WO1989005154A1 - Process for producing an avirulent cold blood virus - Google Patents

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WO1989005154A1
WO1989005154A1 PCT/AT1988/000104 AT8800104W WO8905154A1 WO 1989005154 A1 WO1989005154 A1 WO 1989005154A1 AT 8800104 W AT8800104 W AT 8800104W WO 8905154 A1 WO8905154 A1 WO 8905154A1
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viruses
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avirulent
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Oskar KÖLBL
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Koelbl Oskar
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    • C12N2760/20264—Methods of inactivation or attenuation by serial passage

Definitions

  • the invention relates to a method for producing an avirulent cold-blooded virus, in particular rhabdovirus.
  • VHS virus strains which cause the spring viremia of the carp
  • SVC the virus strains which cause the viral hemorrhagic septicemia of the trout
  • VHS viruses currently describe 3 subtypes that are serologically related. When administered to different animal species, there may be a different immune response to the antigenic determinants of a virus strain. Under natural conditions, the fish belonging to the Salmoniformes contract VHS.
  • FR-PS 2 492 841 relates to attenuation of the VHS virus on EPC cells.
  • EPC cells come from the carp and are therefore cold blood cell cultures.
  • the invention is based on the object to achieve virus strains which are avirulent and possibly produce a cytopathic effect (CPE).
  • CPE cytopathic effect
  • this object is achieved in that after isolation or after passage of the virus in cold blood cells, it is adapted by passages with a gradual temperature increase up to 30 ° C. to warm blood cells, preferably chicken fibroblasts, and, if appropriate, multiplied in these cells. It is thereby achieved that the virus strains lose their virulence, but retain their immunizing properties and thus enable the fish to be vaccinated, since the attenuation of the rhabdoviruses on warm-blooded cells results in the avirulence of these virus strains while maintaining the immunizing properties.
  • An advantage of adapting the fish viruses to warm-blood cell cultures is also that mass cultures of certain warm-blood cells, e.g. BHK 21 or chicken fibroblasts can be produced cheaper than cold blood cell cultures, so that virus cultivation for vaccine production can be carried out economically, since the strains thus obtained show an antigenic effect in vaccines.
  • CPE cytopathic effect
  • the virulence test is carried out by
  • Immunity is checked by infecting vaccinated carp with virulent virus. Infection dose and type of infection as well as posture are the same as for the virulence test. Infected, non-vaccinated control fish all die. Vaccinated survive.
  • the vaccine can be prepared with the attenuated virus per se or with clones of the attenuated virus. Clones with large plaque formation have a better immunizing property.
  • the virus can be propagated in cold blood cells, such as EPC or FHM cells, or in warm blood cells, such as primary chicken fibroblasts. Stationary are suitable
  • Monolayer or roll cultures as well as suspension cultures with a minimum titer of 10 7 KID 50 per ml.
  • Roll cultures with chicken fibroblasts are preferably used.
  • a virus titer of up to 10 9 KID 50 per ml can thus be achieved.
  • Suitable stabilizers are preferably glutamine, gelatin, hydrolyzed gelatin, phosphate, sucrose, sorbitol, peptone or mixtures thereof.
  • the vaccine can be administered via the feed, by a bath or by injection.
  • the vaccination is preferably carried out in summer.
  • the vaccine should be administered twice, with a minimum of 3 weeks to a maximum of 3 months. If the water temperature is high, the distance may be smaller, if it is low, the distance between vaccinations should be longer.
  • the medium was changed in cell seed and the cells were overlaid with Eagle MEM and 2% bovine serum.
  • the seed virus 5 ⁇ 10 3 KID 50 per ml, had been added to the medium. 48 hours later, half to 3/4 of the cells showed CPE and the virus was harvested.
  • Virus titer reached 5 ⁇ 10 8 KID 50 per ml.
  • stabilizers 2% glutamate and 0.5% gelatin or peptone were added. Vaccination of one-carps (K 1 ) using a bath
  • the vaccine virus was administered to carp using soybean meal.
