WO1989009402A1 - FREEZE-DRIED COMPOSITION CONTAINING ENZYME-LABELED ANTIHUMAN INTERFERON-beta ANTIBODY AND ENZYMATIC IMMUNOASSAY KIT CONTAINING THE COMPOSITION - Google Patents

Description

酵素標識さ れ た 抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - /3 抗 体 含 有 凍 結 乾 燥 組 成 物 お よ び こ れ を 含 む ェ ン ザ ィ ム ィ 厶 ノ ア ッ セ ィ 測定 キ ッ 卜

発 明 の 背 景

発明の技術分野

本発明 は 、 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 3 の免疫学的微量定 量法 に 利用 す る 酵素標識さ れ た 抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - ]3 抗体 の 安定化 に 関 し 、 よ り 詳 し く は酵 素標識 さ れ た 抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - /3 抗体を長期 間 に つ て 安定化 す る こ と がで き る凍結 乾燥耝成物 に 関 す る 。 更 に 、 本発 明 は 、 こ の よ う な凍結乾燥朝 成物 を含むェ ンザ ィ ム ィ 厶 ノ ア ッ セ ィ 測定 キ ッ 卜 に も 関 す る 。 従 来 の 技 術

血清 、 尿そ の他生物材料 な ど に 含 ま れる微量物質 （ 例 え ぱ タ ンパ ク 質 、 ペプチ ド ホル モ..ン他 ） な ど を 測定 し ょ う と す る 場合 に は 、 被測定物質の含有量が少な い た め に 高感度で 、 かつ 特異 性の 髙ぃ測定 法 が要求さ れる 。 こ の 目 的を 篛 た す 測定 法 と し て 知 ら れる の が 、 抗原抗体反応を利用 し た 免疫測定 法で あ る 。

し の 免疫測定 法 に は競合法 と 非競合法 と が あ り 、 .前者で は被 測定物質で あ る抗原も し く は抗体を含 む測定試料液 と 予 め標識 化した既知濃度の被測定勅質とを混合し 、 こ れに抗体も し く は 抗原を加え抗原抗体結合物を形成さ せる 。 こ の結合に関与 し た 被測定物質 と標識化 し た被測定物質 との比率を測定する こ とに よ っ て 、 被測定物質の含有量を算出する こ とができる 。 一方、 サン ドイ ッ チ法で知 られる後者では、 まず第一抗体を固枏化 し - これに被測定物質である抗原を含む測定試料液を接触させて抗 原を固相化 し た第一抗体に結合させ 、 固相を液相か ら分齄する ， ついで、 固相上の第一抗体に結合 し た被測定物質である抗原に 標識化 した第二抗体を抗原抗体反応に よ っ て結合させ 、 結合 し た標識抗体量を測定すれば被測定物質である抗原の量を知るこ とができる 。

こ の免疫測定法は用 いる標識物質によ っ て、 放射性物質に よ る標識ではラ ジオ ィ ム ノ ア ツ セ ィ 、 酵素に よ る標識ではェンザ ィムィ ム ノ ア ツ セィ などと区別される 。 近年ェ ンザィ 厶ィ ムノ ア ツ セ ィ は十分な測定感度、 簡単な操作性、 や っ かいな使用後 の処理問題がない こ となど に よ り 、 通常の臨床検査な どに広く 応用 されつつある 。 と ころが酵素で標識された抗体あるい は抗 原は、 凍結乾燥品 と し て の長期安定性に問題があ り 、 実用 の妨 げにな っ ている こ と から長期保存状態に おいても酵.素活性が低 下する こ とのない酵素標識抗体、 あるいは酵素標識抗原を開発 する こ と が望 ま れ て い た 。 一般 に 、 酵素標識抗体 と し て の酵素 標識抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ X ロ ン - 3 抗体 は 、 そ の 調製直後の 活性 は室温で ほ ぼ 2 日 程で 5 0 %失活 し 、 7 曰 後 に 至 っ て はそ の殆 ど を失活 す る 。

