WO1992012429A1 - Analyse a sensibilite elevee de facteur tissulaire et kit utilise a cet effet - Google Patents

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WO1992012429A1
WO1992012429A1 PCT/JP1992/000005 JP9200005W WO9212429A1 WO 1992012429 A1 WO1992012429 A1 WO 1992012429A1 JP 9200005 W JP9200005 W JP 9200005W WO 9212429 A1 WO9212429 A1 WO 9212429A1
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protein
kit
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Kimihiko Matsuzawa
Ryoichi Hasegawa
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Teijin Limited
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
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    • Y10S436/826—Additives, e.g. buffers, diluents, preservatives

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring tissue factor in a sample with high sensitivity and a kit used for the measurement. More specifically, the present invention relates to a method for immunologically and highly sensitively measuring human tissue factor in a human sample by a sandwich method, and a kit used for the measurement.
  • Tissue factor is a lipoprotein involved in the coagulation reaction of blood, conventionally called “tissue thromboblastin” or “coagulation factor ⁇ ”, and is a complex protein composed of a lipid part and a protein part (apoprotein).
  • tissue factor which is a type of c, has been delayed in research at the molecular level due to its extremely low biological content and difficulty in purification.
  • the cDNA of the apoprotein of tissue factor was cloned and its nucleotide sequence and amino acid sequence were determined (Spicel, ER, et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 845148 (1987), Morrissey, JH, et. al .: Cell 84 129 (1987), Scarpati.
  • the apoprotein of human tissue factor is composed of amino acid residues 263, and its molecular weight is reported to be 47 KD by SDS-electrophoresis.
  • Tissue factor is present in almost all living tissues of various animals including humans, but in particular, the circulatory system, for example, the dense brain, lung, placenta, It is distributed relatively abundantly on the vascular endothelium and is usually expressed and present as a membrane protein on the membrane of cells in these tissues.
  • tissue factor together with factor VII is a protein that plays a central role in the initiation mechanism of the extrinsic coagulation reaction. (Bach, R. et al.,: Biochemistry 25 4007 (1986), Fair, DS et al.,: J. Biol. Chem 262, 11692 (1987), Weiss. HJ, et al.,: Blood 73, 968. (1989)).
  • Tissue factors having physiological effects as described above have been attracting attention as important factors for blood coagulation. Therefore, easy and accurate measurement of minute amounts of human tissue factor in a sample plays a very important role in the research of cardiovascular basic medicine and clinical medicine.
  • a typical example is the measurement of tissue factor activity by a two-step method called Nemerson's method (Nemerson, Y. J. Clin. Invest. 4772 (1968)). Briefly, the measurement method is as follows: a mixed solution of coagulation factor VII and factor X is added to a sample, reacted for a certain period of time, and then the reaction solution is added to crude phospholipid-added normal plasma, and the coagulation time is measured. Especially
  • RIA radioimmunoassay
  • a buffer exhibiting a pH near neutrality in an aqueous solution of phosphoric acid, Tris, Hepes, or the like, and a non-binding solution such as Triton or Tween are used as an immunoreaction solution. It describes that an aqueous solution containing a polar solubilizer is used,
  • tissue factor in blood eg, serum or plasma
  • a first object of the present invention is to provide a method for immunologically measuring human tissue factor in a sample by the Sandwich method with high sensitivity, and a kit therefor.
  • a second object of the present invention is to provide a method for accurately and highly sensitively and immunologically measuring a tissue factor contained in human blood, particularly serum or plasma, as a specimen, and a kit therefor.
  • the object and advantages of the present invention are that a sandwich for immunologically measuring a tissue factor in a sample by an immune reaction in a buffer solution.
  • a monoclonal antibody specifically recognizing human tissue factor apoprotein and immobilized on an insoluble carrier, and a human tissue factor apoprotein specifically recognizing the apoprotein;
  • second antibody a labeled monoclonal antibody
  • the molecular weight is about 160,000 to about 500,000 and the isoelectric point is 1.
  • the measuring method is as follows:
  • the first antibody in (a) is a monoclonal antibody that specifically recognizes the apoprotein of human tissue factor and is immobilized on an insoluble carrier
  • the second antibody in (b) is a human antibody against human tissue factor. Specifically recognizes apoprotein, and A labeled monoclonal antibody having a recognition site different from the first antibody, and
  • At least one nonionic surfactant having an HLB (Hydrophilic-lipophilic balance) value of 12 or more;
  • Human tissue factor apoprotein as an antigen for obtaining such a monoclonal antibody may be a natural type extracted from a natural material, or may have an immunological similar to the natural type human tissue factor apoprotein. Any of those obtained by protein engineering or genetic engineering techniques having specific properties may be used. As an example, it may be a hapten, that is, a peptide containing an antigenic determinant of a native human tissue factor apoprotein. In addition, human tissue factor apoprotein is converted to a proteolytic enzyme such as trypsin, chymotribcin, pepsin, etc. It may be a mentor. Examples thereof include peptides at the N-terminal region of human tissue factor apoprotein, peptides at the C-terminal region, and peptides at the intermediate region.
  • a raw material for obtaining a natural human tissue factor apoprotein for example, human brain, human lung or human placenta can be mentioned. Separation and purification can be performed by a combination of commonly used membrane protein separation techniques, such as extraction, salting-out, centrifugation, ultrafiltration, and various types of chromatography. The method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 50-33438 can be exemplified.
  • monoclonal antibodies were derived from hybridomas produced by the cell fusion method of Koehler and Milstein (G. Koehler and C. ilstein, Nature (London), 256 495 (1975)). It is prepared by culturing, secreting, and separating from the culture. That is, a mouse is immunized with a human tissue factor apoprotein antigen, and the lymphocytes of the mouse are fused with mouse myeloma cells to produce a hybridoma. The thus obtained hybridomas produce various monoclonal antibodies in accordance with each of the various fused lymphocytes.Hybridomas producing the desired monoclonal antibody are cloned by cloning. Isolated as a hybridoma. The cloned hybridoma is cultured in vitro or in vivo to isolate a monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody include a monoclonal antibody that does not lose its antibody activity in the presence of the nonionic surfactant of the present invention.
  • the epitope is located in a sterically unhindered position of the human tissue factor apoprotein.
  • Monoclonal antibodies having a toep For example, a monoclonal antibody capable of specifically recognizing apoprotein of human tissue factor and neutralizing the ability of human tissue factor to bind to coagulation VllZnia factor can be mentioned. Monoclonal antibodies capable of neutralizing the ability of human tissue factor to bind to coagulation factor VllZVIIa include, for example, amino acids of human tissue factor.
  • Monoclonal antibodies that do not react with the amino acid residues 204 to 226 of the sequence (the amino acid sequence of FIG. 1 described in JP-A-11-503438) are preferred.
  • a monoclonal antibody which immunoreacts with the following polypeptide (I) consisting of amino acid residues 26 to 49 of the amino acid sequence of human tissue factor heavy chain protein and human tissue factor, and
  • amino acid sequences of the above (I) and (II) are represented by one letter symbols of the amino acids.
  • a particularly preferred combination of monoclonal antibodies is one in which one of the monoclonal antibodies is produced by the hybridoma TF8-5G9 (TF8-5G9) deposited with the ATCC as Accession No. HB 9382.
  • TF9-6B4 produced by the hybridoma TF9-6B4 deposited with the ATC C under the accession number HB 9381. No.).
  • B an immunoassay system
  • a trace amount of human antibody can be obtained by the enzyme immunoassay (EIA), the fluorescence immunoassay (FIA), the chemiluminescence immunoassay (CLIA), or the sandwich method using RIA in the method of the present invention.
  • the tissue factor can be measured with high sensitivity, accurately and easily.
  • one of the above-mentioned monoclonal antibodies is used as an antibody (first antibody) immobilized on an insoluble carrier or the other is labeled (second antibody).
  • the antibody molecule used in the present invention may be any antibody, such as a complete antibody (whole molecule), F (ab ') 2 , Fab' or Facb fragment, which retains the ability to bind to the antigen. There may be.
  • a fragment is preferably F (ab ') 2 or Fab'.
  • the monoclonal antibody obtained as described above is digested with pepsin to obtain F (ab). ab ') z fragment or F (ab') 2 fragment by reducing it to Fab'fragment (Nisonoff,, et al .: Arch. Biochem. Biophys. 89 230 (1960), Parham, P: J. Immunol. 131 2895 (1983), etc.).
  • An anti-human tissue factor / apoprotein monoclonal antibody (first antibody) immobilized on an insoluble carrier can be obtained as follows.
  • the insoluble carrier examples include (1) a polymer obtained from nature and its derivatives, (2) a synthetic polymer and its derivatives, and (3) a mixture of a metal oxide and its polymer.
  • the first group includes polysaccharides and their derivatives such as cellulose, sesoadex, sepharose, carboxymethylcellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, dex Examples include tolan, glass, and inorganic polymers such as silica gel.
  • the second group includes condensation polymers such as vinyl polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, ABS, polyvinyl fluoride, polyamine-methylvinyl ether-maleic acid copolymer, and ethylene-maleic acid copolymer.
  • the third group includes iron oxides, for example, iron tetroxide, a mixture of iron tetroxide and polystyrene, and iron tetroxide coated with polystyrene.
  • the shape is not particularly limited, such as a test tube, a microtiter plate, beads, latex particles, granulated particles, or a membrane. Of these, mirrored beads are preferred.
  • Antibodies immobilized on such an insoluble carrier include, as described above, anti-human tissue factor-apoprotein monoclonal antibody complete antibody (all molecules), F '(ab') 2 , Fab ', Fab, Facb And the like, or a derivative of an antibody molecule or a fragment thereof in which the antigen-binding ability is not lost. Of these, whole antibodies or F (ab ') 2 fragments are preferred.
  • Methods for immobilizing these antibodies on an insoluble carrier include physical adsorption methods, such as a method in which polystyrene antibodies are immersed in an antibody solution, such as ion binding methods, for example, ion-exchange resins or amino groups, carboxylic acid groups, sulfonic acids A method using a carrier having a functional group such as a carboxylic acid group or a phosphoric acid group, or a chemical bonding method, such as a carboxy chloride method, a carbodiimide method, a maleic anhydride derivative method, Isocyanate derivative method, Cyanogen bromide-activated polysaccharide method, diazo method, active ester method, carrier binding method using a cross-linking reagent (such as glutaraldehyde, hexamethylene disocyanate, imid succinate, and maleimide compound as a cross-linking reagent). And a method of binding to the antibody via a substance that has no binding ability but can bind
  • an insoluble carrier of a material whose surface is mirror-finished as the non-soluble carrier, since nonspecific adsorption is low and measurement sensitivity is improved.
  • a mirror-finished insoluble carrier include those having a center line average roughness (Ra) of 1.5 / m or less.
  • the center line average roughness can be measured by a surface roughness profile measuring instrument, for example, Suricom 57OA (manufactured by Tokyo Seimitsu Co., Ltd.).
  • the center line average roughness (Ra) is obtained by extracting a portion of the measurement length from the roughness curve in the direction of the center line, setting the center line of the extracted portion as the X axis, the direction of the vertical magnification as the Y axis, and calculating the roughness curve.
  • R a —— / ⁇ / ⁇ ⁇
  • the center line average roughness (R a) is calculated according to JIS B0601-1982 (Japan), ANS IB 46.1-1979 (USA) and R 468-1966 (I SO).
  • the surface roughness of the insoluble carrier was measured using a surface roughness meter Surfcom® 570A manufactured by Tokyo Seimitsu Co., Ltd.
  • the material and shape of the insoluble carrier having a smooth surface are not particularly limited, and those described above are shown. Particularly preferred examples include polystyrene beads.
  • tissue factor apoprotein antibody thus immobilized on the insoluble carrier of the present invention is used, a trace amount of tissue factor can be accurately and easily measured.
  • labeled monoclonal antibody used as the second antibody in the present invention can be obtained as follows.
  • Examples of the antibody that can be used in the second antibody include a whole antibody (all molecules), Fab ', F (ab') 2 , and Facb fragment as described above. Preferred are whole antibodies, Fab 'fragments or F (ab') 2 fragments.
  • the labeling substance 1 25 La di O isotopes such as I, a fluorescent substance such as Furuoresein, Akurijiniumu * chemiluminescent substances such as esters, more like enzymes, enzyme rather preferably it is with Zohaba action More suitable.
  • Enzymes that bind to monoclonal antibodies include, for example, lysozyme, malate 'dehydrogenase, glucose 6-phosphate dehydrogenase, oxidase, glucose oxidase, alfa phosphatase, luciferase, ⁇ -galactosidase, and alcohol.
  • Il dehydrogenase, invertase and the like can be exemplified.
