, 4B) — ュ ク ソ ー ノ ル ボルネ オ一 ル （一） 一 2 を た 収量 2. 8 s 率 6 4 %) 、 [ α ] 2 5D: - 3.0 1 ° CHC13)、 光学純度 9 0 %ee。
実施例 2
実施例 1 と同様にして得られた菌体懸 «液と （士〉 ーェク ソ ーノ ルボルニルアセテー ト （ （土〉 一 1 ) との反応液 4 0 0 nlから実施例 1 と同様にノ ルボルュルァセテー ト および、 ノ ルボルネオールを ト ルエ ン 3 0 0 mlで抽出し、 こ の抽出液 を約 5 0 oilまで濃縮した。 この濃縮した液に 4. 2 gの無水フ タ ル酸を加え、 1 1 5で で 4時間反応させた後、 飽和炭酸水 素ナ ト リ ゥ ム溶液 2 0 O nlを添加し、 室温で約 5分間撹拌後、 1 0分間静 し、 ト ルヱ ン Sと水層を分欲し ト ル エ ン層 5 0 ，1と水 )g 2 0 O nlを得た。 得られた水層 2 0 O nlに濃塩酸を 加えて酸性と した後、 ジク ロ ロメ タ ン 1 0 0 mlを加えて抽出 し、 ジク ロ crメ タ ンを留ましてフ タ ル酸モノ エ ス テル体 7. 3 gを得た。 得られたフ タル酸モノ ヱ ス テル体を 7 5 mlの^酸 ェ チ ルで溶解した後、 （一） ー フ X ネ チ ルァ ミ ン 3 .4 g を滴 下しフ タ ル酸モノ エ ス テル体のフ ユ ネチルア ミ ン堪 9 . 0 g を 得た。 こ のア ミ ン埴にエ タ ノ ール 4 5 nlを用いて 2回再結晶 を行ない、 さ らに得られた結晶に ト ルエ ンおよび水を加え、 さ らに 8.3扇 1の 7.3 %塲酸溶液を滴下した後、 ト ルエ ン層 を分狭し 。 この ト ルエ ン） 8を濃縮後、 メ タ ノ ー ル 2 O ralに 溶解し、 1 7.4 %の水酸化ナ ト リ ウ ム硖を滴下し、 5 0でで 2時間反応を行なった。 この反応欲より ジク ロ ロ メ タ ン抽出 を行なぃ澳箱して、 1 .3 gの （一） 一 （IS, 2S, 410 —ェ ク ソ 一ノ ルボルネオール O_ _lを無色桔晶と して得た。 収率 5 0 %、 [ or ] 2SD: - 3.2 0。 （ C-1.30， CHC13)、 光学純度 9 8 % ee0
実施^ 3
実施例 1で得られた ト ルエ ン層 5 O nlを弒圧漠縮し 4.9 g のオイ ル様のノ ルポルエルァセテ一 ト (一） 一 1 を得た。 こ のノ ルボルニルァセテー トを 5 O alのメ タノ ールに溶解し、 8 %の水酸化ナ ト リ ゥム 50alを滴下し 5 0でで 2時間反応を 行なった後、 ジク ロロメ タ ンで抽出した。 得られた抽出狭を 滅圧 *箱し晶析させたところ、 3.1 gの （ + ) — (1R.2E.4 S) 一ェク ソ一ノ ルボルネオール （+ ) — 2を無色 晶と して 得た。 収率 7 1 %.光学純度 9 5 %ee以上。
実施例 4
実施例 1 に IB ¾した GPBY培地 1 Lを 2 L容の ミ ニ ジャーフ ァーメ ンターに入れ Acetobacter oasteurianus ATCC 9432 を接種して 3 0でで 2 4時間培養した。 培養後、 1 0.0 gの (土） ーェク ソーノ ルポルニルァセテー トを添加し 4時間培 養を铳行した。 この培養液に 4 0 0篇 1のク ロ 口ホルムを加え て抽出し、 抽出狭をガス ク ロマ ト グラフ ィーに付し、 含有さ れる化合物の含量を測定した待果、 ェク ソ一ノ ルポルニルァ セテー ト 1 0.3 ng/ik (-) 一 (IS.2S.4R) ー ェク ソ 一ノ ルボルネオール （一） 一 2 6. 2 iig/nU および （十） 一 （ 1R.2R.4S) 一ェク ソ一ノ ルボルネオール （ + ) 一 2 0.5 B g/ffllであつ た。