発 明 の 要 旨

本発 明 の 目 的 は 、 ェ ンザィ ム ィ ム ノ ア ッ セ ィ （ E I A ) に使 わ れ る 酵素標識抗体 、. 特 に 生体液 中 の ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - jS の E ί A に よ る微量定量 に 使わ れる酵素標識さ れ た 抗 ヒ ト イ ン タ ー フ ： L ロ ン - |3 抗体の 安定化法 を提供す る こ と で あ る 。

本発明 の他の 目 的 は 、 長期保存状態 に お い て あ酵素活性低下 の極め て 少な い 酵素標識抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ヱ ロ ン - 抗体の凍 結乾燥組成物 を得る こ と で あ る 。

本発明 の 更 に 別 の 目 的 は 、 長期 間 に 亙 り 安定性を有す る 前記 凍結乾燥組成物 を組み入れた ェ ンザィ ム ィ ム ノ ア ツ セ ィ 、 特 に 非競合 E I A 測定用 の キ ヅ 卜 を提供 す る こ と で あ る 。

そ の他 の 目 的 は 、 以下の記述 に お い て 明 ら か に す る 。

上記 目 的お よ びそ の他の 目 的 は 、 非還元性二糖 の一 種で あ る 卜 レハ ロ ー ス の存在 下 に 酵素標識抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - β 抗体を凍結乾燥 す れば達成 さ れ得 る こ と が本発明 に よ っ て 知見 さ れ た 。 し たが っ て 、 本発明は、 卜 レハ ロ ース と酵素標識抗ヒ 卜 イ ン タ ーフ ェ ロ ン - 3 抗体とか ら実質的になる凍結乾燥組成勅を提 供する。

本発明の凍結乾燥組成物 は、 酵素標識抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ エ 口 ン - iS 抗体の長期 に亙る保存安定性に良好なる結果をも た ら し 、 一般に室温で 30日後にあ っ てもその活性を 70 %以上保持する こ と ができ、 4Ό·での _保存では 5 00日 後 _;でも 1 0 0 %保持する こ と がでぎる。

こ の よう な長期保存安定性に優れる凍結乾燥組成物は ヒ 卜ィ ンタ ー フ ェ ロ ン - /3 の免疫学的微量定量に有利 に利用 し得る こ とか ら 、 本発明ではこの凍結乾燥組成物を組み込んだェンザィ ムィ ム ノ ア ッ セ ィ 測定用 キッ 卜 をも提供する 。

図面の簡単な説明

第 1 図 は、 1 % 卜 レハ ロ ース水溶液あるいは 1 % 卜 レハ ロ ー スを含む緩衝液を凍結乾燥-原液と する、 酵素標識抗ヒ 卜 イ ンタ ー フ I ロ ン - /3 抗体の凍結乾燥組成物の 37でぉける残存活性の 経日 変化を示す。

第 2 図 は 、 標準 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ヱ ロ ン - の希轵系列 （ 各 2 00 μ& ) を本発明の凍結乾燥組成物を用 いて測定 し たサン ドィ ツ チ法ェンザィ ムィ ムノ アツ セィ の検量線を示す 。 好適実施態様の 説明

本発明 の 測定対象物で あ る ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 3 と し て は 、 ヒ 卜 正常二倍体細胞が産生 す る 天然型 ヒ 卜 イ ン タ ー フ エ 口 ン - も 、 遺伝子組換え技術を用 い て ヒ 卜 イ ン タ ー フ ヱ ロ ン - 構造遺伝子 を組み込ん だ大腸菌 、 酵母な ど の微生 物 ま た はハ ム ス タ ー 、 サルな ど の動物細胞 に よ り 産生 さ れる遺伝子耝換 え 型 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - /3 も 含 ま れ る—。

ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 3 の微量を高感度かつ 高精度 に 免疫 学 的 に 定 量 す る に は 、 酵素で 標 識 す べ き 抗 体 す な わ ち 抗 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - /S抗体 と し て 抗原分子の特定 の抗原決定基 の み を 特異 的 に 認 識 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 使 用 が 好 ま し い 。 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 は 、 例 え ば公 知 の 細 胞 融 合 法 （ 例 え ば 、 Roger H . Kennet , Thomas J. Hckearn, Kathleen B. Bechto I ら 編 Monoclonal Ant i bod i es-Hybr i domas ： A New Dimension in Biological Analysis-" Plenum Press, New York お よ び London, 1980参照 。 ） に従 っ て取得 さ れる モ ノ ク ロ ー ナル抗体産生 細胞 に 産生 さ せ る こ と に よ っ て 得 ら れ る 。 す なわ ち 、 ヒ 卜 イ ン タ ー フ エ ロ ン - β に よ っ て感作さ れ た マ ウ ス 、 ラ ッ 卜 等 の脾細胞 と 無限の増殖能を有す る ミ エ ロ ー マ 細胞 と を融合さ せ て 、 抗体産 生能 と 増殖能 と を併せ持 っ た マ ウ ス 、 ラ ッ 卜 等の ハ イ プ リ ド ー マを取得 し 、 ついで ケロ ーニングに よ っ て目 的 とするモノ ク ロ ー ナル抗体産生細胞が得ら れる 。 感作するヒ 卜 イ ンタ フ エ ロ ン - 3は天然型でも遺伝子組換え型でも良い。

モノ ク ロ ー ナル抗体が、 ハイ プ リ ドーマを腹水型と し て増殖 して得 られるマ ウス等の腹水由来である場合は、 これをタ ンパ ク質濃度 5〜 500 Z ^程度に適当 に希积 し て用 いれば十分で あるが、 勿論腹水か ら免疫グ ロブ リ ン分画を精製 し て用 いる こ ともできる 。 八ィ プ リ ドー マを i n v roで細胞培養し てモノ ク ロ ーナル抗体を採取する場合は、 腹水に比べて タ ンパク成分中 のモノ ク ロ ーナル抗体の純度が低すぎるこ とが多いので、 その 場合は i π Vは ro培養上清か ら硫安分別沈殿、 プ ロテイ ン 一 A 力 ラムあるいは ヒ 卜 イ ンタ ー フ ェ ロ ン - β を リ ガ ン:ド と し た ァフ ィ ニテ ィ ーカ ラム （抗原カ ラム ） 等を用いて免疫グ ロ ブ リ ン分 画と し て精製濃縮する必要がある。 この場合は八イ ブ リ ドーマ の培養に使用される牛血清成分由来の牛の免疫グ□プ リ ンが混 入する こ ともあるが実用上それで十分である。 最近、 無血清培 地が色々考案されて いるので （例えば、 Τ. Η, Changら 、 J. Immunol . Methods, 39 (1980) , 369-375参照 ） 、 も しそのよ う な培地で培養できるハイブリ ドーマであれば純度の髙ぃモノ ク 口 一 ナル抗体が得ら れるので便利である 。 本発明の抗 ヒ 卜イ ン タ ー フ ェ ロ ン - /3 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 は好 ま し く は特開 昭 59 - 144796号公報記載の ハ イ ブ リ ド ー マ 1 H 12株 よ り 得 ら れる も の が望 ま し い 。 特 開 昭 59 - 144796号公報 に 記載の 内容 は 、 参照 に よ り 本明細書中 に 含め る あ の と す る 。

更 に 、 本発明 の モ ノ ク ロ ー ナル抗体 は 、 免疫グ ロ ブ リ ン分画 に ま で精製後 、 公知の ペプシ ン処理法 （ Y. Hamaguchi ら （ 1979) J. Brochem.85, 1289- 1300 )に 従 っ て F c 部分 を切 除 し 、 メ ル カ プ 卜 ェ チル ァ ミ ン に よ り 還元 開裂 し て 得 ら れる F a b ' 部分を 用 い る こ と が好 ま し い （S. Yosh akeら （1979)、 Scad， J. Immunol 10, 81-86)。