  • the binding method between these enzymes and the monoclonal antibody can be a conventional method such as glutaraldehyde method, periodate method, and maleimide method.
  • a maleimide antibody can be obtained by reacting an antibody fragment with a thiolated enzyme in a solution.
  • maleimidation of body fragments can be carried out by succinimidyl 4- (N-maleidomethyl) cyclohexanecarbonate (SMC C), succinimidyl-metamaleimidate benzoate (MBS), succinimidyl-l6—maleimide hexanoate ( It can be made into a medium by EMC S).
  • SMC C succinimidyl 4- (N-maleidomethyl) cyclohexanecarbonate
  • MSS succinimidyl-metamaleimidate benzoate
  • succinimidyl-l6—maleimide hexanoate It can be made into a medium by EMC S.
  • the introduction of a thiol group into an enzyme can be carried out according to a known method (Ishikawa eds., "Enzyme Immunoassay", Medical Shoin, 1978). For example, it can be obtained by reacting an enzyme with S-acetylmercaptosuccinic anhydride
  • a substrate for measuring the activity of the enzyme which is generally known in immunoassay, is used in accordance with the type of the enzyme. You can do it.
  • Examples include 2 as a substrate for Peruokishida Ichize, 2 '- azino one di one [3 E chill Benz thiazoline sulfonic acid] Jianmoniumu salt (A BTS) - H 2 0 2, Orutofue two Renjiami emissions (OPD) - H 2 0 2, 3, 3 ', 5, 5' - tetramethyl Ben Djidji emissions (TMB) - H 2 0 2, Chirami down one H 2 0 2, 3- (P- arsenate Dorokishifueniru) propyl monobasic H 2 0 2, Le amino Ichiru one H 2 0 2, pyrogallol one H 2 0 2, there are luciferin, 4 twelve Toro off We sulfonyl phosphate Hue over TMG as a substrate for ⁇ alkaline phosphatase, 4-methyl ⁇ Nbe riffs We lil Phosphate, NADP, phenol-monophthalene mono
  • the thus obtained labeled antibody of the present invention can accurately and easily measure a small amount of tissue factor.
  • the lipase is further added to a buffer solution in which an immune reaction is performed.
  • the tissue factor in the specimen is measured in the presence of a protein of 1.0 to 5.0 or a mixture containing the protein.
  • a new combined effect is exhibited by coexisting both without losing the effects of the respective in the immunoreaction solution.
  • the surfactant, the protein effect, and the combined effect of the two can be combined to measure tissue factor in a sample accurately, with high sensitivity, with a small measurement error, in a short time and easily. Make it possible. The details are described below.
  • the human tissue factor in the specimen usually forms an apoprotein-lipid complex, which interferes with the immune response of the antibody to the apoprotein, and as a result, apoprotein, a standard substance for obtaining a calibration curve, A marked difference occurs in the immunoreactivity between the sample and the apoprotein in the sample. As a result, inaccurate measured values may be obtained, and the measurement may take a long time.
  • the immunoreactivity between the standard substance, apoprotein, and the apoprotein in the sample is caused by the surfactant effect.
  • the problem that the difference of In turn, obtaining accurate measurements can significantly reduce measurement time.
  • the non-specific adsorption cannot be sufficiently suppressed, the sensitivity for measuring a small amount of tissue factor with a high background cannot be obtained.
  • the effects of the respective proteins are simultaneously expressed, and the lipid and the complex which are present in a very small amount in the sample are removed.
  • the apoprotein to be formed can be measured accurately with high sensitivity in a short time. Even more surprisingly, the coexistence of the two achieves a combined effect that can not be obtained by themselves, enabling the measurement of tissue factor in a sample with extremely small measurement error.
  • the measurement error referred to here is not a systematic error caused by the habit of an individual, inaccuracy of measuring equipment or a defective reagent, but an error that is caused by an undetermined cause and gives variation to the measured value. Means error. Therefore, the magnitude of the error is expressed by the standard deviation, coefficient of variation (CV), etc. Measurement methods with small measurement errors are indispensable for obtaining accurate measurements with high sensitivity, and are necessary and small in the development of immunological measurement methods that involve especially complex factors. The reason for the manifestation of the combined effect is that if the variation in the measured Although it is not clear because it is considered to be the sum of many factors, it is estimated as follows.
  • the surfactant generally has a degenerative effect on proteins and also has a reaction inhibitory effect on immune reactions.
  • the protein for example, skim milk is insoluble in water at a concentration of more than 0.8% and exists as a suspension.
  • the surfactant exerts an effect of suppressing the protein denaturing action and the immune response inhibitory action, and thus increases the stability of the immune reaction.
  • the present inventors name such a substance having the effect of increasing the stability of an immune reaction as an "antigen-antibody reaction modifier". That is, the protein acts as an antigen-antibody reaction modifier. As a result, it is presumed that the measurement error is significantly improved in the measurement method of the present invention.
  • the surfactant used in the present invention may be any nonionic surfactant having an HLB value of 12.0 or more as long as it does not significantly suppress the antigen-antibody reaction.
  • the non-ionic surfactant can be used not only alone but also in combination of two or more.
  • the HLB value is 0 at 12.5-30.0.
  • HLB value when a mixture of two kinds of nonionic surfactants is used is calculated by the following equation.
  • HLB value of the mixture V A X HLBA X VB X HLB B [V A: the volume ratio of nonionic surfactant A, HLB A: HLB value of the nonionic surfactant A, V B: volume ratio of the non-ionic surfactant B, HLB B: non I O emissions surfactant B HLB value]
  • nonionic surfactant examples include polyhydric alcohol ester ethylenoxide adduct, polyethylene glycol monoester, polyethylene glycol diester, higher alcohol / ethylenoxide adduct, alkylphenol / ethylene oxide adduct, polyoxyethylene ⁇ Polyoxypropylene ⁇ Polyol.
  • the HLB value is 12.0 or more.
  • the HLB value of the non-ionic surfactant mixture is calculated according to the above formula, and is not particularly limited as long as it shows 12.0 or more.
  • the final concentration of the nonionic surfactant used in the present invention in the immunoreaction solution is 2 to 15% by weight, preferably 3 to 10% by weight. If the amount is less than 2% by weight, the difference in reactivity between the apoprotein as a standard substance and the tissue factor in the sample cannot be eliminated, and if it exceeds 15% by weight, the specific immune reaction is suppressed.
  • a protein (or a mixture containing the protein) having a molecular weight of about 160,000 to about 500,000 and an isoelectric point of 1.0 to 5.0 used in the present invention
  • examples include pepsin, ovoglycoprotein, and orosomucoid.
  • a protein having a molecular weight of less than about 160,000 is used, the result of increased non-specific adsorption is obtained, and at a molecular weight of more than about 500,000, reduction of immuno-nonspecific reaction is insufficient and specific. Reduced immune response.
  • the isoelectric point is non-specific when a protein larger than 5.0 is added.
  • the final concentration of the protein in the immunoreaction solution is preferably from 0.01 to 0.8% by weight.
  • concentrations of the protein solution for example, skim or milk
  • non-specific reactions could not be sufficiently suppressed.
  • a skim milk solution in a refrigerator if it was more than 0.8% by weight, the skim milk solution was unredissolved and precipitated, so from the viewpoint of storage stability, 0.8% by weight or less. Is preferred.
  • a mixture containing the protein for example, 10 to 60% by weight, preferably 20 to 50% by weight of the protein as a main component, and 30 to 50% by weight of sugar (eg, lactose)
  • sugar eg, lactose
  • skim milk contains casein as a protein, but compared to the case where casein is used alone, skim milk has better dispersibility in the immune reaction solution, has a higher effect of suppressing nonspecific reactions, and has a temperature of 4 °. It has the characteristic that it has good storage properties in C (precipitation hardly occurs).
  • the skim milk used in the present invention may be milk of any origin as long as it is defatted milk.
  • the “molecular weight” of a protein refers to the molecular weight measured by an osmotic pressure method. Specifically, a polymer solution, a pure solvent, and solvent molecules are freely permeable, but the elution fraction is high. When the semipermeable membrane is used as a boundary surface, the difference in osmotic pressure between the two liquids is used as a parameter of the molecular weight of the polymer. In the present invention, it is a value measured at 4.degree. C. using a 6.66 M urea solution.
  • the term “isoelectric point” refers to a value measured by a chromatographic focusing method that separates proteins according to their isoelectric points.
  • the immunological assay method of the present invention can be performed by a sandwich method using EIA, FIA, CLIA, RIA, or the like.For convenience of explanation, a sandwich method of EIA which is preferably used will be described. However, the present invention is not limited to this measuring method.
  • the sandwich method is roughly classified into a one-step sandwich method and a two-step sandwich method.
  • a sample containing an antigen to be measured, a solid-phase antibody immobilized on an insoluble carrier, and a labeled antibody labeled with an enzyme are subjected to an antigen-antibody reaction in the same reaction system, and the solid-phase antibody
  • This is a method in which an antigen-labeled antibody complex is formed, and after the washing operation, the amount of the labeling substance is measured.
  • the sample, the solid phase antibody, and the detection antibody may be simultaneously present and reacted, or first, the sample and the solid phase antibody may be reacted. After that, the reaction may be performed by adding a labeled antibody.
  • the solid phase antibody may be added after reacting the sample with the labeled antibody.
  • a sample and a solid-phase antibody are first reacted to form a solid-phase antibody / antigen complex, and then the sample is removed and washed, and then a labeling substance is added and a solid-phase antibody is added.
  • ⁇ Forms an antigen-labeled antibody complex. Then, after the washing operation, the amount of the labeling substance is measured.
  • a trace amount of tissue factor can be increased in both the one-step sandwich method and the two-step sandwich method. Accurate with sensitivity and short and easy measurement with small measurement error.
  • the surfactant, the protein and the like can be co-present in at least one of the reaction solution of the primary reaction and the reaction solution of the secondary reaction. However, it is most preferable to coexist in any of the reaction solutions.
  • the solvent used for the above-mentioned immune reaction may be any of various ordinary solvents that do not adversely affect the reaction.
  • a buffer having a pH of about 6.0 to 8.0 such as a phosphate buffer, a Tris ⁇ hydrochloric acid buffer, or a persulfate buffer.
  • the immunoreaction temperature conditions for the measurement are not particularly limited as long as the properties of the protein used are not denatured and the specific immune reaction is not significantly suppressed, but are generally 50 ° C or lower, preferably about 4 ° C.
  • the reaction may be carried out at a temperature of about 45 ° C. for about 5 minutes to 5 hours.
  • the kit used in the measurement method described above in the present invention is: (a) First antibody (solid phase antibody)
  • the first antibody (a) is a monoclonal antibody that specifically recognizes an apoprotein of human tissue factor and is immobilized on an insoluble carrier
  • the second antibody (b) is a human antibody. Specific recognition of tissue factor apoprotein
  • HLB Hydrophilic-lipophilic balance
  • the molecular weight is from about 160,000 to about 500,000 and the isoelectric point is from 1.0 to 5.
  • nonionic surfactant (i) and the protein or the protein-containing mixture (ii) are combined by themselves to constitute a kit.
  • the kit is preferably formed by dissolving each of the buffers (C) in a solvent as a solvent.
  • concentration of the nonionic surfactant in the solution state may be within a range where the concentration in the final use form falls within the above range.
  • the kit may have a concentration more concentrated than the above range.
  • the protein or its mixture can be the concentration of the final use form or its concentrated solution.
  • the washing solution may be any solution that is usually used as a washing agent in an immunoassay.
  • Examples include physiological saline, phosphate buffer, Tris-HCl buffer, and mixtures thereof. These detergents may further contain a nonionic surfactant such as Triton X100, Tween20 or Brig35, and an ionic surfactant such as sodium dodecyl sulfate. Further, proteins such as bovine serum albumin and ovalbumin, animal sera, saccharides, stabilizers, preservatives and the like can also be added to (c) buffer and Z or (d) detergent.
  • a nonionic surfactant such as Triton X100, Tween20 or Schweizer35
  • an ionic surfactant such as sodium dodecyl sulfate.
  • proteins such as bovine serum albumin and ovalbumin, animal sera, saccharides, stabilizers, preservatives and the like can also be added to (c) buffer and Z or (d) detergent.
  • the sample of the present invention refers to a sample containing a tissue factor as an antigen to which an antibody specifically recognizing the anti-human tissue apoprotein of the present invention can react.
  • tissue factor as such an antigen is not limited to human tissue factor, but also includes tissue factors of other animals that cross-react with the antibody.
  • the sample is not particularly limited as long as it contains human tissue factor in the case of an animal, for example, a human.
  • Specific examples include urine, blood (plasma and serum), and joint fluid in a solution state. , Sputum, sweat and other body fluids. Of these, blood and urine are preferred because they are easily available as samples.