実施例 5
実 ¾te例 1 と同 にして得られた Acetobacter pas teuri anu s ATCC 9432 の湿菌体 1 0 gに 2 0 nlの 0. 1 M ト リ ス塩酸バ ッ フ ァー （PH 7.2 ) を添加して »体懸濁液を調製しフ レン チプレス にて 体を破碎した。 得られた歯体破砕液約 3 0 Bi に 0. 3 igのデォキシ リ ポヌ ク レアーゼを加えて氷中で 2 0分 間処理した後、 30, 00OG, 1 5分の遠心分離を行ない、 鹵体 およびその破砕物を除去し、 約 2 2 alの細胞抽出狭を得た。 この細胞抽出液 1 0轚 1に 1 0 0 agの （土〉 一工ク ソ一ノ ルボ ルニルァセテ一 トを添加し、 3 0でのィ ンキュベータ一中で 緩やかに拢捽しながら 1 時間反応を行なった。 反応終了後、 1 0黼 1のク ロ 口ホルムを加えて抽出 し、 抽出液をガス ク ロマ ト グラ フ ィ一に付して、 含有される化合物の含置を測定した。 その結果、 この抽出液中のェク ソ一ノ ルボルニルアセテー ト， (一） 一 (IS.2S.4R) 一ェク ソ一ノ ルボルネオール （一） - 2., および （ + ) — ( IE.2R, 4S) 一ェク ソ一ノ ルボルネオ一 ル （ + ) — 2 の ¾度は各々 4.6邐 g/il. 3. 0 Bg/al, および 0. 3霞 g/nlであった。
実施例 g
実施例 1 に Kjttした GPBY 培地 5 0震 Iを 5 0 O n 1容のフ ラ ス コに入れて滅菌し、 表 1 に示す徼生物を接種し、 3 0で、 2 4時間培養した。 この培養狭に （土） 一ェ ク ソ一ノ ルポル- ルアセテー ト 5 0 0 を添加し、 さ らにゴム栓で シール した 後、 1 6時間培養を行なった。 こ の培餮欲のノ ルボルニルァ セテー ト、 ノノレボルネオールを実旌伊 J 1 と同様にガスク ロマ ト グラフ ィ一で分折した結果を表 1 に示す。
表 1
Figure imgf000018_0001
♦NAC ： ェクソ一ノルポルエルァセチ一
実施例 1
実施例 1 に記載した GPBY培地 1 Lを 2 L容のミ ニ ジャ ーフ ァ ーメ ン夕 一に入れ、 Pseudo農 onas aeruginosa iFO 12582お よ Saccharoayces so. SHS-20030 (FERM BP-4061)をそれぞ れ接胜して 3 0でで 2 4時間培養した。 各々の培養狭を実施 例 1 に S3載したように遠心分離操作により集醏 · 洗菌し、 各 々の菌体光学 S度 （Optical Density: 660ΠΜ) が 1 0 になる ように ρΗ 7.0 の 0.0 5 Μの煉酸綾銜液に懸濁した。 （士） 一ェ ク ソ一ノ ルボルニルァセテー ト は予め 5 0 Ψ/ 澳度にな るよう に ジメ チルスルホキ シ ドで溶解しておいた。 各菌体の懸 S¾ l 0 O alを 5 O O al容のフ ラ ス コ に入れ 5 0 % (土 ） 一ェ ク ソ一ノ ルボルニ ルアセテー ト溶硖を 2.0 m 1添加し、 ゴム栓でシールした後、 3 0でで反応を行な った。 反応の進行は、 pH7.0に保つに必要な 0.1 N水酸化ナ ト リ ゥ ムの添加量でモニター し、 終点近く では少置の反応液 （ 0 . 5 ml) をと り、 実施例 1 に述べたと同様にガス ク ロ マ ト フ ラ フ ィ 一で反応物を確^した。 添加したノ ルボル - ルァセ テー トが約 7 0 %まで分解した時点で反応を停止し、 l O O nlの ト ルエ ンを加えてノ ルボルニルァセ テー トおよびノ ルボルネ オールを抽出した。 こ の抽出液を約 2 5 nlまで濃縮し、 0.4 gの無水マ レイ ン酸を添加して 1 1 5で、 4時間反応を行な つた。 