上記 し た抗体を次いで酵素で標識す る が 、 酵素標識抗体の調 製 に は公知 の試薬 が使用 で き る 。 Ν- ( ε - マ レ イ ミ ド カ プ ロ イ ル才 キ シ ） ス ク シ ン イ ミ ド 、 ビ スマ レ イ ミ ド 、 グル タ ル アルデ ヒ ド 、 カ ルポ ジ イ ミ ド等 、 二個 の官能基を有す る試薬 が あ り 、 ま た ペル ォキ シダ ーゼの糖類を過 ヨ ウ素酸で酸化 し て アルデ ヒ ド基に す る方法 も有効で あ る 。 こ れ ら の試薬 を用 い 抗体の反応 性を保 っ た状態で常法 に 従 っ て酵素 を標識す る 。 本発明 で使用 す る 酵素標識法 と し て 好 ま し く は 、 マ レ イ ミ ド導入 ペル 才 キ シ ダー ゼ と 遊離型 C y s 残基をもつ抗体 F a b ' と を結合 さ せ る 方法が よ い 。 本発明の凍結乾燥組成物は、 通常 0.5〜 10%の 卜 レハ ロ ース 水溶 に 0· 0Λ〜 1 埒の酵素標識抗体を混合し、 これを凍結乾燥 原液と し 、 常法に従っ て凍結乾燥する こ とに よ り得ら れる 。 卜 レハロ ー スは ひ - D - ダルコ ビラ ノ シル - (X - D - ダルコ ビラ ノ シ ドで、 生体中では細胞保護と 関連 して必然的に現われる と いわれている二糖類である 。

本発明の凍結乾燥組成物は、. 突質的に ト レハ □ - ス と酵素、標 識抗体 と のみか ら成り 、 保存安定性の妨げとなる物質は含まな い。 凍結乾燥原液に リ ン酸緩衝液等の通常の緩衝液を添加 した 場合は、 凍結乾燥後に緩衝液由来の塩類等が残存 し 、 これが保 存安定性の妨げ と なるため好ま し く ない。 fc だし 、 電炭酸アン モニゥムのよう な揮発性の緩衝液は、 凍結乾燥原液に添加 し て も、 凍結乾燥後は保存安定性の妨げ と な ら ない fcめ、 添加 して も構わない 。

この よう に し て調製 し た本発明の酵素標識抗 ヒ ト イ ン タ 一フ ェ ロ ン - iS 抗体の凍結乾燥物は、 その酵素活性が長期に亙り 安 定してお り 、 ヒ 卜 イ ン タ ーフ ェ ロ ン - /3 の微量定量用ェ ンザィ ムィ ム ノ アッ セィ測定キ y 卜 に有利 に利用 する こ と ができる。

本発明の E I A測定キ ッ ト は 、

(a) 固相担体に第一抗体である抗 ヒ 卜 イ ンタ ー フ I ロ ン - 3抗 体を結合 さ せ て な る 固相 試薬 、 お よ び

( b ) 酵素標識さ れ た第二 抗体で あ る抗 ヒ 卜 イ ン タ 一 フ エ ロ ン -

3 抗体 と 卜 レ八 ロ ー ス と か ら 実質的に な る凍結乾燥組成物 を含 んで い る 。

第一 抗体 と し て は 、 動物 の ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - /3 感作抗 血清か ら 得 ら れる ポ リ ク ロ ー ナル抗体を使用 し得る 。 こ れは 、 マ ウ ス 、 モルモ ッ ト 、 ラ ッ ト 、 ゥ サギ 、 ャ ギ 、 ヒ ッ ジ 、 ゥマ 等 の 動 物 を常法 に よ り ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - /3 を 含 む 標品 ( 純品で ある必要 は ない ） で免疫 し て 得 た コ ンベ ン シ ョ ナル抗 血清を 、 好 ま し く は常法 に よ り 免疫グ ロ ブ リ ン分画 と し て 精製 攛縮 し て 用 い る 。

こ の精製 し た コ ン ベ ン シ ョ ナル抗体 を 、 例 え ば 96穴マ イ ク ロ プ レ ー 卜 に結合さ せ 、 牛血清 アルブ ミ ン 、 カ ゼ イ ン 、 ゼ ラ チ ン あ る い は市販のブ ロ ッ キ ン グ剤 な どでブ ロ ッ ク し た 後 、 ポ リ ビ ニル ピ ロ リ ド ン お よ び蔗糖含有溶液で処理 し 、 乾燥 し て マ イ ク 口 プ レ ー 卜 の固相試薬 を得 る 。

