WO1986006405A1

WO1986006405A1 - Novel transformant and its use

Info

Publication number: WO1986006405A1
Application number: PCT/JP1985/000252
Authority: WO
Inventors: Reiko Sasada; Haruo Onda; Koichi Igarashi
Original assignee: Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 1985-05-02
Filing date: 1985-05-02
Publication date: 1986-11-06

Description

~ .2 I 一 1 一

5

明細書

新規形質転換体およびその用途

技術分野

本発明は、新規形質転換体およびそれを用いるヒトインターロイキン一 2蛋白質の製造法に関する。

背景技術

インターロイキン一 2 [以下 I L— 2と略称する。なお I L 一 2は、 T細胞增殖因子（TCGF)とも呼ばれる。 ]は、レクチンゃァロ抗原等で剌激された T細胞によつて産生されるリンホカインである [サイエンス，第

10 193巻， 1007— 1008頁（1976) ; ィムノロジカル · レビュー.第 51巻， 257 — 278頁（1980) ]。 I L— 2は、 T細胞をインビトロでその捧能を保持したまま'增殖させ長期間の继代锥持を可能にするほかに、今までに胸腺細胞のマイト一ジェン反応を促進したり（コスティミュレ一ター）、ヌードマウス脾細胞の T細胞依存性抗原に対する抗体産生能を回復させたり（T 細胞リプレーシングファクタ一）キラー細胞の分化増殖を促進する（キラ一ヘルパーファクタ一）活性を有すると報告されている [ザ♦ ジャーナル .ォブ . ィムノロジー，第 123卷， 2928— 2929頁（1979) , ィムノロジカル • レビュー，第 51巻， 257— 258頁（1980) ]。

I L 一 2を利用して、これまでにキラー T細胞やヘルパー T細胞、さ

20 らにはナチュラルキラ一細胞などのクローンが多数得られている [たとえば、ネイチヤー，第 268巻. 154— 156頁（1977) : ザ，ジャーナル♦ォブ，ィムノロジー，第 130巻， 981— 987頁（1983) ]。このような T細胞ゃナチュラルキラー細胞のクローン化という直接的用途のほかに、 I L— 2 を用いてある特殊な抗原、たとえば腫瘍抗原を認識し破壊する抗原特異的なキラー T細胞をィンビト口で選択的に増殖させることができる。このようにして増殖させた腫瘍特異的キラー ' T，钿胞を動物に移入して腫瘍差換えの増殖を抑制阻止することが可能である [ザ ' ジャーナル ·ォブ ' ィムノロジー，第 125巻， 1904— 1909頁（1980)]。また、 I L— 2がインターフエロンァの産生を誘導すること [ザ ' ジャーナル .ォブ ' ィムノロジ一，第 130巻， 1784— 1789頁（1983)]や、ナチュラルキラー細胞を活性化すること [ザ ' ジャーナル ·ォブ · ィ厶ノ口ジー.第 130巻， 1970— 197

3頁 983)]が知られている。

これらの実験事実は I L一 2が抗腫瘍剤として用いられる可能性を示すものである。 I L— 2はまた、胸腺機能を欠如しているヌ一ドマウスのヘルパー Τ細胞機能を回復させること [ョ一口ビアン . ジャーナル . ォブ · ィムノロジー，第 10巻， 719— 722頁（1980〕]や、同種細胞に対するキラ一 Τ細胞の誘導を回復させること [ネィチヤ一，第 284巻， 278—280 頁（ 1980 )]が知られており、免疫機能低下疾患への応用も期待できる。谷口ら [ネイチヤー，第 302巻， 305— 310頁（1983)]およびデボスら [ヌクレイツク ' ァシ 'ソズ ' リサーチ，第 11巻， 4307〜4323頁（1983)]は、それぞれヒト I L一 2遺伝子をクローニングし、これから推定されるヒト I

L 一 2ポリペプチドのァミノ酸配列を記載し、さらに該遺 ί云子の発現に成功したと報告している。

上記デボスらの報告においては、該遺伝子を大腸菌を用いて発現しており、得られる蛋白質は非グリコシル化蛋白質と推定される。

一方、谷口らの報告は、 SY -40のプロモーターを用いサル細胞 COS - 7に遺 ί云子感染（t ranfect)してヒト I L— 2遺伝子を発現した旨記載している。この方法によればグリコシル化ヒト I L 一 2が製造しうると推定されるが、ここで用いられている細胞は、長期間安定にこの状態を持続させることができず、一時的な蛋白質生産能しか有さないため、実用上満足しうるものではなかった。

本発明者らは、ヒト I L一 2蛋白質をコ一ドする D N Aを有する動物細胞形質転換体を製造し、該形質転換体を培養することによる工業的に有利なグリコシル化ヒト I L一 2蛋白質の製造法を確立し、本発明を完成した。

発明の開示

本発明は、ヒト I L一 2蛋白質をコードする領域およびその上流にプ口モータ—を有する D N Aにより形質転換された動物細胞、ならびに該形質耘換体を培養し、培養物中にヒト I L一 2蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徵とする該蛋白質の製造法を提供するものである。

0 本発明におけるヒト I L— 2蛋白質をコードする領域を有する D N A

としては、式

1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys し ys Thr Gin Leu Gin

20

Leu Glu His Leu し en Leu Asp し en Gin Met lie Leu Asn Gly I le Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met 40

Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glじ

60

し eじ Lys His し en Gin Cys Lea Glu Glu Glu Leu. Lys Pro Lei: Glu Glu Yal Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys Asn Phe 0 80

His Le Arg Pro Arg Asp Leu lie Ser Asn. lie Asn Val

100

He Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Th.r He Val Glu Phe

120

Leu Asn Arg Trp lie Thr Phe Cys Gin Ser I le He Ser

133

Thr eu Thr

換え 85/00252 一 4 一

で表わされるヒト I L— 2蛋白質やそれと実質的に同様の活性を有するポリペプチドをコードする D N Aであればいずれでもよく、例えば前記 —、した谷口らおよびデボスらの文献に己載されたヒト I L— 2構造遺伝子

や特願昭 58— 235638号（昭和 58年 L 2月 13日出願）明細書記載の D N Aが挙

げられる。とりわけ好ましいものとして例えば第 1図のコドン 1 ~ 133

で示される塩基酉 i|【jを有する D N Aが挙げられる。

プロモーターとしては、動物細胞発現用のプロモーターのいずれを用

いてもよく、とりわけウイルス由来のプロモータ一が好ましい。

具体的には S V (シミアンウィルス） 40のプロモーター領域 [岡山ら，乇

レキユラ一アンドセルラーバイオロジー，第 3巻， 280〜289頁（L 983)二や種々のレトロウイルス LTRCLong t erm inal repeat)領域に存在するプ

口モータ一が挙げられる。

レトロウイルス LTR 領域由来のプロモーターとしては、たとえば下記.

