WO1993003139A1

WO1993003139A1 - Cell culture support, production thereof, and production of cell cluster using same

Info

Publication number: WO1993003139A1
Application number: PCT/JP1992/000998
Authority: WO
Inventors: Hideaki Sakai; Tomoko Yoshino; Koichi Nakamura; Teruo Okano; Noriko Yamada; Yasuhisa Sakurai
Original assignee: Kao Corporation; Tokyo Women's Medical College
Priority date: 1991-08-08
Filing date: 1992-08-05
Publication date: 1993-02-18
Also published as: EP0552380A1; EP0552380A4

Description

明細書

細胞培養支持体、その製造法

およびそれを用いる細胞集合体の製造法

癸明の分野

本発明は、生化学、医学および免疫学等における細胞類の培養用支持体、その製造法およびそれを用いる細胞集合体の製造法に関するものである。

従来の技術

従来、細胞培養は、ガラス表面上あるいは種々の処理を行った合成高分子材料の表面上にて行われていた。例えば、ポリスチレンを材料とする表面処理 (例えば、ァ線照射、シリコンコーティング等）を行った種々の容器力、細胞培養用支持体として普及している。このような細胞培養用支持体を用いて培養 ·増殖した細胞は、従来、トリプシンのような蛋白分解酵素や化学薬品により処理することで支持体表面から剥離 ·回収されていた。しかしながら、前述のような処理を施して増殖した細胞を回収する場合、処理工程が煩雑になり、不純物混入の可能性が多くなつたり、増殖した細胞が前記処理により変性し、細胞本来の機能が損なわれる等の欠点が指摘されている。

そこで本発明者等は、前記欠点を解消するために、トリプシンや E D T Aのような蛋白分解酵素や化学薬品等による処理を施さずに環境温度を変化させるだけで、培養 ·増殖させた細胞を支持体表面から剥離 ·回収することが可能な細胞培養に使用する支持体材料を以前に提案した（特開平 2 - 2 1 1 8 6 5号公報)。

しかしながら、この発明による細胞集合体では、温度を変えることにより剥離 ·回収が可能になるものの、基材上のポリマー被覆表面上に凹凸が認められる場合があり、例えば、培養中の細胞を顕微鏡観察する際に表面の凹凸像が培養細胞像に重なり、観察に支障をきたすことがあった _c 発明の目的

本発明は、前記公報の癸明をさらに発展させ、基材上のポリマー被覆表面が 03凸の無い平滑なものであり、顕微鏡等による細胞の培養状況が明確に観察され、しかも、細胞の剥離'回収がより容易にかつ効杲的に行える細跑培養支持侔、その製造法およびそれを^ 、る細胞集合体の製造 Sを提供することを目的とする。

本癸明者らの充に提案した細胞培養支持体において、被覆するホモポリマーまたはコポリマーを特定範固の量とすることにより、ポリマー被覆表面が、培養細胞観察時に一般に用いられる光学顕微鏡下で凹凸のほとんど認められない平滑なものとなることがわかった。したがって、先に提案した細跑培養支持体を使用した場合のように、凹凸像と培養細跑像が重なることなしに細胞の培養状況が明確に観察でき、また、細胞培養時には、細胞が支持体表面に均一に付着し、増殖することが可能になる。さらに、培養細胞の剥能 ·回収時により効率が良くなる、先の細跑培養支持侔を使用した場合と同様に集合状態の剥離雜跑が得られる等の効杲を見い出した。

癸明の概要

本発明は、細胞付着性基材および該基材表面上に被覆量 2〜 8 O i g/m² で被覆された水に対する臨界溶薛温度が 0〜 8 0 ^eCのポリマー層からなる細胞培養支持体を提供する。

本癸明はまた、水に対する臨界溶蘚温度が 0〜 8 CTCのポリマーを与えるモノマーおよび溶媒を含有するモノマー溶液を、該モノマー溶液の溶媒成分の塗布量が 3〜： L 0 0 ml/n:²となるように基材表面上に塗右した後、電子線照射する細胞培養支持体の製造 ¾を提俟する。

本癸明はさらに前記細胞培養支持^を^ (、て細胞を培養し、剥離処理する細胞集合体の製造法を提供する。

発明の詳細な説明

本発明の細胞培養支持体は、基材表面上が特定のポリマーで被覆されたものである。該ポリマーは、 0〜8 0 °C、好ましくは 1 0〜5 0 °C、さらに好ましくは 1 5〜 3 7 °Cの臨界溶解温度（以下、単に「T」ということがある）を有するものである。 Τが 8 0 °Cを越えるようなポリマーを被覆ポリマーとして使用した場合、後で述べる本発明の細胞集合体の製造に当り、培地はポリマーの Tより高い温度におかれなければならないことから、該温度では細胞の活性の極度の低下または細胞の死滅が起こり、また丁が 0 °Cより低いポリマーを使用した場合、培地を 0てより低い温度におかなければならず、前記と同様に細胞活性の極度の低下などが起こる。なお、

「臨界溶解温度」とは、 2層分離している 2種の物質が、ある温度になると互いに完全溶解して均一層となる温度をいう。特に、温度を上げて完全溶解する場合の温度を「上限臨界溶解温度」、温度を下げて完全溶解する場合の温度を「下限臨界溶解温度」という。

