JPH02216054A

JPH02216054A - ヒト組織因子の測定方法，試薬およびキット

Info

Publication number: JPH02216054A
Application number: JP3622889A
Authority: JP
Inventors: Yukiya Koike; 小池　行也; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-02-17
Filing date: 1989-02-17
Publication date: 1990-08-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（ａ）産業上の利用分野本発明は、ヒト組織因子を免疫学的に測定する方法、試
薬及びキットに関するものである。

更に詳しくは、ヒト組織因子を特異的に認識し結合する
モノクローナル抗体を用いるサンドイッヂ法によるヒ１
〜組織因子の免疫学的測定方法、試薬及びキラ１〜に関
するものでおる。

（ｂ）従来の技術ヒト組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｆａｃｔｏｒ）は組織ト
ロン小プラスチンとも呼ばれ、外因系凝固の開始物質と
して重要な動きを示すことか知られている。づなわち、
第Ｖｌｌ因子と複合体を形成し、第Ｘ因子や第１Ｘ因子
を活性化する物質でおる。組織因子は脂質部分と蛋白部
分（アポ蛋白）よりなる糖脂質蛋白（ｇｌｙｃｏｌ　１
ｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）で、その活性発現には双方の存在
が必要である。アポ蛋白は分子量５万前後の糖蛋白で一
種の膜缶白と考えられている。＋ｎｔａｃｔな細胞では
組織因子は細胞膜中に表面を覆われた状態で存在すると
考えられ、特にガンなどにお（プる組織・血管の損傷に
よって、細胞表面に組織因子が露呈し、血管向凝固が起
こり易くなる。またＴＮ　Ｆ　（’ｒｕｍｏｒ　Ｎｅｃ
ｒｏｓ：ｓ　Ｆａｃｔｏｒ）やＩ　Ｌ　（ＴｎｔｅｒＬ
ｅｕｋｉｎ）　、サイト力イン類か、ある種の細胞を刺
激して細胞表面に組織因子活性か発現力ると報告されて
いる［Ｐ、Ｒ，Ｃｏｎｋｌｉｎｇ、　Ｃ，Ｓ、Ｇｒｅｅ
ｎｂｅｒｑ、　ａｎｄＪ、Ｂ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｂｌ
ｏｏｄ、　　ｖｏｌ　　７２．　　Ｎｏ、１．　１２８
−１３３（１９８８）参照］。

最近、ヒ１へ組織因子アポ蛋白をコードするＣ［）ＮＡ
クローンが単離され、蛋白の１次構造が明らかになった
［Ｅ、に、５ｐｉｃｅｒ　　ｅｔ　ａｍ　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　ｖｏｌ、８４．５１４８
−５１５２　（１９８７）参照］。

またヒト組織因子アポ蛋白は不溶性であるが１〜リプシ
ン等の酵素によって消化を受けると可溶化することも明
らかにされている。

ヒト組織因子は全身請臓器に存在するが、特に肺、脳、
胎盤に多く、節管内皮細胞も組織因子を産生ずることか
知られている［Ｃｏ１ｕｃｃｉ　Ｈ，ｅｔａ　；　Ｊ、
　Ｃｌ１ｎ、　ＩｎＶｅＳｔ、−戸、　１８９３−１８
９６　（１９８３）参照］。

しかしながら、ヒト絹織因子の血液中または尿中ての存
在型体については未だ報告されていない。

ヒ１〜組織因子の測定方法としては、従来、生体内より
組織の切片を取り出し、すりつぶして血液凝・固活性を
測定する生物学的測定方法か用いられてきた。しかしな
から、この方法では定量的にヒ１〜組織因子を測定する
ことは囲動で必り、また再現性も低く操作が煩雑である
という問題かおる。

また、血中または尿中におけるヒ１〜組織因子の血液凝
固活性を測定することは夾雑蛋白の影響、■害物質の存
在等の理由で困難である。

（Ｃ）発明の目的そこで本発明者らは、ヒト組織因子の定量的な測定方法
として、ヒト組織因子の血液凝固活性を測定するのでは
なく、ヒト組織因子自体を直接測定する方法について研
究を重ねたところ、それぞれ異なる抗原決定部位を認識
する２種類の抗ヒト組織因子七ツクローナル抗体を用い
ることによって可能となることを見出し本発明に到達し
た。