  • the vaccine dose per carp was 10 8 KID 50.
  • the first vaccination was in early July at a water temperature of 30oC
  • the second vaccination was in early August at a water temperature of 25oC.
  • the average carp weight was 18 days on first vaccination.
  • a large pond was filled with these carp from 6 ponds.
  • 15 fish were taken from 3 ponds in autumn and subjected to an infection in the aquarium with a virulent strain.
  • the carp was infected by water with a virus dose of 5 ⁇ 10 5 KID 50 per ml of water.
  • the water temperature was 6oC. After 10 weeks the temperature was gradually increased to 14oC within 8 days. The experiment was stopped 4 weeks later.
  • One of the 15 carp in the 1st pond died of SVC. Of the 15 carp in the 2nd pond, two died. The 15 carp of the 3rd pond all remained healthy.
  • Adaptation and attenuation of the VHS virus VHS strains are isolated from fish material by the common methods of cultivation in cold blood cell cultures, primarily in the RTG-2 and FHM cell lines. The best growing temperature is 15o C.
  • the transfer to warm blood cell cultures can take place immediately or after passage in cold blood cell cultures.
  • the warm-blood cell cultures are grown in the usual way. Monolayer cell cultures are best prepared in tubes. After the cell cultures have grown, the medium is changed. The maintenance medium is best the same one that was used as the growth medium. Serum can be added to the maintenance medium, preferably 1%. The best way to inoculate the cell cultures is after changing the medium. However, it can also take place after the growth medium has been removed. After an absorption time of at least 30 minutes, the preservation medium is then applied. The cocultivation method is also suitable.
  • the breeding temperature should be maintained exactly, with the initial temperature being 17oC +/- 1oC.
  • the adaptation to a higher temperature can be started.
  • the temperature increase per stage is best to be 2-3 ° C. Sometimes a bigger step is successful. If cultivation in mammalian cells initially fails at the higher temperature, further passages must be carried out at 17 ° C. By gradually increasing the temperature by 2-3 ° C, the strains are adapted up to a growth temperature of 28 ° C.
  • Adapted strains can be applied to other warm blood cell systems, such as BHK-21, Vero, A 72 or fetal Bovine lung cells are transmitted and multiplied.
  • Seed virus is added. After inoculation, the cultivation temperature is 20 to 28oC, taking into account the adaptation temperature reached. A stabilizer can be added when the cultures are inoculated with the seed virus.
  • Suitable stabilizers are: glutamate, gelatin, hydrolyzed gelatin, phosphate, sorbitol, sepharose, sucrose, peptone or mixtures thereof.
  • Virus obtained by the described method can be used to produce an antiserum for direct immunofluorescence for the detection of the VHS virus, in particular in fish tissue and fish tissue cultures.
  • the following is an example of a specific execution method.
  • Cold blood cells FHM, RTG 2.
  • Warm blood cells BHK 21, Vero, A 72 and secondary fetal

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Description

Verfahren zur Herstellung eines avirulenten Kaltblutervirus
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines avirulenten Kaltblütervirus, insbesondere Rhabdovirus.
Im vorliegenden Fall handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von jenen Rhabdoviren, die entweder die Frü h ja hrs virämi e der Ka rpf en hervorrufen, also um Rhabdovirus carpio, oder um jene Viren, die die virale, hämorrhagische Septikämie der Forellen hervorrufen. Jene Virusstämme, die die Frühjahrsvirämie der Karpfen hervorrufen, werden im folgenden mit SVC, und jene, die die virale, hämorrhagische Septikämie der Forellen hervorrufen, mit VHS bezeichnet. Von den VHS-Viren werden derzeit 3 Subtypen beschrieben, die serologisch verwandt sind. Bei Verabreichung an verschiedene Tierarten k ann es zu einer unterschiedlichen Immunantwort auf die antigenen Determinanten eine s Virusstammes kommen. Unter natürlichen Bedingungen erkranken die zu den Salmoniformes zählenden Fische an VHS. Andere Fischarten, wie Esche, Hecht und Renke, zeigen nach Infektion gelegentlich mehr oder weniger ausgeprägte VHS-Krankheitssymptome. Bei Fischen mit einem Gewicht über 2g ist oberhalb einer Temperatur von 14º C die Zahl der Erkrankungen stark reduziert oder überhaupt fehlend. Die Bekämpfung der VHS ist wegen der nach einer Infektion zurückbleibenden Virusträger sehr schwierig und kostenaufwendig. (Ahne W., Zbl.Vet.Med. B, 32, (1985): 237-264, Meier W. u. M., J. of Applied Ichthyology 2, (1986): 181-186, Ahne W. u. M., J. of Applied Ichthyology 2 (1986): 187-189). Das Rhabdovirus carpio ist serologisch einheitlich.