第二抗体 は 、 上 に 詳述 し た 酵素標識抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - β 抗体で あ り 、 上 に説明 し た よ う に 卜 レハ ロ ー ス の存在 下 に 凍結乾燥 す る 。

本発明 の E I Α 測定キ ッ 卜 は 、 特 に 非競合的サ ン ド イ ッ チ法 に好都合に用 い られる。

本発明の酵素標識抗 t 卜 イ ン タ フ エ ロ ン - 抗体の凍結乾 燥組成物を用いたサン ドイ ッ チ法の手) を以下に説明する 。

( A ) 被測定物質である ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - に対する第一 抗体を担体上に固相化する。 担体と して はサン ドイ ッ チ方式 に よる免疫測定法において通常使用 されるものであれぱいず れであ っ ても用 いる こ とができる _a た とえば、 ィ ム ノ ア ヅ セ ィ用プ レー 卜 と して市販さ れているマイ ク ロプ レー 卜やブラ スチッ ク ビーズあるいはプラスチッ クをコ 一 卜 した鉄ビーズ 等、 ガラス ビーズ、 プラスチッ ク チュ ーブ、 ペーパーデイ ス ク 、 架橋デキス 卜 ラ ン粒子、 架橋ァガロ ース粒子等を例示す るこ とができる。 これら の担体に寧一抗体を固相化する方法 と し ては、 用いる担体に応じ て物理的吸着や化学結合などの 方法が適宜選択さ れる。

( B ) 固相化 し た第一抗体に測定試料を接触させ被測定物質であ る t 卜 イ ンタ ーフ ェ ロ ン - 3 を抗原抗体反応によ り 第一抗体 に結合させる。 接触条件 （ 温度、 時間など ） は適宜決定され

( C ) 次に 、 凍結乾燥 した酵素標識第二抗体を緩衝液に溶解 した 後接触さ せ、 抗原抗体反応に よ り 第二抗体を第一抗体に結合 し た ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - / s に 結合さ せる 。 こ れ に よ つ て ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 3 は第一抗体 と 第二抗体 と に サ ン ド イ ッ チさ れる 。 接触条件 （ 温度 、 時間な ど ） は適宜決定 さ れ る 。

な お 、 （B)お よ び （C) のス テ ッ プを周時 に 行 う ワ ン ス テ ッ プ 法も可能で あ る 。 す なわ ち 、 測定試料 と 第二 抗体 と を同 時 に 存 在 さ せ る こ と に よ っ て も 、 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 5 は第一抗 体 と 第二抗体 と に サ ン ド イ ッ チさ れ 、 し かも こ の ワ ン ス テ ッ プ 法 は よ り 高感度の測定 が期待で き る 。

標識 は 酵素で常法 に よ り 行 う 。 例 え ば酵素 と し て は アル 力 リ フ ォ ス フ ァ タ ーゼ 、 - ガ ラ ク 卜 シダ ーゼ 、 西洋 ヮ サ ビ ぺ ル 才 キ シ ダ ー ゼ の よ う な ペル 才 キ シ ダ ー ゼ等が ^用 さ れる 。 こ れ ら の実験手技 は成書 に 詳 し く 解説 さ れ て い る ので 、 目 的 に 応 じ た 標 識 抗体 を 調 製 す る 方法 を 知 る こ と は 容 易 で あ る ( 例 え ば 、 石川 、 河 合 、 宮井 ら 編 、 " 酵 素 免 疫 測 定 法 " 医 学書院、 1978、 東京 ： B.B.Mishel l 及び S.M.Shi igi ら 編 、 " Selected Methods in Cel lular Immuno I ogy ，， W . H . Freeman and Comp： 1980 San Franc i sco； A. Kawamu pa 編、 " Fluorescent Ant i body Techniques and their App I i ca t ions ，， 第 2版 、 Univ. Tokyo Press, 1977、 Tokyo 等参照 ） ' (ひ） 第一抗体と第二抗体と に サン ド イ ッ チさ れた ヒ 卜 イ ンタ ー フ エ ロ ン - iS を第二抗体の量を測定する こ と に よ っ て定量す る。 例えば、 酵素で標識し た第二抗体を用 い fc場合に は、 酵 素基質を加えて酵素反応に よる基質の分解を比色測定する 。 既知濃度の ヒ 卜 イ ンタ 一 フ エ ロ ン - を用 いて検量線を作つ ておけば目 的 とする試料の濃度を知る こ とができる 。