（ｄ）発明の構成すなわち本発明は、それぞれ異なる抗原決定部位を認識
する２種類の抗ヒト組織因子モノクロナル抗体の一方を
不溶性担体に結合して第１次抗体とし、他方を第２次抗
体として用いることを特徴とする１ノントイツチ法によ
るじ１へ組織因子の免疫学的測定方法、測定試薬ｄ５よ
び測定キラＩ〜である。

以下、本発明について詳細に説明する。

］ノントイッチ法による免疫学的測定方法とは、一般に
抗原の２つの異なった位置に結合する抗体を用いて抗原
の有無またはその量を測定する方法でおる［ワイド［放
射線免疫検定法（Ｒａｄｉ。

ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ）Ｊ　１９９−
２０６　（１９７０）参照］。

υンドイッチ法は全反応を液相で行うこと（液相法）も
、一部を同相化して行うこと（同相法）も可能であるが
、本発明方法においては操作の容易ざから液相法で行う
ことが有利である。

ヒト組織因子は前記した通り、脂質部分と蛋白部分（ア
ポ蛋白）よりなる糖脂質蛋白であり、第ＶＩ［因子と複
合体を形成し、第Ｘ因子や第ＴＸ因子を活性化する外因
系白液凝固の開始物質である。ヒト組織因子は１ｎｔａ
Ｃ１の細胞では細゛胞膜中に表面を覆われた状態で存在
する。近年、ヒ１〜組織因子アポ蛋白、更にヒト絹織因
子アポ蛋白をトリプシン等の酵素によって消化あるいは
ＣＮ　Ｂｒ等によって分解されたヒト組織因子アポ蛋白
の断片等も得られている。

本発明の測定方法によれば、ヒト組織因子と第■■因子
どの複合体、ヒト組織因子アポ蛋白７１３よびヒト組織
因子アポ蛋白の消化物おるいは分解物を含めたヒト組織
因子の測定か可能どなる。

本発明において用いられる抗ヒ１へ組織因子モノクロー
ナル抗体としては、それぞれ異なる抗原決定部位を認識
する２種類のものであれば特に限定はないが、具体的に
は、本発明者らによって既に見出されたヒト組織因子に
特異的に結合し該ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害し
ない抗ヒト組織因子モノクローナル抗体（平成元年２月
２日出願［抗ヒト組織因子モノクローナル抗体」）等が
挙げられる。更に具体的には、微工研奇託番号ＦＥＲＮ
Ｐ−１０５０５（Ｇ　Ｘ　３を産生する。）　、　ＦＥ
ＲＭ　Ｐ−１０５０６（ＧＸ４を産生ずる。）　、　Ｆ
ＥＲＩ（Ｐ−１０５０７（Ｅ　Ｘ　６を産生ずる。）の
ハイブリドーマ細胞が産生ずる抗体およびそれと同等の
結合特性を右する抗に１〜組織囚因子ノクローナル抗体
である。

本発明に関して微工研に寄託したハイブリドマ細胞か産
生するＧＸ３．ＧＸ４およびＥＸ６の抗ヒト組織因子モ
ノクローナル抗体の特徴を述べる。

これらはともにヒト組織因子に特異的に結合し、該ヒト
組織因子の血液凝固活性を阻害しないものであり、更に
ＧＸ３は下記一般式（ＩＩ＞ＮＶＰＫＰＥＷＥＬＩＴＫ
ＦＮＴＳＫＷＴＬＮＹＡＡＶＴＮＴＴＧＳ−ＮＨ２（１
霞ロイシン　　　　　　　　　　　　　ｊを認識し、Ｇ
Ｘ４は式（ＩＩ）を認識し、がっ式（ｎ）の高次構造を
認識するものであり、ＥＸ６は下記一般式（丁）Ｈ２Ｎ　−ＧＱＥＫＧＥＦＲＥＩＦＹＩＩＧＡＶＶＦＶ
ＶＩＩＬＶＩＩＬＡＩＳＬＨＫＣＲＫＡＧＶＧＱＳＷＫ
ＥＮＳＰＬＮＶＳ−ＣＯＯ１１・（Ｉ　）ここでアミノ
酸の略号は式（ＩＩ＞に同じである。