のものが挙げられる。 ·

氺エーベルソンマウス白血病ウィルス（A— Mじ LV) [ゴフ . S . P .ら，セル，

第 22巻， 777〜785頁（1980)]

氺モロニーマウス白血病ウィルス（M -MiiLV) [丹羽ら，セル，第 32巻， 11

05〜U 13頁（1983)]

氺成人 T細胞白血病ウィルス（ATLV) [吉田ら，プロシ一ジングォブナ

ショナルアカデミーサイエンス USA ,第 79巻， 6899~ 6902頁 982) ] 氺トリ肉腫ウィルス（ASV) [北村ら，ネイチヤー，第 297巻. 205〜208頁（1

982)]

本発明においては、上記したプロモーターを 1個または 2値以上用い

ることができる。

本発明で動物細胞の形質転換に用いる D N Aは、さらにェンハンサー

を有していてもよい。ェンハンサーとしては、ウィルス由来のェンハン

差換え — o —

サ一が挙げられ、例えば SV40プロモータ一領域に存在するェンハンサー [岡山ら，前出]やレトロウィルス LTR領域に存在するェンハンサ一が挙げられ、とりわけ上記 LTR領域の塩基配列繰返し部分のェンハンサ一が好ましい。

レトロウィルス由来のェンハンサ一としては、たとえば下記のものが挙げられる。

A - uLV [コブ， S . P .ら；前出]

M - LV こ丹羽ら；前出]

ATLV [吉田ら；前出]

ASV [北村ら：前出]

本発明においては、上記したェンハンサーを 1個または 2個以上用いることができる。 ' - 上記プロ.モーターおよびェンハンサ一は形質転換する動物細胞の種に応じてそれぞれ適切なものを選択して使用することができる。

例えば、マウス細胞またはハムスター細胞を形質耘換するために；ま、レトロウイルスとりわけ A - MuLV の LTR領域プロモ一夕一およびェンハンサ一または（および） SV40プロモータ一領域のプロモーターおよびェンハンサ一が好ましい。

また、ヒト細胞を形質転換するためには、レトロウイルス好ましくはヒト由来のレトロウイルス、とりわけ ATLVの LTR領域のプロモーターおよびェンハンサ一が好ましい。

なお、本願明細書中に一例として開示するレトロウィルスの LTR領域のプロモータ一（所望によりそのェンハンサーも有していてもよい）および SV40プロモー夕一（所望によりそのェンハンサーも有していてもよい）からなる遺伝子の発現系は、動物細胞を遺伝子感染し、昕望によりクローン化して動物細胞の形質転換体を取得し、遺伝子産物を産生せしめる

差換え場合、各種の動物細胞において効率よく遺伝子を発現させることができる。

従って上記発現系は、 Γ L— 2遺 ¾子のみならず、リンホカイン（ィンターフヱロン— ，同一^，同一ァ，リンホトキシン，腫瘍壌死因子など）やホルモン（インスリン，ソマスタチン，ヒト成長ホルモンなど）など有用蛋白質の遺 ί云子を、動物細胞を用いて発現する場合に、有利に用いることができる。

動物細胞から特定の蛋白質をより高能率に生産するために、上記のようにプロモーターゃェンハンサーを工夫して用いることの他に、細胞当たりの特定遺伝子（例えば I L - 2遺伝子）のコピー数を增すための操作もできる。例えばプラスミド上の目的とする遺伝子のそばに増幅可能な遺伝子で所望により選択マーカーとしても使えるような遺伝子 [例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR)遺伝子]を锆合させることもできる（米国特許第 4 , 399 , 216号）。

本発明に用いられるヒト I L— 2蛋白質をコ一ドする領域およびその上流にプロモータ一を有する動物細胞形質転換用 D Ν Αは、たとえばクローニングされた I L - 2蛋白質をコードする領域を有する D N A (cM A)を含有するブラスミド，たとえばウィルス由来のプロモーター（必要によりさらにェンハンサー）とスプライス領域を含有するプラスミドおよびたとえばポリ A付加領域を含有するブラスミドより製造することができる。

上記動物細胞形質耘換用 D N Aの製造法を具体的に説明するために、ヒト I L一 2蛋白質をコードする領域を有する D N Aとして第 1図に示す D N A (p ILOT135— 8中の cDNA)を原料として用いる場合につき下記する。

P ILOT135— 8を制限酵素 Ps t l及び St ulで切断し、 St i部位には Bam H I

差換え 5/00252 一 7 —

リンカ一を锆合する。一方プロモーターおよびスプライス領域を有するプラスミド [冽、 pPfil; 岡山ら，前出]を Hindi!及び Pstiで、またポリ A付加領域を有するプラスミド [例、 pCDVl,上記文献]を Hindll及び Bam Hiで切断し、それぞれの D N A断片 3種を結合させたのち、例えば大腸菌（ Escherichia coli)DH 1株を形質転換させ、アンピシリン耐性コロニーを選択し、培養さらに抽出することにより、ヒト I L一 2蛋白質をコードする領域を有する動物細胞形質耘換用プラスミド（ I )を分離することができる。このプラスミド（ I )は SV40 D N Aのプロモーター，スプライス領域とポリ A付加領域の間にヒト I L— 2をコードする領域を有する。必要により上記プラスミド（ I )を、 SV40プロモーター領域の上流に 1 ケ斩存在する HiridHI部位で切断し、クローニングされた前記レトロウイルスの LTR領域の塩基配列操り返し部分の D 断片を分離，精製後、 Hi ndlEリンカ一と結合させ、前記プラスミド〔 I )の HitidlE部位に組込んで動物細胞形質転換用ブラスミド（H)を構築することができる。このブラスミド（ Π )はレトロウイルス由来のプロモーターおよびェンハンサーを有し、その下流に存在する SV40 D Ν Αのプロモーター，スプライス領域とポリ A付加領域の間にヒト I L一 2蛋白質をコードする領域を有する。さらに必要により、上記プラスミド（Π)を、例えば制限酵素 Clalで切断し C 1 a ίを失活させた後、 T4 D N Aリガーゼを作用させ LTR領域上流の C lalD X A断片を除去し、 HindDI切断部位が LTR領域と SV40プロモーター領域の間の Iケ听となったプラスミド（IE)を構築する。プラスミド（ΠΙ) を制限酵素 Hind ΠΙおよび Xholで切断し各々の付着末端を平滑化した後、 T4DXAリガーゼ反応により結合し動物細胞形質転換用プラスミド（IV) を構築することができる。プラスミド（17)はレトロウイルス LTR領域のプロモーターおよぴェンハンサ一を有し、その下流にヒト I L— 2蛋白質をコードする領域を有する。 -

差換え' 5/00252

一 8 - また所望により、プラスミド（ROを制限酵素 C Iで切断し付着末端を平滑化した後 Hindi!リンカーを桔合させる。これを HindMで切断し、上記したレトロウィルス（Mu—LV)由来のプロモーターおよびェンハンサーを除去して環状化する。このプラスミドにの cDNA (吉田ら，前出）力、らその LTR領域を切り出して揷入すると、ヒトレトロウイルス LTR領域のプロモーターおよびェンハンサーを有し、その下流にヒト I し— 2遺伝子を有するプラスミド（V )が得られる。

一方、プラスミド（ROの Hindi [切断部位を Xholに、 I L— 2遺伝子の 5 '末端側の Ps t l切断部位を EcoR Iに変換し、 3 '末端側の Bam HI切断部位の直前に Bgi nを、ポリ A付加領域の下流に Clal及び HindlE切断部位を揷入してプラスミド（VI )を得る。

ハムスター DHFR遺伝子 cDNAを有するプラスミドの Clal切断部位にブラスミド CVI)の Clal消化により得られた MuLV— LTR及び I L - 2遺子等を含む D N A断片を揷入し、レトロウィルス由来のプロモーターの下流に I L— 2遺伝子を有し、その下流に SV40プロモーターおよび DHFR遺伝子を有するプラスミド（H)を得る。