  • a supernatant obtained by homogenizing tissues in a solid state such as brain, lung, kidney, myocardium, digestive organ, placenta, vascular endothelium, and blood cells may be used.
  • the present invention relates to human samples, especially human serum or human plasma. Most suitable for measuring tissue factor.
  • a trace amount of tissue factor in a sample for example, a clinical sample (eg, body fluid such as plasma, serum, urine, etc.) can be used to enhance the immune reaction in a solution. It can be quantified with sensitivity, accuracy, small measurement error, short time and simple operation.
  • a clinical sample eg, body fluid such as plasma, serum, urine, etc.
  • the immunological measurement method of the present invention and the measurement value of tissue factor by the measurement kit are useful for monitoring of diagnosis and treatment of thrombotic diseases, vasculopathy diseases, neoplastic diseases and the like.
  • Monoclonal antibody TF9-6B4 (described in JP-A-1-503438) having a binding site in the amino acid residue region from position 146 to position 167 of human tissue factor / apoprotein was 0.1 M
  • a surface prepared with a carbonated buffer (pH 9.5) at a concentration of 20 g / m1 and measured with mirror-finished polystyrene beads (Imnochemica cane Imnobeads, Surfcom 57OA (Tokyo Seimitsu Co., Ltd.)).
  • T13S Tris-HCl-0.1 M NaC ⁇
  • T13S 50 mM Tris-HCl-0.1 M NaC ⁇
  • T13S 50 mM Tris-HCl-0.1 M NaC ⁇
  • the solution was placed in a dialysis tube, and dialyzed overnight at 4 ° C. with 0.1 M phosphate buffer (pH 6.0) -5 mM EDTA as an external solution to obtain a peroxidase solution into which a thiol group was introduced.
  • the maleated monoclonal antibody solution and the thiolated Peroxidase solution (3.57 mg / m 1) 445/1 was mixed, and the mixture was concentrated to about 1401 by ultrafiltration and reacted at 4 ° C for 48 hours.
  • the reaction solution was subjected to gel filtration using HPLC (column TSK Gel 3000 SW) and PBS (pH 7.2) as an eluent to obtain a peroxidase-labeled monoclonal antibody.
  • the molar ratio of the antibody to peroxidase in the labeled antibody was 1: 3.3.
  • Tris-HCl 0.1 M NaCl—0.5% SA-3% Triton X—100—0.1% Recombinant human tissue using a skim milk ( ⁇ 7.4) dilution buffer Factors ⁇ Apoprotein 0, 15,
  • the monoclonal antibody-immobilized beads described in the above (1) were added to each tube one by one, and incubated at 37 ° C for 120 minutes.
  • TBS-T a solution of 0.05% Tween 20 (hereinafter abbreviated as TBS-T) in 0.1 mM NaCl (pH 7.4) with 0.1 mM NaCl (pH 7.4)
  • TBS-T a solution of 0.05% Tween 20
  • the peroxidase-labeled monoclonal antibody prepared in the above (2) at an antibody concentration of 1 gZml was added with 0.4 ml and incubated at 37 ° C for 60 minutes.
  • HLB value of 'ionic surfactant' Relationship between HLB value of 'ionic surfactant' and absorbance with respect to standard substance As dilution buffer, 0.1% skim milk and 5% concentration 0.5% BS containing various nonionic surfactants (A to H) with HLB value
  • A—5 OmM Tris' normal human plasma sample (A) was diluted 4-fold with 0.1 M NaCl (pH 7.4), and the sample dilutions were 0.4 ml each. Then, it was placed in a polypropylene tube. The antibody-immobilized beads described in (1) of Example 1 were added to each tube, and incubated at 37 for 120 minutes.
  • FIG. 1 shows the HLB value of the nonionic surfactant and the absorbance at 450 nm of the standard substances (yTF) OpgZml and 1000 pg / m1.
  • BSA 0.5% BSA—5 OmM Tris with 0.1% skim 'milk and a defined concentration of Triton X-100 (0, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20%) as dilution buffer Use 0.1 M HCl (pH 7.4)
  • B normal human plasma sample
  • N 0.4 ml
  • FIG. 2 shows the concentrations of human tissue factor obtained corresponding to each Triton X-100 concentration.
  • the measured value was the highest and constant between 2 and 15% of Triton X-100.
  • the concentration combinations of 3.0% Triton X-100 and skim milk were 0% -0.1%, 0.1% -3.0%, and 0.1% -3.0. 0.5%
  • BSA—5 OmM Tris-HCl-0.1M NaC1 pH 7.4 was used to dilute the normal human plasma sample C and sample D 4 times, respectively, to obtain a sample diluent.
  • One tube of the antibody-fixed beads described in (1) of Example 1 was added to each tube and incubated at 37 for 120 minutes.
  • the labeled antibody prepared in section (2) of Example 1 was dissolved in each of the above-mentioned dilution buffers at an antibody concentration of 1 ⁇ g / m1 to obtain a solution of 0.1 g / ml. Each 4 ml was added and incubated at 37 ° C for 60 minutes.
  • the monoclonal antibody TF9-6B4 described in (1) of Example 1 was prepared in a 0.1 M carbonate buffer (pH 9.5) at a concentration of 20 igZml in a volume of 10 ml. This solution was divided into 2 portions of 5 ml each, and one side of this solution was subjected to mirror-finished polystyrene beads (Surfcom 57 OA, manufactured by Imnochemicals, Surfcom 57 OA (manufactured by Tokyo Seimitsu Co., Ltd.)). Ra): 1.3 m) was added to 30 samples, and as a comparative example, non-specular polystyrene beads (# 80 beads manufactured by Sekisui Co., Ltd., Ra: 3.
  • a 0,1000 pgZml solution of the apoprotein was prepared in the same manner as in section (3) of Example 1, and the apoprotein for each of the immobilized antibodies (A) and (B) was prepared in the same manner as described in section (3) above.
  • the absorbance at 450 nm at each concentration was measured.
  • the SZN ratio (OD 45 o value at apoprotein 1000 pg / m 1) and OD 45 () value at 0 pg / 1 apoprotein) were calculated as an index of sensitivity for each immobilized antibody. Table 4 shows the results. Table 4
  • the mirrored beads of the present invention enabled low background and high SZN.
  • 63, 125, 250, 500, 1000, and 2000 pg Zm1 solutions were prepared, and 0.2 ml of each was placed in a polypropylene tube.
  • 0.2 ml of a solution prepared by dissolving the peroxidase-labeled monoclonal antibody prepared in section (2) of Example 1 at an antibody concentration of 1 gZm1 in the above-mentioned dilution buffer was added and stirred. Thereafter, the tube described in the above (1) is added to each tube.
  • Noclonal antibody-immobilized beads were added one by one and incubated at 37 ° C for 120 minutes.
  • the one-step 'sandwich' method according to the present invention gives a high sensitivity of 15 pg / m 1 and gives a good calibration curve.
  • Triton X 100—0.1% skim milk—0.5% BSA—5 OmM Tris-HCl—0.1M NaCI (pH 7.4) as dilution buffer
  • Sample diluents obtained by diluting each of the plasma sample or urine sample described in 5 with 4-fold were placed in polypropylene tubes in an amount of 0.4 ml each (N-2).
  • Each antibody-immobilized bead described in (1) of Example 1 was added to each tube, and the tube was incubated at 37 ° C for 120 minutes.
  • FIG. 1 shows the relationship between the HLB value of a nonionic surfactant according to the method of the present invention and the absorbance with respect to a standard substance.
  • FIG. 2 shows the results of measuring human tissue factor in normal human plasma by changing the concentration of Triton X-1 U in the presence of skim milk.
  • FIG. 3 is a calibration curve of the one-step sandwich method according to the method of the present invention.
  • FIG. 4 is a calibration curve for quantifying tissue factor in human plasma by the method of the present invention.

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Description

明 細 書
発明の名称
組織因子の高感度測定方法及びその測定キッ ト
発明の詳細な説明
産業上の利用分野
本発明は、 検体中の組織因子を高感度に測定する方法及びその測定に 使用するキッ トに関する。 更に詳しくは、 本発明はヒト検体中のヒト組 織因子をサンドィツチ法により免疫学的に高感度に測定する方法及びそ の測定に使用するキッ 卜に関する。
従来の技術
組織因子は、 従来 「組織卜ロンボブラスチン」 あるいは 「凝固第 ΙΠ 因子」 と呼ばれていた血液の凝固反応にかかわるリポ蛋白質であり、 脂 質部分と蛋白質部分 （アポ蛋白質） とからなる複合蛋白質の一種である c かかる組織因子は、 生体の含量がきわめて低くかつ精製が困難なこと から、 分子レベルでの研究は遅れていたが、 1 9 8 7年三つの研究ダル —プによって相次いでヒト組織因子のアポ蛋白質の c D N Aがクローン 化され塩基配列とアミノ酸配列が決められた （Spicel, E. R. , et al.： Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 5148 (1987), Morrissey, J. H.， et al. ： Cell 84 129 (1987), Scarpati. E. M. , et al. ,： Biochemistry 26 5234 (1987)) 。 それによると、 ヒ ト組織因子のアポ蛋白質はアミ ノ酸 2 6 3残基からなり、 分子量は S D S—電気泳動法で 4 7 K Dと報 告されている。
組織因子は、 ヒ トをはじめとする各種動物の生体組織のほとんど全て に存在するが、 特に循環器系、 例えば循環器系の密な脳、 肺、 胎盤及び 血管内皮に比較的多く分布し、 通常これら組織の細胞の膜上に膜蛋白質 として発現 ·存在する。
またその生理作用は、 血管の損傷 ·破綻によつて惹起される一連の外 因系凝固反応の開始反応を担うことにある。 具体的には C a + +存在下、 凝固第 VII因子と分子複合体を形成 ϋて凝固第 X因子、 第 IX因子の両者
5
を活性化し、 内因系凝固反応と合流してフィプリンゲルの形成に至らし める。 すなわち第 VII因子とともに組織因子は、 外因系凝固反応の開始 機構における中心的役割を担う蛋白質である。 （Bach, R. et al.，： Biochemistry 25 4007 (1986), Fair, D. S. et al.，： J. Biol. Chem 262, 11692(1987), Weiss. H. J. , et al. ,： Blood 73, 968 (1989)) 。
I 0
以上述べたような生理作用を有する組織因子は血液凝固の重要な因子 として注目されている。 したがって、 検体中の微量のヒト組織因子を容 易かつ正確に測定することは、 循環器系の基礎医学、 臨床医学の研究に おいて果す役割は非常に大きい。
従来、 検体中のヒト組織因子を測定する方法としては、 いくつかの方 法が提案されている。 代表的な例としては、 Nemerson の方法と呼ばれ る二段法による組織因子活性の測定である （Nemerson, Y. J. Clin. In vest. 47 72 (1968)) 。 その測定方法を略記すると、 検体に凝固第 VII 因子および第 X因子の混合液を加え一定時間反応させた後、 この反応液 を粗製リン脂質を加えた正常血漿に添加し、 凝固時間を測定することに
20
より組織因子活性を判定するものである。 しかしながらこの方法の問題 点として、 用いる試薬の安定性が低く、 また凝固時間を精度よく測定す ることが困難なため、 溶液 Ψの徼量なヒ卜組織因子を容 に測定するこ とは難しいことである。 また、 上記方法は凝固第 Xa因子を測定すること によつて組織因子活性を判定するという間接的測定方法であるのでその 精度はきら限界がある。 その他に提案されている活性測定による組織因 子測定法はいずれも上記問題点を有している。
一方、 組織因子の免疫学的測定方法として次のものが報告されている。
1つは、 ィー ·ブジエルクリ ドらによる放射免疫測定法 （R I Aと略） である (Bjorklid, E. et al. , Br. J. Haematol. , 39 445 (1978) )。 もう 1つは、 ケー 'アンド一らによる R I Aである （Andoh, K. , et al. ， Thromb. Res. 43 275 (1986), Kubota, T. et al. , Thromb. Haemost as. 54 258 (1985)) 。 いずれの方法もポリクローナル抗体のみを用い た競争法であり、 ヒ ト組織因子に対する特異性に問題があった。 またい ずれも測定時間が非常に長く、 すなわち前者は 3 6時間、 後者は 5 1時 間、 必要とする。 したがっていずれの方法も正確さ並びに測定の容易さ などの点で実用性が低い。
その後、 モノクローナル抗体を用いた測定方法として （i) 特表平 1 — 5 0 3 4 3 8号公報、 （ii) 特開平 2— 2 0 3 7 9 5号公報、 及び
(iii) 特開平 2— 2 1 6 0 5 4号公報が開示されている。 本発明者ら の研究によれば、 検体中でのヒ ト組織因子は、 通常アポ蛋白質 ·脂質複 合体を形成しているためにアポ蛋白質に対する免疫反応が妨害されるこ と、 及び正常人血液、 例えば血清または血漿中での含有量が P g (pico -gram) Zmlオーダーの極く微量であることが判明した。 かかる観点に おいて前記 （i)〜 （iii) の特許公報の方法を見ると、 前記 （i) の特 許公報においては、 サンドィツチ法による身体サンプルにおけるヒ ト組 織因子検出の際、 免疫反応溶液として T B S Zトリ トンの使用を記載し ているが、 ヒト検体の組織因子の測定、 殊にヒト血液、 例えば血清また は血漿中の組織因子の測定について全く記載されていない。
前記 （ii) 及び （iii) の特許公報の方法においては、 免疫反応溶液 としてリン酸、 トリス、 H e p e s等水溶液中で中性付近の p Hを示す 緩衝液と T r i t o n、 Tw e e n等の非極性可溶化剤とを含む水溶液 を用いることを記載しているが、 前記 （i) の特許公報の方法と同様ヒ
5
ト血液、 例えば血清または血漿中の組織因子の測定は全く記載されてい ない。
発明が解決しょうとする課題
そこで本発明の第 1の目的は、 検体中のヒト組織因子を高感度でサン ドィツチ法により免疫学的に測定する方法及びそのためのキッ トを提供
I 0
することにある。
本発明の第 2の目的は、 ヒト血液、 殊に血清または血漿を検体として、 その中に極く微量含まれる組織因子を正確に且つ高感度で免疫学的に測 定する方法及びそのためのキッ トを提供することにある。
本発明の他の目的は、 ヒト検体、 殊にヒト血液中に極く微量含まれる
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組織因子を、 短時間で且つ容易な操作で免疫学的に測定する方法及びそ のためのキッ トを提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明者らの研究によれば、 前記本発明の目的及び利点は、 検体中の 組織因子を緩衝液中で免疫反応により免疫学的に測定するサンドィツチ 0
方法において、
( a ) ヒト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認識し不溶性担体に固定 されたモノクローナル抗体 （第 1抗体） 及びヒト組織因子のァ ポ蛋白質を特異的に認識し、 且つ前記第 1抗体とは異なる認識 部位を有する、 標識化されたモノクローナル抗体 （第 2抗体） を使用し、
(b) 該免疫反応を、
(i) HLB (Hydrophilic-lipophilic balance) 値が 12以 上である少なくとも 1種の非イオン界面活性剤を 2〜1
5重量％の濃度で含有し、 且つ
(ii) 分子量が約 1. 6万〜約 5. 0万であり且つ等電点が 1.
