JPS59139349A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、ポリペプチドに関し、勃に詳しくはインタ
ーロイキン２活性を有するポリペプチドに関する。

インターロイキン２は、Ｔ−リンパ球の活性化増殖に重
要な働きをしており、癌、細菌感染、ウィルス性疾患、
免疫不全症、自己免疫患などの免疫疾患の治療剤として
使用できることが示唆されている。

本発明者らは、ヒ）Ｔ白血病細胞のｍＲＮＡより調製し
たインターロイキン２活性をもつポリペプチドをコード
しているＤＮＡが挿入されたサル細胞よりインターロイ
ギン２活性を有するポリペプチドを分離して１１ｊ製す
ることに成功した。ここに得られたポリペプチドは糖類
が全くなく、Ｗｉ類はヒト免疫活性に関与していないこ
とがわかった。こアミノゐ（市乙るり　戎Ｉ Ａｌａ　　ｐｒｏ　　Ｔｌ＋ｒ　　Ｓｅｒ　　３ｅｒ　
　Ｓｅｒ　　１−ｌ＋ｒ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｌ
＋ｒＧＩ　　Ｎ　　Ｌｅｕ　　ＧＩ　　Ｎ　　１−ｅｕ
　　Ｑｌｕ　　Ｈｉｓ　　ｌｅｕ　　１−ｅｕ　　１−
ｅｕ　　ＡＳＩ）Ｌｅｕ　　ＧＩ　　Ｎ　　Ｍｅｔ　　
ｌｉｅ　　Ｌｅｕ　　ＡｓＮ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　
ＡｓＮ　　１−ｙｒｌ−ｙｓ　　ＡＳＮ　　ｐｒｏ　　
１−ｙｓ　　１−ｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｒｇ　　Ｍｅｔ
　　１−ｅｕ　　ＴｈｒＰｈｃ’Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　
Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａ
ｌａ　　Ｔｈｒ　　ＧｌｕＬｅｕ　　　Ｌｙｓ　　　Ｈ
ｉｓ　　　１−ｅｕ　　　ＧＩ　　Ｎ　　　Ｇｙｓ　　
　Ｌｅｕ　　　Ｇ１１ｌ　　　Ｑｌｕ　　　ＧＩＬｌｌ
−ｅｕ　　１−ｙｓ　　ｐｒｏ　　１−ｅｕ　　Ｇｌｕ
　　Ｑｌｕ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ａ、ＳＮ　　１−
ｅｕＡｌａ　　ＧＩ　　Ｎ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ａ
ｓ　Ｎ　　ｐＨｅ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｑ　　
Ｐｒ。

Ａｒｇ　　Ａｓ１）　　　Ｌｅｕ　　　　Ｉｌｅ　　　
Ｓｅｒ　　　ＡｓＮ　　　　Ｉｌｅ　　　Ａｓ、Ｎ　　
　Ｖａｔ　　　　ｌ１ｅＶａｌ　　ｌｅｕ　　Ｑｌｕ　
　１−ｅｕ　　ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ
　　Ｔｌｕ・Ｔｈｒ　　ＰｈｅＭｅｔ　　ＣＶｓ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｔｙｒ　　Ａｌａ　　ＡＳＩ）　　Ｇｌｕ　　
Ｔｉ１ｒ　　Ａ、Ｉａ　　１−ｈｒ　　ｌ１ｅＶａｌ　
　Ｑｌｕ　　ｐｉｌｅ　　１−ｅｕ　　ＡｓＮ　　Ａｌ
・（ｌ　　Ｔ−ｒｐ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ　　ｐＨｅＣ
ＶＳ　　ＧＩ　　Ｎ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｊｌｅ　
　３ｅｒ　　Ｔ１＋ｒ　　１−ｅｕ　　７ｈｒ得られた
ポリペプチドは、インターロイキン２話性を有し、マウ
スの乳癌由来同系腫瘍の増殖をｉｎ　ｖｉｖｏにおいて
抑制した。

以下に本発明のポリペプチドの製造法及びその性質につ
いて実施例により説明する。

実施例１ ｉｌｌ　　イア　ｐ　−ｑイキン２生産能を有するジュ
ルヵ７）＋１１細胞株（ＡＴＣＣＣＲＬ　　８１２９）
をｌＸｌ０’個／　ｍｌ！の細胞密度で無血清合成培地
ＲＩＴＣ５５−９１，０００ｍｐニ懸濁し、ファルコン
社製回転培養瓶に入れ、３７℃で４日間培養し、遠沈操
作により細胞を集めた。この細胞を４ＸＩＯ’個／　ｍ
ｌの細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、ここにＣｏｎ
　Ａ　２５μｆ／　ｍｌを添加し、上記ファルコン社製
回転培養瓶（４本）に１．００　’Ｑ　ｒｎＬ≦で張り
込み６時間回転培養した。

（２）　　このようにして得たＣｏｎ　Ａ　２５μｙ／
　ｍｉ　で６１待間誘導したジュルヵット細胞（１，２
Ｘ　Ｉ　Ｏｌ’［ｉｌ）をＰＢＳ溶液ｓｏｏｍｚに懸濁
し、細胞を遠心によって２度洗浄してから、ヌクレアー
ゼ阻害剤であるＲｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　−Ｖ
ａｎａｄｙｌ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（１０ｍＭ）を含んだ
Ｒ３Ｂ溶液（１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ。

ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＮａＣＡ！、　１．５ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ、　）８００　ｍｌに懸濁した。次に、ＮＰ−４
０を０．０５９６になるように加えた後、ゆるやかに撹
拌後３．００　Ｏｒ　ｐ　ｍで５分遠心して核を除去し
、その上清液にＳ　Ｄ、Ｓ　（０，５％）とＥＤＴＡ（
５ｍＭ）を加えた後、ただちにフェノールを等量加え細
胞質ＲＮＡを抽出した。合訂３回フェノール抽出を繰返
してがら２容エタノールでＲＮＡを沈澱し、遠心でこの
沈澱を集め１゜ｍ　Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　、　ｐ
Ｈ７，５で溶解した。

このようにしてジュルヵット細胞から得られたＲ　Ｎ　
Ａ　Ｂは１９６　ｍ９であった。

次ニ、コのＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ｄＴ）−セルロース（Ｐ、Ｌ、Ｂｌｏｃｈｅｍｊｃａ
ｌｓ＋Ｔｙｐｅ　７　）　　ヲ用い、カラムクロマトグ
ラフィーな行った。吸着は２０　　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣＡ　、　ｐＨ７，５゜０．５　Ｍ　　ＮａＣ１、１
ｍＭＥＤＴＡ　、　’０．５９５　ＳＤＳ溶液にＲＮＡ
を溶カイして行い、溶出は緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ　
−ＨＣｌ　、　ｐＨ７，６、０，５ＭＮａＣｌ　、　Ｉ
　ｍＭ　ＥＤＴＡ）で洗浄後、水とｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）　　で交互にｍＲＮＡを溶
出することにより行った。この結果、溶出されたｍＲＮ
Ａ址は３．６■であった。

さらに、このｍＲＮＡの一部（２，４ｍｙ）　　をＳＤ
Ｇ遠心（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，
１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．２　Ｍ　ＮａＣｊ＋を含む５〜２５％シヨ糖密度勾
配。