さらに、 DHFR遺伝子を含む cDMの Bam HI D N A断片を、プラスミド（VI )の Bg l Π切断部位に揷入するとレトロウイルス由来のプロモーターの下流に I L— 2遺伝子および DHFR遺伝子を有するプラスミド（VI)を得る。本発明の動物細胞形質転換体は、例えばヒト I L一 2蛋白質をコードする領域およびその上流にプロモーターを有する D X A (プラスミド）で動物細胞を形質転換して、必要により選択，採取することにより製造することができる。

上記動物細胞は、 I L - 2遺伝子を発現しうる動物細胞であればいかなるものでもよく、例えばマウス [例、 L細胞；プロシージング . ソサィェティ 'ォブ ·ェクスペリメンタル ·パ、ィォロジカル ·' ジシン，第 9

差 ί¾え 2巻， 893頁（1956)].ラ 'ソト [例、 RK細胞：ジャーナル ·ォブ . セル · フィジオロジー，第 94巻， 335頁（1978)], ニヮトリあるいはァヒル由来細胞，ヒト [例、 Fし钿胞；プロシージング ' ソサイエティ ' ォブ · ェクスペリメンタル .バイオロジカル . メジシン，第 94巻， 532頁（1957)]，ハムスタ一 [例、 CHO細胞：プロシージング ' ォブ ' ナショナル ' アカデミー . ォブ ' サイエンス USA, 第 77巻， 4216頁（1980)]などが挙げられる。

形質転換は、共形質耘換 [cotransformation: ウイグラーら，セル，第 16巻， 777〜785頁（1979)]により有利に目的とする動物細胞形質転換体を選択，採取することができる。

すなわち、特定の遺伝子 [チミジンキナーゼ（TK)遺伝子，アデニンホスホリボシルトランスフヱラ一ゼ遺伝子， DHFR遺伝子など]欠損動物細胞、例えばマウス Π遺伝子欠損 L細胞またはハムスター DHFR遺伝子欠損 CH0細胞を、同時に上記ヒト I.L一 2蛋白質をコ一ドする領域等を有す' る D N A (プラスミド）とマーカーとして上記欠損遺伝子含有プラスミドを用いて共形質転換するか、通常の細胞を、同時にマーカーとして抗生物質（ネオマイシンなど）耐性遺伝子含有プラスミドを用いて共形質転換し、前者の場合は公知の方法 [ウイグラーら，前出；リーら，ネイチヤー，第 294巻， 228— 232頁（1981)]により、後者の場合は細胞培養培地に対応する抗生物質またはその誘導体（例えばゲネチシン G418など）を添加して培養するこコルベア一ガラピンら，ジャーナルォブモレキュラーバイォ σジ一，第 150巻， 1~ 14頁（1981)]ことにより容易に目的とする形質転換体を選択，採取することができる。また上記前者の方法と後者の方法を組合せて形質拿云渙体を選択，採取することもできる。

I L一 2遺伝子を有するクローン化された動物細胞形質耘換体は共形 - 質転換により始めて提供できたものであり、該形質転換体は、有利にグリコシル化 I L一 2等の製造に用いることができる。

換え T/JP85/00252

一 10 - 本発明のヒト I L一 2蛋白質は、前記した本発明の形質転換体を培養し、培養物中に該蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することにより製造することができる。

培養は、動物細胞培養用培地、例えば牛胎児血清や哺乳動物の血清を混在微生物の不活化工程および塩忻，脱塩工程を含む精製処理に付して製造される哺乳動物血清由来の動物細胞培養用組成物 [特願昭 59 - 521号 (昭和 59年 1月 9日出願）明細書]を添加した MEM培地などの動物細胞の培養用培地を用いて行う。

細胞の培養は、通常 30〜40。Cで 2〜10日間行う。

形質転換体が、遺伝子増幅遺伝子（DHFR遺伝子など）を有する場合は、まず適当な遺伝子増幅条件下（DHFR遺伝子の場合はメソトレキセ一ト存在下（通常 1〜100 /ζ Μ濃度））で培養すると、マーカー遺伝子の数の増幅に伴い、目;的とする特定遺伝子のコピー数が増加し、特定の蛋白質の生産量を增すことが出来る。

培養物中に生成蓄積した I L— 2蛋白質は、細胞を除去したのち培養液をそのまま濃縮乾燥して使用することができるが、自体公知の分離精製法を適切に組合わせて、培養上清より I L - 2蛋白質を分離精製することができる。

これらの公知の分離，精製法としては、塩折や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法，透圻法，限外ろ過法，ゲルろ過法および SDS -ポリアクリルァミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法，イオン交換クロマトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法，ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一などの特異的親和性を利用する方法，逆相高速液体クロマトグラフィ一などの疎水性の差を利用する方法，等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。

ここで得られる I L一 2蛋白質含有溶液は必要によりこれを凍結乾燥により粉末とすることができる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール，マンニトール，デキストロース，マルトース，グリセロール，ヒト血清アルブミン（HSA)などの安定剤を加えることができる。

本発明の動物細胞形質転換体を使用するヒト I L - 2蛋白質の製造法によれば、グリコシル化ヒト I L— 2蛋白質を容易に大量に製造することができる。

本発明により得られるグリコシル化ヒト I L— 2蛋白質は、低毒性で公知の天然のヒト I L一 2と実質的に同様の活性を有する。ここで天然のヒト I L 一 2と実質的に同様の活性とは、例えば以下の生物学的および免疫学的活性をいう。すなわち、正常な T細胞やナチュラルキラー細嗨をその機能を保持させたまま増殖させる活性を有する。したがって、本発明のヒト I L— 2蛋白質は、 T細胞やナチュラルキラ一細胞をイン . ビトロで長期にわたり増殖，継代したりクローン化するのに使用できる。なお、この性質を利用してヒト I L一 2の活性を測定することができる。さらに、本発明のヒト I L— 2蛋白質は、たとえば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキラ— T細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫瘍を殺す能力をもっところのナチュラルキラー細胞をィンビト口で選択的に増殖させることができ、またこのキラー T細胞を生体へ移入する際に、本発明のヒト I L— 2蛋白質を同時に接種することにより、その抗腫瘍効果を増大させることから、温血動物（例、マウス，ラット，ゥサギ，犬，ネコ，ブタ，ゥマ，ヒッジ，ゥシ，人など）の腫瘍の予防，治療や免疫機能低下疾患の治療のために用いることができる。

T細胞をィンビト口で増殖させる目的に使用するためには、本発明のヒト I L一 2蛋白質を約 0 . 01〜 1ュ二':；ト Zm l、好ましくは約 0 . 1〜0 . 5 ュニット /mlの濃度で培地に添加して用いることができる。

T細胞をィンビトロで増殖させる目的に使用する具体例としては、た

渙え . ― T/JP85/00252 一 12- とえば、 20%ゥシ胎児血清を含む RPMI 1640培地にヒト末梢血より分離した T細胞（1 X10⁸個/ ml)および X線（1500ラヅド）照射した B細胞トランスフォーマント（1 X 10^s個 Ztnl)を加えて 37°C , 5 %C0₂存在下で 3日間リンパ球混合培養を行なつて得られるァ口抗原感作 T細胞を含む細胞浮遊液に本発明のヒト I L— 2蛋白質を 0.1〜(3.5ュニット Zmlの濃度で約一週間ごとに培地交換しながら約 1か月間培養を続ける方法などが挙げられる。 . . 本発明のヒト I L一 2蛋白質を腫瘍の予防.治療剤として用いるには、当該蛋白質を自体公知の担体と混合稀釈して、たとえば注射剤，カブセル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与することができる。さらに、前述したようにィンビト口で增殖させたキラー T細胞やナチュラルキラー細胞と共にまたは単独で使用することがで έる。 - '本発明のヒト I L一 2蛋白質は、グリコシル化されており公知の天然から分離されたヒト I L一 2と実質的に同じ生物活性を有するのでこ ή と同様に使用することができる。