試料と して は、 培養液ま た は体液、 尿等の生体試料が挙げ ら れる。 ま た 、 ヒ ト血清あるいは血漿も用 い られ、 ヒ 卜血中に内 在する I F N - 3 測定も可能である 。 こ の内在性 I F N - 3 は H I V 、 H B 、 H T L V - 1および -2等の各種ウ ィ ルス感染患者 血中において変動する こ とが確認さ れてお り 、 従っ て エイ ズ、 肝炎、 A T L 等の診断薬 と し て本発明の測定キ ッ 卜 が期待さ れ るひ

以下、 非制限的実施例を挙げて本発明をさ ら に具体的に説明 する。 - 実 施 例

保存安定性の優れた ヒ 卜 イ ン タ ーフ I ロ ン - 3 ェ ンザィ ムィ 厶 ノ ア ツ セィ 用 酵素標識抗体凍結乾燥組成物 ：

特開昭 62 - 206 47^公報明細書に記載された方法に基づき、 酵素標識抗体の調製並びに ヒ 卜 イ ンタ ー フ X ロ ン - ]3 の測定を 行 っ た 。

a ) 酵素標識抗体の調製 ：

特開 昭 59 - 144796号公報 に 示さ れた 抗 ヒ 卜 イ ン タ 一 フ エ 口 ン - jS マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナル抗体 に 、 抗体重量の 4% に 相 当 す る ペプシ ン を加え 、 37 で 20時間消化 し た 後 、 Sephacryl S-200 カ ラ ム に よ るゲル沪過 に て 抗体 F ( a b ' )₂ 画分 を得 た 。 さ ら に 、 こ の画分 を メ ル カ 7 卜 ェ チル ァ ミ ン に よ り 還元 処理を施 し 、 Sephacryl S-200カ ラ ム に よ る ゲル 過 に て 抗 体 F a b ' 画分 を得 た 。 一方 、 西洋 ヮ サ ビ ペル才 キ シ ダ ー ゼ ( H R P ) に N - ( ε - マ レ イ ミ ド カ プ ロ ィ ル 才 キ シ ） ス ク シ ン イ ミ ド を 添加 、 30°C、 60分 間反応 さ せ た後、 Sephadex G-2i>力 ラ ム に て 分画 し 、 マ レ イ ミ ド 導 入 H R P を 得 た 。 さ ら に 、 こ のマ レ イ ミ ド導入 H R P 1.2fflgに 上記調製 し た 抗体 F a b ' を加え 、 4 で 20時間反応後 、 IH trogel AcA

。44 カ ラ ム に よ るゲル 過 に て 酵素標識抗体 （ H R P — 抗体 F a b ' ) を得た 。

b) ヒ 卜 イ ン タ ー フ ヱ ロ ン - ι3 の測定法 ：

抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 3 ゥサギ抗血 清 よ り ァ フ ィ ニ テ ィ ー 精製 し た ポ リ ク ロ ー ナル抗体をマ イ ク ロ プ レ ー 卜 に 結合 さ せ た 後 、 4 %の ポ リ ピ ニル ピ ロ リ ド ン お よ び 10 % の蘆糖を 含有する P B S 溶液で処理 し て乾燥させた 。 このプ レー 卜 を 洗淨液にて 1 回洗淨 し た後、 ヒ 卜 イ ンタ 一 フ エ ロ ン含有サン' プル 100^、 上記調製 し た酵素標識抗体 （適宜希釈 し たもの ） を wel l あた り 50 ^加え、 2〜 10でで一晩反応さ せる。 翌日 プ レー 卜 洗浄後、 40fi¾t 0 - フ エ 二 レンジァ ミ ン、 20 δ過酸化 水素水を含む リ ン酸 - クェン酸緩衝液 （ ΡΗ 5.0) から成る酵 素基質液 1 OOj^ / we I !Jttえ、 室温暗所で 60分 反応後、 反応 停止液（4.5規定硫酸） 100^Z wel I加えて反応を停止し 、 波 長 430〜405 nmにおける吸光度測定をする。