0〜5. 0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合物を含 有する
緩衝液中で行なう、
ことを特徵とする組織因子の高感度測定方法により達成されることが見 出された。
さらに本発明者らの研究によれば、 前記測定方法は、
(a) 第 1抗体
(b) 第 2抗体 （標識抗体）
(c) 緩衝液
(d) 洗浄液及び
(e) 第 2抗体として酵素で標識化された抗体を使用する場合には、 酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤
を組合せてなる検体中の組織因子を免疫学的に測定するためのキッ 卜で ぁ ヽ
(1) (a) の第 1抗体はヒト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認識 し不溶铨担体に固定されたモノクロ一ナル抗体であり、 （b) の第 2抗体はヒ ト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認識し、 且 つ前記第 1抗体とは異なる認識部位を有する標識化されたモノ クローナル抗体であって、 且つ
( 2 ) 該キッ トは、 さらに
(i) H L B (Hydrophilic- lipophilic balance) 値が 1 2以 上である少なくとも 1種の非ィォン界面活性剤及び
(ii) 分子量が約 1 . 6万〜約 5 . 0万であり且つ等電点が 1 .
0〜5 . 0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合物 をそれら自体又は溶液状態で組合せてなる、
ことを特徵とする検体中の組織因子を高感度で測定するためのキッ トの 使用により達成されることが見出された。
以下本発明の測定方法及びそのためのキットについて、 さらに詳細に 説明する。
(A) モノクローナル抗体及びその調製；
本発明の測定方法及びそのためのキッ トにおいては、 2種のモノクロ ーナル抗体が使用されるが、 いずれのモノクローナル抗体もヒト組織因 子のアポ蛋白質を特異的に認識するものである。
かかるモノクロ一ナル抗体を得るための抗原としてのヒト組織因子ァ ポ蛋白質は、 天然の材料から抽出した天然型のものであっても、 また天 然型のヒト組織因子アポ蛋白質と類似した免疫学的性質をもつ蛋白工学 的又は遺伝子工学的手法によつて得られるものいずれであつてもよい。 その例として、 ハプテンすなわち天然型のヒト組織因子アポ蛋白の抗原 決定部位を含むペプチドであってもよい。 更にヒト組織因子アポ蛋白質 を蛋白分解酵素、 例えばトリプシン、 キモ卜リブシン、 ペプシンなど、 あるいは蛋白分解試薬、 例えば臭化シアンなどによって得られるフラグ メン卜であってもよい。 その例として、 例えばヒ ト組織因子アポ蛋白質 の N末端領域のぺプチド、 C末端領域のぺプチド及び中間領域のぺプチ ドなどがあげられる。
天然型のヒ ト組織因子アポ蛋白質を得るための素材料としては、 例え ばヒ ト脳、 ヒ ト肺あるいはヒ ト胎盤などが挙げられる。 分離 ·精製は、 通常用いられる膜蛋白質の分離技術、 例えば抽出、 塩析、 遠心分離、 限 外濾過、 各種のクロマトグラフィ一等を組み合せて行うことが出来るが、 その 1例として前記特表平 1—5 0 3 4 3 8号公報記載の方法を挙げる ことが出来る。
このように入手した抗原を用いて、 モノクローナル抗体は、 ケーラー とミルシュタインによる細胞融合法 (G. Koehler and C. ilstein, Na ture (London), 256 495 (1975)) により作製されたハイプリ ドーマを 培養して分泌させ、 その培養液から分離することにより調製される。 す なわち、 ヒ ト組織因子アポ蛋白抗原でマウスを免疫した後、 このマウス のリンパ球をマウス . ミエローマ細胞と融合させハイプリ ドーマを作製 する。 このようにして得たハイプリ ドーマは、 融合された種々のリンパ 球のそれぞれに応じて種々のモノクロ一ナル抗体を産生するので、 目的 とするモノクローナル抗体を産生するハイブリ ドーマをクローニングに よってクローン化されたハイプリ ドーマとして単離する。 このクローン 化ハイプリ ドーマをイン · ビトロ又はイン ' ビボで培養してモノクロ一 ナル抗体を分離する。
該モノクローナル抗体の好ましいものとしては、 本発明の非イオン界 面活性剤存在下でその抗体活性を失わないモノクローナル抗体が挙げら れる。 また、 ヒ ト組織因子アポ蛋白質の立体的に障害のない位置にェピ W 3
トープを有するモノクローナル抗体があげられる。 例えば、 ヒト組織因 子のアポ蛋白質を特異的に認識し、 ヒト組織因子の凝固第 VllZnia因 子への結合能を中和することのできるモノクローナル抗体があげられる。 かかるヒト組織因子の凝固第 VllZVIIa因子への結合能を中和すること のできるモノクローナル抗体としては、 例えばヒト組織因子のアミノ酸
5
配列 （特表平 1一 503438号公報記載の第 1図のアミノ酸配列） の 第 204~226アミノ酸残基の部位と反応しないモノクローナル抗体 が好ましくはあげられる。 なかでも好ましくは、 ヒト組織因子重鎖タン パク質及びヒ卜組織因子のアミノ酸配列の第 26〜49アミノ酸残基か らなる下記ポリペプチド （I) と免疫反応するモノクローナル抗体、 及
I 0
びヒト組織因子重鎮タンパク質及び組織因子のァミノ酸配列の第 146 〜167アミノ酸残基からなる下記ポリペプチド （Π) と免疫反応する モノクローナル抗体との組合せがあげられる。
EPKPVNQVYTVQIST SGDffKSKC (I)
VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT (II)
I 5
上記 （ I ) 及び （II) のアミノ酸配列はアミノ酸の一文字記号により 表示されている。
本発明において、 特に好ましいモノクローナル抗体の組合せは、 モノ クローナル抗体の一方が、 ATCCに受理番号 HB 9382として寄託 されたハイプリ ドーマ TF8— 5G9が産生する抗体 （TF8— 5G9) 0
であり、 他方が ATC Cに受理番号 HB 9381として寄託されたハイ プリ ドーマ TF9— 6B4が産生する抗体 （TF9— 6B4) である （こ れら乇ノクローナル抗体は前記特表平 1—5 ϋ 3438号公報に記載さ れている） 。 (B) 免疫測定系；
前記した 2種のモノクローナル抗体を用い、 本発明の方法で酵素免疫 測定法 （E I A) 、 蛍光免疫測定法 （F I A) 、 化学発光免疫測定法 (CL I A) または R I Aなどによるサンドィツチ法によって微量のヒ ト組織因子を高感度で、 正確にかつ容易に測定することが可能である。 本発明のサンドィツチ法においては、 上記モノクローナル抗体の一方 を不溶性担体に固定した抗体 （第 1抗体） あるいは他方を標識化した抗 体 （第 2抗体） に用いる。 また本発明に用いる抗体分子は、 完全抗体（全 分子） 、 F ( a b')2、 F a b' 又は F a c bフラグメ ントなど抗原と の結合能を保持しているものであればそのいずれであってもよい。 かか るフラグメントは、 F (a b')2 又は F a b' が好ましくこの場合には、 上述のようにして得られたモノクローナル抗体を公知の方法、 たとえば 該抗体をペプシンで分解して F (a b')z フラグメントとするか、 更に F (a b')2 フラグメントを還元処理することによって F a b' フラグ メントとすることにより得られる （Nisonoff, , et al.： Arch. Bioc hem. Biophys. 89 230(1960)， Parham, P: J. Immunol. 131 2895 (1983) など） 。
不溶性担体に固定された抗ヒ ト組織因子 · アポ蛋白質モノクローナル 抗体 （第 1抗体） は以下のようにして得ることができる。
不溶性担体としては、 （1) 天然から得られる重合体とその誘導体、 (2) 合成重合体とその誘導体、 更には （3) 金属酸化物とその前記重 合体との混合物を挙げることが出来る。 第 1のグループには、 多糖類と その誘導体、 例えばセルロース、 セソアデックス、 セファロース、 カル ボキシメチルセルロース、 ニトロセルロース、 酢酸セルロース、 デキス トランなど、 あるいはガラス、 シリカゲルなどの無機重合体などがある。 また第 2のグループにはビニル重合体、 例えばポリスチレン、 ポリェチ レン、 ポリプロピレン、 A B S、 ポリフッ化ビニル、 ポリアミンーメチ ルビニルエーテル一マレイン酸共重合体、 エチレン一マレイン酸共重合 体など、 縮合系重合体、 例えば 6—ナイロン、 6 , 6—ナイロン、 アミ ノ酸重合体などのポリアミ ド、 ポリエチレンテレフタレートなどのポリ エステルなどがある。 また第 3のグループとしては鉄酸化物、 例えば四 三酸化鉄、 四三酸化鉄とポリスチレンとの混合物、 四三酸化鉄をポリス チレンで被覆したもの、 などがある。 また、 その形状は試験管、 マイク ロタイタ一プレート、 ビーズ、 ラテックス粒子、 造粒粒子あるいはメン ブレンなど特に限定されない。 これらのうち、 好ましいのは鏡面化した ビーズである。
このような不溶性担体に固定される抗体としては、 前述の如き抗ヒト 組織因子 ·アポ蛋白質モノクローナル抗体の完全抗体 （全分子） 、 F ' ( a b ' ) 2、 F a b ' 、 F a b、 F a c bなどのフラグメント、 あるい は抗原結合能が失われない抗体分子またはそのフラグメントの誘導体が あげられる。 これらのうち完全抗体又は F ( a b ' )2 フラグメントが好 ましい。
これらの抗体を不溶性担体へ固定する方法は、 物理吸着法、 例えばポ リスチレンの抗体を抗体溶液に浸漬する方法など、 イオン結合法、 例え ばイオン交換榭脂あるいはアミノ基、 カルボン酸基、 スルホン酸基、 リ ン酸基などのィォン化する官能基をもつた担体を用いる方法など、 ある いは化学反応による具有結合法、 例えばカルボキシ ·クロライ ド法、 力 ルボジイミ ド法、 無水マレイン酸誘導体法、 イソシァネート誘導体法、 臭化シアン活性化多糖法、 ジァゾ法、 活性エステル法、 架橋試薬による 担体結合法 （架橋試薬としてグルタールアルデヒド、 へキサメチレンィ ソシァネート、 コハク酸イミ ド、 マレイミ ド化合物など） など、 更には、 例えばヒ ト組織因子に対しては結合能はないが該抗体に対し生物学的反 応により結合しえる物質を介して結合する方法、 例えばプロティン A結 合担体を用いる方法などである。
該不溶性担体として、 特にその表面が鏡面化された材質の不溶性担体 を用いると、 非特異的吸着が低く、 測定感度が向上するので好ましい。 かかる鏡面化された不溶性担体としてはその表面の中心線平均粗さ （R a) が 1, 5 / m以下のものがあげられる。 該中心線平均粗さは、 表面 粗さ形状測定機、 例えば S u r i c om 57 OA (東京精密社製） に よって測定できる。
中心線平均粗さ （Ra) は、 粗さ曲線からその中心線の方向に測定長 さ の部分を抜取り、 この抜取り部分の中心線を X軸、 縦倍率の方向を Y軸とし、 あらさ曲線を y = f ( X ) で表わしたとき、 次式で与えられ る R aの値をミク口ン単位で表わした値を意味する。
R a=—— /ϊΜ/ά χ この中心線平均粗さ （R a) については、 J I S B0601-19 82 (日本） 、 ANS I B 46. 1 - 1979 (USA) 及び R 4 68 - 1966 (I SO) に説明されている。
なお以下の本発明の実施例では、 不溶性担体は東京精密 （株） 製の表 面粗さ計 S u r f c om® 570 Aを用いて表面粗さを測定した。 前記平滑な表面を有する不溶性担体の材質及び形状は特に制限されず、 前記に説明したものが示される。 特に好ましい例としてはポリスチレン ビーズが挙げられる。
かく して得られた本発明の不溶性担体に固定された抗ヒ ト組織因子ァ ポ蛋白質抗体を用いる時、 微量の組織因子を正確かつ容易に測定すこと が出来る。
次に、 本発明において第 2抗体として用いる標識されたモノクローナ ル抗体 （標識抗体） は以下のようにして得ることが出来る。
第 2抗体において用いることが出来る抗体としては、 上記した如く完 全抗体 （全分子） 、 F a b '、 F ( a b ' ) 2、 又は F a c bフラグメント などが挙げられる。 好ましいのは完全抗体、 F a b ' フラグメント又は F ( a b ' ) 2 フラグメントである。 標識物質としては、 1 25 Iなどのラ ジォアイソトープ、 フルォレセインなどの蛍光物質、 ァクリジニゥム * エステルなどの化学発光物質、 更には酵素などが挙げられるが、 好まし くは増巾作用のある酵素がより適している。