Ｈｉｔａｃｈｉ　ＲＰＳ　２８　ローター２６．００Ｏ
ｒｐｍ、２４時間、４℃）して分画し、１１−１１１−
１２３１７）画分を分画番号＋２，１３．１４としてそ
れぞれ５９μｖ、４６μ２．６０μ７得た。

（３）　　ここに得られた分画番号１３のｍＲＮＡを前
出の検定法に従い、アフリカッメガエルの卵母細胞に１
個当り５０ｎ２をマイクロインジェクション法により注
入して得られた卵母細胞培＃ニー１〕＋ｉ、τインター
ロイキン２の活性検定に供したところ、次表に示すトリ
チウム化チミジンの取り込みおよび活性化Ｔ１１７７球
数の増加がみられ、これら分画のｍＲＮＡは本発明のヒ
トインターロイキン−２ｍＲＮＡを含有することが証明
された。

表−■ （イ） ☆　各希釈度のトリチウム化チミジンの取り込み４１（
ｃｐｍ）のプロビット・プロットを標準インターロイキ
ン−２（１０単位／ｍ／）と比較して求めた。

（４）　　次に、ここで得られたインターロイキン−２
ｍＲＮＡ　　を含む１１〜＋２Ｓ　　ｍＲＮＡ分画１３
よりｃ　ＤＮＡをインビトロで合成し、プラスミドベク
ターＰＢＲ３２２と組換え体ＤＮＡを作り、こレヲエシ
エリヒア・コリにトランスボームしてインターロイキン
−２ｃＤＮＡクローンを持つ菌体な以下の方法で選択し
た。

（４−１）　５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ緩胴液（ｐ
Ｈ７，５）。

３０　ｍＭ　ＮａＣｌ、　６　ｍＭ　ＭｇＣｌ、　、　
５　ｍＭジチオスレイトール（ｆ）ＴＴ　）　、　０．
５　ｍＭノ各ｄＡＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ　
、　ｄＴＴＰ（ｄＣＴＰは８ｕｐ　　ラベルしたものを
含む）　、　０．７５１１グオリゴ（ｄＴ）１ｏ　、１
０μ？　　ｍＲＮＡおよび１５ユニットＡＭＶ逆転写酵
素（Ｊ、Ｗ、Ｂｅａｒｄ）　　を混ぜ、４１℃に９０分
間保った。反応終了後、フェノール処理１回を行い、エ
タノール沈澱としてＤＮＡを回収し、２０　ｍ　Ｍ　　
Ｔｒｉｓ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡｐＨ７，５溶液に溶解し
た。これにより約２．５μＶの１木鎖ｃＤＮＡが合成さ
れた。この溶液からｍＲＮＡを除くために、ＮａＯＨ溶
液を加えて０．３３　ＮＮａＯＨとし室温にて１５時間
置き、次いで溶液をＩ　Ｍ　Ｔｒｉａ　−ＨＣＩ　、　
ｐＨ７，５の等量で中和し「セファデックスＧ−５ＱＪ
カラムに通した。

これにより１．８μ２のｃ　ＤＮＡを回収した。

（４−２）５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）、１
０ｍＭ　Ｍｇｃ４　、１０　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．７５
　ｍＭの各ｃ　Ａ　Ｔ　Ｐ　＊ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、（ｄＣＴＰは８Ｈでラベルされたものを含む）
　、　１．Ｓμｙ１　本鎖ｃＤＮＡ、８ユニットボリメ
レース（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）■（米国ＢＲＬ製）を
混ぜ、１５℃で１５時間反応を行った。反応終了後、フ
ェノール処理１回、クロロホルム処理１回を行い、エタ
ノール沈澱トしてＤＮＡを回収した。この反応により１
．１０μ２の二重鎖ｅＤＮＡを得た。

次いで、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（Ｉｌｌ　Ｈ４，５）
。

０．２　Ｍ　ＮａＣｌ１　、１　ｍＭ　ＺｎＣ４，１，
１０μを二ｆｆ１ｆｌｉｌｊ　ｃＤＮＡを混ぜて３７℃
で２０分間インキュベートした後、０．２５ユニツトの
ヌクレアーゼＳ□（王共■製）を加え、さらに１５分間
インキュベートした。反応終了後、フェノール処理２回
行い、「セファデックスＧ−５０Ｊカラムに通し、０．
５５μ２の二重鎖ｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａを回収した。

（４−３）　０．１４　Ｍカコジル酸カリウム、３０ｍ
Ｍ００５５μ２二重鎖ｃＤＮＡおよび５ユニツトのター
ミナルトランスフェラーゼ（ＢＲＬ）を混ぜ３７℃テア
　分子ｕｌインキュベートし、反応終了後、フェノール
処理１回を行い、［セファデックスＧ−５ＯＪカラムに
通しエタノール沈澱としてＤ　Ｎ　Ａ　０．５０μ７を
回収したところ約５０個のｄＣＭＰカー両３′末端に付
加された。

ＰＢＲ３２２ＤＮＡ１０μ７を制限酵素ＰｓｔＩで切断
したのち、前述の二重ｇ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｋこｄｃＭ
Ｐ「４を付加したのと全く同じ条件でｄＣＴＰの代りに
ｄＧＴＰを用いて両３′末端にｄＧＭＰ鎮を付加した。

かくし又約５０個のｄＧＭＰが両３′末端しこイ」加さ
れた。

（４−４）　５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，５
）　、　Ｏ，１ＭＮａＣ１、５ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　０
．０５μりのｄＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２２，０，
０１μ２のｄ　ＣＭＰが付加されたｃＤＮＡをまず６５
℃で２分間、次いで４６℃で１２０分間、さらに３７℃
で６０分間、そして室温で６０分間保持した。

エシェリヒア・コリχ１７７６を５０ｒｎｌのＬ培地（
ｔｏｏμｆ　／　ｍｌのジアミノピメリン酸と５０μ９
７　ｍｅのチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％ＮａＣｌおよび０．１％グルコースを含
む）に接朴し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がお
よそ０．３になるまで３７℃で振とう培養した。培養終
了後、培養液を０℃で３０分間放置し、次に菌体を遠心
分離により集め、６　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ
７，６）、　０．１　ＭＮａＣｌｌ　、　５　＋ｎＭＭ
ｇＣ７１！、　　。

１０　　ｍＭ　ＲｂＣ１の溶液２５ｖ、で２回洗浄した
。

得られた菌体を５　ｍＭＴｒｉｓ　−ｕｃｇ　（ｐＨ７
，６）　。

０．２５　Ｍ　ＫＣＩ　、　５　ｍＭ　ＭｇＣｌ、　、
　０．１　Ｍ　ＣａＣ１，および１０　ｍＮ４ＲｂＣ６
を含む溶液２Ｑｍｌに懸渇し、０℃にて２５分間ｅ置後
、遠心分離により菌体な集めた。