Nach P.J. Enzmann und Konrad M., Tierärztl. Umschau
39 (1984): 886-892, ist die Entwicklung eines Impfstoffes gegen die VHS bisher nicht geglückt. Passagen in
Kaltblüterzellkulturen führen zur Avirulenz der VHS-Virusstämme. Dabei geht jedoch auch die immunisierende Eigenschaft weitgehend verloren (Kölbl 0., Diagnose und Behandlung von Fischkrankheiten, DVG, München 1978, S 61 - 76).
Die FR-PS 2 492 841 bezieht sich auf die Attenuierung des VHS-Virus an EPC-Zellen. EPC-Zellen stammen vom Karpfen, sind also Kaltblüterzellkulturen.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, Virusstämme zu erzielen, welche avirulent sind und gegebenenfalls einen cytopat hischen Effekt (CPE) erzeugen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß nach Isolierung oder nach Passagen des Virus in Kaltblüterzellen dieses durch Passagen bei stufenweiser Temperaturerhöhung auf bis zu 30º C an Warmblüterzellen, vorzugsweise Hühnerfibroblasten adaptiert und gegebenenfalls in diesen Zellen vermehrt wird. Dadurch wird erreicht, daß die Virusstämme ihre Virulenz verlieren, Jedoch ihre immunisierenden Eigenschaften erhalten und damit eine Impfung der Fische ermöglichen, da eben die Attenuierung der Rhabdoviren an Warmblüterzellen die Avirulenz dieser Viruεst ämme bei Erhaltung der immunisierenden Eigenschaften ergibt. Ein Vorteil einer Adaptierung der Fischviren an Warmblüterzellkulturen besteht auch darin, daß Massenkulturen bestimmter Warmblüterzellen, wie z.B. BHK 21 oder Hühnerfibroblasten, billiger hergestellt werden können als Kaltblüterzellkulturen, so daß die Viruszuchtung für eine Impfstoffproduktion wirtschaftlich günstig erfolgen kann, da die so erhaltenen Stamme in Vakzinen antigene Wirkung zeigen.
Nachfolgend wird das Verfahren zunächst anhand des SVC-Virus und dann anhand des VHS-Virus näher beschrieben.
A) Adaptierung und Attenuierung des SVC-Virus Nach Anzüchtung des SVC-Virus auf Kaltblüterzellen wie EPC- und FHM-Zellen wird das Virus entweder sofort oder erst nach Passagen in diesen Zellen auf Warmblüterzellen, vornehmlich auf primäre Hühnerfibroblastenzellkulturen, übertragen. Nach 6 bis 10 Passagen kommt es zum
Auftreten eines cytopathischen Effektes (CPE). Ausgehend von 20º C wird durch stufenweise Erhöhung der Temperatur eine Zucht ungstemperatur von 30º C erreicht. Die
Anzuchtbarkeit dieser so adaptierten Virusstämme auf Kaltblüterzellen ist gegeben. Die SVC-Stämme erwerben durch die Passagierung folgende Eigenschaften: CPE auf
Warmblüterzellen; die Überlebensrate bei höheren
Temperaturen (30º C bis 37º C) ist wesentlich erhöht; das
Wachstum auf anderen Warmblüterzellen, wie z.B. BHK-21-, Vero-, MDBK-, IBRS-, A 72-Zellen, ist mit CPE bei 20° C bis 30º C gegeben; die krankmachenden Eigenschaften nehmen bis zur Avirulenz ab, die immunisierenden
Eigenschaften bleiben erhalten.