また遺伝子組み換え技術により大腸菌等で生産されるヒト I L _ 2に比し、本発明のヒト I L— 2蛋白質はダリコシル化されていることから安定で水に対する溶解度が高く、有利に精製，製剤化され、有利に使用できる。

本願明細書中のヒト I L— 2の活性は以下のように測定したものである。

すなわち、 I L— 2濃度に ί衣存して増殖するマウス細胞株を浮遊した培地に形質転換細胞培養上清または I L - 2を含む検体を加えて培養し、該細胞株の增殖をトリチウムチミジンの取込を指標として測定した。目的とする検体中のユニット（U)算出のためには、常に標準 I L— 2 (1 U

/ml)を並べてアツセィを実施して、その比率からュ二':/ トを算出した。

差換え具体的には、形質転換細胞培養上清またはヒト I L一 2を含有するコンディションドメジゥムを含む 20%FCS加 RPMI 1640培地中で、 37°Cで 5 %C0₂の存在下に継代維持された I L - 2依存性マウス細胞株 [(NKC3), 日沼ら、バイオケミカル ·バイオフィジカル · リサーチ · コミュニケィシヨンズ，第 109巻， 363〜369頁（1982)]を無血清 RPMI 1640培地を用いて

2回洗浄し、 20%FCS加 RPMI 1640培地に 6 X 10⁵個 Zmlになるように再浮遊する。

形質転換細胞培養上清または I L - 2を含む資料 50 2を 96穴平底マイクロタイタ一プレート（ヌンク社，デンマーク）の第 1列目の穴に入れ、 50 βずつの 20%FCS加 RPMI 1640培地を用いて第 12列目まで順次 2倍段階希釈系列を作成後、上記 NKC 3細胞浮遊液を 50 J2ずつ各穴に分注し、 37°Cで 5 %C0₂の存在下に 24時間培養する。培養 20時間目に、各穴に 1 ずつトリ'チウムチミジン（ァマルシャム社，ィギリス）を添加してさらに 4時間培養を継铳後、セルハーべスター（フロー社，アメリカ）を使用して細胞をガラスフィルタ一上に回収し、液体シンチレーシヨンカウン夕ーを用いてトリチウムチミジンの取込を測定する。測定に際しては標準 I L— 2標品について上記と同一の操作を行い、トリチウムチミジンの取込を測定する。

ュニット（U)の計箅はジャーナル · ォブ . ィムノロジー，第 120巻， 20 27— 2032頁（1978)に準じてプロビット変換法により行う。すなわち、標準 I L— 2標品（ヒト末梢血リンパ球を 5 X L0^S個/ lとなるように 10% FCS加 RPMI 1640培地に浮遊し、コンカナパリン— A40〃 gおよび — 0— テトラデカノィルホルボール一 13—ァセテ一ト 15ngZmlを添加して、 37 てで 5 %C0₂の存在下に 48時間培養した培養液の違心上清を 1 ϋ/mlと定める）の希釈系列のうち最大値の取込を 100%として、各希釈段階の取込値の割合（％)を計算する。得られた数値を正規確率紙にプロッ卜し、 50 %の取込を示す希釈倍数を作図から求める。同様にして〖 L— 2を含む資料についても 50%の取込を示す希釈倍数を求める。

資料の I L一 2活性（U/ml)は次式に従って計算される：

資科が 50%取込も示す希釈 ίき数

標準 IL - 2標品が 50%の取込を示す希釈倍数

なお、本定量法によって求めたヒト末梢'血から得られた天然の I L— 2の比活性は、 20,000~70,000ll/mgであつた。

本願明細書および図面において、塩基などを略号で表示する場合、 IU PAC— IUB Commission on Biochemical Nomenclature (こよる略号あるレヽは当該分野における慣用略号に基づぐものであり、その例を以下に挙げる。 . '

DNA ：デォキシリボ核酸

cD ：相浦的デォキシリボ核酸

A ：アデニン

T ：チミン

G ：グァニン .

C ：シ卜シン

A ：リボ核酸

mR .A ：伝令リポ核酸

dATP ：デォキジアデノシン三リン酸

dTTP ：デォキシチミジン三リン酸

dGTP ：デォキシグアノシン三リン酸

dCTP ：デォキシシチジン三リン酸

ATP ：アデノシン三リン酸

EDTA ：ェチレンジアミン四酢酸

図面の簡単な説明

差換え第 1図は、参考例（vii)で得たプラスミド ρ θΤ135— 8の I L— 2遺伝子の一次構造（塩基配列）を示し、第 2図は実施例 1 ( i )における動物細胞形質転換用プラスミド PTB106の、第 3図は同（Π )における PTB213および PTB215の、第 4図は同（iii)における PTB314の、第 5図は同（iv)における PTB385の、第 6図は同（ V )における PTB485および PTB487の構築図をそれぞれ示す。 ₎

第 7図.第 8図および第 9図は実施例 2の形質転換体の培養時の細胞数および培養上清中の I L - 2活性測定锆杲を示す。第 10図は実施例 3 のオートラジォグラフの結果を示し、レーン 1および 2はそれぞれ正常抗血清の 10倍および 100倍希釈物との反応を、レーン 3 , 4 , 5 , 6および

.7はそれぞれ抗ヒト I し— 2抗血清の 10倍， 101H咅， 1000倍および 10, 000 倍希釈物との反 IEを示す。

発明を実施するための最良の形態

以下の参考例および実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお実施例に開示する形質転換体は、財団法人発酵研究所（ I n s t i t e for Fermentation, Osaka; IFO)に下記の寄託番号により寄託されている。

マウス L- IL213-3細胞: IFO-50049

ヒト Fい 385- 6 細胞：〖F0- 50050

ハムスタ一 C-Iい 485- 14細胞： IFO-50051

参考例ヒト I L一 2遺伝子含有プラスミドの単離

( i ) ヒト I L一 2をコードする mRNAの分離

ヒト末梢血より調製したリンパ球を 12— 0—テトラデカノィルホルボール _ i3—ァセテ一ト（TPA)(15ng/ml)とコンカナバリン A(40," g/ml)を含む RPMI 1640培地 0%の牛胎児血清を含む）中、 37°Cで培養し、 I L

差換え — 2を誘導させた。 24時間後、この誘導した 1 X10¹⁰値のヒトリンパ球を 5 Mグァニジンチオシァネート、 5 %メルカブトエタノール、 50mMトリス · HC1 pH 7.6, lOmM EDTA溶液中でテフロンホモゲナイザーによつて破壊変性した後、 N—ラウロイリルザルコシン酸ナトリウムを 4 %になるように加え、均質化した混合物を 5.7M塩化セシウム溶液（5.7M塩化セシウム， 0.1M EDTA) 6 ml上に重層し、ベックマン S'28のロータ一を用いて 15°Cで 24000rpm 48時間遠心処理を行い、 RNA沈澱を得た。この RM 沈澱を 0.25% N—ラゥ口イリルザルコシン酸ナトリゥム溶液にとかした後、エタノールで沈澱させ、 10mgの RNAを得た。この RMを高塩溶液 [0.5 M aCl, 10mMトリス · HC1 pH 6, 1 m.M EDTA, 0.3%SDS]中でオリゴ（dT) セルロースカラムに吸着させ、ポリ（A)を含む mENAを低塩溶液（lOmM トリス · HC1 H7.6, 1 mM EDTA, 0. S%SDS)で溶出させることにより、ポリ（A)を含む ιηϋΜ300 gを分取した。 .