上記と同じ溶液１　ｍｌに菌体な再び懸濁し、得られた
菌体懸濁液の０．２罰に上記組換えＤＮＡを入れ、０℃
で４０分間静買した。さらに、３７℃で２分間保ったの
ち、再び０℃で６０分間静１μした。次に、これに前記
り培地０．７ｍＡを加えて３７℃で３０分間振とう培養
した。この培養ｉＱ、１ｍ／を１００μ２／　ｍｅジア
ミノピメリン酸、５０μｔｊ／ｍｌチミジンと１５μｆ
／ｍｌ！テトラサイクリンを含むし培地の１．５　％寒
天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて２日間インキュベ
ートした。

（４−ｓ）上記において出現したコロニー４３２個をそ
れぞれ２４コロニーを１集団とする１８集団の混合体と
して１００μ９７ｍ１！のジアミノピメリン酸、５０μ
ｙ　／　ｍｔ：のチミジンとｌＯμｆ　／　ｍｔ＋のテ
トラサイクリンを含むし培地２００＋＋＋ｌに接種し、
３７℃で５〜７　ｕｙ聞振とう培養後、クロラムフェニ
コールを最終濃度で１７０μｆ　／　ｒｎｉになるよう
に加えた新鮮な上記り培地２００１１１１！を追加し、
さらに−晩飯とう培養する。こうしてプラスミドＤＮＡ
を増幅しておいて１６法に従ってプラスミドＤＮＡを精
製した。このＤＮＡを用いてＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ　−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ法でインク
−ロイキン−２ｃＤＮＡをもつクローンなスクリーニン
グした。ここで月１いたＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　
−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙは以下のように
して行なツタ。

精製したＤＮＡ２５μ２を制限酵素Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌで
切断Ｌ、７ｒ−／−ル処理３回、フェノール−クロロホ
ルム処理１回およびクロロホルム処理１回を行ってＤＮ
Ａをエタノール沈澱して８ｏ９６エタノールで洗浄した
のち回収し、これを８０％ボルムアミド溶液４０μｌに
溶解し、９０℃で５分間熱変性させた。その後、１０Ｘ
ＳＳＣ（’　１．５ＭＮａＣ１。

０．１５　Ｍクエン酸３ナトリウム）で１．３ｍ／に希
釈した。これを二）１−セルロースフィルターに固定し
、８０℃で３時間加熱乾燥した。このフィルターを５０
９６ホルムアミド、２０ｍＭビペス、ｐ　Ｈ６，５、０
，７５ＭＮａＣ６、５ｍＭＥＩ）ＴＡ　、　０．２９６
ＳＤＳおよび２５０μｔ　　ｍＲＮＡを含む溶液中で３
７℃。

１８時間インキュベートしてフィルター上のＤＮＡとイ
ンター−イキンー２ｍＲＮＡとをハイフ“リダイズさせ
た。次いで、このフィルターを１０ｍＭピペス　ｐＨ６
，５、０，１５Ｍ　ＮａＣ７！、　１　ｒｒ＋ＭＥＤＴ
Ａ、０．２４ＳＤＳ溶液で６５℃で３回洗浄した後、さ
らに１鴫　ピペス、１０ｍＭ　　ＮａＣ４溶液で３回洗
浄し、次いで０．５　ｍ１ｖｌ　ＥＤＴＡ　、　０．１
９！ＴＳ　Ｄ　Ｓ溶液で９５℃でｌｍ１ｎ処理してフィ
ルターに吸着したｍＲＮＡを溶出した。

これを常法に従ってオリゴｄＴ−セルロースカラムにか
けて回収した。この回収したｍＲＮＡを７フリカツメガ
エル卵母細胞に注入し、蛋白に翻訳させインターロイキ
ン−２活性を測定した。この結果、】８集団の中の１集
団に前述のトリチウム化チミジンの取り込み邦による活
性検定法により４８単位／　ｍｅのインターロイキン−
２の活性が検出された。

そこで、さらにこの集団に為する２４コロニーを今度は
単独にそれぞれ前述したように１００μ２／ｍ／のジア
ミノピメリン酸、５０μｆ　／　ｍ／！のチミジンと１
０μｆ　／　ｍｅのテトラサイクリンを含むし培地２０
０ｍ１に接種し、３７℃で５〜７時間振とり培養後、ク
ロラムフェニコールを最終製置で１７ｏｔｔＷ／ｍｌ！
になるように加えた新鮮な上記し−培地２００ｍ／を追
加し、さらに−夜振とう培養してプラスミドＤＮＡを増
幅しておいて１ｂ法に従ってプラスミドＤＮＡを精製し
た。そして各ＤＮＡ　５μＶをＨ４ｎｄ　ＩＩＩで切断
した後、前回と同様にニトロセルロースフィルターに固
定してインターロイキン−２ｍＲＮＡとバイブ・リダイ
ズさせ、ｍＲＮＡを回収してアフリカッメガエルの卵母
細胞に注入して蛋白に翻訳しインターロイキン−２活性
を測定して、２４コロニーの中のどのコロニーにインタ
ーロイキン−２クローンが存在するか検定したところ１
コロニーより得られた精製プラスミドＤＮＡ。

プラスミドｐ　３−１６にハイ７リダイズするｍ　ＲＮ
Ａを卵母細胞に翻訳させたものにインターｐイキン＝２
活性が見出され（表２）、本クローンがインターロイキ
ン−２ｃＤＮＡを持つクローン（エシェリヒア・コリχ
１７７６／３−１６　　ＡＪ１１９９５（ＦＥＲＭ−Ｂ
Ｐ２２５））であると同定された。

即ちプラスミドｐ３−１６のｃＤＮＡはインターライキ
ン−２ｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成するＤＮ
Ａ　（インターロイキン−２遺伝子）をもつことが証明
された。

次にプラスミドｐａ−１６のｃＤＮＡの制限酵素切断個
所を検討したところ、ｘｂａ　Ｉ　（米国ＢＲＬ旺）で
１ケ所、ＢｓｔＮＩ（米国Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ
ｉｏ　Ｌａｂ。

社）で２ケ所（Ｘｂａ　ｌ切断個所の上流及び下流）切
断された。しがし、このｃＤＮＡは約６５０塩基対より
なり、１１〜＋２３のインターロイキン２　　ｍＲＮＡ
の一部に対応するものとわかったのテ、再び間柱にして
調製したヒトインターロイキン２　　ｍＲＮＡを鋳型に
してＬａｎｄらの方法（Ｌａｎｄｅｔ　ａｌ＋Ｎｕｃｌ
ｅ目Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　Ｖｏｌ、９．　ｐ２５５
１（１９８１））によりｍｌ述同様にしてｃＤＮＡを合
成し、プラスミｔ’ｐＢＲ３２２にＪｉ１人した。この
プラスミドを用いてＥ−ｃｏｌｉχ１７７６を形質転換
させ、約２１Ｊｏ。

個の転換株のなかから、プラスミドｐ３−１６１７）ｃ
ＤＮＡと同じ配列を持っｃ　Ｄ　Ｎ　ＡクローンをＧｒ
ｕｎｓｔｅｉｎ　−Ｈｏｇｎｅｓｓの方法を用いて選別
し、約８５０塩基対のｃ　ＤＮＡインサートを持つプラ
スミ）’、ｐ　Ｉ　Ｌ　２−５０Ａヲｈつ転換株（エシ
ェリヒア・コリ　χ１７７６／ＩＬ　　２−５０ＡＡ　
Ｊ　　１１９９６　（ＦＥＲＭ　−ＢＰ　２２６）　）
　　を得た。このｐｌＬ２−５ＯＡのｃＤＮＡの制限酸
素切断地図を図−１に示す。