B) Prüfung des attenuierten SVC-Virus auf Virulenz und immunisierende Eigenschaften
Die Viruleπzprüfung wird vorgenommen durch
Verabreichung des attenuierten SVC-Virus an spezifisch pat hogenfreie (SPF-) Karpfen. Diese Karpfen werden in einem Wasser, das 108KID50 Virus pro ml enthält, 2 Stunden lang gebadet. Die Wassertemperatur während des gesamten Versuchszeitraumes von 2 Monaten liegt unter 15º C, am besten bei 10º C. Alle Fische überleben bei avirulenten Virusstämmen.
Die Immunität wird durch Infektion von geimpften Karpfen mit virulentem Virus geprüft. Infektionsdosis und Infektionsart sowie Haltung sind gleich wie bei der Virulenzprüfung. Infizierte, nicht geimpfte Kontrollfische sterben alle. Geimpfte überleben.
C) Herstellung eines Impfstoffes Die Impfstoffherstellung kann mit dem attenuierten Virus per se oder mit Klonen des attenuierten Virus erfolgen. Klone mit großer Plaquebildung haben eine bessere immunisierende Eigenschaft. Die Virusvermehrung kann vorgenommen werden in Kaltblüterzellen, wie z.B. EPC- oder FHM-Zellen, oder aber in Warmblüterzellen, wie z.B. primäre Hühnerfibroblasten. Geeignet sind stationäre
Monolayer oder Rollkulturen wie auch Suspensionskulturen, wobei ein Miπdesttiter von 107KID50 pro ml erreicht wird. Vorzugsweise werden Rollkulturen mit Hühnerfibroblasten verwendet. Ein Virustiter bis zu 109KID50 pro ml kann damit erreicht werden. Als Stabilisatoren geeignet sind vorzugsweise Glutamin, Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Phosphat, Saccharose, Sorbit, Pepton oder Gemische davon. D) Anwendung des Impfstoffes
Der Impfstoff kann verabfolgt werden über das Futter, durch ein Bad oder durch Injektion.
Die Impfung wird vorzugsweise im Sommer durchgeführt. Der Impfstoff sollte zweimal im Abstand von mindestens 3 Wochen bis höchstens 3 Monaten verabfolgt werden. Ist die Wassertemperatur hoch, kann der Abstand geringer sein, ist sie niedrig, sollte der Abstand zwischen den Impfungen länger bemessen werden.
Nachfolgend ist ein konkretes Ausführungsbeispiel wiedergegeben.
Adaptierung und Attenuierung eines SVC-Stammes Zunächst wurden 50x wöchentliche Passagen in EPC-Zellen bei 20º C , gefolgt von 120 Passagen in primären Hühnerfibroblastenzellkulturen, durchgeführt. Dann wurde durch schrittweise Erhöhung der Temperatur um 2 bzw. 3º C eine Anpassung auf 30º C erreicht, wobei jeder Schritt einer Temperaturerhöhung 5 - 30 Passagen umfaßte. Gelegentlich waren Zwischenpassogen in EPC- oder FHM-Zellen erforderlich. Schließlich folgten 50 Passagen bei einer Temperatur von 30º C . Insgesamt wurden 350 Passagen durchgeführt.