をｔ２減するものである。

これらの抗体のなかで好ましいものとしては、ヒト胎盤
由来の組織因子アポ蛋白をＣＮ　Ｂｒで処理して得られ
た、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白のリン脂質を結合
するドメインを含むカルボキシル基末端側の断片に結合
せず、ヒト胎盤由来の組織因子アポ蛋白のリン脂質を結
合するドメインを含まないアミン基末端側の断片に結合
し、該ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト
組織因子モノクローナル抗体または式（Ｉ）で表わされ
るヒト組織因子アポ蛋白の断片に結合せず、式（ｎ）で
表わされるヒ１〜組織因子アポ蛋白の断片に結合し、該
ヒト組織因子の血液凝固活性を阻害しない抗ヒト組織因
子のモノクローナル抗体である。

具体的には微工研寄託番号ＦＥＲ）Ｉ　Ｐ−１０５０５
（ＧＸ３を産生Ｔる。）　、　ＦＥＲＮ　Ｐ−１０５０
６（ＧＸ４を産生ずる。）のハイブリドーマ細胞が産生
する抗体およびそれと同等の結合特性を有する抗ヒト組
織因子モノクローナル抗体である。

更に本発明においては、微工研奇託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−
１０５０５（Ｇ　Ｘ　３を産生ずる。）のハイブリドー
マ細胞が産生する抗体およびそれと同等の結合特性を有
する抗ヒト組織因子モノクローナル抗体を不溶性担体に
結合する１次抗体とし、微工研奇託番号ＦＥＲＮ　Ｐ−
１０５０６（Ｇ　Ｘ　４を産生ずる。）のバイブ゛リド
ーマ細胞が産生ずる抗体およびそれと同等の結合特性を
有する抗ヒト組織因子モノクローナル抗体として用いる
ことか好ましい。

これらの抗体は完全な形の抗体のままで用いうろことは
もちろんのこと、その本質的結合能か維持される抗体断
片、例えばユニバレン１への抗体。

Ｆａｂ　、　Ｆａｂ’、　（Ｆａｂ’）２等として用い
ることもできる。

本発明における被検試料としては、ヒト組織囚、子が含
まれているものでおれば特に限定はないが、具体的には
溶液状態のものとしては、尿、血液（血漿および血清）
、関節液、喀痰、汗等の体液か挙げられ、固体状態のも
のとしては組織抽出物及び脳、肺、胎盤ならびにガン組
織のホモジネト（粉砕物）等が挙げられる。このなかで
体液およびガン組織のボモジネ−１〜であることが好ま
しく、操作の容易さから尿、血液（血漿および血清）で
あることが特に好ましい。

本発明において用いられる不溶性担体としては、例えば
ポリスチレン、ポリエヂレン、ポリプロピレン、ポリエ
ステル、ポリアクリルニトリル、弗素樹脂、架橋デキス
１ヘラン、ポリサッカライドなどの高分子、その仙紙、
ガラス、金属、アカロスａ３よびこれらの絹合せなどを
例示することができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状２球状
、繊維状、棒状、盤状、容器状、レル。

試験管などの種々の形状であることかできる。

本発明においては２次抗体として用いられる抗体を直接
標識抗体としてもよい。或いは、かかる２次抗体に対す
る抗体を３次抗体として用いて、それらを標識抗体とし
てもよい。本発明においては最終的な検出手段は本質的
な問題ではなく、ヒト組織因子を認識する１組の２個の
抗体としてそれぞれ異なる抗原決定部位を認識する２種
類の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体を用いることか
要件であり、かかる組合せにより認識固定した後の検出
手段は如何なるものでもかまわない。