本発明のポリマー層のポリマーは（メタ）アクリルアミド、 N—置換または N, N—ジ置換（メタ）ァクリルァミド、アルキルビニルエーテルおよびそれらの混合物よりなる群から:！択されるモノマーから得られるホモポリマーまたはコポリマーである。（メタ）アクリルアミドの窒素原子の置換基は、具体的には、炭素数 1〜8のアルキル基、炭素数 2〜8のアルコキシアルキル基、炭素数 3〜6のシクロアルキル基、窒素原子または酸素原子を含む複素璟基（複素環の窒素原子が（メタ）アクリルアミドのァミド基を構成する窒素原子であってもよい）等が挙げられる- また、増殖細胞の種類によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合、被覆物質と細胞培養支持体との梠互作闱を高める必要が生じた場台、細跬支持体の親一 . 水 ·琼水性のバランスを調整する必要がある場合等は、前記以外の他のモノマ一類をさらに加えて共重合してよい。本発明に使用する前記ボリマーとその他のポリマーとのグラフトまたはブロック共重合体、あるいは本発明のポリマーと他のポリマーとの混合物を用いてもよい。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架橋することも可能である。本癸明にいる好適なポリマーとしては、例えば、特開平 2— 211865号公報に開示されたポリ一 N—イソプロピルアクリルアミド（T=32。C) 、ポリ一 N—n—プロピルアクリルアミド（T=21°C) 、ポリ一 N— n—プロピルメタクリルアミド（T= 32 °C) 、ポリー N—ェトキシェチルァクリルァミド（T=約 35°C) 、ポリ一 N—テトラヒドロフルフリルァクリノレアミド（T=約 28 V) 、ポリ一 Ν—テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Τ=約 35°C) 、ポリ一 N，N—ジェチルァクリルアミド（T = 32°C) 等が挙げられる。その他のポリマーとしては、例えば、ポリ一 N 一ェチルアクリルアミド、ポリ一 N—イソプロピルメタクリルアミド、ポリー N—シクロプロピルアクリルアミド、ポリ一 N—シクロプロピルメタク-リルアミド、ポリ一 N—ァクリロイルピロリジン、ポリ一 N—ァクリロィルピペリジン、ポリメチルビ二ルエーテル等が挙げられる _c

本癸明に使用する細胞培養支持体は、基材上にポリマーを被覆して得られる。ボリマーの被覆量は 2〜8 Offig/ni²、好ましくは 4〜50mg/in²、さらに好ましくは 6〜3 Omg/m²である。ポリマー被覆量が 8 OmgZni²を越えると、細胞が細胞培養支持体表面上に付着することが困難となり、逆に被覆量が 2 mgZni²未満になると細跑が付着して培養可能になるが、剥離 · 回収することが困難になる。

ポリマーの被覆量は、例えば、フーリエ変換赤外分光計全反射法 (FT 一 I R— ATR法）、被覆部または非被覆部の染色や蛍光物質の標識による分析、さらに接触角測定等による表面分析を単独あるいは併用して求めることができる。その中で、例えば、基材としてポリスチレン製ペトリディッシュ [ファルコン（Falcon) 3002) ] を使用し、被覆するポリマーをポリ一 N—イソプロピルァクリルアミドとした場合の FT— I R-AT R法による被覆量の定量法は以下のとおりである。

ポリマーの被覆量が I R光の侵入深さより十分に薄いと仮定し、基材であるポリスチレンを内部標準（常に一定量になるものとする）とすると、ポリスチレン量に対する被覆されたポリマー量の比率を以下の式（1) ：吸収強度比 = Abs_16<QZAbs₁₆₀₀

[式中、吸収強度比はポリスチレン量に対する被覆されたポリマー量の比率、 Abs₁₆₄₀は被覆されたポリ一 N—イソプロピルアクリルアミド由来のアミド I (1640cn-リ吸収強度、 Abs_16t)0は基材であるボリスチレン由来のベンゼン環伸縮 (1600cm-¹) 吸収強度を意味する] から求めることができる。

予め既知量のポリー N—ィソプロピルァクリルァミドをファルコン 30 0'2表面上に塗布し、式（1) より塗布量と吸収強度比に関する検量線を作成すれば、本発明の細胞培養支持体の被覆ポリマー量は、吸収強度比を測定すれば、前述の検量線から求めることが可能となる。

被覆を施される細胞付着性基材は細胞が付着する材質ならばいずれでもよく、その材質としては、通常細跑培養に用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の高分子化合物、あるいはセラミックス、金属等が挙げられる。その際、基材表面はオゾン処理、ブラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を用いて親水化を施されたものでも良い。形状はべトリディッシュに隈定されることはなく、プレート、ファィバー、（多孔質）粒子、あるいは、一般に細胞培養等に用いられる容器

- D- の形状（フラスコ等）であってもよい。

本癸明においては、このような細跑付着性基材表面上に、 0〜8 0 °Cの臨界溶蘚温度を有するホモポリマーまたはコポリマーを被覆するが、基材表面を上部から観察して、被覆されている部分の総面積は、細胞付着性基材表面総面積の 4 0〜1 0 0 %であり、細跑の剥離性を考えると 6 0〜1 0 0 %が好ましく、 7 0〜1 0 0 %がさらに好ましい _c 被覆部分を上部から観察して、その形態は何ら限定されるものではないが、例えば、ラインとスペースからなるパターン、水玉模様のパターン、格子状のパターン、その他特殊な形のパターン、ある 6いはこれらが混ざっている状態等の微細なパターンが子ましい。また、その被覆部の大きさ、さらに横から見た形は何ら限定されるものではない。さらに、その被覆部分と非被覆部分の配置は規則的であっても、不規則的であってもよいが、その 2者は微細に分散されていることが好ましい。