飽和炭酸水紫ナ ト リ ウ ムを 2 5 mi添加して室混で 5分 間撹拌後、 約 1 0分静 Bし、 水) 8と トルエン層に分液した。 ト ルエ ン jgを濃縮する とオ イ ル様の （一） 一ェ ク ソ一ノ ルボ ルニルア セテー ト (一） 一 1 が得られた。 こ のノ ルボルニル アセテー トを 1 0編 1のメ タ ノ ールに溶解し、 8 %の水酸化ナ ト リ ウ ムを滴下し、 ア ルカ リ下で.5 0で、 2時間反応を行な つ た。 こ の反応液よ り ジク ロ ロ メ 夕 ン 1 Ο πΙを加えて抽出 し、 抽出液を濃縮して （+ ) — (1R.2R.4S) — ェ ク ソ - ノ ルボル ネオール ( + ) - 2を析出させた。 この結晶をガス ク ロ マ ト グラ フ ィ 一で分析したと ころ、 表 2 に示すよ うな拮果を得た。
(以下余白） 表 2·
Figure imgf000020_0001
*モル (%) =得られた （ （一〉 一 2〉 の转 (»g) , n Λ *モル収率（％) 一添加した （ （±) _ 〉 （ng) X 1/2 x 1 0 0
8
if co S2 Antibiotic nediu震 3 培地 50 ml を 500 ml 7ラ ス:!に入れアース ロ バク タ一 ' エ ス ピー (Arthrobacter, s£) S HS-0145 (PERM BP- 4060》を接種して 3 0 でで 2 0時間培養し た。 培 ¾後、 100 tag の （土） -ェ ク ソ -ノ ルボルニルァ セテー トを添加しさ らに 8時間培養を統行した。 こ の培養液に 20 ml の ク ロ 口 ホルムを加え、 ノ ルボル -ルアセテー ト、 ノ ルボ ルネオールを抽出し、 抽出液中に含まれる （-)-(lS.2S, 4K〉- ェ ク ソ -ノ ルボルネオール （ 一） 一 2、 （+)-(lR, 2R, ェ ク ソ -ノ ルボルネ オール （十〉 一 2を実施例 1 と同様にガス ク ロ マ ト グラ フ ィ一で含量を各々測定した。 その桔果、 抽出谀中 には、 1.02麗 g/nl の（-〉-(lS,2S.4R)-ェ ク ソ -ノ ルボルネ オ一 ル (- - 2. O.llng/il の （+)一 UR,2R,4S) -ェ ク ソ -ノ ルボ ルネオ一ル ( + ) 一 2 が含まれていた。
以下に本実施例で用いたアース ロバク 夕一 ' エ ス ビー（ 11 hrobacter S£. ) SHS-0145 (FER BP- 4060)の菌学的性状を示 す。
1. 形態学的特徵
本菌はグラムポジィ ティ ブの桿菌で、 菌形 ' 大き さは変化 に富む。 若い培赛時栢 （肉汁寒天培地、 30で、 8-12時間培養） では 1.0-1.1 X 3.0-4.0 Β の大き さの桿菌状となるが、 培 養が進むと菌は短小化し （肉汁寒天培地、 30で、 24-48 時間 培養〉 、 やがて培養が停止期にはいる と球 ¾状 （直径 1.0-1 . l K 肉汁寒天培地、 30で 72-96 時間培養） となる。 胞子 の形成は認められない。 運動性を有する。
2. 培養上の性状
肉汁寒天平板上の生育 （ 3 0で、 7 曰培養） ： 2 4時間以内 に 1.4-1.6 ηι 平 *な表面で、 隆起の少ない、 光沢のある、 淡黄色から淡黄白色の円形のコ ロニーを形成する。
肉汁斜面培養上の生育 （ 3 0で、 7 曰培養） ：接種画線に沿 つて絲線状に、 良好に、 牛酷質に生育する。
肉汁高層寒天培養での生育 （ 3 0 で、 7 曰培養〉 ：表面に良 好に生育し、 突剌竦の上部のみに生育が認められる。
肉汁液静 S培養 （ 3 0で、 7 日培養） ：培養硖表層に厚膜状 に生育し、 狭全体に中庸に «り、 沈 *物の量は微量である。 特に具気は認められない。
3. 生育