Herstellung eines Impfstoffes
Primäre Hühnerfibroblastenzel lkulturen wurden mittels Eagle MEM (minimum essεntial medium) + 5 %
Rinderserum in Rollkulturen angezüchtet. 3 Tage nach
Zelleinsaat wurde das Medium gewechselt und die Zellen mit Eagle MEM und 2 % Rinderserum überschichtet. Das Saatvirus, 5 × 103KID50 pro ml, war dem Medium beigegeben worden. 48 Stunden später zeigte die Hälfte bis 3/4 der Zellen einen CPE und es wurde das Virus geerntet. Erreichter Virustiter 5 × 108KID50 pro ml. Al s Stabilisatoren wurden zugefügt 2 % Glutamat und 0,5 % Gelatine oder aber Pepton. Impfung von einsömmrigen Karpfen (K1) mittels Bad
44 K1 mit einem durchschnittlichen Gewicht von 30g wurden 2 Stunden bei einer Temperatur von 10º C in einem Wasser gebadet, das 5 × 105KID50 pro ml Impfvirus enthielt. Kein geimpfter Fisch starb bis zum 65. Tag nach Verabreichung des Impfstoffes. Eine nachfolgende
Infektion mit einem virulenten SVC-Stamm, in gleicher
Weise durchgeführt wie die Impfung, mit einer Virusdosis von 5 × 105KID50 pro ml Wasser, hatte keine Erkrankungs- oder Todesfälle zur Folge. Von der nichtgeimpften Kontrollgruppe, die zur gleichen Zeit in gleicher Weise infiziert wurde, starben alle.
Impfung von Karpfen im 2. Sommer (K1-2) durch Verabreichung des Virus mit dem Futter
Das Impfvirus wurde mittels Sojaschrot an Karpfen verabfolgt. Die Impfdosis pro Karpfen war 108KID50 Die erste Impfung war Anfang Juli bei einer Wassertemperatur von 30º C , die zweite Impfung fand Anfang August bei einer Wassertemperatur von 25º C statt. Das Durchschnittsgewicht der Karpfen betrug 18 dag bei der ersten Impfung. Es wurden ca. 50.000 Karpfen in 6 Teichen geimpft. Mit diesen Karpfen aus 6 Teichen wurde im Herbst ein großer Teich besetzt. Es gab weder in der Impfphase noch nach Besatz des großen Teiches in der Winterung und danach im Frühjahr Verluste. Um zu prüfen, ob die Immunisierung erfolgreich war, wurden von 3 Teichen jeweils 15 Fische im Herbst entnommen und einer Infektion im Aquarium mit einem virulenten Stamm unterzogen. Die Karpfen wurde über das Wasser mit einer Virusdosis von 5 × 105KID50 pro ml Wasser infiziert. Die Wassertemperatur betrug 6º C. Nach 10 Wochen wurde die Temperatur schrittweise innerhalb von 8 Tagen auf 14º C erhöht. 4 Wochen danach wurde der Versuch beendet. Von den 15 Karpfen des 1. Teiches starb einer an SVC. Von den 15 Karpfen des 2. Teiches starben zwei. Die 15 Karpfen des 3. Teiches blieben alle gesund. Adaptierung und Attenuierung des VHS-Virus VHS-Stämme werden durch die gebräuchlichen Methoden der Anzüchtung in Kaltblüterzellkulturen, vornehmlich in der RTG-2- und FHM-Zellinie aus Fischmaterial isoliert. Die günstigste Anzüchtungstemperat ur ist 15º C . Die Übertragung auf Warmblüterzellkulturen, am besten primäre Hühnerfibroblasten, kann sofort oder nach Passagen in Kaltblüterzellkulturen erfolgen. Die Anzüchtung der Warmblüterzellkulturen geschieht in der üblichen Weise. Es werden am besten Monolayer-Zellkulturen in Röhrchen hergestellt. Nach Anwachsen der Zellkulturen wird das Medium gewechselt. Das Erhaltungsmedium ist am besten das gleiche, das als Anzuchtmedium verwendet wurde. Es kann Serum zum Erhaltungsmedium, vorzugsweise 1 %, zugesetzt werden. Die Beimpfung