表　　　２　　【イ　） （ロ） 対照■　　　　　　Ｘ　２　　　　０ （無処的卵母細胞　　×３２　　　　　０☆ｌ　プラス
ミドｐ３−ｉｓのｃＤＮＡｔこＩ・イブリダイズしたｍ
ＲＮＡ 次にｍｌ−２ａ、ｂに示すように、ＰＢＲ３２８プラス
ミドベクターにｐＫＣＲベクター（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ　７８．　
Ａ　３１５２７−１５３１　。

１９８１）のＳＶ４０ウィルスの初期遺伝子のプロモー
ターを含む領域を組み込んだＰＣ，Ｅ−１ヘクターを造
成した。そしてプラスミドル３’−１６−６０Ａクロー
ンのプラスミドよりＰｓｔｌで挿入されたｃＤＮＡを切
り出し、ｐＣＥ−１ベクターのｐｓｔＩサイトに挿入し
た（プラスミドｐｃＥＩＬ−２）。　このときの挿入様
式は図−２に示すようンこＳＶ４０初期遺伝子のプロモ
ーターの下流にインターロイキン２遺伝子のイニシエイ
ションコドンＡＴＧが接続されてい゛るものである（図
のＩ）。このベクターをサル培養細胞のＣＯ５−７細胞
（Ｇｌｕｚｍａｎ＋　Ｙ、Ｃｅ１ｌ　ｖｏｌ、　２３　
ｐ＋７５−１８２（１９８１））に感染せしめた。（Ｍ
ｃ　Ｃｕｔｃｈａｎ　ｅｔ、ａｌ　Ｊ＋Ｎａｔ１．　Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、　ｖｏｌ、　４１　ｐ３５１−
３５７（１９６８））すなわち、Ｃｏｓ　−７細胞ａ　
ｘ　１ｏ’　／ｍｌを５９６のＦＢＳを含むＤＭＥＭに
懸濁し、この０．５ｍｅを２４穴のヌンク培養プレート
にまき、３７℃で４時間培養したのち、０，１ｍ１ｖ＋
エチレンジアミンテトラアセテートを含む１ｍＭ　−）
　リス塩酸緩衝液１７．６ｐｌと２ＭのＣａｃ１ｇ液　
２．４μｌ及び２倍濃緬ノ・ンクス・バランスド生理食
塩水（２ＸＨＢＳ　）（５０ｍＭビペス、２８０ｍＭ　
　Ｎａｃｌ、１．５ｍＭ　Ｎａ、　ＨＰＯ，−１２Ｈ１
ＩＯを含む、ｐ　Ｈ７，１０）　２０９ｇの混合液４０
μｌに上記ベクター１μ７を溶解したものを添加した。

３７℃４［Ｉｉ！１間培養後、培地を吸引除去し、ＰＢ
３１ｍ／で洗浄し更にＰＢＳ中２０％のグリ七ロールＱ
、５ｍｇを添加し、３分間室温に放饗したのち、水液を
吸引除去し、更に１　ｍｅのＰＢＳで洗浄し、５％ＦＢ
Ｓを含むダルベツコっ銃形培地Ｉｍｅ中にて３７℃で培
養を続け２４時間毎に培地５ｏｏｍｅを新鮮培地と交換
する。

このようにして得られた培養液中めインターロイキン２
活性を検討した。

対照としてベクタープラスミドｐ　ＣＥ　−１ヲ用いて
同様の方法で実験を行いインターロイキン２活性を調べ
た。結果を表−３に示す。

表−３ このようにＰＯＥ工Ｌ　−２がインターロイキン２活性
をもつポリペプチドをコードしている遺伝子を有してい
ることがわかったので、エシェリヒア・コ　リ　χ　１
７７Ｓ／　工Ｌ−２５０ＡＪ１１９９６　　（ＦＫＲＭ
ＢＰ−２２６）を大量に培養して、得られた細胞よりプ
ラスミドＤＮＡ区分を得、プラスミドＤＮＡを制限酵素
Ｐｓｔｌで完全に消化し、生じた二つのＤＮＡ断片の内
、知かい方の断片をインターロイキン２活性をもつポリ
ペプチドをコードしている遺伝子として分離し、精製し
た。

分離、精製したＤＮＡについて、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂ
ｅｒｔの化学法（Ｍｅｔｈ、　Ｉｎｚｙｍ、　６５．４
９９−５６０　、１９８０　）によシ塩基配列を調べた
ところ、以下に示すとおシの結果が得られた。

上記塩基配列の内、イニシェーションコドンとなるＡＴ
Ｇが最初に来るフレームと仮定して、これをアミノ酸配
列に翻訳すると、上記塩基配列図に並記し／ヒようにな
る。このアミノ酸配列においてＣ−末端はスレオニンで
あるが、これはポリペプチドのＣ−末端がスレオニンで
あることと一致し、またホ゛リペブチドの分子数が１５
，０００ダルトンであることとも一致しているので、上
記仮定は正しいものである。

又、上記アミノ酸配列の内シグナルペプチドであると考
えられる部分を除くと、メチオニン（ＡＴＧ　）より２
１番目のアラニンがＮ−末端となると考えられる。更に
、上記アミノ酸配列の内、上記アラニン以後のいくつか
のアミノ酸がないものであって、連続した複数のアミノ
酸を有しているペプチドであっても、インターロイキン
２蛋白の活性部位を保持しているようなポリペプチドで
あればインターロイキン２活性を有する。

組換え体ｏｏｓ−７細胞を３ａｔ容培養槽を用いて培養
を繰返し培養上清１６６ｔを得た・培養培地は表−３に
示す実験に用いたものと同じである。

培養上清中のインターロイキン２活性は２００μ／ゴで
あった。

実施例２ ｃｏＢ−ポリペプチドは以下の性質を有している。

（１）　　分子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動で行ったところ、１５，０００であった。

（２）　　このポリペプチドは蛋白分解酵素で失活し、
５６℃、１時間の熱処理で安定であり、ｐＨｌ０−９．
０の範囲で安定であった。

（３１ａｏｓ−ポリペプチドのインターロイキン２活性
について、活性化Ｔ細胞増殖活性を下記の方法で測定し
た。

検体１００μＺを９６穴マイクロタイタープレートの１
列目に添加し、２％の牛胎児血清を含有するＤＭＫＭ培
地に２倍希釈を繰り返して９６六マイクロプレート上に
おいて各１ｏｏμｔの希釈系列を作成した。そこに上述
活性化Ｔす〉バ球株（ＯＴＬＬ）　を５個／１ｏｏμｔ
の細胞密度として１００μを宛各くぼみに添加した。３
７°Ｃ，５％炭酸ガスインキュベーター中７２時間もし
くは９６時間静ｔｉｆ培養し、その後、倒立顕微鏡にて
生存する活性化７９２８球数をカウントする。この際、
１００ｕ／ｍ、　　１　ｏ　ｕ　／ＩＲ１のインターロ
イキン２活性を有するＣｏｎ　Ａ刺激培養上清をポジテ
ィブ・コントロールとして用い、検体添加群における’
［’　ＩＪンパ球の増殖数と比較し、検体のインターロ
イキン２活性を算出した（表−４）。