生育温度：生育可能温度 10-37で。 最適生育温度は 24-32で（ ペプ ト ン水）。 耐熱性：スキム ミ ルク中 63で、 30分で生存でき ない。
生育 pH:生育可能 pH 5.2-10。 最速生育 pHは 6.0-9.0(ぺプ ト ン水）。
酸素に対する挙動：好気的。 嫌気下での生育 （ガスパ ッ ク、 肉汁寒天平扳） は認められない。
4. 細胞壁組成： Beso-MP(Beso-ジァ ミ ノ ビメ リ ン黢）は検出 され ¾い。
5. D N Aの G + C含量： 57¾
6. 主な生理学的猪性質
O Fテス ト ： 才キシディ ティ ブ （D—グルコース）
酸の生成： D— グルコース、 ガラ ク ト ース、 D—マンノ ー ス、 シユーク ロース、 ト レハロース、 フ ラク トース （弱〉 、 マンニッ ト （弱） から酸を生成するが、 Lーァラ ビノース、 D—キシロースから殆ど酸の生成は認め られない。 ラ ク トー ス、 リ ボース、 ソルボース、 ラ ムノ ース、 ィ / シ トール、 セ ロ ビオース、 マル トースからの酸の生成も 32められない。
リ トマス ミ ルク ： 陰性
ゼラ チ ン液化： 陰性
V P反応： 陰性
MR反応： 陰性
硫化水素の生成： 陰性
ク ェ ン酸の利用性： 陽性 （ク リ ス テ ンセ ン培地、 シモ ンズ 培地）
無棒 N¾の利用性： ア ンモ -ゥ ム塩、 ¾酸塩とも利用する。 ゥ レア ーゼ： |¾性
カ タ ラ ーゼ： 賜性
ォキ シダーゼ： ¾性
D Nエース ： 陰性
メ チ レ ンブルーの S元： S性
7. 分離源： S本の土壤 以下に実施例 6 および 7で用いたサ ッ カ ロ ミ セ ス · エ ス ビ 一 ( SaceharoBYces sp. ) SHS-20030 (PEEM BP - 4061)の ffi学的 性状 ¾: 75す o
1. 形態的特微
菌の形状： 本 は球形ないし榷円形の 3.5-4.5 X 5-6^ Bの酵 母 »で、 增殖は主に出芽により增殖する。 出芽は钿胞表面か ら多極に認められる （麦芽エキス寒天培地、 2 8 で、 3 曰間 培養〉 o 菌糸は認められない。
子囊胞子： 細胞内に 1 〜 4個の球形からやや楕円形の胞子 を形成 （Gorodokowa寒天培地、 2 8 、 1 0 日間培養〉 。
2. 糖の発酵性と同化性
グルコ ース、 ガラ ク ト ース、 シ ユ ー ク ロ ー ス、 マル ト ー ス、 ラ フ イ ノ ースを同化し、 発酵性が認められるが、 ラ ク ト ース、 セ ロ ビオース、 ス ターチは同化も発酵も！ 2め られない。
3. その他の生理試联
バラ フ イ ンの同化： 瞎性
確酸力 リ ウ ムの同化： 陰性 アルブチ ンの分解： 陰性
• ビタ ミ ン要求性： な し 産業上の利用可能性
本発明で得た光学活性な /ルポルナ ン型アルコールの利用 方法を以下の参考例に示す。
考例 1
実施例 1で得た （一〉 一 US, 2S.4B) — ェ ク ソ一ノ ルポル ネ オール 2.8 g ( 0 , 0 2 5モル） を堪化メ チ レ ン 5 6 slに 溶解し、 ビ リ ジニ ゥ ム ク ロ 口 ク ロ メ イ ト （P P C ) 8. 1 £ ( 1.5モル比〉 モ レキュラ シーブ 4 A l gを加え 2 5〜 3 0 でで 1時間反応した。 反応狭を トルエ ン 5 6 alで希釈後、 'ン リ カゲル 2 8 gのカ ラ ム中を通し不溶物を除去する。 流出液 を濃縮乾固すると粗製の （十） 一ノ ルカ ンフ ァーが白色の桔 晶性粉末と して得られる。 得られた （ + ) —ノ ルカ ンフ ァ ー をテ ト ラ ヒ ド ロ フ ラ ン 4 5纖 1に溶解し、 L D A ( 1.1 モル比) のテ ト ラ ヒ ドロフ ラ ン 3 0■ 1溶被中に一 1 0 1 5でで滴 下する。 同温度で 2 0分間反応後、 ァ リ ルプロマイ ド 3 · 3 g ( 1. 