モノクローナル抗体と結合させる酵素としては、 例えばリゾチーム、 マレート 'デヒ ドロゲナーゼ、 グルコース一 6—フォスフエ一ト ·デヒ ドロゲナーゼ、 パ一ォキシダーゼ、 グルコース ·ォキシダーゼ、 アル力 リフォスファターゼ、 ルシフェラーゼ、 ^ーガラク トシダーゼ、 アルコ 一ル*デヒドロゲナーゼ、 インベルターゼなどを例示することが出来る。 これら酵素とモノクローナル抗体との結合方法は、 グルタルアルデヒ ド法、 過ョーソ酸法、 マレイミ ド法など通常の方法に従うことが出来る。 例えばマレイミ ド化された抗体乂は抗体のフラグメントとチオール化さ れた酵素を溶液中で反応することにより行うことが出来る。 抗体又は抗 体のフラグメントのマレイミ ド化は、 例えばサクシンィミ ジル 4— (N —マレイミ ドメチル） シクロへキサンカーボネート （SMC C) 、 サク シンィミジル一メタマレイミ ドベンゾエート （MB S) 、 サクシンイミ ジル一 6—マレイミ ドへキサノエート （EMC S) などによりマレイミ ド化することができる。 酵素へのチオール基の導入は公知の方法 （石川 編 「酵素免疫測定法」 、 医学書院、 1978年） に従うことができる。 例えば酵素と S—ァセチルメルカプト無水コハク酸 （AMSA) 又は N ーサクシンィミジル一 3— （2—ピリジルチオ） プロピオネート （S P DP) などと反応することにより得られる。
本発明の測定方法において、 標識物質として酵素を使用した場合には、 該酵素の種類に対応して、 免疫学的測定において通常知られている該酵 素の活性を測定するための基質を使用することが出来る。
その例としては、 ペルォキシダ一ゼの基質として 2, 2' —アジノ一 ジ一 [3ェチルベンツチアゾリンスルフォン酸] ジアンモニゥム塩 （A BTS) — H202、 オルトフエ二レンジァミ ン （OPD) — H202、 3， 3', 5, 5' —テトラメチルベンヂヂン （TMB) — H202、 チラミ ン一 H202、 3— (P—ヒ ドロキシフエニル） プロピル酸一 H202、 ル ミノ一ル一 H202、 ピロガロール一 H202、 ルシフェリン等があり、 ァ ルカリフォスファターゼの基質としては 4一二トロフヱニルフォスフエ ート、 4—メチルゥンベリフヱリルフォスフェート、 NADP、 フヱノ —ルフタレン ·モノフォスフェート、 ァダマンティル一 1, 2_ジォキ セタン ·ァリル · フォスフェート （AMP PD) などがある。
—ガラストシダーゼの墓質としては 2—二トロフヱニルー — D— ガラク トシド、 4ーメチルゥンベリフェリル一 yS— D—ガラク トシドな どがある。
ルシフヱラーゼの基質としては、 F MN H 2— R C H O— 02などがあ る。
かく して得られる本発明の標識された抗体は、 微量の組織因子を正確 かつ容易に測定することが出来る。
次に本発明においては、 さらに免疫反応が行なわれる緩衝溶液中に①
H L B (Hydrophile-Lipophile- Balance) 値が 1 2. 0以上の 1種又は 2種以上の非イオン界面活性剤及び、 ②分子量が約 1 . 6万〜約 5. 0 万でかつ等電点が 1 . 0〜5 . 0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合 物を存在せしめて、 検体中の組織因子を測定する。 該界面活性剤と該蛋 白質等とを共存させることにより、 免疫反応溶液中でそれぞれが持つ効 果を失うことなく、 両者を共存させることによって新たな併用効果が発 現する。 本発明によれば、 該界面活性剤 ¾；果、 該蛋白質効果及び両者の 併用効果が相まって検体中の組織因子を高感度で正確に、 小さな測定誤 差で短時間にかつ容易に測定出来ることを可能ならしめる。 以下詳細に 説明する。
検体中のヒ卜組織因子は、 通常アポ蛋白質，脂質複合体を形成してい るためにアポ蛋白質に対する抗体の免疫反応が妨害され、 その結果、 検 量線を得るための標準物質であるアポ蛋白質と検体中のアポ蛋白質との 免疫反応性に著しい相異が起こる。 そのため不正確な測定値となったり、 測定の長時間化などの不都合が生じる。
ここで免疫反応溶液中に前記界面活性剤のみを存在 （該蛋白質は使用 ず） させた場合、 その界面活性効果により前記した標準物質であるァ ポ蛋白質と検体中のアポ蛋白質との免疫反応性の差が生ずる問題点は解 決し、 正確な測定値を得るとと'もに測定時間を著しく短縮することが出 来る。 しかしながらこの場合、 非特異吸着を充分に抑制出来ないために バックグランドが高く微量な組織因子を測定する感度を得ることは出来 ない。
一方、 該蛋白質又は該蛋白質を含む混合物を前記界面活性剤を共存さ せずに単独で用いた場合、 免疫反応における非特異吸着が抑制され、 し たがってバックダランドが低くなり高感度を得る。 しかしながらこの場 合には検体中のヒト組織因子の測定上の前記問題点は解決せず、 正確に、 かつ短時間に測定することは出来ない。
本発明に基いて、 免疫反応溶液中に該蛋白質と該界面活性剤との両者 を共存させた場合、 それぞれが持つ効果が同時に発現し、 検体中に極く 微量に存在する脂質と複合体を形成する該アポ蛋白質を短時間に、 高感 度で正確に測定することが可能となる。 更に驚くべきことに両者を共存 させることによって、 著しく小さな測定誤差で検体中の組織因子の測定 を可能にするという、 それぞれ単独では得られない併用効果が達成され る
ここで言う測定誤差とは、 個人のくせ、 測定機器の不正確性あるいは 試薬の不良などによって起こる系統誤差ではなく、 「突き止められない 原因によって起こる誤差で測定値にバラツキを与えるもの」 すなわち偶 然誤差を意味する。 したがって誤差の大小は、 標準偏差、 変動係数 （C V ) などによって表現される。 測定誤差の小さな測定法は、 高い感度で 正確な測定値を得るために必須であり、 なかんづく複雑な要因が関係し 合う免疫学的測定法の開発においては必要かつ小口』欠である。 該併用効 果の発現理由は、 測定値のバラツキが偶然誤差においては全測定工程の 多くの要因の総和された結果と考えられるため、 明確でないが、 次のよ うに推定される。 すなわち、 前記界面活性剤は一般に蛋白質に対して変 性作用があるとともに、 免疫反応に対しては反応阻害作用を有している ことが知られている。 一方、 該蛋白質、 例えばスキム · ミルクは、 0. 8 %を超える濃度では水に溶けずらく懸濁液として存在することから比
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較的水になじみずらい蛋白質である。 したがって該蛋白質は単独使用の 場合水溶液である免疫反応溶液中で完全に溶解していないことが考えら れる。 しかしながら界面活性剤を共存させる時、 その界面活性効果によ り該蛋白質 （スキム · ミルク） の溶解性が増強され、 免疫反応溶液中で の該蛋白質 （スキム · ミルク） のもつ非特異吸着抑制効果とともに、 界
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面活性剤の蛋白変性作用、 免疫反応阻害作用を抑制する効果が発現し、 したがって該免疫反応の安定性が増やすものと考えられる。 このような 免疫反応の安定性を増やす効果をもつ物質に対し本発明者らは 「抗原一 抗体反応調整剤」 と名づける。 すなわち該蛋白質は、 抗原一抗体反応調 ' 整剤として作用する。 その結果、 本発明の測定方法では、 測定誤差が著 しく改善されるものと推定される。
本発明に使用する界面活性剤は、 H L B値が 1 2. 0以上の非イオン 界面活性剤であれば、 抗原抗体反応を著しく抑制しない限りいずれであつ てもよい。 また非ィォン界面活性剤は 1種のみならず 2種以上と組合せ て使用することもできる。 好ましくは H L B値が 1 2. 5 - 3 0. 0で0
ある非イオン界面活性剤である。 ここで、 2種の非イオン界面活性剤の 混合物を使用する場合の H L B値は次式によって算出される。
(混合物の HLB値） = VA X HLBA X VB X HLBB [VA：非イオン界面活性剤 Aの容積比率、 HLBA：非イオン界面活性剤 Aの HLB値、 VB：非イオン界面活性剤 Bの容積比率、 HLBB：非ィォ ン界面活性剤 Bの HLB値]
該非イオン界面活性剤としては、 例えば多価アルコールエステルェチ レンォキシド付加物、 ポリエチレングリコールモノエステル、 ポリェチ レングリコールジエステル、 高級アルコール ·ェチレンォキシド付加物、 アルキルフヱノール ·エチレンォキシド付加物、 ポリオキシエチレン · ポリオキシプロピレン ·ポリオールなどが挙げられる。
単独で用いられる場合はその HL B値が 12. 0以上のものであれば よく、 例えばポリオキシエチレン ·ポリオキシプロピレン ·ポリオール (シンパ口ニック F 68 "登録商標" ， 11 8値=29) 、 ポリエチレ ングリコール （10) ·セチル ·エーテル （B r i j 56 "登録商標" ， HLB値 =12. 9) 、 ポリエチレングリコール （10) *ォレイル ' エーテル （B r i j 96 "登録商標" ， HLB値 = 12. 4) 、 ポリエ チレングリコール · アルキル ·ァリノレ 'エーテル （Re n e x690 " 登録商標" ， 1^1^8値=13. 0) 、 ポリエチレングリコール （9) P -T e r t—ォクチルフヱノール （NP40 "登録商標" ， HL B値 = 13. 1 ) 、 ポリエチレングリコール · ソルビタン ·モノラウレ一ト (Twe e n 21 "登録商標" ， HLB値 =13. 3 ； Twe e n 20 "登録商標" ， HLB値 =16. 7) 、 ポリエチレングリコール （9— 10) ノニル · フヱノール （Tr i t on "登録商標" N— 101, H LB値 =13. 4) 、 ポリエチレングリコール （9一 1 ϋ) · P-T e r t一才クチルフヱノール （Tr i t on "登録商標" X- 100, H LB値 =13. 5) 、 ポリエチレン 'グリコール （12) ' トリデシル' エーテル （R e n e X 30 "登録商標" ， 11 8値=14. 5) 、 ポリ エチレン ·グリコール （12— 13) · P-T e r t—ォクチルフヱノ —ル （Tr i t on "登録商標" X— 102, HLB値 =14. 6) 、 ポリエチレングリコール ·ソルビタン ·モノステアレート （Twe e n
60 "登録商標" ， 11し8値=14. 9) 、 ポリエチレン ·グリコール (20) ·ォクチル 'エーテル （B r i j 98 "登録商標" ， HLB値 = 15. 3) などを挙げることが出来る。 また 2種以上で用いる場合は、 非ィォン界面活性剤混合物の H L B値を前記した式により算出し時、 1 2. 0以上を示せば特に限定されるものではない。
HLB値が 12. 0未満の非イオン界面活性剤を使用すると、 該免疫 反応中での特異的免疫反応の低下が見られ充分な感度が得られない。
本発明に用いられる非イオン界面活性剤の免疫反応溶液における最終 濃度は 2〜15重量 であり、 好ましくは 3〜10重量％である。 2重 量％未満では、 標準物質としてのアポ蛋白質と検体中の組織因子との間 の反応性の差をなくすことができず、 また 15重量％を超えると特異的 免疫反応が抑制される。
次に本発明で使用する分子量が約 1. 6万〜約 5. 0万でかつ等電点 が 1. 0〜5. 0である蛋白質 （又は該蛋白質を含む混合物） としては、 例えばカゼイン、 ペプシン、 オボグリコプロテイン、 ォロソムコィ ドな どがあげられる。 分子量約 1. 6万未満の蛋白質を用いた場合には、 非 特異吸着が上昇する結果が得られ、 また約 5. 0万より大きい分子量で は免疫非特異的反応の低減が不充分かつ特異的免疫反応の低下が見られ る。 また等電点に関しても 5. 0より大きい蛋白質を添加した場合非特 異吸着が上昇し、 また等電点が 1 . 0未満の場合には特異的免疫反応が 抑制される。 該免疫反応溶液中での蛋白質の最終濃度は、 0 . 0 1〜0. 8重量％とするのが好ましい。 種々の濃度の該蛋白質溶液、 例えばスキ ム， ミルクを用いて免疫測定を行なったところ、 0 . 0 1重量％未満で は、 非特異的反応を充分に抑制出来ず、 また、 1ヶ月間、 該蛋白質たと えばスキムミルク溶液の冷蔵庫における保存試験を行なった結果、 0 . 8重量％より大ではスキムミルク溶液が再溶解不能の沈殺を生じたため、 その保存安定性の面から 0. 8重量％以下が好ましい。
該蛋白質を含む混合物としては、 例えば主成分として前記蛋白質 1 0 〜6 0重量％、 好ましくは 2 0〜5 0重量％、 糖 （例えば乳糖） 3 0〜