この mMAを更にエタノールで沈澱させ、 0.2mlの溶液（lOmM トリス · Η C1 ρΉ'7.6, 2 mM EDTA, 0.3%SDS)に溶かし、 65°Cで 2分間処理して 10

〜35%ショ糖密度勾配遠心処理（べックマン SW28のローターを用いて 20 °C,25000rpin で時間違心分離）することにより分画して 22分画を得た。この各分画につき RMの一部ずつを、アフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、合成される蛋白質中の I L一 2活性を測定し、分画 11〜15(沈降定数 8S~15S)に I L一 2の活性を検出した。この分画の I L— 2mRN

Aは約 25,u gであった。

(Π) 単鎖 DN Aの合成 .

上記で得た mRMおよび逆転写酵素を用い、の反応液（5 igの mR ，50 8ォリゴ（(1下）， 100ユニットの逆転写酵素， 1 mMずつの dATP, dCTP, dGTPおよび dTTP, 8 mM MgCl₂, 50mM C1, lOmM ジチオスレイト一ル， 50 m トリス · HC1 pH 8.3)中で 42°C， 1時間インキュベートした後に、フエ

簦換えノールで除蛋白し、 0.Πの NaOHで 70°C,20分処理して RNAを分解除去した。

(iii) 二重鎮 D M Aの合成

ここで合成された単鎖の相捕 D N Aを 50 J2の反応液（mRNAとオリゴ dT を含まない以外は上記と同じ反応液）中で 42°C 2時間反応させることにより二重鎖 D N Aを合成した。

(iv) dCティルの付加

この二重鎖 D N Aにヌクレア一ゼ Siを 50〃J2の反応液（二重鎖 D N Α ,Ο. 1M舴酸ナトリウム ρΗ 4.5, 0.25Μ NaCl, i.om ZnSO_{+ )} 60ユニットの Si ヌクレアーゼ）中で室温 30分間作用させ、フヱノールで除蛋白し、エタノールで D N Aを沈澱させた後、これにターミナルトランスフェラーゼを 50〃 2の反応液（二重鎖 D N A.0.UM力コジル酸力リ，0.3Μトリス（塩基） Η 7.6, 2 mMジチオスレィトール， 1 mM CoCl₂, 0.15mM dCTP, 30ュニットターミナルトランスフエラーゼ）中で 3分間 37°Cで作用させ二重鎖 D N Aの 3 '両端に約 15値のデォキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連の反応で約 300ngのデォキシシチジン鎖をもつた二重鎖 D N Aを得た。

(V ) 大腸菌プラスミドの開裂ならびに dGティルの付加

一方、 10〃 gの大腸菌プラスミド PBR322 D N Aに制限酵素 Pstlを 50 の反応液く10," gD λ' A , 50m.M NaCl, 6 mM トリス · HCl H 7.4, 6 m Mg Cl₂， 6 mM 2 —メルカプトエタノール， 100〃 g/ml牛血清アルブミン， 20 ュニッ卜の PstO中で 3時間 37°Cで作用させて PBR322 D N A中に 1ケ所存在する Pstl認識部位を切断し、フヱノールで除蛋白した後、ターミナルトランスフェラーゼを 50〃 J2の反応液（D N A 10,u g, 力コジル酸カリ， 0. トリス（塩基） pH 7.6, 2 m ジチオスレィトール， 1 mM CoC 1₂, 0.15mM GTP, 30ュニヅトターミナルトランスフエラーゼ）中で 3分間 37°Cで作用させ上記プラスミド PBR322 D N Aの 3 '両端に約 17個のデ

差換えォキシグァニン鑌を延長させた。

(vi) cDNAの会合ならびに大腸菌の形質変換

このようにして得られた合成二重鎖 D N AO. l;igと上記プラスミド pB R322, 0.5 8を0. 1 NaCl , 50mM トリス · HC1 pH 7.6, 1 mM EDTAよりなる溶液中で 65°C 2分間、 45°C 2時間加熱しその後除冷して会合させェネアらの方法 [ジャーナルォブモレキュラーバイオロジー，第 96卷， 495— 5Q9頁 975)]に従って大腸菌 MM294を形質転換させた。

(vii) cDM含有プラスミドの単離

このようにして約 20000個のテトラサイクリン耐性株が単離され、これら各々の D N Aをニトロセルロースフィルターの上に固定した。次いで谷口らの報告 [前出]した I L— 2のアミノ酸配列をもとにしてアミノ酸 No.74〜78(Ly^⁴ - His-Leu- Gin - Cys)およびァミノ酸 No.122〜126(

12り - 5' ^

Thr _:Phe- Met- Cys- Glu)に対応する塩基配列（ A CAT CTT CAG TGT" および⁵ ACA TTC ATG TGT GAA³ )をトリエステル法 [クレアら.プロシ一ディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー ·ォブ ·サイエンス US A, 第 75卷， 5765— 5769頁（1978)]により化学合成した。

このォリゴヌクレオチドに対して T4ポリヌクレオチドカイネースを用いて 50 J2の反応液（オリゴヌクレオチド 0.20," g, 50mM トリス · HC1 pH 8.0, lOmM MgCl₂, 丄 OmMメルカプトエタノール， 5Q Ci y —³² PATP.

3ュニヅト T 4ポリヌクレオチドカイネ一ス）中で 1時間 37°Cで反応させ、 5 '末端を³² Pで標識した。この標識されたォリゴヌクレオチドをブローブとしてラゥンらの方法 [ヌクレイツク · アシッド · リサーチ，第 9巻， 6 103— 61U頁ひ 981)]に従って上記の二トロセルロースフィルター上に固 —- 定した D N Aに会合させ、オートラジオグラフィ一によつて上記二種類のォリゴヌクレオチドプローブに反応する菌株を 4個単離した。これら差換え 252

—19一

の菌株の各々の菌体からプラスミド DMAをアルカリ法 [バーンボイムら，ヌクレイック ' ァシッド . リサーチ，第 7巻， 15U— 1524頁（1979)]によって単離した。次にプラスミド D N Aの揷入部を制限酵素 Pstlにより切り出し、分離したプラスミドのうちでその揷入部の長さの最も長い断片を含むものをえらび、このプラスミドを pILOT 135-8 と名づけた。次にこの PILOT 135-8 プラスミドに揷入された CD N Aの配列の一次構造（塩基配列）をジデォキシヌクレオチド法とマキサム一ギルバート法によつて決定した。その一次構造は第 1図に示した。