表　　−４ 表−４に示すように、ＣＯ５−ポリペプチドは活性化Ｔ
細胞を増殖するインターロイキン２活性を示した。

（４Ｊ　　００Ｂ−ポリペプチドを培地（Ｃ！１ｉｃ８
／ＲＰＭ工、５×１０＝２−メルカプトエタノール、　
　１０　ｍＭ　ＨＫＰＦ！Ｓ。

２％ＮａＨＯ０３，２％ＦＢＳ　）　　で４００　Ｕｎ
ｉｔ／ｍＡ’に調製した。これを検体とし、検体５０μ
ｔと抗インターロイキン２モノクローナル抗体（Ｃ１ｏ
ｎｅ扉５）５０μｔを９６穴マイクロプレートのウェル
中で混合し、ろ７°Ｃでインキュベートした。３０分後
、更に工ｇＧ　５ｏｒｂ　（ジ、エンザイムセンター社
製、ブドウ球菌菌体）を培地で２０倍希釈したのち１０
０μｔ／ウェル加え、５７℃で３０分インキュベートし
、抗原抗体複合体を工ｇＧ　５ｏｒｂ　Ｋ吸着させた。

マイクロプレートを５０００回転で２０分間インキュベ
ートした後、各ウェルから上清１００μｔを採取し、０
ＴＬＬのＤＮＡ取シ込み法にて上清中に残ったインター
ロイキン２活性を測定した（表−５）。

表　　−５ 表−５に示したとおｐ、ａｏｓ−ポリペプチドは０ＴＬ
Ｌ細胞のＤＮＡ合成を促進し、活性化Ｔ　ＩＪンバ球株
を増殖させる、いわゆるインターロイキン２活性を示し
た。さらに、この活性は抗イシタ−ロイキン２クローナ
ル抗体で完全に吸収されたことから、このポリペプチド
は、その分子上に同一の抗原構漬をもつことが明白であ
る。