8 0重量％、 好ましくは 4 0〜6 0重量％、 その他脂肪 （例えば 0 . 5 〜2重量％) 、 灰分 （例えば 5〜1 2重量％) 、 水分 （例えば 2〜8重 量％) などを含むことができる。 このような混合物として典型的なのは スキムミルクである。 スキムミルクは蛋白質としてカゼィンを含むもの であるが、 カゼインを単独で使用した場合に比べて、 スキムミルクは、 免疫反応溶液中における分散性が良く、 非特異的反応を抑制する効果が 高く、 温度 4 °Cにおける保存性が良い （沈殿が生じにくい） という特徴 を有する。 なお、 本発明に用いるスキムミルクとしては、 脱脂したミル クであれば、 何の由来の乳であっても良い。 一番典型的なもののひとつ としては、 市販されている D i f c o社製のスキムミルクである。 な お本発明において、 蛋白質の 「分子量」 は浸透圧法によって測定した分 子量を意味し、 具体的には高分子溶液と純溶媒と溶媒分子は自由に透す が、 溶出高分チは透さない半透膜を境界面として接した際に両液の浸透 圧差が高分子の分子量のパラメータとなることを利用して蛋白質の分子 量を測定するもので、 本発明では 6. 66 M尿素溶液を用いて 4 °Cで測 定した値である。 また 「等電点」 は蛋白質をその等電点に従って分離す るクロマトフォ一力シング法によって測定した値をいい、 具体的には P
BE94 (フアルマシア製） ゲルを充填したカラム （0. 5 cm0x4 5 cm) を用い溶出液 0. 025Mイミダゾール塩酸 （pH7. 4) で 測定した値をいう。
本発明方法においては免疫反応の溶液 （緩衝液） 中でその濃度が 2〜 15重量％の該界面活性剤と最終濃度が 0. 01〜0. 8重量％の該蛋 白質を共存させる時、 前記した如くおのおののもつ効果をより効果的に 発現するとともに、 測定誤差が著しく改善される共存効果が得られる。
(C) 免疫測定方法；
次に本発明において検体中の七ト組織因子を免疫反応利用して測定す る具体的手段について説明する。
本発明の免疫学的測定方法としては、 E IA、 F I A、 CL I Aまた は R I Aなどによるサンドィツチ法によって行うことが出来るが、 説明 の便宜のために、 好ましく用いられる E I Aのサンドィツチ法について 説明するが、 この測定方法に限定されるものではない。
サンドィツチ法としては大別して 1ステップサンドィツチ法と 2ステツ プサンドイッチ法とがある。 例えば 1ステップサンドイッチ法は、 測定 しょうとする抗原を含む検体、 不溶性担体に固定された固相抗体及び酵 素を標識した標識抗体を同一反応系で抗原 ·抗体反応を行なわせ、 固相 抗体 ·抗原 ·標識抗体複合体を形成せしめ、 洗浄操作の後、 標識物質の 量を測定する方法である。 この場合、 検体と固相抗体と檩識抗体とを同 時に存在させて反応させてもよいし、 先ず検体と固相抗体とを反応させ てから標識抗体を添加して反応させてもよい。 また、 検体と標識抗体と を反応させてから固相抗体を添加してもよい。 いずれにしても洗浄操作 前に同一反応系中で固相抗体 ·抗原 ·標識抗体複合体を形成しさえすれ ばよい。 一方、 2ステップサンドイッチ法は、 検体と固相抗体とを先ず 反応して固相抗体 ·抗原複合体を形成せしめ、 しかる後検体を除去、 洗 浄してから標識物質を添加して固相抗体 ·抗原 ·標識抗体複合体を形成 せしめる。 次いで洗浄操作の後、 標識物質の量を測定する方法である。 本発明においては、 免疫反応溶液に該界面活性剤と該蛋白質又はそれ を含む混合物を共存せしめることにより 1ステップサンドィツチ法およ び 2ステップサンドィツチ法のいずれにおいても、 微量の組織因子を高 感度で正確に、 小さな測定誤差で短時間にかつ容易に測定出来る。
2ステップサンドィツチ法の塲合、 該界面活性剤及び該蛋白質等は 1 次反応の免疫反応溶液及び 2次反応の免疫反応溶液の少なくともいずれ かの反応溶液中に共存させることもできるが、 なかでもいずれの反応溶 液中にも共存させることが最も好ましい。
上記における免疫反応に用いられる溶媒としては、 反応に悪影響を与 えない通常の各種のものいずれであってもよい。 例えばリン酸緩衝液、 トリス《塩酸緩衝液、 酔酸緩衝液などの p Hが 6 . 0から 8 . 0程度の 緩衝液を用いるのが好ましい。
測定に際して免疫反応温度条件は、 使用する蛋白質の性質を変性させ ず、 かつ特異的免疫反応を著しく抑制しない限り特に制限はないが、一 般には 5 0 °C以下、 好ましくは約 4 °C〜 4 5 °C程度の温度条件下に約 5 分から 5時間程度を要して反応を行えばよい。
本発明において前記した測定方法に使用されるキッ トは (a) 第 1抗体 （固相抗体）
(b) 第 2抗体 （標識抗体）
(c) 緩衝液
(d) 洗浄液及び
(e) 第 2抗体として酵素で標識化された抗体を使用する場合には、
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酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤
より構成される。
この本発明のキッ トにおいて、 （a) の第 1抗体は、 ヒト組織因子の アポ蛋白質を特異的に認識し不溶性担体に固定されたモノクローナル抗 体であり、 （b) の第 2抗体はヒト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認
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識し、 且つ前記第 1抗体とは異なる認識部位を有する標識化されたモノ クローナル抗体である。
また本発明のキッ トは、
(i) HLB (Hydrophilic- lipophilic balance) 値が 12以上である' 少なくとも 1種の非ィォン界面活性剤及び
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(ii) 分子量が約 1. 6万〜約 5. 0万であり且つ等電点が 1. 0〜5.
0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合物
をそれら自体又は溶液状態として組合せられている。
ここで前記 （i) の非イオン界面活性剤及び （ii) の蛋白質又は蛋白 質を含有する混合物は、 それら自体で組合されてキッ トを構成していて 0
もよく、 溶液状態として組合せられていてもよい。 "溶液状態" として は、 好ましくは前記 （C) の緩衝液を溶媒としてそれぞれをその中に溶 解してキッ トを構成する。 その場合、 溶液状態における非イオン界面活 性剤の濃度は、 最終使用形態での濃度が前記範囲となる範囲であればよ く、 キッ トとしては前記範囲よりも濃縮された濃度であってもよい。 ま た蛋白質又はその混合物も同様に最終使用形態の濃度或いはその濃縮溶 液であることができる。
そして （d ) 洗浄液は、 通常免疫測定における洗浄剤として使用され ているものであればよい。
その例としては、 生理食塩水、 リン酸緩衝液、 トリス塩酸緩衝液及び これらの混合液が挙げられる。 これらの洗浄剤にはさらにトリ トン X 1 0 0、 T w e e n 2 0または B r i g 3 5の如き非イオン系界面活性剤、 ドデシル硫酸ナトリウムの如きイオン系界面活性剤を加えられてもよい。 さらに （c ) 緩衝液及び Z又は （d ) 洗浄剤中に牛血清アルブミン、 オボアルブミンなどの蛋白質、 動物の血清、 糖類、 安定剤、 防腐剤など を添加することもできる。
本発明の検体とは、 本発明の抗ヒト組織アポ蛋白質を特異的に認識す る抗体が免疫反応することができる抗原としての組織因子を含有する試 料をいう。
かかる抗原としての組織因子には、 ヒ ト組織因子に限らず、 該抗体と 交叉反応する他の動物の組織因子も含まれる。
また、 試料としては動物例えばヒ卜の場合であればヒ ト組織因子が含 まれていれば特に限定はないが、 具体的には溶液状態にある尿、 血液 （血 漿および血清） 、 関節液、 喀痰、 汗等の体液があげられる。 なかでも試 料としての入手の容易性等から血液、 尿が好ましい。 脳、 肺、 腎、 心筋、 消化器、 胎盤、 血管内皮、 血液細胞などの固形状態にある組織をホモジ ネ- トして得られた上清液であってもよい。
しかしながら本発明はヒ ト検体、 特にヒ ト血清又はヒト血漿中のヒ ト 組織因子の測定に最も適している。
発明の効果
かくして、 本発明の免疫学的測定方法によれば、 検体中にある、 例え ば臨床サンプル （血漿、 血清、 尿等の体液など） などの微量の組織因子 を、 溶液中での免疫反応において高感度で、 正確に、 小さな測定誤差で、 短時間に、 しかも簡便な操作で定量することができる。
本発明の免疫学的測定方法、 及び測定キッ トによる組織因子の測定値 は、 血栓性疾患、 血管障害性疾患、 腫瘍性疾患などの診断及び治療のモ 二タリングなどに有用である。
実施例
以下実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例中、 ％表示は重量 %を示す。
実施例 1
(1) 抗ヒト組織因子 ·アポ蛋白質モノクロ一ナル抗体固定ビーズの調 m
ヒト組織因子 ·アポ蛋白質の 146番目から 167番目のアミノ酸残 基領域に結合部位を有するモノクローナル抗体 TF 9— 6 B 4 (特表平 1—503438号公報に記載されたもの） を、 0. 1M炭酸緩衝液 (pH9. 5) に 20 g/m 1の濃度に調製し、 鏡面化されたポリス チレン · ビーズ （ィムノケミカノレ ·ィムノビーズ、 Su r f com 5 7 OA (東京精密社製）で測定した表面.中心線平均粗さ （Ra) ： 1. 3 urn) を浸し 4 °Cで 17時間静置した。 ビーズを 50 mM卜リス塩酸一 0. 1M N a C ϊ (pH7. 4) (以下 T 13 Sと略） にて 3回洗浄後、 1%BS A-TBS (pH7. 4) で室温に 3時間静置した。 TBSで 再度 3回洗浄し、 モノクローナル抗体固定ビーズを得た。 使用するまで TB S中に 4°Cで保存した。
(2) ペルォキシダーゼ標識抗ヒ ト組織因子 ·アポ蛋白質 'モノクロ一 ナル抗体の調製
5 ヒト組織因子 ·アポ蛋白質の 26番目から 49番目のァミノ酸残基領 域に結合部位を有するモノクローナル抗体 TF 8— 5 G 9 (特表平 1一 503438号公報に記載） 635 / gの 0. 5ml PBS溶液に、 サクシンィミジルー 4一 （N—マレイミ ドメチル） シクロへキサン力一 ボネート （SMC C) の DM F溶液 （1 OmgZm 1 ) 10. 6 / 1を 10 25 °Cで撹拌下滴下した。 45分間撹拌し、 この反応液を 3000 r p m、 10分間遠心分離して上清を得た。 次にこの上清を HPLC (カラ ム TSK Ge l 3000 SW) で溶出液として 0. 1 Mリン酸緩 衝液 （pH6. 0) を用いてゲル濾過し、 マレイミ ド化されたモノクロ ーナル抗体を得た。
i s ペルォキシダーゼ （東洋紡） 143mgの 0. 1Mリン酸緩衝液 （p H 6. 0) 溶液 14. 3m 1に S—ァセチルメルカプト無水コハク酸の DMF溶液 （6 OmgZm 1 ) 176. 4〃 1を 25 °Cで撹拌下徐々に 滴下し、 60分間反応させた。 この溶液に 0. 1Mトリス塩酸緩衝液 （p H7. 0) 5. 72mlと 0. 1M EDTA溶液 （pH7. 0) 1. 0 14m 1、 1Mヒ ドロキシルァミン溶液 （pH7. 0) 11. 44m 1 を加え 30°Cで 5分間撹拌した。 溶液を透析チューブに入れ、 0. 1M リン酸緩衝液 （pH6. 0) -5mM E D T Aを外液として 4°Cで二 昼夜透析し、 チオール基を導入したペルォキシダーゼ溶液を得た。
該マレイミ ド化モノクローナル抗体溶液と上記の如く得たチオール化 ペルォキシダーゼ溶液 （3. 57mg/m 1 ) 445 / 1 とを混合し、 該混合液を限外濾過によって約 140 1に濃縮、 4 °Cで 48時間反応 させた。 反応液を HPLC (カラム TSK G e l 3000 SW) で溶出液として PB S (pH7. 2) でゲル濾過して、 ペルォキシダー ゼ標識モノクローナル抗体を得た。 該標識抗体の抗体とペルォキシダー ゼのモル比は 1 ： 3. 3であった。
(3) ヒト組織因子の検量線の作成
50mMトリス ·塩酸— 0. 1M Na C l— 0. 5% SA-3% トリ トン X— 100— 0. 1%スキム · ミルク （ρΗ 7. 4) の希釈バッ ファーを用いてリコンビナント · ヒト組織因子 ·アポ蛋白質の 0、 15、
31、 63、 125、 250、 500、 1000 P gZm 1溶液を作成 し、 この 0. 4m 1づっをポリプロピレン製チューブに入れた （N=2) 。 各チューブに前記 （1) 項記載のモノクローナル抗体固定ビーズを 1ケ づっ加えて、 37°Cで 120分間ィンキュベ一トした。
5 OmMトリス ·塩酸一 0. 1M Na C 1 (pH7. 4) にツイ一 ン 20を 0. 05%溶解した液 （以下 TB S— Tと略） で 3回洗浄した 後、 前記希釈バッファーで抗体濃度 1 gZm lとした前記 （2) 項で 作成したペルォキシダーゼ標識モノクローナル抗体を 0. 4m Iづっ加 え、 37 °Cで 60分間インキュベートした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202— 0.