被覆率は、 X線電子分光法（X P S ) による元素分析、被覆部または非被覆部の染色や蛍光物質の標識による分析、さらに接触角測定等による表面分析を単独あるいは併用して求めることができる。例えば、基材としてポリスチレン製ペトリディ、リシュ (ファルコン 3 0 0 2 ) を使用し、被覆するポリマーをポリ一 Ν—イソプロピルアクリルアミドとした場合、ポリスチレンには存在せずボリ一 Ν—イソプロピルァクリルァミドに存在する Ν原子（アミド詰合由来）を X P Sにより測定し、以下の式（2 ) ：

被覆後の Ν%

被覆率 X 1 0 0

ポリ - Ν -ィブァ Dビル了ミドの Ν % (12. 5 % )

から被覆率を求めることができる _c

前記方法によれば、着巨可能な原子は Nだけでなく、被覆するポリマー中に存在する他の原子（例えば酸素原子）でも同様に被覆率を算岀することが可能である。

基材へのポリマーの被覆方法は、後述するような化学的方法、物理的方法を単独であるいは併用して行うことができる。被覆時に前記モノマーを使用する場合、そのモノマーは常温において気体、液体、固体のいずれの状態のものでもよい。また、ポリマーを使用する場合においても、そのポリマーは常温において液体、固体状態のいずれの状態のものでもよい。これらのものを化学的な反応によって結合させる場合、電子線照射（E B ) 、ァ線照射、紫外線照射、プラズマ処理、コロナ処理、さらに基材と被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカルおよびイオン反応等の一般に用いられる有機反応を用いることができる。物理的な相互作用による方法としては、被覆材料自身または基材との相溶性が良いマトリックスを媒体とし、塗布、混練等の物理的吸着を用いる方法等があるが、これらに限定されるわけではない。

例えば、モノマーと適当な溶媒を含む溶液を基材上に塗布した後、霉子線照射してモノマーを重合させることによつても行える。周いる溶媒は、モソマーを溶解するものであれば特に限定されないが、常圧下で漭点が 1 2 0 °C以下、特に 4 0〜1 1 0てのものが好ましい。沸点が高すぎると、電子線エネルギー重合効率が低下する。好ましい溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、 n (または i )一プロパノール、 2 (または ri )一ブタノール、水等が挙げられ、それらの 1種以上使用してよい。その他の溶媒、例えば、 1一ペンタノール、 2—ェチルー 1ーブタノール、 2—ブトキシエタノール、エチレン（またはジエチレン）グリコールまたはそのモノエチルエーテル等も 1種以上使用してよい。溶液には、その他に添加剤として、硫酸、水酸化ナトリウム、塩化ナトリウム等を配合してよい。溶液のモノマー濃度は特に限定されないが、最終的に得られる細胞培養支持一 I ' 体の性能面と、基材上への前記溶液の塗布性を考慮すると、例えば、 1 0 ~ 7 0重量％が好ましく、さらに耔ましくは 2 0〜6 0重量％、最も好ましくは 3 0〜5 5重量％である。

この溶液の基材への塗布量は、溶液中の溶媒成分塗布量として、 3〜1 0 O lZn!²、好ましくは 5〜5 O mlZn²となる量である。溶媒成分塗布量が 3 mlZm²未漓であると、基材上への溶液の塗布性が悪く、逆に 100E1/E ² を越えると、得られる細胞培養支持体表面が平滑とならず好ましくない。また、モノマー溶液塗布量としては、例えば、 1 0〜1 5 0 mlZiE²、特に 1 5〜 7 0 ml ¾²が好ましい。

溶液の基材への塗布法は公知のいずれの方法でもよく、例えば、スピンコーター、バーコ一ター等による塗布法、噴霧塗布法等が挙げられる。塗布後、溶液が塗布された基材に対して電子線を照射し溶液内のモノマ一の重合を行う。電子線照射量は 5〜4 0 Mrad、好ましくは 1 0〜3 5 Mr ad、さらに好ましくは 1 5〜 3 0 Mradである。照射量が 5 Mrad未満であると、細胞の剥離性が十分得られない。逆に 4 O Mradを越えると、基材が変色や亀裂等の劣化を起こす。なお、電子線照射量は次式：

f X霉子流（mA)

電子線照射量 (Mrad) =

ラインスピート nt miiu

[式中、 ίは電子線照射装置に固有のスカラー値を意味する]

によって求められる。電子線照射は一度に行ってもよいが、複数回に分けて段階的に行ってもよい。後者の場合、最終的に得られる細跑培養支持体の控能面および支持体表面の平滑性の点から、電子線総照射量は 5〜4 0 Mradが耔ましく、初回電子線照射量は 1 ~ 1 0 Mrad. 特に 2〜 6 Mradが好ましい。その他の電子線照射条伴としては、電子線発生部の真空度 5 X 1 0 Torr以下、電子線加速電圧 1 5 0〜6 0 0 kV、照射部の酸素濃度は（乾

一 S一燥）窒素ガスあるいはその他の不活性ガスの導入等により 2 , 0 0 O ppm以下とすることが好ましい。

電子線照射により基材上にポリマーが被覆される。電子線照射後、通常の後処理、すなわち、洗淨、乾燥、滅菌等を行って本発明の細胞培養支持体を得る。洗浄は、例えば基材上に被覆されたポリマーを膨灑させるに十分な温度の脱イオン水を用いて行ってよく、また、超音波をかけながら行つてもよい。