der Zellkulturen erfolgt am besten nach dem Mediumwechsel. Sie kann aber auch bereits nach Entfernung des Anzuchtmediums erfolgen. Nach einer Absorptionszeit von am besten 30 Minuten wird dann das Erhaltuπgsmedium aufgebracht. Auch die Cokultivierungsmethode ist geeignet. Die Züchtungstemperatur soll dabei gena u eingehalten werden, wobei die Ausgangstemperatur 17º C +/- 1º C beträgt. Da zunächst kein CPE ( cytopathischer Effekt) erkennbar ist, muß die erfolgreiche Anzüchtung kontrolliert werden. Sie erfolgt am besten durch Beimpfuπg von RTG 2-Zellkulturen. Von jeweils der letzten Anzüchtung auf RTG-2-Zellkulturen wird wieder eine Passage auf RTG 2-Zellkulturen gemacht. Bei Abreißen der Passage in den Säugetierzellen kann von dieser RTG 2-Zellkultur-Virusanzücht ung wieder die Adaptierung auf Warmblütergewebekulturzellen versucht werden (Wechselpassagen). Die Passagen werden am besten im Abstand von 7 Tagen vorgenommen. Kürzere und längere Abstände (bis zu mehreren Wochen) sind aber möglich. überraschenderweise kann das Kaltblütervirus VHS an eine Züchtungstemperatur von bis zu 28º C adaptiert werden. Nach 5 - 10 Passagen in Säugetierzellen bei einer Temperatur von 17º C +/- 1º C kann mit der Adaptierung an eine höhere Temperatur begonnen werden. Die Temperatur- Steigerung pro Stufe wird am besten 2 - 3º C betragen. Manchmal ist ein größerer Schritt erfolgreich. Sollte eine Anzüchtung in Säugetierzellen bei der höheren Temperatur zunächst nicht gelingen, müssen bei 17º C weitere Passagen durchgeführt werden. So wird durch stufenweise Erhöhung der Temperatur um jeweils 2 - 3º C eine Adaptierung der Stämme bis zu einer Wachstumstemperatur von 28º C erreicht.
Wechselpassagen, wie oben bereits beschrieben, sind manchmal nötig. Ein CPE kann ab dem Erreichen einer Züchtungstemperatur von 20º C nach mehreren Passagen bei dieser Temperatur beobachtet werden. Zumeist ist dieser CPE aber erst nach mehreren Passagen ab einer Wachstumstemperatur von 23º C oder 25º C festzustellen.
Adaptierte Stämme können auf andere Warmbluterzellsysteme, wie z.B. BHK-21-, Vero-, A 72- oder fetale Rinderlungenzellen übertragen und darin vermehrt werden.
Die Züchtbarkeit auf Kaltblüterzellen, wie z.B. RTG-2-und FHM-Zellen, bleibt erhalten. Die Vermehrung kann erfolgen in stationären Monolayer- oder Rαllkulturen wie auch in Suspensionskulturen, wobei ein Titer von 107KID50 per ml oder mehr erreicht wird. Möglich ist auch die
Vermehrung in einer Suspensionskultur aus trypsinierten
Hühnerembryonen, der sofort oder nach Vorbebrütung
Saatvirus zugesetzt wird. Die Züchtungstemperatur beträgt nach Beimpfung 20 bis 28º C bei Berücksichtigung der erreichten Adaptionstemperatur. Ein Stabilit sator kann bei Beimpfung der Kulturen mit dem Saatvirus zugesetzt werden.
Als Stabilisatoren sind geeignet: Glutamat, Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Phosphat, Sorbit, Sepharose, Saccharose, Pepton oder Gemische davon.
Nach dem beschriebenen Verfahren erhaltenes Virus kann zur Herstellung eines Antiserums für die direkte Immunfluoreεzenz zum Nachweis des VHS-Virus, insbesondere in Fischgewebe und Fischgewebekulturen, verwendet werden. Im folgenden ist ein Beispiel für ein konkretes Ausführungsverfahren wiedergegeben.