025% 3, 3' ， 5, 5' —テトラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加えて 37°Cで 30分間ィンキュベートし、 その後 1規定硫酸 im ϊを各チューブに加えて発色反応を停止し、 450 nmの吸光度を 測定した。 得られた各濃度での吸光度から、 測定誤差の指標である変動 係数 （CV) を次式によって算出し、 その結果を表 1に示した。
CV (%) = { (標準偏差） / (平均値） } X 100 比較例として前記希釈バッファーからトリ トン X— 100をのぞいた 場合、 スキム · ミルクをのぞいた場合および卜リ トン X— 100、 スキ ム . ミルクの両者をのぞいた場合のおのおのについて、 同様の操作で該 アポ蛋白質の各濃度での吸光度を測定し、 変動係数を算出した。 それら の値を比較値として表 1に示した。
Figure imgf000029_0001
表 1から明らかなように、 本発明方法である免疫反応溶液中にトリ ト ン X— 100とスキム · ミルクを共存させた時、 各濃度での変動係数す なわち測定誤差が著しく小さくなること判った。
実施例 2
イオン界面活性剤'の HLB値と標準物質に対する吸光度の関係 希釈緩衝液として、 0. 1%スキム · ミルクと 5%濃度の図 1記載の HLB値をもつ各種非イオン界面活性剤 （A〜H) を含む 0. 5%B S
A— 5 OmMトリス '塩酸一 0. 1M N a C 1 (pH 7. 4) を用い て正常人血漿検体 （A) を 4倍に希釈して得た検体希釈液を、 各々 0. 4m lづっポリプロピレン製チューブに入れた。 各チューブに実施例 1 の （1) 項記載の抗体固定ビーズを 1ケづっ加えて 37でで 120分間 ィンキュベートした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 実施例 1の （2) 項で作成した標識抗 体を前記各々に対応する希釈緩衝液に抗体濃度 1 β gZm 1で溶解した 液を、 0. 4m 1づっ加えて 37 °Cで 60分間インキュベートした。
TB S— Tで 3回洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202— 0,
025% 3, 3' , 5, 5' —テトラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加えて 37 °Cで 30分インキュベートし、 1規定硫酸 lm 1を 加えて発色反応を停止した。 その後 450 nmの吸光度を測定した。
非イオン界面活性剤の HLB値と標準物質 （y TF) O p gZm lお ' よび 1000 p g/m 1の 450 nmでの吸光度を図 1に示した。
図 1から明らかなごとく免疫反応溶液中に含まれる非ィォン界面活性 剤の HLB値が 12. 0未満では吸光度の低下が起き、 充分な測定感度 が得られないことが判る。
実施例 3
トリ トン X— 100濃度変化による正常人血漿中のヒト組織因子の測 室
希釈緩衝液として、 0. 1%スキム ' ミルクと所定濃度のトリ トン X -100 (0、 1、 2、 3、 5、 10、 15、 20%) を含む 0. 5 % B S A— 5 OmMトリス塩酸一 0. 1M Na C l (pH7. 4) を用 いて正常人血漿検体 （B) を 4倍に希釈して得た検体希釈液を、 各々 0. 4mlづっポリプロピレン製チューブに入れた （N==2) 。 各チューブ に実施例 1の （1) 項記載の抗体固定ビーズを 1ケづっ加えて 37でで 120分間ィンキュベーションした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 実施例 1の （2)項で作成した標識抗 体を前記各々に対応する希釈緩衝液に抗体濃度 1 ^ g/m 1で溶解した 液を、 0. 4m 1づっ加えて 37 °Cで 60分間インキュベーションした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202— 0. 025% 3， 3' . 5, 5' —テ トラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加えて 37°Cで 30分間ィンキュベ一ションし、 1規定硫酸 1 m 1を加えて発色反応を停止した。 その後 450 nmの吸光度を測定し 一方、 実施例 1の （3) 項で用いたアポ蛋白質を標準物質とし、 前記 と同じ希釈緩衝液を用いて、 前記と同様にして T r i t o nX- 100 のそれぞれの濃度に対応した検量線を作成しておいた。 そして、 対応す る Tr i t onX— 100濃度の検量線を用いて、 前記のごとく して得 られた希釈検体が示した 450 nmの吸収強度からヒ ト組織因子の濃度 を求めた。 それぞれの T r i t o n X- 100濃度に対応して得られた ヒト組織因子の濃度を図 2に示した。
図 2から明らかな如く、 トリ トン X— 100 2〜 15%の間で測定 値が最も高くかつ一定であることが判つた。
実施例 4
スキム · ミルク濃度変化における測定誤差と測定感度
希釈緩衝液として、 3. 0%トリ トン X— 100と所定濃度のスキム ミルク （0、 0. 005、 0. 01、 0. 02、 0. 1、 0. 8、 1. 0%) を含む 0. 5%BS A— 5 OmMトリス塩酸一 0. 1M N a C 1 (pH7. 4) を用いてリコビナント · ヒト組織因子アポ蛋白質 0、 1000 p gノ m 1溶液を調製した。 この溶液各々 0. 4mlづっポリ プロピレン製チューブに入れた （N=2) 。 各チューブに実施例 1の （1
5
) 項記載の抗体固定ビーズを 1ケづっ加えて 37°Cで 120分間インキュ ベーションした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 実施例 1の （2) 項で作成した標識抗 体を前記各々の希釈緩衝液に抗体濃度 1 g m 1で溶解した液を 0. 4mlづっ加えて 37°Cで 60分間ィンキュベーションした。
10
TBS— Tで 3回洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202—◦. 025% 3， 3' ， 5, 5' —テトラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加えて 37°Cで 30分間ィンキュベーシヨンし、 1規定硫酸 1 m 1を加えて発色反応を停止した。 その後 450 nmの吸光度を測定し た。 この吸光度から各スキム · ミルク濃度で変動係数 （CV) 及び感度
I 5
の標識としての SZN比 （アポ蛋白質 1000 p gZm 1での OD450 値） /アポ蛋白質 0 p g/m 1での OD450値） を算出した。
0 表 2
Figure imgf000033_0001
表 2から明らかな如ぐ、 トリ トン X— 100を 3%共存させた時スキ ム * ミルク濃度は 0. 01~0. 8%の間で CV、 SZN比ともに良好 であった。
実施例 5
正常人血漿測定におけるトリ トン X— 100とスキム · ミルクの併用 効果
希釈緩衝液として、 3. 0%トリ トン X— 100とスキム · ミルクの 濃度組合せが 0%—0. 1%、 0. 1%-3. 0%、 及び 0. 1%— 3. 0 で含む0. 5%B S A— 5 OmMトリス塩酸一 0. 1M N a C 1 (pH7. 4) を用いて正常人血漿検体 Cと検体 Dをそれぞれ 4倍に希 釈して得た検体希釈液を、 各々 0. 4m 1づっポリプロピレン製チュー ブに入れた （N=2) 。 各チューブに実施例 1の （1) 項記載の抗体固 定ビーズを 1ケづっ ¾えて 37 で 120分間インキュベーションした。
TB S— Tで 3回洗浄した後、 実施例 1の （2) 項で作成した標識抗 体を前記各々の希釈緩衝液に抗体濃度 1 ^ g/m 1で溶解した液を 0. 4mlづっ加えて 37°Cで 60分間ィンキュベーシヨンした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202— 0. 025% 3, 3' ， 5, 5' —テトラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加えて 37°Cで 30分間ィンキュベーシヨンし、 1規定硫酸 1 m 1を加えて発色反応を停止した。 その後 450 nmの吸光度を測定し た。
一方、 実施例 1の （3) 項で用いたアポ蛋白質を標準物質とし、 前記 と同じ希釈緩衝液を用いて、 前記と同様にしてトリ トン X— 100とス キム · ミルクのそれぞれの濃度組合せに対応した検量線を作成しておい た。 そして、 対応する濃度組合せの検量線を用いて、 前記の如く して得 られた希釈検体が示した 450 nmの吸収強度からヒト組織因子の濃度 を求めた。 それぞれの濃度組合せに対応して得られたヒト組織因子の濃 度と変動係数 （CV) を表 3に示した。 表 3
Figure imgf000034_0001
表 3から明らかな如く、 本発明のトリ トン X— 100とスキム， ミル クを共存させて検体を測定する時、 小さな測定誤差 （変動係数） で、 正 確にヒ卜組織因子を測定出来た。 実施例 6
固定ビーズの表面中心線粗さと SZN比に関係
実施例 1の （1) 項記載のモノクローナル抗体 TF 9— 6 B 4を 0. 1M炭酸緩衝液 （pH 9. 5) に 20 i gZm lの濃度の溶解液 10 m 1調製した。 この溶解液を 5m 1づっ 2分し、 この液の一方に鏡面化さ れたポリスチレン · ビーズ （ィムノケミカル製ィムノビーズ、 S u r f c om 57 OA (東京精密社製） で測定した表面中心線平均粗さ （R a) : 1. 3 m) を 30ケ加え、 比較例として他方の液に非鏡面化ポ リスチレン . ビーズ （セキスィ （株） 製 # 80ビーズ、 上記と同様にし て測定した R a ： 3. 9 ) を 30ケ加え、 いずれも 4 °Cで 20時間 静置した。 ビーズを TB Sで 3回洗浄後、 1%B SA— TB S (pH 7. 4) で室温に 3時間静置した。 TB Sで再度 3回洗浄し、 本発明の鏡面 化ポリスチレンビーズ固定抗体 （A) と比較例の非鏡面化ポリスチレン ビーズ固定抗体 （B) 得た。
実施例 1の （3) 項と同様にして該アポ蛋白質の 0、 1000 p gZ m l溶液を作成し、 上記 （3) 項記載と同様にして固定抗体 （A) (B) それぞれについてのアポ蛋白質の各濃度での 450 nmの吸光度を測定 した。 各固定抗体での感度の指標として SZN比 （アポ蛋白質 1000 p g/m 1での OD45o値） アポ蛋白質 0 p g/ 1での OD45()値） を算出した。 これらの結果を表 4に示す。 表 4
Figure imgf000036_0001
表 4から明らかな如く、 本発明の鏡面化ビーズは低いバックグラウン ドと高い SZNを可能にした。
I 0
実施例 7
1ステップサンドィツチ法による検量線の作成
リコビナント · ヒト組織因子，ァボ蛋白質の希釈緩衝液、 0. 5%B SA— 3%トリ トン X— 100— 0. 1%スキム · ミルク一 50mMト リス塩酸一 0. 1M Na C 1 (pH7. 4) 溶液、 0、 15、 31、
I 5