c) 本発明の凍結乾燥組成物の安定性 ：

上記測定法を用いて、 以下の如 く調製 した酵素標識抗体凍 結醫組成物の安定性を調べた。

a)で調製 し た酵素標識抗体 も μ& (約 0.2^〉 を 10ι2褐色パ ィ アル瓶に と り 、 196 卜 レハ ロ ー ス水溶液、 あるい は 1% 卜 レハ ロ ースを含む緩衝液 （ リ ン酸緩衝液、 ρΗ 7.0)

を加え、 凍結乾燥に よ り 2種の凍結乾燥組成物を得た 。 ヒ 卜 イ ン タ ーフ ェ ロ ン _ 3 ェンザィ ムィ ムノ ア ッ セ ィ 時に は測定 - 用緩衝液 （ 0.1Ηリ ン酸緩衝液、 0.1 %牛血清アルブミ ン （ Β S A ) 、 0.05% Tween-20 、 H 7.0) 6 ^にてノ ィ アル中の 凍結乾燥組成物を溶薛し 、 その 50 t2を各 we I Iに添加 し 、 上記 測定 b) に 用 い た 。 こ の 2 種類の 酵素標識抗体凍結乾燥組成 物 を 37Τίに て 30日 間保存 し 、 こ れ 6の保存安定性を 比較 し た 。 な お 、 2 種の 凍結乾燥組成物 の凍結乾燥直後の残存活性 に は 差 は な か っ た 。 保存安定性 の変化 は凍結乾燥直後を 100%と し て残存活性で表わ し た 。 結果を第 1 図 に 示す 。

第 1 図 に示 し た よ う に 緩衝液を含む凍結乾燥組成物 は 16曰 、 30日 と 残存活性が極め て 低く 、 卜 レ ハ ロ ー ス と 酵素標識抗体 と か ら実質的 に 成る凍結乾燥組成物 の保存安定性 に 対す る顕 著な有効性を示 し た 。

d ) ヒ 卜 イ ン タ ー フ I ロ ン - 3 の定量 ：

本発明 の酵素標識抗体凍結乾燥組成物 を用 い る と 、 ヒ 卜 ィ ン タ ー フ ヱ ロ ン - 3 の髙感度測定 が可能 と な る 。 ヒ 卜 イ ン タ 一フ エ ロ ン - iS 含有希釈系列サ ンプル （ 各 200^ ) を使用 し 、 上記 b ) の測定法 に従 い測定 し た 結果を第 2 図 に示す 。

第 2 図 に 示 し た 検量線 は 、 0.25〜 50IU ^ ま で直線を示 し 、 測定 限界 は 0.25IU/ で あ っ た 。 バ イ オ ア ツ セ ィ に よ る 測定 感度 に 比べ る と 20倍 以上高い 。 従 っ て 、 本方法 は ヒ 卜 血中 に お け る 内在性 I F N - 5 測定 に 有効で 、 病態 と 血 中 I F N - β レ ベル と の 関連 に .も 重要な情報を得 る こ と がで き る 。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 酵素標識さ れた抗 ヒ 卜イ ンタ ーフ I ロ ン - 抗体 と ト レ Λ ロース とか ら実質的になる凍結乾燥組成物。

2. 抗 ヒ ト イ ン タ ーフ ェ ロ ン - 3抗体がモノ ク ロ ーナル抗体 である請求の範囲第 項記載の凍結乾燥組成物。

3 . 抗 ヒ トイ ン ダーフ エ ロ ン - /3抗体がマウス抗 ヒ 卜 イ ン タ 一フ エ ロ ン - 3 抗体である請求の範囲第 1 項ま た は第 2項記載 の凍結乾燥組成物 。