実施例 1 動物細胞形質転換体の製造

( i ) ブラスミド PTB106の構築

参考例で得たプラスミド PILOT 135-8 からヒト I L一 2遺伝子部分（ヌクレオチド No. 1〜559まで）を制限酵素 Pstlと Stu'Iで切断したのち、ァガロース電気泳動で分離じ、 D N A断片（0.56kb)を得た。この D NA0. 5 gを 15^ βのライゲージヨン緩衝液（66mM トリス ♦ HC1 pH 7.6 , 6.6rn gCl₂, lOmM DTT, 66 M ATP)に溶解し、 5 '末端をリン酸化した 0.2 ^ gの Bam HIリンカー（CCGGATCCGG)と、 2ュニット T 4D N Aリガーゼとを混合し、 14てで時間反 iSさせた。リガーゼを 65°C10分間の熱処理によつて失活させたのち、 5 ίき量の蒸留水を加えて、さらに制限酵素 Bara HIの緩衝液（10mM トリス · Η(ΐ ρΗ 8, lOOmM NaCl, lOmM MgC , 1 mM メル力プトエタノール， 1 0 0〃g/n 中血清アルブミン）中 30ュニッ卜の Bam

HI及び 8ュニッ卜の Pstlで 3時間処理した。セファロース 4 Bカラム（0. 5cm直径， 15cm長さ）でリンカ一部分と、リンカーを結合した I し一 2 D N Aを分離し、エタノール沈澱により Bam HIリン力ー锆合 I L— 2 D N A (他端は Pstl)を回収した。

一方、公知のプラスミド pPl 1 [岡山ら，前出]を制限酵素 H dlE及び P st Iで切断し、 SV40プロモータ一及びスプライス領域をもつ 0.5kbの D N CT/JP85/00252

-20- A断片を、ァガロース電気泳動で分離して製造した。また、プラスミド pcDV 1 [岡山ら，前出]を制限酵素 Bam HI及び HindHIで切断し、 SY40DN Aのポリ A付加領域，プラスミド PBR322に由来する複製原点及びアンピシリン耐性遺伝子領域を含む 2.5kbの D N A断片を同様にして製造した。これら 3種の DMA断片を T4DN Aリガーゼを用いて結合させ、大腸菌 DHIを形質転換させた [マニアチスら，モレキュラークローニング， 249 ~ 255頁，コールドスプリングハーパーラボラトリー（1982)]。得られたアンピシリン耐性コロニーからバーンボイムードリ一の方法 [ヌクレィヅクアシッドリサーチ，第 7巻， 1513〜1524頁（1979)]によってプラスミドを単離検索し、ヒト I L一 2遺伝子を含む動物細胞形質変換用プラスミド PTB106の構築を確認した（第 2図）。

(ii) プラスミド PTB213および PTB215の構築

A— MuLVプロウィルス DNAがプラスミド pBE322の Hindltt部位にク口一二ングされたプラスミド pYJl [ゴフ， S.P.，セル，前出]を制限酵素 Bam H I及び Pstlで切断し、 LTR領域を含む 1.2kbD N A断片をァガロース電気泳動にて分離後精製した。また、 M— MuLVプロウィルス D Aが PBR322 の Hindni部位にクローニングされたプラスミド p8.2 [丹羽ら，前出]を制限酵素 Ps 11及び C 1 a Iで切断し、 LTR領域を含む 1.1 kb D N A断片を分離精製した。

これら LTR領域を含む D N A断片 1 gを各々 T 4D N Aポリメラーゼ緩衝液（33mM トリス ♦酢酸（pH 7.9), 66mM 酸力リゥム， iOmM 胙酸マグネシゥム，0.5mMジチオスレィトール， 100 g/ml牛血清アルブミン） 19 βに溶解し、 2mM dNTP(4種， dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 1 2及び T 4 D Ν Αポリメラーゼ 2.5ュニッ卜を加えて 37°C 5分間反応させた。 0.2ME DTACPH 7 )を 2.5 J2加えて反応を停止させフエノール—クロ口ホルム（ 1

: 1 )で抽出後、エタノール沈澱により D NAを回収した。これら末端を平滑化した DN A断片に、実施例 1 ( i )に記載した方法に従って Hindffi リンカー（CAAGCTTG)を锆合させた。

一方、実施例 1 ( i )において構築したプラスミド PTB106を制限酵素 Hi ndUKS Qプロモーターの上流に 1ケ听存在する）で切断し、 5'末端のリン酸基をアル力リ性ホスファターゼ処理により除去した。

HindlEリンカ一結合 1.2kb A-MuLV LTR領域 D N A断片または Hindffl 1. lkb M-MuLV LTR領域 D N A断片を、それぞれ pTB106D AHindll [断片と混合し T4D NAリガーゼを作用させて D N Aを結合させ、それぞれ LTR 領域を含む動物細胞形質転換用プラスミド pTB213(A- MuLV由来）及び pTB2 15(M- MuLV由来）を構築した（第 3図）。

( iii ) プラスミド PTB314の構築

実施例 1 (Π )で得た PTB213を制限酵素 Clalで切断し、 65°Cで 10分間ィンキュベ一トして Clalを失活させたのち、 T 4.D N Aリガーゼを作用させて、 PTB213からその LTR領域上流の 0.13kbClaID N A断片を除去し、 H 〖ndin切断部位が LTR領域と S 0プロモーター領域の間の 1ケ訢となった組み変え体 P T B 271を搆築した。更にこの p T B 271を制限酵素 H i n d ΠΙ及び X h olで各々の付着末端を 4種の dNTP存在下で T4DNAポリメラーゼを反 Ct、させて平滑化したのち、 T4D N Aリガーゼ反応により桔合させて（SV 40プロモーター部分を除き） A- .MuLV LTR領域をプロモーターとした動物細胞形質転換用プラスミド PTB314を構築した（第 4図）。

( i ) プラスミド pTB385の構築

実施例 1 (iii)で得た PTB314を制限酵素 Clalで切断し、付着末端を DN Aポリメラーゼ反応により平滑化したのち HitidlEリンカー（CAAGCTTG)を T4D N Aリガーゼ反応により結合させた。 Hindffiで切断後、ァガロース電気泳動により、 3.3kbD N A断片を分離精製し、この D N A断片を

T4D N Aリガーゼ反応により環状化して、 PTB314から A- MuLV LTR領域を除去したプラスミド PTB343を得た。このプラスミドは、 Sailまたは Hi ndHI切断部位に適当なプロモーターを揷入することにより、 Γ L— 2を動物細胞にて発現させることが出来る。

一方、 ATLV [吉田ら，前出] cDNAをォカャマ ·バーグの方法 [岡山ら，モレキユラ一アンドセルラーバイオロジー，第 2巻， 161〜170頁（1982)

]によりクローニングした PATLV421 [畑中ら（京都大学ウィルス究所）によりクローニングされ ATLVゲノム [吉田ら，前出]のヌクレオチド o.5897 〜8894を有するプラスミド]から、 ATLV LTR領域を含む Rsa I切断 0.75k bD N A断片を分離，精製し、 Hind リンカ一（前出）を結合させた。この Hind リンカー锆合 0.75kb DNA断片を、 HindlEで切断後アルカリホスファターゼ処理した pTB383と混合し、 T4D N Aリガーゼ反応により p TB385を構築した（第 5図）。

(V) プラスミド PTB485及び PTB487の構築

実施例 1 (iii)で得た PTB314をもとに、その Hind 切断部位を Xholに、 I L一 2遺伝子領域の 5 '末端側の Pstl切断部位を EcoRiに変換し、また、

I L一 2遺伝子領域の 3 '末端に存在する Bam HI切断部位の直前に Bgl Πを、ポリ A付加領域の下流に Cla【及び Hindi! [切断部位を掙入したブラスミド PTB399を構築した。