1モル比） を 0で以下で滴下し、 室温で 3時間反応する 反応硖を水水 7 O nl中に流入し、 希 «Κ水で酸性に した後、 ト ルエ ン 5 0纖 1で 2回抽出を行なう。 ト ルエ ン層を水洗後、 溶媒を «圧下留去する と粗製の （ + ) —ヱク ソ ー 3 — （ 2— プロぺュル〉 一ビ ンク ロ 【2.2 , 1 ]ヘプタ ン ~ 2 — オ ンが油 状残 ¾と して得られる。 これを減圧蒸 »にて、 沸点範囲 9 2 〜 ： 1 0 3 でノ 1 0 〜 1 2 naHgの溜分を集める こ と によ り、 精 製した。 収 fi 3. 0 7 g ( 収率 8 2 %〉 、 化学純度（GC) 9 8 . 6 %、 エ ン ド異性体 0. 4 ¾ 光学純度（HPLC) 9 0 %ee、 比 旋光度 [な 〗 25D+ 8 4 . 6 ° (C-1.0. CHCl3)o
恭考例 2
実施例 2で得た （一） 一 （ IS.2S, 4R) -ェク ソ ー ノ ルボル ネオールを用いて参考例 1 と全く 同様に反応後処理を行なつ た。 粗生成物を减圧蒸溜にて糖製し、 沸点範囲 7 4 〜 8 6で Z 3〜 4 m震 Hgの溜分を集めて目的の （+ ) -ェク ソ ー 3 — （ 2 —プロぺニル） ー ビ シク ロ [2 . 2 , 1 ]ヘプタ ン一 2 — オ ン を得た。 収置 1 , 3 8 g (収率 7 8 %) 、 化学純度（GC) 9 8 . 8 %, エ ン ド異性体 0. 9 %、 光学純度（HPLC) 9 8 %ee、 比 旋光度 [a ]25D+ 8 9 。 （C-1.2B6. CHCl3)s I R (Filii) 3060 , 1740. 1640. 1460, 1440. 1310. 1090 οη_1ο 1 H N M R (CDCU) δ 1.30-2.00 (i. 8H), 2.5-2.6(u. 3H) δ 4.90-5.20 (議. 2H), 5.7-5.9(B. lH)
上圮参考例によ り得られた化合物は例えば、 文献記載の方 法 U. Med. Chen. ϋ(9). 1847-1854 (1988) )によ り、 医薬と して有用な Τ Χ Α2レセブタ ーア ンタ ゴニ ス 卜 に導く こ とがで き る ο

Claims

3ff求の範囲
式 （ I ) ：
Figure imgf000026_0001
(式中、 Rはァ シル基を、 Aおよび はそれぞれ独立して水 素を表わすかまたは一緒になつて結合手を表わす 0 ) で示される （土） 一ェ ク ソ一ノ ルボルナ ン型エ ス チルに シュ ー ドモナ ス厲、 ァセ ト バク 夕ー厲、 アースロ バク ター厲、 ο ド ト ルラ厲およびサ カ ロ ミ セス属に厲する微生物から遷択 される微生物またはその菌体処理物を接胜させる工程を包含 する光学活性ノ ルポルネオールの製造方法。
2. ( 2 S ) — ェ ク ソ一ノ ルポルナ ン型アルコ ールを分取 する蹐求項 1 に Ϊ3«の製造方法。
3. ( 2 R ) 一ェ ク ソ一ノ ルポルナ ン型エ ス テルを分取す る請求項 1 に記«の製造方法。
4. Rがァセチル基である »求項 1、 2または 3圮載の製 造方法。
5. 微生物がァセ ト バクタ一 · バス ト リ ア ヌ ス に Λする も のである II求項 1、 2、 3または 4 に記載の製造方法。
6· 微生物がアース ロバク タ一 ' エス ビー S H S — 0 1 5 (微ェ研条寄第 4 0 6 0号〉 である、 請求項 1、 2、 3 ま たは 4に Ε«の製造方法 7 · ア ー ス ロ バ ク タ一 . エ ス ピー S H S — 0 1 4 5 (微ェ 研条寄第 4 0 6 0号） 。
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