本発明の細胞集合体の製造法は、かくして得られた細胞培養支持体上にて行われる。本発明の細胞培養支持体に適用される細胞は特に限定されないが、例えば、ゥシ大動脈血管内皮細胞、ゥシ肝実質細胞、ラット肝実質細胞、ラット腺維芽細胞、ヒト血管内皮細胞、ヒトケラチノサイト等が挙げられる。このような細胞は当業者に周知の方法で入手し得る。細胞の培養は、通常、 0〜5 0 °Cで行われる。本発明の細胞培養支持体による培養においても、この通常行われる温度域で良いが、被覆されるポリマーが上限臨界温度を有していれば、それ以下の温度で行い、ポリマーが下限臨界温度を有していれば、それ以上の温度で行う必要がある。その他の培養条件は特に隈定されず、当分野において通常行われる条件下で培養を行ってもよい。例えば、培地としては、ゥシ胎児血清（F C S ) 等の血清が添加されているものでもよいし、無血清培地でもよい。

培養後、培養細胞を細胞培養支持侔から剥離 ·回収するには、周囲温度を上記ポリマーの上限臨界溶解温度以上、好ましくは上隈臨界溶解温度より 1 0 °C高い温度、あるいは下限臨界溶解温度以下、好ましくは下限臨界溶解温度より 1 0 °C低い温度以下に変化させるだけでよく、細胞を培養していた培養液中においても、その他の等張液中においても可能であり、目的に応じて選択することができる。その際、培養細胞を効果的にかつ容易

- Q - に剥離させるため、細胞培養支持体を軽くたたいたり、摇らしたり、更にはピぺット等を使用して培地を撹拌するなどしてもよい。

本癸明の細胞培養支持体は、免に提案した細胞培養支持体に比べて、基材表面上のポリマーの被覆が均一になされたものである。そのため、培養中の細胞は、支持体表面にむらなく均一に付着し、増殖することができる。したがって、支持倖上の個々の細跑は、より均一な条件で培養されたことになり、剥離 '回収した個々の細跑は比較的に機能にばらつきのないものである。また、前記手段により、例えば、シート状、集合体の状態で細跑を剥離 ·回収した場合、本発明によるものは均一にむらなく培養できるため、芫に提案した細胞培養支持体からのものに比べて、欠損部（細胞のない部分）のないシート状あるいは境状細胞集合体が得られる。

以下、被覆ポリマー調製用モノマーとして、 N—イソプロピルアクリルアミドを用い、支持钵基材として、一般に細胞培養用ペトリディッシュ材料として用いられるポリスチレンを Sいた場合を例にとって、本発明の作用を具体的に説明する。

前述のように、本癸明の細胞培養支持体は、特定範囲の被覆量、特定範囲の被覆率で N—イソプロピルァクリルァミドの重合体が被覆されたものであり、支持体表面（すなわち、基 ¾上の被覆ポリマー表面）に凹凸がほとんど生じない。また、 N—イソプロピルアクリルアミドを溶^している溶媒が基材上に特定範囲の塗布量で塗布されるため、電子線照射の際の溶媒の薛間的な蒸発または突涛を避けることができ、その結杲、基材上の溶液層の厚さが均一となり、溶液の被覆むらの発生が防止できる。したがつて、本発明の細跑培養支持体は、支持体表面に凹凸がほとんどなく、支持体上で培養される細胞は支持体表面全体にむらなく均一に付着、増殖することが可能となり、その際、培養細胞が表面の凹凸に隠れて観察しにくいということもない。

このように、支持体基材上に被覆されたポリー N—ィソブロピルァクリルアミドは水溶液中で約 3 2ての下限臨界溶解温度を有する。下限臨界溶解温度である 3 2 °C以上では、このポリマーはその占有体積が小さくなり、ポリマー中の水分子を排除して、支持体表面は疎水性を示す。しかし、逆に 3 2て以下では、ポリマーの占有体積が大きくなり、ポリマー中の水分子が占める体積分率が上昇し、支持体表面は親水性を示すようになる。したがって、温度を制御するだけで細胞培養支持体表面の親水 ·踩水性は調整され、細胞の支持体への接着性が変化する。そのため、温度を変化させるだけで、培養 ·増殖後の細胞を破壊することなく、細胞培養支持体から容易に剥離 ·回収することが可能となる。

このようにして得られた本発明における細胞およびその集合体は、以下に示すような利点を有する。

①増殖した細跑は化学的処理により障害を受けることがなく、細胞本来 'の機能が損なわれていない。 ②剥離した細胞は欠損部がなく集合体を保持で.きている。 ③倔々の細胞機能にばらつきのな、一様な培養細胞が得られる。 ④剥離した細胞およびその集合体は、培地以外の不純物が含まれていない。

実旌例

以下、本発明を実施例により、より具体的に説明するカ^ 本癸明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例；！〜 5

基材としてべクトン 'ディキンソン ' ラブゥニァ（Becton Dickinson L abware) 社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュを用い、培養細跑としてゥシ大動脈血管内皮細胞を採用した。ペトリディッシュ基材表面を被覆するために、まず、ペトリディッシュ表面をイソプロピルアルコールを ^いて洗し、窒素気流下で乾燥した _c このペトリディッシュ上に、後記表 1に示す溶媒量を用い、所定の濃度に調製した N—ィソプロピルァクリルァミドのィソプロピルアルコール溶液を所定量添加後、水平な合の上に静置し、モノマー溶液を塗^ ·展開させた後、 251^^(3の電子線を1回照射した。その際の電子線発生都の真空度は 1 X 10 _^sTorr以下、電子線加速電圧は 20 OkV、照射部の酸素濃度は 100 Oppm以下とした（以下の実施例、比較例においても同様)。電子線照射後、 5°Cのイオン交換水によりペトリディッシュを浼淨し、残存モノマーおよびべトリディッシュ表面に結合していないホモボリマーを取り除いた。クリーンベンチ内で乾燥させ、さらにエチレンォキサイド（E 0) ガス滅菌を行ない、さらに十分に脱気を行なうことにより、最終的な製品である細胞培養支持体材料を得た。