しかしながら、本発明に用いることができる代表的検出
法を例示すると、２次抗体を酵素、放射性物質、蛍光物
質あるいは他の結合物質で標識したものを用いる検出法
となる。

上記検出法に実際に用いられる酵素とじては、アルカリ
性フォスファターゼ、パーＡキシターヒ。

β−Ｄ−ガラク１〜シターゼなどを、敢削性物貿として
は　　Ｉ・　　　■・　Ｃ・　Ｈなどを、また蛍光物質
としてはフルオレツセインイソチオシアネ−１〜、デ１
へラメチルローダミンイソチオシアネトなどを使用する
ことができるが、これらは例示したものに限らず、免疫
学的測定方法に使用されているものであれば、他のもの
でも使用できる。

また、２次抗体を溶解する溶媒としては、リン酸、トリ
ス、　ＨｅｐｅＳ等水溶液中水溶液中近のｐＨを示す緩
衝剤と、ｒｒｉｔｏｎ、　ＴＷｅｅｎ等の非極性可溶化
剤とを含む水溶液を用いる。

次に本発明によるヒ１〜組織因子の測定方法について具
体的に説明する。

ヒ１〜組織因子に対するモノクローナル抗体（第１抗体
）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック容器）に固
定化する（以下これを″固定化抗体″という）。ついで
不溶性担体と測定しようとする試薬または検体試料との
非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば生血清
アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆刃る。

このようにして得られた第１抗体か固定化され］４た不溶性担体を検体試料と一定時間および温度で接触さ
せ反応させる。この間に固定化抗体（第１抗体）と検体
試料中のヒ１〜組織因子か結合する。

次いで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物質で標識
化したヒト組織因子に対する抗体（第２抗体）の溶液（
例えば水溶液）を、不溶性担体にお（プる固定化抗体に
結合したヒ［へ組織因子と一定時間および温度で接触さ
け第２抗体と反応させる。

これを適当な洗浄液で洗い、次いて不溶性担体上に存在
する第２抗体に標識された標識物質の量を測定する。

かくしてその値から検体試料中のヒ１〜組織因子の量を
算出することかて′きる。

本発明におりる測定試薬は、それぞれ異４【る抗原決定
部位を認識する２種類の抗ヒｌ〜組織因子七ツクローナ
ル抗体の一方を不溶性担体に結合した第１次抗体と他方
の第２次抗体とより主として構成される。

また、この試薬を能率よく月つ簡便に利用りるために、
これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキラ１〜を形成
することができる。かかる補助剤としては、例えば固体
状の試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗浄
するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵
素を使用した場合、酵素活性を測定するための基質、そ
の反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキラ１〜として
通常使用されるものか挙げられる。

（ｅ）発明の効果本発明によれば直接ヒト組織因子を測定することができ
、溶液状態（例えば尿中）のヒト組織因子てあっても、
他の夾雑物の影響を全く受けず定量的に、かつ短時間で
測定することか可能となつＩこ。

実施例１ヒ１〜組織因子の測定七ツクローナル抗体ＧＸ３を２０μＣｌ　／ｄの濃度に
なるようにＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液−０，１５）
ＩＮａＣＱ、ｐＨ７，４）で希釈し、マイクロタイター
プレｌ〜のウェルに１００μｌ加えて、−晩装置し、抗
体を固相に吸着させた。１％ＢＳＡ　（牛面清アルブミ
ン）を含むＰＢＳを１５０μｌ／ウェル加えて室温−Ｃ
２時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０とＯ２１
％「３Ｓ△を含むＰＢＳ　（洗浄用バッファー）て洗浄
した。次にヒト組織因子を洗浄用バッファーで希釈し、
１００μｌ／ウェル加え、３７°Ｃで１時間反応させた
。３回洗浄用バッファーで洗浄した後、パオキシダーゼ
標識化モノクローナル抗体ＧＸ４を洗浄用バッファーで
３００ｎ（］　／ｄの）農度になるように希釈し、１０
０μｌ／ウェル加え、３７°Ｃて１時間反応させた。３
回洗浄用バッファーで洗浄した後、基質溶液（ＡＢ丁Ｓ
）を１００μｌ／ウェル加えで、波長４１５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。