Eine Adaptieruπg wurde mit 16 VHS-Virusstämmen durchgeführt. Es wurde vorgegangen wie oben für Isolierung und Adaptieruπg beschrieben. Die Stufen der Temperaturerhöhung waren: 17° C, 20° C, 23° C, 25° C, 28° C und 29º C. Die Passagen wurden im allgemeinen im 7 Tage-Abstand durchgeführt. Es gab aber auch kürzere und längere Intervalle (4 - 28 Tage). Bei längeren Unterbrechungen wurden die Stämme bei -40º C oder -80º C nach Zugabe eines Stabilisators (Kälberserum, Glutamat) tiefgefroren. Die primären Hühnerfibroblastenmonolayer wurden mittels Eagle- oder Earle-MEM-Medium mit 3 - 5 % Kälberserum bzw. mit 3 % newborn Kälberserum bzw. mit 3 % fetalem Kälberserum bei 37º C in 2 Tagen angezüchtet. Die Erhaltungsmedien waren die gleichen, die zur Anzüchtung verwendet wurden. Dem Eagle-Erhal tungsmedium wurde 1 Vol.-% bzw. 1/2 Vol.-% der angeführten Sera zugesetzt. Bei Verwendung von Earle-Medium fehlte ein Serumzusatz im Erhaltungsmedium. Nach 150 - 250 Passagen der im Adaptieruπgsversuch stehenden Stämme wurden folgende Ergebnisse erzielt:
5 Stämme ließen sich auf eine Wachstumstemperatur von 25º C adaptieren unter Ausbildung eines CPE. 4 von diesen Stämmen vermehrten sich unter Ausbildung eines CPE auch bei 30º C. Ein weiterer Stamm wuchs bei 25º C. Der CPE dieses Stammes ist aber gering. Ein Stamm ließ sich nur bis zu einer Temperatur von 23º C mit geringem CPE adaptieren. Bei 4 Stämmen ist bisher keine Adaptierung gelungen. Nach bis zu 4 Passagen ist die Virusvermehrung abgerissen. Die restlichen Stämme lassen sich ohne Erzeugung eines CPE bei einer Temperatur von 20º C bzw. 23º C passagieren.
2 Stämme, die auch bei 28º C wachsen, scheinen sich auf 29º C adaptieren zu lassen. Ein CPE ist hier bisher nicht feststellbar. Die Stämme mit Ausbildung eines CPE lassen sich auch in folgenden Zellsystemen unter
Verursachung eines CPE vermehren:
Kaltblüterzellen: FHM, RTG 2. Warmblüterzellen: BHK 21, Vero, A 72 und sekundäre fetale
Rinderlungenzellen.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines avirulenten Kaltblütervirus, insbesondere Rhabdovirus, dadurch gekennzeichnet, daß nach Isolierung oder nach Passagen des Virus in Kaltblüterzellen dieses durch Passagen bei stufenweiser Temperaturerhöhung auf bis zu 30º C an Warmblüterzellen, vorzugsweise Hühnerfibroblasten, adaptiert und gegebenenfalls in diesen Zellen vermehrt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von avirulenten SVC-Viren
(spring viremia of carp, Frühjahrsvirämie) die stufenweise Temperaturerhöhung von 20º C beginnend bis 30º C vorgenommen wird.
3 . Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung von avirulenten VHS-Viren
(virale hämorrhagische Septikämie der Forellen) die Adaptierung durch Passagen bei 17 +/- 1º C begonnen und bis 28º C vorgenommen wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das an Warmblüterzellen adaptierte Kaltblütervirus auf andere Warmblüterzellen übertragen und in diesen Systemen vermehrt wird.
5. Vakzine gegen Frühjahrsvirämie der Karpfen (SVC), dadurch gekennzeichnet, daß sie SVC-Viren enthält, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2 adaptiert und attenuiert sind.
6. Vakzine gegen virale hämorrhagische Septikämie der Forellen, dadurch gekennzeichnet, daß sie VHS-Viren enthält, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 und 3 adaptiert und attenuiert sind.
7. Vakzine gemäß Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Viren mit einem Stabilisator versetzt und gegebenenfalls gefroren oder lyophili siert sind.
8. Vakzine nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Stabilisatoren Glutamat, Gelatine, hydrolysierte Gelatine, Phosphat, Sorbit, Sepharose, Saccharose, Pepton oder Gemische davon enthält.
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