得られた細胞培養支持体表面上の被覆量は、 FT— IR— ATR法（使用檨器： J I R-RFX3002. 日本電子製）を用い、 128回積算した詰杲から明細書中に記載の式（1) に徒って吸収強度比を算出し、さらに、予め作成しておいた検量線より求めた。その際に使用した検量線の式を以下に示す。

被覆量 OngZm²) =37.6 x吸収強度比

得られた結杲を後記表 2に示す。

また、得られた培養細胞支持体表面上のボリマー被覆率は、 XPS (使用機器： ES CA1000. 島津製作所製）を用い、入射角 90度の分析値より、明細書中に記載の式（2) にって求めた _c 得られた詰杲を表 2 に示す。

さらに、このものの被覆面の平滑性を先学顕微鏡下で、表面に凹凸の有

— 1 一無を調べることにより検討した。結杲を表 2に示す。

ゥシ大動脈血管内皮細胞の培養は、得られた細胞培養支持体材料上にて- ゥシ胎児血清（FCS) を 10%含むダルベッコ一改変イーグル培地（D MEM) を培地として、 5%二酸化炭素中、 37°Cで行なった。十分に細胞が増殖したのを確認した後、培養液を 5°Cに冷却し、 30分間放置して、付着 Z増殖細胞を剥離させ、増殖細胞剥離回収率を下式に従って求めた。結果を表 2に示す。

剥離回収した細胞総数

増殖細胞剥離回収率 (％) = X 100

増殖させた細胞総数

その際、剥離回収した細胞総数および、増殖させた細胞総数を計測するためには、細胞を個々の状態にしなければならない。したがって、剥離回収した細胞総数は、 5^eCに冷却、放置した後、回収した細胞瑰に対し、トリブシン一 EDT A処理を行ない細跑を個々の状態にして行なった。また、増殖させた細胞総数は、前記方法で剥離回収した細胞総数に、 5°Cに?令却、放置しても剥離しなかった細胞をトリブシン一 EDT A処理にて、個々の状態に剥離させた細胞総数を加え合わせることにより求めた。

表 1

実施例 6および 7 べクトン 'ディキンソン ' ラブゥ-ァ钍製ファルコン 3 0 0 2ペトリデイツシュを用 t、、電子線照射量を 2 0 Mrad 1回（実施例 6 ) 、 3 5 Mrad 1回

(実施例 Ί ) とする以外は実施例 2と同様にして細胞培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実施例 2と同様に検討した結杲を後記表 2に示す。その支持体上で、実施例 2と同様にゥシ大動脈血管内皮钿膣を培養し、これを剥離回収して増殖細跑剥離回収率を求めた。結杲を表 2に示す。

実施例 8および 9

べクトン ·ディキンソン ·ラブゥ二ァ社製フアルコン 3 0 0 2ペトリディッシュを用い、電子線照射を 1 0 Mrad 1回（実施例 8 ) 、 1 5 Mrad 1回 (実施例 9 ) とする以外は実施例 3と同様にして細胞培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実施例 3と同様に検討した結果を後記表 2に示す。その支持痒上で、実施例 3と同様にゥシ大動脈血管内皮細胞を培養し、これを剥離回収して増殖細胞剥離回収率を求めた。

ΪΞ杲 2に刁、 1 c

-実施例 1 0および 1 1

べクトン 'ディキンソン ·ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディッシュを用い、 N—イソプロピルアクリルアミドを溶解する溶媒をェタノール（実施例 1 0 ) 、水（実施例 1 1 ) とする以外は実施例 2と同様にして細胞培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実施例 2と同様に検討した詰杲を後記表 2に示す。その支持侔上で、実旌例 2と同様にゥシ大動脈血管内皮細胞を培養し、これを剥離回収して増殖細跑剥離回収率を求めた。結果を表 2に示す _c

実施例 1 2および 1 3

べクトン 'ディキンソン · ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディッシュを用い、 N—イソプロピルアクリルアミドの代わりに ^:—エトキンェチルァクリルァミド（実施例 12) 、 X— n—プロピルメタクリルァミド（実施例 13) を使 Sする以外は実施例 3と同様にして細跬培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実旌例 3と同様に検討した結果を後記表 2に示す。その支持体上で、実施例 3と同様にゥシ大動脈血管内皮細胞を培養し、これを剥離回収して増殖細胞剥離回収率を求めた。結杲を表 2に示す _c

10- 表 2

1 1被覆率 I 覆 in ；増殖細胸剥離

I I (mg/mつ 1 (%) ！の平滑拦！回収率（％)

\実施例 1 ： 28 j 100；平滑 j 〉90 i

1実施例 2 ！ 12 ！ 991 平滑 1 〉90 I 実施例 3 1 9 j 75；早滑 j > 90 ！

1実施例 4 ； 7 1 δ δ i -Tin ！ >90 j

1実施例 5 ； 6 1 44 j 平滑！ > 90 j 実施例 6 I 10 ！ 8δ j 早滑！ >90 ；実施例 7 I 18 j 1 ο ο；！ >90 ：実施例 8 1 ⁴ 平滑 >90 j 実施例 9 5 66 j 平滑 >90