【図面の簡単な説明】

図−１はインターロイキン２活性を持つポリペプチドを
コードしうる遺伝子の制限酵素地図である。 図−２はｐｃｘ工Ｌ−２の造成経過の説明図である。 特許出願人　財団法人　瘤研究　会 同　　味の素株式会社 手続補正書（自発） 昭和５８年１１月１０日 特許庁長官　若杉和夫　　殿 １、事件の表示 特願昭５７−２３０５７２ ２　発明の名称 ポリペプチド 五　補正をする者 事件との関係　　特許出願人 財団法人癌研究会 （ａｏ　６）味の素株式会社 ４、代理人 〒１０４ 東京都中央区京橋１丁目１番１０号 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄、図面の簡単な説明の欄
および図面 ＆　補正の内容 （１１明細書第３頁７行目の１自己免疫患」を「自己免
疫疾患」に訂正する。 （２）　　同第５頁１２行目の「挿入されたサル細胞」
を「挿入され、ベクターＤＮＡを感染させたサル細胞」
に訂正する。 （３）　　同第３頁１５〜１６行目の「糖類が全くなく
、・・・関与していないことがわかった。」を「糖類が
全くないことがわかった。」に訂正する。 （４）　　同第３頁１７行目の１ポリペプチドは、」と
「スレオニンを」との間に「Ｃ末端に」を加入する。 （５）　　同第９頁５〜４行目の［プラスミドベクター
　ＥＢＢ　５２２　Ｊを「プラスミドベクターｐＢＲ５
２２」に訂正する。 （６）同第１０頁５行目のＪ　ｃ　Ａ’ＴＰ、　Ｊを「
ａＡＴＰ、Ｊに訂正する。 （７）同第１１頁１２行目の「ｐＢＲ５２２Ｊを「１ｌ
ｌＢＲ６２２」に訂正する。 （８）同第１２頁１行目のＪＰＢＲ５２２」を［Ｉ］Ｂ
Ｒ５２２」に訂正する。 （９）　　同第１２頁５〜９行目の［エシェリヒア・コ
リχ１７７６を・、・、に接種し、］を［エシェリヒア
・コリχ１７７６を１００μｆ／ｍｌのジアミノピメリ
ン酸と５０μＰ／ｍのチミジンを含むＬ培地（１％トト
リトンｔ　　ｏ、５％酵母エキス、０．５％Ｍａｉｌお
よびＱ、１％グルコースを含む）５０ｍＪに接種し、」
に訂正する。 顛　同第１６頁１１〜１２行目の［精製プラスミドＤＮ
Ａ、プラスミドｐｓ−ｔ６ｊ　を「精製プラスミドＤＮ
Ａ（ｐ５−１６月に訂正する。 （＋１１　　同第１６頁１５〜１６行目の［エシェリヒ
ア、コリχ１７７６／３−１６Ｊを「エシェリヒア・コ
リχ１７７６／ｐ５−１６」に訂正する。 ０　同第１７頁４行目の［ｘｂａＩＪを「ｘｂａＩ」に
訂正する。 ０３　　同第１７頁８行目の「１１〜１２Ｓの」を削除
する。 任く　同第１７頁１１行目の「ｍＲＮＡを」と「＠型」
との間に「含む１１−１２５ｍＲＮＡを」を加入する。 （ｌＥＯ同第１７頁１２行目のｌ−Ｎｕｃｌｅｉｌ−Ａ
ｃ１ｄｙ８Ｒｅ８・、　Ｊ　を［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄｓ　１１１ｅｓ’−、Ｊ　Ｋ訂正する。 σｅ　同第１７頁１５行目の［前述同様にして１を［前
述したのと同様にして］に訂正する。 αη　同第１７頁下から４行目の「−ｃＤＮＡと同じ配
列を持つ」を「ｃＤＮＡと相同性のある」に訂正する。 舖　同第１８頁１行目の「χ１７７５／工Ｌ」を「χ１
７７６／ｐ工Ｌ」に訂正する。 （Ｌ樟　同第１９頁下から７行目の「ＰＢＲ５２８」を
［ｐＢＲ３２８Ｊに訂正する。 （イ）同第１９頁下から３行目のｆＪ　ＰｃＥ−１ベク
ター」を「ｐＣＩｌ！−１ベクター」に訂正する。 Ｑυ　同第１９頁下から２〜１行目の「プラスミドＰ５
−１６−５ＯＡクローン」を［プラスミドｐ工ＴＪ　−
２−５０Ａクローン」に訂正する。 ｔ２カ　　同第２ｏ頁９〜１０行目の［感染せしめた。 （Ｍｅ　Ｃｕ七ｃｈａｎ−山−、・（１９６８））Ｊを
１−感染せしめた（　ＭｃＣｕｔｃｈａｎ　ｅｔ　ａｌ
　Ｊ、　Ｎａｔｌ−Ｃａｎｃｅｒ工ｎ５ｔ−ｖｏｌ、４
１　ｐ５５１−！＋５７　（１９６８）　）。」に訂正
する。 （ハ）同第２ｏ頁１１行目ｔｙ）　［Ｏｏｓ　−７１ｆ
ｌ胞Ｊ　ヲ「ｃｏｓ−ｙ細胞」に訂正する。 ｃ＋４）同第２ｏ頁１２行目の［ＦＥＳ　Ｊをｌ−Ｆｃ
５Ｊに訂正する。 （ハ）同第２０頁下がら５行目の「ＣａＣｌ２液」を「
ＣａＣｌ２液」に訂正する。 （イ）　同第２０頁下から３行目の「Ｎａｃｌ　Ｊをｆ
−Ｎａ（！ｌ　Ｊに訂正する。 ０１　　同第２１頁５行目）「５％ＦＢＳＪ　ヲ［５％
ＦＣ！Ｓ　Ｊに訂正する。 （ハ）同第２２頁１行目の「ＰｃＥ工Ｌ−２」を「ｐｃ
Ｅ工Ｌ−２」に訂正する。 （至）　同第２２頁４行目のｌ’−ＩＬ−１−５０Ｊを
［工Ｌ−２−５０ＡＪに訂正する。 （７）同第２８頁１行目の［２％ＦＢＳ　Ｊを［２％ｐ
ｃｓ　Ｊに訂正する。 ６ｉ）　　同第３０頁５行目の後に次の文章を加入する
。 ［実施例ろ プラスミドｐＴｓＳ−５（１０／ｊ　７）　（Ｎｉｓｈ
ｉ　Ｔ、　、　ＴａｎｉｇｕｃｈｉＴ、　ｅｔ　ａｌ、
　、　ＳＥ工ＫＡＧＡＫＵ　５５．９６７　　（１９８
１）　）　を先ず制限酵素Ｓａｌ　ｉで切断し一ジリュ
１部位をＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ断片）あるいは
Ｔ　４ＤＮＡポリメラーゼ処理によりフラッシュ（ｆｌ
ｕｓｈ　）にした。Ｃ１ａ　ｌで切断後、ｔｒｐブロモ
−クー領域を有する大きい方の断片を常法に従ってアガ
ロースゲル電気泳動により単離精製し、ＤＮＡ　５μ２
を回収した。 他方、ｐＩＬ２−５０Ａの−Ｐａｔ　■切断により得ら
れるｃＤＩＪＡインサート１１μ？が那４Ａ工で切断さ
れ、Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼ処理され、大きい方の
断片がアガロースゲル電気泳動によシ単離、精製された
。このようにしてインターロイキン−２の１３２個のア
ミノ酸をコードするｃＤＮＡ断片が７、２　ｐ　９−得
られた。次に、ｔｒｐプロモーター（上記）を含む断片
０．４５μｍ、インターロイキン−２ｃＤＮＡを含むＩ
（ｇ　ｉ　ＡニーＰｓｔ　■断片０，５μｊｉＬおよび
合成オリゴヌクレオチド（５つＣＧＡＴＡＡ（］０ＴＡ
ＴＧＧＯＡ（５１）　　と　　（ろ’）　　ＴＡＴＴ（
１！ＧＡＴＡＣ！（！ＧＴ　　　（５’）　　　（各　
々　２０６．６ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）
中でＴ４］）ＮＡ　ＩＪガーゼ１単位を用いて連結した
（図−５）。 このように連結されたプラスミドはエシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１にトランスホームされた。出現したトランス
ホーマントの中で、目標とするトランスホーマントは次
のようにして選択した。 まず最初に、インターロイキン−２ｃＤＮＡおよび合成
オリゴヌクレオチドの両方とハイプリダイス可能ナトラ
ンスホーマントカコロニーハイブリダイゼーション法に
より選択された。次に、ＡＴＧＧＯＡ配列の丁度下流に
前記塩基配列の１１１から１１３の位置のＯＣＴ配列か
ら始まるＤＮＡ断片（Ｃ＋０ＴＡ（ＥＴ・・１０．）が
挿入されているプラスミドＤＮＡを持ったトランスホー
マントをＰｓｔ　ｌ　、　Ｘｂａ　１切断個所を検定す
ることにより選択した。 ｐＴ工Ｌ２−２’ｌａを含む上記のトランスホーマント
を２５　ｐ　ｇ−／ｒａｔのストレプトマイシフ、　　
２５ｐｆ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地１ｏｍｌ中
で６７℃で一晩飯とり培養し、その１　ｔｎｌを同じＬ
培地１００＋＋＋／に接種した。６７°Ｃで振とう培養
し、６５０ｍμのＯＤがほぼ１，０に達したときに５−
インドールアクリル酸を５０μＰ／ｍの濃度になるよう
に添加（〜、２時間後にその菌体を集め、３０ｍＭのＮ
ａ１ｌを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐＨ７，
５）溶液の８　ｍｌ　ＩＩＣ懸濁した。次に、この菌体