一方、ハムスター細胞の mRMから岡山らの方法 [モレキュラーアンドセルラーバイオロジー，第 3巻， 280~289頁（1983)]により作製された c

DMラィブラリーより DHFR遺伝子 cDMを有するプラスミド pTB348を選択した。 PTB348は l.lkbのハムスター DHFEcDNAを有し、 DHFR一 CH0細胞にトランスフヱクトすると約 100コロニー/〃 gD N Aの DHFR+細胞が得られた。この PTB348を Clalで切断後、アル力リ性フォスファターゼで処理し、 Clalで切断した PTB399より分離精製された 2.1kbDNA断片 [A- MuLV LTR

'領域，スプライス領域（SV40, 16S), I L - 2cMA及びポリ A付加領域を

簦換え含む（SV40, early)]と混合して、 T 4D N Aリガーゼ反応によりプラスミド PTB485を構築した（第 6図）。

PTB348を Bam HIで切断し、 DHFR遺伝子 cDMを含む Q .95kb D N A断片を分離精製したのち、この断片を PTB399の Bgin切断部位に、前述の方法に準じて揷入した。得られたプラスミドのうち、 I L — 2遺伝子と同方向に DHFR遺 ί云子が挿入されたものを選んで PTB487とした（第 6図）。

ΡΤΒ485は A- MuLV LTRをプロモータ一とする I L— 2遺伝子と SV40複製開始領域をプロモーターとする DHFR遺伝子を同方向に連結した構築をもつが、 PTB487は、プロモーターとしては I L — 2遺伝子上流の A- MuLV - L TRのみももち、 I L — 2遺伝子下流に近接して存在する DHFR遺 ί云子も、このプロモータ一の支配下に発現するポリシスト口ン性べクターである。

(vi) 動物細胞の形質転換

ファルコンシャーレ（直径 6'cm)に 10%牛胎児血清を含むィ一グル MEM 培地も入れ、マウス TK欠損 L細胞を 37°Cでー晚培養した。培養後、この钿胞（7 X丄 0⁵個/デイシュ）に対して、プラスミド pTK61(ヘルぺスシムプレックスウィルス（HSV)の Π遺伝子を含む 3.5kb Bam HI D N' A断片を PBR322にクローニングした組み換え体を有する大腸菌株 LE578 [ジーン，第 7巻，第 3 〜 342頁（1979);Dr. エンキストより分与]よりプラスミドを単離し、 TK遺伝子を含む 2 kb PVLI Π断片 [プロシージングォブナショナルアカデミーサイエンスし' SA, 第 78巻， 1441〜1445頁（1981)」を pBR3

22にリクローニングしたもの）0.2 gとそれぞれ 10 gの PTB10S, ΡΪΒ213, PTB215および PTB314 D N Aともグラハムらの方法 [ピロ口ジ一，第 52巻， 456〜467頁（1973)]に従って混合，接種した。 4時間 37°Cで培養後、新たな培地に替えて一夜培養し、翌日 L0%牛胎児血清を含む HAT培地

(15 z g/inl ヒポキサンチン， 1 β g/ml アミノプテリン， 5〃 g/ml チミジン，0.25," g/ml グリシンを含む MEM培地）に替えて、 37°Cで培養を続けた。

差換え 3〜4日に一度培養液の交換を行って培養を続けると、約 2〜3週間後に TK+となった細胞が増殖してコロニーを形成した。

一方、ヒト FL細胞にはプラスミド PTB106 , PTB31 及び pTB385を、プラスミド pTB 6 [ヘルぺス単純ウィルス由来 Π遺伝子を含むプラスミドの TK構造遺伝子領域を、トランスポゾン Tn5のネオマイシン耐性遺伝子の構造遺 ί云子領域を含む 1 kb Bg l H -Sma l D N A断片で置換したプラスミド [コルべ一ルーガラピンら（ジャーナルォブモレキュラーバイォロジ一，第 150巻， 1 —14頁（1981) )の PAG60と同じ構築のプラスミド] と共に導入した。細胞への D N A導入の条件は、 Π欠損 L細胞の場合に準じておこない、選択培地として G418 (ゲネチシン，ギブコ社製） 800 g/ m 1を含むイーグル M E M培地（ 10 %牛胎児血清を含む）を用いた。選択培地で培養を続けると、 2 — 3週間後には、 G 8耐性細胞が増殖し、コロニ —を形成した。

プラスミド PTB485及び PTB487については、 DHF1TCHO細胞 [ウルラウプら，プロシージング . ォブ . ナショナル . アカデミー · ォブ . サイェンス USA , 第 77巻， 4216 - 4220頁（1980)を 5 %牛胎児血清を含むハム 12培地にて培養し、 PTB485はシャーレあたり 1 〃g . PTB487は 5 gのブラスミドをグラハムらの方法（前出）に準じて遺伝子感染した。 2 日後に、 10 %透忻牛胎児血清及び ; cz g/m lプロリンを含むダルべッコ改変 MEM培地で液替を行なつて、以後この選択培地で培養を続けると約 2〜 3週間後に、 DHFR+となって増殖した細胞がコロニーを形成した。コロニー形成率は、 PTB487は PTB485の 10分の 1以下であった。

(vii ) 形質転換体のクローニング

実施例 1 Oi )で得た形質転換細胞のクローニングを、それぞれの細胞にっき、公知の方法（例えばリミテッドダイリューシヨン法）に従っておこなった。クロ一ニング終了後は、 L (TK+)細胞及び Fl GUS¹")細胞の

差換えクローンは 10%牛胎児血清を含むイーグル MEM培地， CH0(MFR+)細胞のク口ーンは、 5 %牛胎児血清及び 35, g/mlプロリンも含むダルべッコ改変 MEM培地にて培養した。分離された各クローンの細胞はリンブ口ディッシュにまき、細胞が約 80%コンフルェントになったとき新しい培地と交換して、 48時間培養後、培養上清中の I L一 2活性を測定した。

マウス L細胞の場合、 PTB106による形質転換細胞 9クローンのうち、最も高い I L一 2活性が検出されたのはクローン 4 [レ IL106-4]で 0.6'/ mlであった。これに対し PTB2 による形質転換細胞からは、 4.6U/mlの活性を示したクローン 3 -IL213- 3]が、また PTB215による形質転換細胞からは 1.9U/mlの活性を示すクローン 4 [L- IL215-4]pTB314による形質拿云換細胞からは、 4.6U/mlの活性示したクローン 12[L- IL314- 12]が分離された。結果を第 1表に示す。

第 1表

！プラスミド形質転換体（クローン） IL-2活性 ϋ/rnl

！ ρΤΒ 106 し- IL106 - 4 ' 0 6

： ρΤΒ 213 L-IL213-2 2. 3 ！

4 6

ΤΒ 215 L-IL215-1 1 3

！ L-IL215-4 1 9

！ ρΤΒ 314 L-IL314-9 3 2

4 6

ヒト FL細胞の場合は、プラスミド pTB 106による形質耘換細胞は、 0. 2ί1/π 以下の I L一 2活性しか示さず、また pTB 314による形質転換細胞も 0.2L^:/mlの I L— 2活性を示すにとどまった [Fい IL314- 1]。一方、 ATL yのプロモーターをもつプラスミド pTB 385による形質転換細胞からは、 L5U/mlの I し— 2活性を示すク口ーン FL- IL385 - 6が得られた。結果を 0252

26.