測定結果を図１に示す。ヒト組織因子と吸光度との関係
は直線関係にあり、この検量線を用いれば、溶液状態に
あるヒト組織因子を定量的に測定可能である。

実施例２尿中のじ１〜絹織因子の測定ヒト新鮮尿を洗浄用バッファーで適当な濃度になるよう
に希釈し、抗原として実施例１と同様の操作により、尿
中のヒ［〜組織因子を検出した。尿の希釈率と吸光度の
関係を図２に示ず。

本発明のヒ（〜組織因子に対する２種類のモノクローナ
ル抗体を用いた測定系はヒ１へ尿中のヒ１〜組織因子を
温度依存的に検出し、実施例１の検量線を用いて計紳し
た結果、健常人尿中に２〜３μ９／ｍｌのヒト組織因子
か含まれていることを認めた。

実施例３測定系の特性（添加試験）１／４０および１／８０に希釈した尿にいろいろな濃度
になるようにじ１へ組織因子を加え、抗原として実施例
１と同様に２種類のモノクローナル抗体を用いたサンド
イッチ法て検出した。ヒト組織因子の）躾度と吸光度と
の関係を図、３−Ａに示す。

次いて、１／２０．１／４０．１／８０．１／１６０に
希釈した尿にそれぞれ５０ｎ（］／威、　１００ｎ（］
　／威濃度になるようにヒト絹織因子を加え、抗原とし
て同様に検出した。尿の希釈倍率と吸光度との関係を図
３−Ｂに示す。

以上の結果から、本発明によるモノクローナル抗体を用
いた測定系は１／１６０〜１／４０４釈した尿中のヒト
組織因子を尿中の夾雑蛋白の影響なく特異的に測定する
ことができる。検体の測定結果からヒ１〜尿中にヒト組
織因子は１〜２５μｇ／ｍ１．の範囲で含まれているこ
とかわかった。それ故、じ１〜尿を１／１６０〜１／４
０希釈すれば実施例１の検量線の直線範囲に入り、正確
に尿中のヒト組織因子を測定することができる。

【図面の簡単な説明】

図１はヒト組織因子測定の検量線を示したものである。図２は本発明の測定系におけるヒト尿中の組織因子の検
出を示したものである。図３は、本発明の測定系の添加
試験の結果をまとめたものでおる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）それぞれ異なる抗原決定部位を認識する２種類の
抗ヒト組織因子モノクローナル抗体の一方を不溶性担体
に結合して第１次抗体とし、他方を第２次抗体として用
いることを特徴とするサンドイッチ法によるヒト組織因
子の免疫学的測定方法。
（２）上記抗ヒト組織因子モノクローナル抗体がヒト組
織因子に特異的に結合し、該ヒト組織因子の血液凝固活
性を阻害しない抗ヒト組織因子モノクローナル抗体であ
る請求項１記載の方法。
（３）上記サンドイッチ法によるヒト組織因子の免疫学
的測定方法において、被検試料が体液である請求項１記
載の方法。
（４）上記サンドイッチ方によるヒト組織因子の免疫学
的測定方法において、被検試料が尿および血液（血漿な
らびに血清）である請求項１記載の方法。
（５）サンドイッチ法による免疫学的測定方法において
、それぞれ異なる抗原決定部位を認識する２種類の抗ヒ
ト組織因子モノクローナル抗体の一方を不溶性担体に結
合して第１次抗体とし、他方を第２次抗体として用いる
ことを特徴とするヒト組織因子の測定試薬。
（６）サンドイッチ法による免疫学的測定方法において
、それぞれ異なる抗原決定部位を認識する２種類の抗ヒ
ト組織因子モノクローナル抗体の一方を不溶性担体に結
合して第１次抗体とし、他方を第２次抗体として用いる
ことを特徴とするヒト組織因子の測定キット。