実施例 10 15 ' 100 j 平滑 >90

実施例 11 9 791 平滑 >90

実施例 12 ！ 1 δΐ | 平滑 >90

実施例 13 ； 9 741 平滑 >90

比較例 1

べクトン *ディキンソン ·ラブゥニァ社製ファルコン 3002ペトリディッシュを、表面処理を全く行なわずにそのまま細跑培養支持^材料としていた以外は実施例 1と同様な実験を行なった。詰杲を後記表 3に示す。比較例 2

基衬としてべクトン *ディキンソン ·ラブゥニァネ土製ファルコン 300 2ペトリディッシュを ffiい、！\'一イソプロピルアクリルアミドを使 Sせずに実施例 2と同じ条俘で電子線を照射し、そのものを細跑培養支持体材料として用いた以外は実施例 2と同様な実験を行なつた。結果を後記表 3に示す。

比較例 3および 4

基材としてべクトン ·ディキンソン · ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュを用い、表 4に示す溶媒量を用いて所定の濃度に調製したモノマー溶液を使用する以外は、実施例 1と同様な実験を行なった。結果を後記表 3に示す。

表 3

実施例 1 4〜 1 8

べクトン ·ディキンソン ·ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディッシュを S t、、電子線照射を表 5に示すように複数回に分割して実施する以外は実施例 3と同様にして細跑培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実施例 3と同様に検討した結果を後記表 7に示す。その支持体上で、実施例 3と同様にゥシ大動脈血管内皮細跑を培養し、これを剥離回収して、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表 7に示す。 33ζ Ο

；電子線照射線量 (Mrad) | 初回照射時！ 2段目照射時 3段目照射時 i 実施例 14 1 1 1 δ 0 '

実施例 15 3 2 0 0 ：

Ϊ

実施例 16 6 2 0 0 i

実施例 17 1 0 2 5 0 ！

実施例 18 6 6 1 δ ！

実施例 1 9〜 2 2

べクトン ·ディキンソン · ラブゥニァ社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュ上に、 Ν イソプロピルアクリルアミドを表 6に示す溶媒量を用いて所定の濃度に調製したイソプロピルアルコール溶液を、表 6に示す量で添加し、水平な台の上に静置させる以外は実施例 1 5と同様にして細胞培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実施例 1 と同様に検討した詰果を後記表 7に示す。その支持体上で、実施例 1と同様にゥシ大動脈血管内皮細胞を培養し、これを剥離回収して増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表 7に示す =

表 6

モノマー溶液展開したモノマー使用した溶媒量濃度 (重量％) 溶液量（ffilZm²)

実施例 19 6 0 4 7 1 9

実施例 20 δ 0 4 7 2 4

実施例 21 4 δ 4 7 2 7

実施例 22 3 0 4 7 3 4 ；実施例 2 3および 2 4 べクトン -ディキンソン 'ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュを用い、 N—イソプロピルアクリルアミドを溶解する溶媒をェタノール（実施例 2 3 ) 、水（実施例 2 4 ) とする以外は実施例 1 6と同様にして細胞培養支持体材料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実施例 3と同様に検討した結杲を後記表 7に示す。その支持体上で、実施例 3と同様にゥシ大動脈血管内皮細跑を培養し、これを剥離回収して増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表 7に示す。

実施例 2 5および 2 6

べクトン ·ディキンソン 'ラブゥニァ社製フアルコン 3 0 0 2ペトリディッシュを^い、 N— ^ f ソプロピルァクリルァミドの代わりに !\-ーェトキシェチルァクリルァミド（実施例 2 5 ) 、 N— n—プロピルメタクリルァミド（実施例 2 6 ) を使用する以外は実施例 1 7と同様にして細跑培養支持体料を得た。被覆量、被覆率および被覆面の平滑性を、実旌例 3と同様に検討した結杲を後記表 7に示す。その支持体上で、実施例 3と同様にゥシ大勖脈血管内皮細胞を培養し、これを剥離回収して増殖細跑剥離回収率

¾：求め Γ: ο SB'果 : ¾ (に不 S o

I被覆量被覆率材料被覆面増殖細胞剥離

I (mg/m²) (% の平滑性回収率（％) 実施例 14 1 δ ί 6 δ ! 平滑 > 90

実施例 15 7 73 平滑 > 90

実施例 16 ！ 10 86 ！平滑 1 〉 90 ！実施例 17 ： 12 98 ί 平滑 > 90 1 実施例 18 ； 15 100 平滑〉 90 ！実施例 19 29 1001 平滑 1 〉 90

実施例 20 ^; 11 ! 9 δ 1 平滑〉 90 ！実施例 21 ！ 9 74 平滑〉 90

実施例 22 8 80 平滑 > 90

実施例 23 11 8 δ 平滑 > 90

実施例 24 6 69 军滑 > 90

実施例 25 12 99 平滑 > 90 1 実施例 26 11 ! 98 平滑 > 90

比較例 5

基材としてべクトン 'ディキンソン ' ラブゥユア社製フアルコン 300 2ペトリディッシュを用い、 Ν—イソプロピルアクリルアミドを使せずに実施例 15と同じ条件で電子線を照射し、そのものを細胞培養支持体材料として用いた以外は実施例 3と同様な実験を行なった。結杲を後記表 8 に:^ 0

比較例 6および 7

基材としてべクトン ·ディキンソン · ラブゥ-ァ社製フアルコン 300 2ペトリディッシュを ¾い、表 9に示す溶媒量を用いて所定の濃度に調製

一ゥ-, - したモノマー溶液を使用する以外は実施例 15と同じ条件で電子線を照射し、そのものを細胞培養支持体として用いた以外は、実施例 3と同様な実験を行なった。結杲を後記表 8に示す。