をリゾチーム処理した後、凍結融解を５回繰返して菌体
を破壊し、遠心分離によって菌体抽出物上清を得た。菌
体抽出物上清について０ＴＬＬアツセイ法によジインタ
ーロイキン−２活性を測定したところ、高いインターロ
イキン−２活性が認められた。 ｐ’ｒ工Ｌ　２−２１ａ　（ＡＪ１２０１５）およびｐ
Ｔ工Ｌ２−２１ｂ（ＡＪ１２０１４）を有するエシェリ
ヒア・コＩＪＨＥ１旧はそれぞれＦＩＲＭ−ＢＰ２４Ｂ
、　ＦＥＲＭ−ＢＰ２４９として寄託されている。 エシェリヒア・コリＡＪ１２０１３　（ＦＥＲＭ−ＢＰ
２４Ｂ）全２５μｍ／ｍ／アンピシリンおよび２５μＰ
／−ストレプトマイシンを含有する１０ｔのＬ培地（１
％トリプトファン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｍａ
ｉｌおよび０．１％のグルコースを含む）に接種し培養
した。６５０　ｎｍのＯ，Ｄ、が約１．０に達した時　
６−インドールアクリル酸４を５０μＬｉ−／ｍ／の濃
度で加え、２時間後に菌体を集め５０　ｍＭ　Ｎａ１ｌ
を含む２０ｍＭ　？リス塩酸（ｐＨ７，５）で洗浄し、
同じ緩衝液１８０−中に再び懸濁した。次に、１０■／
ＩｉｔノＩＪゾチ一ム溶液２０Ｍ、更に０．５　Ｍ　Ｋ
ＤＴＡ　（ｐＨａＯ）の２ｒｎｌを添加ののち、０°ｃ
　Ｋて２０分間放置し、引き続き一５０°Ｃと５７℃で
の凍結融解を６回行年うことによりインターロイキン−
２を菌体から抽出し、５０，０００ｒｐｍ　３０分間の
超遠心分離を汀公って菌体抽出液を得た。 得られた菌体抽出液のうち１６０ｍ／（総蛋白量２．４
１、インターロイキン−２活性５Ｘ１０５ｕ／ゴ、比活
性２　Ｘ　１０’　ｕ／ｍｇ　）をｐＨ７，７，０，２
Ｍの塩化ナトリウムヲ含む０．１Ｍ）リスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸緩衝液であらかじめ平衡化した多孔質
ガラスピーズ（ｃｐａ−ｉ　ｏ　、孔径５ｓｏｉ、　１
２０−２００メツシユ、Ｅｌｅｃｔｒｏ　−Ｎｕｃｌｅ
ｏｎｉｃｓ　−ｄ：　ｌ！　）５０ｍＡ’を充填したカ
ラム（５２祁径Ｘ６５Ｍ）に通液し、インターロイキン
−２を吸着させた。 その後、上記の緩衝液１００＋ｎ／！で洗浄しｐＨ７，
７，０、７５Ｍのチオシアン酸カリウムを含む０１Ｍト
リスヒドロキシアミノメタン−塩酸緩衝ｉ　２００ｍで
吸着インターロイキン−２を溶ａｔさせた。 得られたインターロイキン−２溶離液１５０＋＋＋／を
、ｐＨ／）、　０の００７Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝
液に対して４８時間透析を行なった後同じ緩衝液であら
かじめ平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−２５（７ア
ルマシア社製）４０ｄを充填したカラム（２２１＋Ｉ１
１径×１０５ＷＩｎ）に通液し、インターロイキン−２
を吸着させた。引き続き、同じ緩衝液１０．０ｍ／で洗
浄後、ｐＨ６，０の０．５　Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩
衝液１００ｄで吸着インターロイキン−２を溶離させた
。 得られた溶離液８Ｑｍ／に固型硫安を加えて８０ヂ・飽
和とし、−夜静置後、遠心分離によって生じた沈澱を集
め、ｐＨ７，０であり、１．２５Ｍの塩化ナトリウムを
含む０．０５　Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液１０
＋ｍ／に溶解し、同じ緩衝液によって平衡化シタセファ
デックスＧ−７５スーパーフアイン（ファルマシア社製
）５００ｔ！Ｌｌを用いてゲル濾過（５２■径Ｘ６５ｃ
ｒｎ）を行なった。インターロイキン−２は分子量１４
，０００〜１６，０００ダルトンに単一の活性ピークと
して溶出された。 得られたインターロイキン−２画分２０ｍｊｌＣ。 グルコースを最終濃度１Ｍとなるように加え、ｐＨ７，
０であり１．２５　Ｍの塩化ナトリウムおよび１Ｍグル
コースを含む０．０５Ｍリン酸−リン酸ナトリウト緩衝
液であらかじめ平衡化したフェニルセファロースｃｒｉ
−６Ｂ　（ファルマシア社製）５　ｍｌを充填したカラ
ム（１０日径Ｘ６ｃｒｎ）にそれを通液し、インターロ
イキン−２を吸着させ九次に同じ緩衝液１５ｍＡでカラ
ムを洗浄し、その後、５０ｍ１のｐＨ７，０であシ、０
．１Ｍ塩化ナトリウムおよび１Ｍグルコースを含む０．
０５　Ｍリン酸−リン酸ナトリウム緩衝液で溶離した。 得られたインターロイキン−２両分２０ｍ／のうぢ５ｍ
ｌを、日立６！１８−５０高速液体クロマトグラフィー
装置（日立製作新製）を用いて、あらかじめｐＨ４，０
の０．５Ｍ酢酸−トリエチルアミン緩衝液で平衡化した
Ｕ］、ｔｒａｐｏｒｅ　ＲＰＳＣを充填した高速液体ク
ロマトグラフィー用カラム（４，６ｔｔｍｒ径Ｘ　７５
ｗｎ、　Ｂｅｃｋｍａｍ社製）に０．５ｄ／ｍｉｎの流
速で通液した後、上記緩衝液（以下溶媒Ａと称す６）と
８０％ｖ／ｖ１−プロパツール水溶液（以下溶媒Ｂと称
する）を用いて、溶出を行なった。 最初の１０分間は溶媒Ａのみを流し、１０分〜２２分の
間は直線グラジェント法で溶媒Ａ１００％から溶媒Ａ７
０％十溶媒Ｂ５０％に変化させて流し、２２分から８６
分の間は直線グラジェント法で、溶媒へ７０％十溶媒Ｂ
ｏｏ％から溶媒Ａ５０％＋溶媒Ｂ７０％に変化させて流
した。なお、タンパク質の検出は、日立６５８−４１波
長可変型紫外設光度モニター　（日立製作新製）を用い
、２８０ｎｍにおける吸光度測定によった。ヒト　イン
ターロイキン−２は溶出を始めてから７０分後に単一の
ピークとして溶離され、菌体抽出液からの回収率は６０
％であった。ここに得られたインターロイキン−２は缶
口質１　”９　当り５×１０７ユニツトの活性を示した
。 得らねたインターロイキン−２は、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で分子量約１／）、０００ダルト
ソの位置に単一のバンドを示し、常法に従ってダンシル
法ＶこよるＮ−末端残基の分析を行なった結果、Ｎ末端
アミノ酸としてアラニンのみが検出された。 次に得られたインターロイキ７−２　約４０μグー（２
５０ピコモル）を用い、気相プロテインシークエンサー
４７０Ａ型（アプライドバイオシステムズ社製）を用い
る自動エドマン分解法（ＴｈθＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
Ｂｊ、ｏｌｏｇｉａａｌ　Ｃ！ｈｅｆｒｎｉｓｔｒ７．
２５６巻。 ７９９０−７９９７頁、　　１９８１年）によって、イ
ンターロイキン−２を構成するアミノ酸をＮ−末端より
逐次決定した。１段目の分解物を高速液体クロマトグラ
フィーにて分析したところ２００ピコモルのＰＴＨ−ア
ラニンが検出され、他のＰＴＨ−アミノ酸は検出さｉｌ
なかつたので、インターロイ上ソー２ＯＮ−末端アミノ
酸はアラニンと決定された。２段目の分ｍ物からは、１
Ｂ【ＪピコモルのＰＴＨ−プロリンと少量のＰＴＨ−ア
ラニンが検出され、他のＰＴＨアミノ酸は検出されなか
ったので、インターロイキン〜２のＮ−末端から２番目
のアミノ酸はプロリンと決定された。 ６段目の分解物からは５０ピコモルのＰＴＨ−トレオニ
ンと少量のＰＴＨ−プロリンが検出され、他のＰＴＨ−
アミノ酸は検出されなかったので、インターロイキン−
２ＯＮ末端から３番目のアミノ酸はトレオニンと決定さ
れた。なお、ＰＴＨ−トレオニンは不安定で分解しやす
いことが知られており、ＰＴＨ）レオニンの回収率が低
かったことは、この分野でしばしば経験することである
。４段目、５段目、６段目、７段目の分解物からはそれ
ぞれ２０〜４０ピコモルのＰＴＨ−セリン、ＰＴＨ−セ
リン、ＰＴＨ−セリン、ＰＴＨ−）レオニンのみが検出
された。ＰＴＨ−セリンも不安定で分解しやすいことが