63， 125、 250、 500、 1000、 2000 p gZm 1溶液を 作成し、 この 0. 2m 1づっポリプロピレン製チューブに入れた。 各チュ ーブに実施例 1の （2) 項で作成したペルォキシダーゼ標識モノクロ一 ナル抗体を前記希釈緩衝液で抗体濃度 1 gZm 1に溶解した液を 0. 2mlづっ加え、 撹拌した。 その後各チューブに前記 （1) 項記載のモ 0
ノクローナル抗体固定ビーズを 1ケづっ加え、 37°Cで 120分間ィン キュベーショ ンした。
TI3S— Tで 3 洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202— 0. 025% 3, 3' ， 5, 5' —テトラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加え、 37°Cで 30分間ィンキュベ一ションし、 1規定硫酸 1 m 1を加え発色反応を停止した後、 450 nmの吸光度を測定した。 そ の結果得た検量線を図 3に示した。
図 3から明らかな如く、 本発明による 1ステップ 'サンドイッチ法は、 15 p g/m 1の高い感度を与え良好な検量線が得られることが判る。
実施例 8
検体の測定
希釈緩衝液として、 3%トリ トン X— 100— 0. 1%スキム · ミル ク一 0. 5%B S A— 5 OmMトリス塩酸一 0, 1M N a C I (p H 7. 4) を用いて表 5に記載のおのおのの血漿検体又は尿検体をそれぞ れ 4倍に希釈して得た検体希釈液を、 各々 0. 4mlづっポリプロピレ ン製チューブに入れた （N-2) 。 各チューブに実施例 1の （1) 項記 載の抗体固定ビーズを 1ケづっ加えて 37°Cで 120分間ィンキュベー シヨンした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 実施例 1の （2) 項で作成した標識抗 体を前記各々の希釈緩衝液に抗体濃度 1 gZm 1で溶解した液を 0. 4 m 1づっ加えて 37°Cで 60分間ィンキュベーションした。
TBS— Tで 3回洗浄した後、 発色剤として 2. 5mM H202— 0. 025% 3, 3' ， 5， 5' —テトラメチルベンジジン溶液を 0. 4 m 1づっ加えて 37°Cで 30分間ィンキュベ一ションし、 1規定硫酸 1 m 1を加えて発色反応を停止した。 その後 450 nmの吸光度を測定し た。
一方、 実施例 1の （3) 項で用いたアポ蛋白質を標準物質とし、 前記 と同じ希釈緩衝液を用いて前記と同様にして検量線を作成した。 得られ た検量線を図 4に示す
この検量線を用いて、 前記の如く して得られた希釈検体が示した 4 5 0 n mの吸収強度から血漿検体中のヒト組織因子アポ蛋白質の濃度を表 5に示す。 表 5
Figure imgf000038_0001
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明方法による非イオン界面活性剤の H L B値と、 標準物 質に対する吸光度との関係を示したものである。
図 2は、 スキム · ミルク存在下にトリ トン X— 1 U ϋ濃度変化させて 正常人血漿中のヒト組織因子を測定した結果を示す。 図 3は、 本発明方法による 1ステップ ·サンドィツチ法の検量線であ
* >
図 4は、 本発明方法によりヒ ト血漿中の組織因子を定量するための検 量線である。

Claims

請求の範囲
1. 検体中の組織因子を緩衝液中で免疫反応により免疫学的に測定す る方法において、
(a) ヒト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認識し不溶性担体に固定 されたモノクローナル抗体 （第 1抗体） 及びヒト組織因子のァ ポ蛋白質を特異的に認識し、 且つ前記第 1抗体とは異なる認識 部位を有する、 標識化されたモノクローナル抗体 （第 2抗体） を使用し、
(b) 該免疫反応を、
(i) HLB (Hydrophilic- lipophilic balance) 値が 12以 上である少なくとも 1種の非イオン界面活性剤を 2〜1 5重量％の濃度で含有し、 且つ
(ii) 分子量が約 1. 6万〜約 5. 0万であり且つ等電点が 1.
0〜5. 0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合物を含 有する
緩衝液中で行なう、
ことを特徵とする組織因子の高感度測定方法。
2. 該第 1抗体、 該第 2抗体及び検体とを同一の免疫反応系中で接触 させることによる請求の範囲第 1項記載の測定方法。
3. (1) 該第 1抗体と検体とを緩衝液中で接触させ、
(2) 前記 （1) で得られた第 1抗体を洗浄剤で洗浄し、
(3) 前記 （2) で得られた第 1抗体と、 該第 2抗体とを緩衝液中で 《¾c±TTヽ
(4) 前記 （3) で得られた第 1抗体を、 洗浄剤で洗浄し、 そして (5) 前記 （4) で得られた第 1抗体に結合した標識物質を検出する、 ことよりなる、 請求の範囲第 1項記載の測定方法。
4. 該モノクローナル抗体が、 いずれもヒト組織因子の凝固第 VIIZV Ila因子に対する結合能を中和することができる抗体である請求の範囲 第 1、 2又は 3項記載の測定方法。
5. 該モノグローナル抗体の一方が、 下記アミノ酸配列 （ I ) に認識 部位を有し、 他方が下記アミノ酸配列 （Π) に認識部位を有する抗体で ある請求の範囲第 1、 2又は 3項記載の測定方法。
EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC (I)
VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT (II)
6. 該モノクローナル抗体の一方が、 ATCCに受理番号 HB 938 2として寄託されたハイプリ ドーマ TF 8 - 5 G 9が産生する抗体であ り、 他方が ATCCに受理番号 HB 9381として寄託されたハイプリ ドーマ T F 9— 6 B 4が産生する抗体である請求の範囲第 1、 2又は 3 項記載の測定方法。
7. 該モノクローナル抗体が、 いずれも独立して完全抗体、 F a b' フラグメント又は F (a b')2 フラグメントである請求の範囲第 1、 2 又は 3項記載の測定方法。
8. 該第 1抗体におけるモノクローナル抗体が、 完全抗体又は F (a b')2 フラグメントである請求の範囲第 1、 2又は 3項記載の測定方法。
9. 該第 2抗体におけるモノクローナル抗体が、 完全抗体、 F a b' フラグメント又は F (a b')2 フラグメントである請求の範囲第 1、 2 又は ύ唄 sci戦の測疋カ ¾。
10. 該非イオン界面活性剤が 12. 5〜30. 0の HLB値を有する ものである請求の範囲第 1、 2又は 3項記載の測定方法。
11. 該緩衝液は HLB値が 12以上である少なくとも 1種の非イオン 界面活性剤を 3〜10重量含有する請求の範囲第 1、 2又は 3項記載の 測定方法。
12. 該非イオン界面活性剤がアルキル'フヱノール'エチレンォキシ
5
ド付加物である請求の範囲第 1、 2又は 3項記載の測定方法。
13. 該緩衝液は、 分子量が約 1. 6万〜約 5. 0万であり且つ等電点 が 1. 0〜5. 0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合物を最終濃度と して 0. 01〜0. 8重量％含有する請求の範圑第 1、 2又は 3項記載 の測定方法。
I 0
14. 該蛋白質又は該蛋白質を含む混合物がスキム， ミルクである請求 の範囲第 1、 2又は 3項記載の測定方法。
15. 該不溶性担体が、 鏡面化されたビーズである請求の範囲第 1、 2 又は 3項記載の測定方法。
血漿である請求の範囲第
I 5 16. 該検体がヒト血清又はヒト 1、 2又は 3 項記載の測定方法。
17. (a) 第 1抗体
(b) 第 2抗体 （標識抗体）
(c) 緩衝液
(d)洗浄液及び
0
(e)第 2抗体として酵素で標識化された抗体を使用する場合には、 酵素活性を測定するための基質及び反応停止剤
を組合せてなる検体中の組織因子を免疫学的に測定するためのキッ トで あって、 (1) (a) の第 1抗体はヒト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認識 し不溶性担体に.固定されたモノクローナル抗体であり、 そして (b) の第 2抗体はヒ ト組織因子のアポ蛋白質を特異的に認識 し、 且つ前記第 1抗体とは異なる認識部位を有する標識化され たモノクローナル抗体であって、 且つ
(2) 該キッ トは、 さらに
(i) H L B (Hydrophilic-lipophilic balance) 値が 12以 上である少なくとも 1種の非イオン界面活性剤、 及び (ii) 分子量が約 1. 6万〜約 5. 0万であり旦っ等電点が 1.
0〜5. 0である蛋白質又は該蛋白質を含む混合物、 をそれら自体又は溶液状態で組合せてなる、
ことを特徵とする検体中の組織因子を高感度で測定するためのキッ ト。
18. 該モノクローナル抗体が、 いずれもヒト組織因子の凝固第 VII/V Ila因子に対する結合能を中和することができる抗体である請求の範囲 第 17項記載のキッ ト。
19. 該モノクロ一ナル抗体の一方が、 下記ァミノ酸配列 （ I ) に認識 部位を有し、 他方が下記アミノ酸配列 （Π) に認識部位を有する抗体で ある請求の範囲第 17項記載のキッ ト。
EPKPVNQVYTVQISTKSGDWKSKC (I)
VFGKDLIYTLYYWKSSSSGKKT (II)
20. 該モノクローナル抗体の一方が、 ATC Cに受理番号 HB 938 2として寄託されたハイプリ ドーマ TF8— 5G9が産生する抗体であ り、 iik方が ATC Cに受理番号 HB 938丄として寄託されたハイプリ ドーマ TF 9— 6 B 4が産生する抗体である請求の範囲第 17項記載の キッ 卜
21. 該モノクローナル抗体が、 いずれも独立して完全抗体、 Fab' フラグメント又は F (ab')2 フラグメントである請求の範囲第 17項 記載のキッ ト。
22. 該第 1抗体におけるモノクローナル抗体が、 完全抗体又は F (a
S
b')2 フラグメントである請求の範囲第 17項記載のキッ ト。
23. 該第 2抗体におけるモノクローナル抗体が、 完全抗体、 Fab' フラグメント又は F (ab')2 フラグメントである請求の範囲第 17項 記載のキッ ト。
24. 該非イオン界面活性剤が 12. 5〜30. 0の HLB値を有する
10
ものである請求の範囲第 17項記載のキッ ト。
25. 該緩衝液は、 最終使用形態として HLB値が 12以上である少な くとも 1種の非イオン界面活性剤を 2〜15重量％好ましくは3〜10 重量含有する請求の範囲第 17項記載のキッ ト。
26. 該非イオン界面活性剤がアルキル · フヱノール ·エチレンォキシ
I 5
ド付加物である請求の範囲第 17項記載のキッ ト。
27. 該緩衝液は、 最終使用形態として分子量が約 1. 6万〜約 5. 0 万であり且つ等電点が 1. 0〜5. 0である蛋白質又は該蛋白質を含む 混合物を 0. 01〜0. 8重量％含有する請求の範囲第 17項記載のキッ 卜
0
28. 該蛋白質又は該蛋白質を含む混合物がスキム · ミルクである請求 の範囲第 17項記載のキッ ト。
29. 該不溶性担体が、 鏡面化されたビーズである請求の範囲第 17項 記載のキッ ト。
3 0. 該検体がヒ ト血清又はヒ ト血漿である請求の範囲第 1 7項記載の キッ 卜 o
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