2 8

表 9

実施例 1~5の結杲から明らかなように、被覆量が 2〜8 O^g K 被覆率が 40〜100%であり、基材表面上に展開する N—ィソプロピルァクリルァミド溶液中の溶媒であるイソプロピルアルコール量が 3〜1 X 10² ml/m²の範囲であれば、得られた細跑培養支持体材料の表面は、表 2に示す通り顕微鏡レベルでは平滑であり、しかも、増殖細胞剥能回収率は、 9 0%以上の値が得られる。この現象を実現するための方法は、実施例 1〜 5のいずれの方法によっても可能であり、細跑培養支持体材料として先に提案した細脗培養支持体より好ましいものである。その際、実施例 6〜9 に示すように電子線照射線量を変化させること、実施例 10および 11に示すように溶鎮の種類を変化させること、さらに、実施例 12および 13

-99- に示すようにモノマー種類を変化させること等の方法を実施しても、この現象を実現することが可能である。実施例 1 4〜2 6に示されるように、電子線照射を複数回に分割しても同様に可能である。

—方、比較例 1に示すように、無処理のファルコン 3 0 0 2では増殖した細胞を温度を低下させるだけで剥離回収することはできなかった。また、比較例 2および 5で示すように、モノマー溶液を展開せずに電子線を照射しただけの材料でも同様であった。比較例 3および 6のように、被覆量、被覆率および溶媒量がいずれも所定の範囲以下の材料では、細胞が増殖するものの、温度を低下させるだけで剥離 ·回収することはできなかった。比較例 4および 7のように、溶媒量が 1 X 1 0 ½l/m²以上で調製することにより得られた材料では、増殖細胞剥離回収率は 9 0 %以上の値が得られたものの、顕微鏡下では被覆表面に凹凸が認められ、培養中の細胞像がその凹凸の像と重なつて細胞観察の行ない易さという点で不十分な性能の材料であった。

実施例 2 7

実施例 3で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するため、これを遠心分離（6 0 0 G、 5分）により回収し、十分に撹拌し、個々の細胞とした後、 2 x 1 0 ⁵個の細胞をべクトン ·ディキンソン ·ラブゥユア社製フアルコン 3 0 0 2ぺトリディッシュ上で苒び培養させた。細胞の培養は実施例 3 と同様の方法を採用した。結杲を後記表 1 0に示す。

実施例 2 8

実旌例 1 5で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するため、これを違心分離（6 0 0 G、 5分）により回収し、十分に撹拌し、個々の細胞とした後、 2 x 1 0 ⁵個の細胞をべクトン 'ディキンソン · ラブゥニァ社 Sファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュ上で再び培養させた。細胞の培養実施一 9::— 例 3と同様の方法を採用した。結杲を後記表 1 0に示す比較例 8

比較例 1で培養した付着細胞を 0. 0 5 %トリプシン一 0. 0 2 %E D T A処理し、剥離させた細胞の損傷度合を確認するため、これを遠心分離（6 0 0 G、 5分）することにより回収し、得られた 2 x l 0 ⁵傰の細胞をべクトン ·ディキンソン ·ラブゥヱァ社製フアルコン 3 0 0 2ペトリデイツシュ上で唇び培養させた。培養は実施例 1と同様の方法を探用した c 結果を表 1 0に示す。

表 1 0

剥離回収細胞の損傷度合については、表 1 0に示すように、実施例 2 7 お.よび 2 8では培養開始時の 1 0倍まで再増殖させることが可能であるが、比較例 8では 5倍までしか再増殖させることができなかつこ。このことは、本発明の剥離回収細胞は従来のそれよりも損傷度が小さいことを意味する。実旌例 2 9

実施例 2で得られた剥離細胞の接能の均一性を確認するため、得られたシート状細跑集合体を 4分割し、それぞれ十分に撹拌し、個々の細胞とした後、 2 x 1 0 ⁶個の細胞をべクトン 'ディキンソン 'ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ぺトリディッシュ上で再び培養させた。細胞の培養は実施例 2と同様の方法を採 Sした。細胞の機能は、培養 1曰後、常法であるラジオイ厶ノアツセィ法を用いてプロスタサイタリンの安全代謝産物である α -keto - F I a量を求めることにより判断した、 4分割した細胞集合体のそれぞれの活性を後記表 1 1に示す。

実施例 3 0

実施例 1 6で得られた剥離細胞の機能の均一性を確認するため、得られたシート状細胞集合体を 4分割した。後の操作は実施例 2 9と同様の方法を採用した。 4分割した細胞集合体のそれぞれの活性を後記表 1 1に示す。比較例 9

比較例 1で培養した付着細胞 [低温にしてシート状細胞集合体を得ることができないため、活性はペトリディッシュ全体で 1点（早均値）しか測定できない] を、 0. 0 5 % トリプシン一 0.◦ 2 % E D T A処理し、剥離させた細胞の損傷度合を確認するため、これを遠心分離（6 0 0 G、 5分）することにより回収し、得られた 2 X 1 0 ⁶個の細胞をべクトン ·ディキンソン ·ラブゥユア社製ファルコン 3 0 0 2ペトリディッシュ上で再び培養させた。細胞の培養および活性測定は実施例 2 9と同様の方法を採用した。結果を表 1 1に示す。

表 1 1から明らかなように、剥離回収細胞の活性は、実施例 2 9および 3 0では、いずれも比較例 9に比べて 6〜7倍であった。また、実施例 2 9および 3 0において、分割 1〜4の各活性も略同様であった。このことは、本発明の剥離回収細胞が、従来のものよりも損傷度が小さく、しかも、ポリマーが被覆された支持体表面上においての均一に培養できることを意味- 9 Ό ο