知られており、このだめ回収率は低かったが、低のＰＴ
Ｈ−アミノ酸は検出されなかったので、インターロイキ
ン−２ＯＮ−末端から４番目から７番目までのアミノ酸
はそれぞれセリン、セリン、セリン、トレオニンと決定
された。８段目、９段目、１０段目の分解物からは、そ
れぞれ１００ピコモルのＰＴＨ−リシン、１２０ビ］　
モル（ｒ）　ＰＴＨ−’）　シフ、２０ピコモルのＰＴ
Ｈ−トレオニンが検出さね、インターロイキン−２のＮ
−末端から８番目、９ｉ目、１ｏ＄目のアミノ酸はりシ
ン、リシン、トレオニント決定された。同様にしてイン
ターロイキン−２ＯＮ−末端から１１番目から１５番目
のアミノ酸はグルタミン、ロイシソ、グルタミン、ロイ
シン、グルタミン酸と決定され、このときの対応するＰ
ＴＨアミノ酸の検出値は６０〜１２０ピコモルであった
。 １６段目の分解物には、２０ピコモルのＦＴＨ−ヒスチ
ジンが検出された。尚、ＰＴＨ−ヒスチジンも回収率の
低いことが知られている。同様にして１７段目から３０
段目の分解物からもそれぞれ２０〜１００ピコモルのＰ
ＴＨ−アミノ酸が検出され、インターロイキン−２のＮ
−末端から１６番目から３０番目までのアミノｒ俊はそ
れぞれヒスチジン、ロイシン、ロイシン、ロイシン、ア
スパラギン酸、ロイシン、グルタミン、メヂオニン、イ
ンロイシン、ロイシン、アスパラギン、グリシン、イン
ロイシン、アスパラギン、アスパラギンと決定さｉｌ、
た。このインターロイキン−２の部分アミノ酸配列はＡ
ｎｎ壬子塩基配列より予想されたものと完全Ｖこ一致し
ている。 次に、得られたインターロイキン−２のＣ末端アミノ酸
の決定を行なった。Ｃ末端の決定はカルボキシペブヂダ
ーゼＹを用いるＣｉｈａｎｇらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｊ、　、　１９９．５４７〜５５５　（１９８１）
　）の方法に準じて行なった。インターロイキン−２約
８０μｉｉ％　（５０（１ピコモル）を５ａｐｌの０．
０５モル酢酸緩衝液（ｐＨ５，４）に溶解し、これにカ
ルボキシペブチダーゼＹのｏ１■／　ｍｌ　？Ｊ　液１
μｔを加え、２５°Ｃに保った。反応液より７／Ｉｔの
試料を経時的に採取し、そｔｌそれを凍結乾燥したのち
１０　ｐＬ　（７）　０．１　％　ルＮａＨＣ＋０３　
（ｐＨ９０Ｋ　調Ｑ％　）を加えた。次に再結晶により
精製したジメチルアミノアゾベンセンスルホニルクロラ
イトノ４　ｍｍｏｌｅ／ｍＡア七トン溶液２０ｐｔを加
え７０’Ｃにて１５分加熱した後７０％エタノール２υ
０μｔを加え、うち１０μｔを用いてＨＰＬＯ分析を行
なった。ＨＰＬＣ分析の結果、初期の反応液からはジロ
イシンが検出されたので、インターロイキン−２のＣ末
端アミノ酸はトレオニンであり、０末端付近のアミ７自
更配列はロイシン−トレオニン（Ｃ−末端）であること
が分°った。 以上の実験結果より、得られたインターロイキン−２の
Ｎ−末端付近、Ｃ−末端付近のアミノ酸配列が、遺伝子
の塩基配列より予想されたものと完全に一致しているこ
とが分ったので、次に４．′、ｙ成アミノ酸の組成比を
贋べだ。 インターロイキン−２約４　ｏμ！７　（２５０ピコモ
ル）を常法に従い、６ＮＨＯ１中１１０°Ｃ４８時間の
加水分解を行ｒい、アミノ酸アナライザーを用いて分桁
した。結果を表に示す。なお、上記加水分解条件で分解
のおこることが知られているセリン、トレオニン、トリ
プトファンについては、セリン、トレオニンは１１０℃
、２４時間加水分解での分析値を用いて補正し、トリプ
トファンについてはケイ光分析にて別途求めた。表−６
より明らかな様に得られたインターロイキン−２のアミ
ノ酸組成は、遺伝子の塩基配列より予想されたものと一
致している。以上の結果より、得られたインターロイキ
ン−２の１次構造はアミノ酸配列式Ｉに示すものと判定
される。 ／ 表−６ Ｃ５２同第５１頁６行目カラ１−図−３＆’ｉ　ｐＴＩ
Ｌ　２−２１の造成経過の説明図である。」をＪＪＩＩ
人する。 ６リ　図−６を提出する。 （以上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｆｌｌ　　インターロイキン２活性を有するポリペプチ
   ド。 （２）Ｃ−末端がスレオニンである特許請求の範囲第１
   項記載のポリペプチド。 （３）　　アミノ酸配列式Ｉに示す特許請求の範囲第１
   項記載のポリペプチド。 アミノ酸よりなりインターロイキン２活性を有する特許
   請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ７　ミ　ノ　市隻市乙亜り　い、゛工 Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｔｂｒ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　　
   Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　ｉｙｓ　　Ｌｙｓ　　ＴｈｒＧＩ
   　Ｎ　　１−ｅＵ　　ＧＩ　Ｎ　　１−ｅｕ　　Ｑｌｕ
   　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ
   Ｌｅｕ　　ＧＩ　Ｎ　　Ｍｅｔ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　
   　ＡｓＮ　　Ｇｌｙ　　ｐＨｅ　　ＡｓＮ　　１−ｙｒ
   Ｌ’／Ｓ　　Ａｓ　Ｎ　　ＰｒＯＬｙｓ　　Ｌｅｕ　　
   Ｔｈｒ　　Ａｒｏ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　１−ｈｒｐ
   ｌ＋ｅ　　１−ｙｓ　　ｐｌ］ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｍｅｔ
   　　Ｐｒｏ　　ｉｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　Ｔｌ＋
   ｒ　　ＱｌｕＬｅｕ　　ＬＶｓ　　Ｈｉｓ　　Ｌｅｕ　
   　ＧＩ　Ｎ　　Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ
   　　Ｇｌｕｌ−ｅｕ　　ｌｙｓ　　ｐｒｏ　　１−ｅｕ
   　　Ｑｌｕ　　Ｑｌｕ　　Ｖａｌ　　ｌｅｕ　　ＡｓＮ
   　　１−ｅｕＡｌａ　　ＧＩ　Ｎ　　３ｅｒ　　ｔ−ｙ
   Ｓ　　Ａｓ　Ｎ　　ｐＨｅ　　ｌ−１ｉｓ　　Ｌ（３Ｌ
   Ｉ　　Ａｒｇ　　ｐｒ。 Ａｔ’（Ｉ　　Ａｓ１ｌ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　３ｅ
   ｒ　　ＡｓＮ　　Ｉｌｅ　　ＡｓＮ　　Ｖａｔ　　ｌ１
   ｅＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　
   　Ｇｌｙ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　
   　Ｐｌ＋ｅＭｅｔ　　Ｑｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｙｒ　Ａ
   ｌａ　　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　Ａｌａ　　７ｈｒ
   　　ｌ　１ｅＶａｔ　　ＧｌＵ　　ｐＨｅ　　ｌｅｕ　
   　Ａｓ　Ｎ　　ＡｒｇＴｒＤＩｌｅ　　ｌ”ｈｒ　　’
   ｐＨｅＣＶＳ　　ＧＩ　Ｎ　　Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｉ
   ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｌ＋ｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔ１１ｒ