第 2表に示す。

第 2表

ハムスター CHO細胞の場合は、プラスミド pTB 485による形質転換細胞からは 2.0U/mlの I L— 2活性を示す C- IL485- 4及び 0.3U/ lの I丄— 2 活性を示す C- IL485- 5が得られた。一方ポリシストロン性ベクターと考えられるプラスミド pTB 487による形質転換細胞からは、 10.5U/mlの I L一 2活性を示すクローン C- IL487- 10が得られた。結果を第 3表に示す。 (viii) 遺伝子增殖 '

実施例 1 (vii)で得られた I L一 2産生 CH0細胞洙 C- IL485- 4を LOnMメソトレキセ一ト（MTX)を含むダルべッコ改変 MEM培地（5 %牛胎児血清， 35 g/mlプ口リンを含む）にて培養した。このクローンは、この濃度の ΜΠでは正常な増殖を示したので、 MTX濃度を 100 nMに上げて继代し培養を続けた。更に、 MTX濃度を 1 〃Mとすると大半の細胞が死滅したが、 3〜4日に液替を行って培養を続けると 10⁵個の細胞当り数個の細胞がコロニー状に増殖をはじめた。これらの細胞が十分増殖したのち、 10 Μ MTXの培養液にて继代すると再び大半の細胞が死滅し、数個の細胞が、コロニ —伏の増殖を示した。このようにして得られた細胞は 10 Μ ΜΤ.Χ存在下に、安定した正常な增殖を示し、また ΜΠを含まない培養液に戻して增殖させ数代继代したのち、 MTX存在下に培養しても正常に増殖した。この 10 M MTXに耐性の C- IL485- 4細胞は、実施例 1 (vii)と同じ条件のもとで 59.0U/mlの I L一 2を培養液中に産生し、もとのクローンに比ベ約 30倍の産生量の增加が認められた。

同様の方法で C- IL485- 5及び C- IL487 - 10細胞株についても耐性細胞を分離した。いずれの場合も、 ΠΧ耐性細胞では、もとの細胞に比べて、培養液中の I L - 2活性の上昇が認められた。結果を第 3表に示す。

第 3表

Iプラスミド；形質転換体 i IL- 2活性 ϋ/ml ί

(クローン）；もとの細胞 I j M^r細胞 I TB 485 i C-IL485-4 I 2.0

！ C-IL485-5 i 0.3

； TB 487 ； C-IL487-10 | 10.5 j 20.3

実施例 2 形質転換体の培養 .

実施例 1 ( V )で得た動物細胞形質転換体い IL3U- 12について、径時的に培養上清中の I L— 2活性を測定した。直径 3.5cmのファルコンディッシュにし 5x 10⁵個のい i U- 12細胞をシードし、 10%牛胎児血清を含む MEM培地' 2 mlで 37°CC0₂インキュベーターで培養した。培養開始 1 日後より毎日細胞数及び培養上清中の I L _ 2活性を測定した（第 7図）。細胞の増殖と共に I L一 2は生成蓄積され、細胞の増殖が止まつた後も I L ― 2の産生は持続し、最大値は 24.6U/mlであつた。

ヒト FL細胞にプラスミド PTB385を導入して得られた FL- IL385-6細胞についても同様に経時的に培養液中の I L一 2活性を測定した。直径 3.5c mのファルコンディッシュに L0%牛胎児血清を含むィ一.グル MEMにて 3 X 10⁵個の細胞もまき、翌日、同じ培養液 2 mlで液替を行ったのち、毎日細胞数と培養液中の I L - 2活性を測定した [第 8図]。い IL314- 12細胞の場合と同様に、細胞の増殖と共に I L一 2は生成蓄積され、細胞の增殖がとまつたのちも I L一 2の産生は持続し、最大値は 10.1U/mlであつ

差換えた。

CHO細胞の形質転換細胞株 C - 1 L485 - 4及びその MTX ( 10 M)耐性細胞からのクローン C-IL485- 14についても同様の方法で I L— 2の産生量を経時的に測定した。培養液は 5 %牛胎児血清及び 3 5 / gZralプロリンを含むダルベッコ改変 MEM培地を用い、その他の条件は前者に準じて行った [第

9図]。 I L一 2活性の最大値は、 119U/naであった。

実施例 3 グリコシル化ヒト I L— 2の分離

実施例 1 (iv)で得た動物細胞形質転換体（クローン） L- IL213-3を子牛胎児血清 10%を含む MEM培地で培養した。細胞を直径 3 cmのフアルコンシャーレ（ファルコン社製）に培養後、 2日目にメチォニン不含の MEM培地に³⁵ S―メチォニンも 50 Ci(10³Ci/mM)を含む培地に交換し、培養を続け、細胞外に分泌される I し一 2分子を標識した。 ³⁵ S—メチォニン含有の MEM培地で培養を継続後、〖〜72時間内に培養液と細胞 _を集め 15, OOOrpm, 20分， 4 °Cで遠心して遠心上清を採取した。得られた上清 180 J2に £の抗ヒト I L一 2抗血清（ゥサギ）を加え、 37。C 1時間， 4 °C

—昼夜静置した。次に 10%のプロティン A懸蜀液（0.05Mトリス— aCl, δ mM EDTA H 7.4, 0.05% - 40)を 100 2 加えた後、さらに 4 。Cで 1〜 2時間静置した [ジャーナルォブィムノロジー，第 115卷， 1 6 〜 1624頁（1975)]。プロティン Aに結合した一抗原—抗体複合物を 12 , OOOrpm. 2分間の遠心で集めた後沈澱物を 0.05%の NP- 40を含む NET锾衝液で 4〜 5回遠心洗浄した後、沈澱物をポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル緩衝液 30 に懸蜀し、 100°C, 5分間加熟した。遠心して上清を集め、 Π%のポリアクリルアミドゲル電気泳動（40Volt, 17 時間）を行った [ネイチヤー，第 227卷. 68！)〜 685頁（1971)]後ゲルを 50% のトリクロロ胙酸で固定し、フルォログライ一を行い、オートラジオグラフを得た。抗 I L— 2抗血清と反応する I L - 2分子は分子量 14キロ

差換えダルトンと 16~ Πキロダルトン付近に二本のバンドとして検出された（第画）。

産業上の利用可能性

本発明の動物細胞形質転換体を用いてヒト I L - 2蛋白質を工業的に有利に製造することができ、該蛋白質は腫瘍予防，治療剤や免疫機能低下疾患の治療剤として有用である。

換え

Claims

請求の範囲

1. ヒトインターロイキン— 2蛋白質をコードする領域およびその上流にプロモータ一を有する D N Aにより形質転換させた動物細胞。

2. D N Aがさらにェンハンサーを有する請求の範囲第 1項記載の形質転換体。

3. ェンハンサ一がレト口ウィルス LTR領域の塩基配列镍返し部分である請求の範囲第 2項記載の形質転換体。

4. プロモーターがレトロウィルス LTR領域由来のプロモータ一である請求の範囲第 1項〜第 3項記載の形質転換体。

3

o

5. さらに遺伝子増幅遺伝子を有する請求の範囲第 1項〜第 4項記載の形質転換体。

6. 形質転換が共形質転換である請求の範囲第 1項〜第 5項記載の形質転換体。 ' '

7 . 請求の範囲第 1項〜第 6項記載の形質転換体を培養し、培養物中にヒトインターロイキン— 2蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徵とする該蛋白質の製造法。

差換え