本発明の細胞培養支持体は、トリプシンや E D T Αのような蛋白分解醇素や化学薬品等による処理を经ずに、周囲温度を変化させるだけで細胞培養支持体から培養細跑を剥離♦回収することができるため、 ①処理工程が簡略化される、 ②不純物等の混入の可能性が完全になくなる、 ③増殖した細胞が化学的処理により細胞膜が障害されるということがなく、 ④細胞本来の機能が損なわれない、 ⑤剥離した細跑が集合状態を保持している、 ⑥ 細胞の培養 ·回収を繰返し行なうことができる等の有利な点を持つ。また、本癸明の細跑培養支持体は支持体表面が平滑であり凹凸がないため、顕微鏡下での細胞像に凹凸像が重なることがなく、培養細胞の顕微鏡による観察が容易にかつ明確に行われる。さらに、従来の細胞培養支持体は一般にその支持体表面の状態に細胞の培養 ·回収锼能が大きく依存するが、本癸明によれば支持体の表面状態に左右されることなく機能が一様に発現するため、製品の品質が安定し、歩留りも良好となる上に細胞の種類に応じて最適なモノマ一種ノ配合量を選択することも可能となる。

一 —

Claims

請求の範囲

1 . 細胞付着性基材および該基材表面上に被覆量 2〜 8 O mgZffi²で被覆された水に対する臨界溶解温度が 0〜 8 0 Cのポリマー層からなる細胞培養又持体。

2. 基材上に被覆されたポリマー層の水に対する臨界溶温度が 1 0〜 δ 0 °Cである請求項 1記載の細跑培養支持祐。

3 . 基材上に被覆されたポリマー層の水に対する臨界溶解温度が 1 5 ~ 3 7 °Cである請求項 1記載の細胞培養支持体。

4 . 基材上に培養されたポリマー層が（メタ）アクリルアミド、 N—置換または N, N—ジ置換（メタ）アクリルアミド、アルキルビニルエーテルおよびそれらの混合物よりなる群から選択されるモノマーのホモポリマ一またはコポリマーを主として含有する請求項 1記載の細胞培養支持体。

5. ポリマー被覆量が 4〜 5 O mg/iE ²である請求項 1記載の細胞培養支持体。

6 . 細胞付着性基材がガラス、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートセラミックスまたは金属である請求項 1記載の細胞培養支持体。

7 . 細胞付着性基材の表面が親水化処理されてし、る請求項 1記載の細胞培養支持体。

8 . 基材表面を上部から観察して、ポリマー層で被覆されている部分の面積が基材の 4 0〜 1 0 0 %である請求項 1記載の細跑培養支持体。

9 . 基材上の被覆されたポリマー層がポリ一 N— ^ (ソプロピルァクリル Ύミド、ポリ一 N— n—プロピルァクリルァミド、ポリ一 N— n—プロピルメタクリルァミド、ポリ一 N—ェトキシェチルァクリルァミド、ポリ一 N—テトラヒドロフルフリルァクリルァミド、ポリ一 N—テトラヒド口フルフリルメタクリルァミド、ポリ一 -\^:, 一ジェチルァクリルァミド、ポーヮ 7一リ一 N—ェチルァクリルァミド、ポリ一 N—イソプロピルメタクリルアミド、ポリ一 N-シクロプロビルアクリルアミド、ポリ一 N—シクロプロピルメタクリルァミド、ポリ一 N—ァクリロイルピロリジン、ボリ一 N—ァクリロイルビペリジン、ポリメチルビニルエーテルよりなる群から選択される請求項 4記載の細胞培養支持侓。

1 0. 水に射する臨界溶-解温度が 0〜 8 CTCのポリマーを与えるモノマ一および溶媒を含有するモノマー溶液を、該モノマー溶液中の溶媒成分の塗布量が 3〜1 0 O mlZin²となるように基材表面上に塗布した後、電子線照射することを待徵とする細胞培養支持体の製造法。

1 1. 溶媒が常圧下で 1 2 0て以下の点を有する請求項 1 0記載の製

2. 電子線の総照射量が 5〜4 O Mradである請求項 1 0記載の製造法 _c

3. 電子線照射が複数回に分けて段階的に行われる請求項 1 0記載の

1 4. モノマーが（メタ）アクリルアミド、 N—置換または N, N—ジ置換（メタ）アクリルアミド、アルキルビニルエーテルおよびそれらの混合物よりなる群から選択される請求項 1 0記載の製造法。

1 5 · 基材上の被覆されたポリマー層がポリー N—イソプロピルァクリルアミド、ポリ一 N— n—プロピルアクリルアミド、ポリ一 N— n—プロピルメタクリルァミド、ポリ一 N—ェトキシェチルァクリルァミド、ポリ一 N-テトラヒドロフルフリルァクリルアミド、ポリ一 N-テトラヒドロフルフリルメタクリルァミド、ポリ一！\^τ, 一ジェチルァクリルァミド、ポリ一 Ν—ェチルァクリルァミド、ボリー Ν—ィソプロピルメタクリルァミド、ボリ一シクロプロピルアクリルアミド、ポリ一； —シクロプロピルメタクリルァミド、ポリ一 Ν—ァクリロイルピロリジン、ポリ一 Ν—

- C - アタリロイルビペリジン、ポリメチルビニルエーテルよりなる群から選択される請求項 10記載の製造法。

16. 基材上に形成されたポリマー層の被覆量が 2~8 Omg/m²である請求項 10記载の製造法。

17. 請求項 1記載の細胞培養支持体を用いて細胞を培養し、剥離処理することを特徵とする細胞集合体の製造法。