4 . 抗 ヒ 卜 イ ン タ 一フ エ ロ ン - iS抗体が F a b ' 画分である 請求の範囲第 Ί 〜 3項のいずれかに記載の凍結乾燥組成物。

5. 酵素が西洋ヮサビペルォキシダ一ゼである請求の範囲第 1 〜 4項のいずれかに記載の凍結乾燥組成物。

6. 下記の （a)および（b) を含んでなるェンザィムィ ムノ ア ッ セィ 測定キ ッ ト ： -

(a) 固相担体に第一抗体である抗 ヒ 卜 イ ン タ ーフ ； c ロ ン - & 抗体を結合さ せてなる固相試薬、 および

.(b) 酵素標識された第二抗体である抗 ヒ 卜 イ ン タ 一 フ I ロ ン - 3抗体 と 卜 レ Λ ロ ー ス とから実質的になる凍結乾燥祖成 ' 物 。

7 . 固相 試薬 が 、 固相担休 に 第一 抗体を結合さ せ 、 乾燥 し て 得 ら れ た も の で あ る請求 の範囲第 6 項記載の ェ ンザ ィ ム ィ ム ノ ア ツ セ ィ 測定 キ ヅ 卜 。

8 . 固相 試薬 が 、 固相担体 に 第一抗体を結合 さ せ た 後 、 ポ リ ビ ニル ピ ロ リ ド ン お よ び蔗糖含有溶液で処理 し 、 乾燥 し て 得 ら れた も の で あ る 請求の範囲第 6 項 ま た は第 7 項記載の ェ ン ザ ィ 厶 ィ ム ノ ア ッ セ ィ 測 定 キ ッ 卜 。

9 . 第一抗体が ポ リ ク ロ ー ナル抗体で あ る 請求の 範囲第 6 〜 8 項の いず れか に 記載の ェ ン ザ ィ ム ィ 厶 ノ ア ヅ セ ィ 測定 キ ヅ 卜 。

10. 第一抗体が ゥサギ抗 ヒ 卜 イ ン タ ー フ ェ ロ ン - 3 抗体 で あ る請求の 範囲第 6 〜 9 項の いず れか に 記載の ェ ンザィ 厶 ィ ム ノ ア ツ セ ィ 測定 キ ッ 卜 。

11. 第二 抗体が モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体で あ る請求の 範囲第 6 〜

10項の いず れか に 記載の ェ ンザ ィ 厶 ィ ム ノ ア ッ セ ィ 測定 キ ッ 卜 。

12. 第二抗体がマ ウ ス抗 ヒ 卜 イ ン タ 一 フ エ ロ ン - 3 抗体 で あ る請求の範囲第 6 〜 11項の い ず れか に 記載の ェ ン ザ ィ ム ィ ム ノ ア ツ セ ィ 測定 キ ッ 卜 。

13. 第二 抗体が F a b ' 画分で あ る 請求の範囲第 6 〜 12項の い ず れか に 記載の ェ ン ザ ィ 厶 ィ 厶 ノ ア ッ セ ィ 測定 キ ツ 卜 。

14. 第二抗体を標識す る酵素 が西 洋 ヮ サ ビ ペル ォ キ シ ダ ー ゼ であ る請求の範囲第 6〜 13項の いずれか に 記載のェ ンザィ ムィ ム ノ ア ヅ セ ィ 測定キ ッ ト 。

15. 請求の範囲第 6項記載のェ ンザィ ムィ ム ノ ア ッ セ ィ 測定 キ ッ 卜 を含んでな る エイ ズ用 診断薬。

16. 請求の範囲第 6項記載のェ ンザィ ムィ ム ノ ア ッ セ ィ 測定 キ ッ 卜 を含んで な る肝炎用 診断薬。

17. 請求の範囲第 6項記載の ェ ンザィ ム ィ ムノ ア ッ セ ィ:測定 キ ッ ト を含んで なる成人 T細胞 白 血病用 診断薬。