WO1986003975A1 - Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation - Google Patents

Hepatitis b virus vaccine and process for its preparation Download PDF

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WO1986003975A1
WO1986003975A1 PCT/JP1985/000733 JP8500733W WO8603975A1 WO 1986003975 A1 WO1986003975 A1 WO 1986003975A1 JP 8500733 W JP8500733 W JP 8500733W WO 8603975 A1 WO8603975 A1 WO 8603975A1
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surface antigen
virus
hepatitis
antigen
medium
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PCT/JP1985/000733
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Inventor
Katsuo Koike
Haruo Sugano
Munehiro Oda
Shigeru Katayanagi
Takao Fujimori
Original Assignee
Japanese Foundation For Cancer Research
Meiji Milk Products Company Limited
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide comprising at least one of adr-type hepatitis B virus surface antigen and / or a surface antigen in the virus or a large surface antigen of the virus, and a polypeptide having no or a sugar chain attached thereto.
  • the present invention relates to a glycopolypeptide composition, a method for producing the same, and a hepatitis B predictor containing the same as an active ingredient.
  • Hepatitis B is a viral disease that occurs frequently in the Far East, including Japan, Southeast Asia, and Africa. It is also detected in Europe and the United States, but the proportion is relatively small.
  • the cause of this disease is hepatitis B virus (HB), which is classified into four subtypes (adw, adrayw, ayr) by antigenic determinants. It is said that there are many adr types, especially ayw and adw types in Europe and the United States.
  • HBV The structure and function of HBV are increasingly being characterized by biology, molecular biology, and immunological studies.
  • Dane particles which have the structure of a complete DNA virus, small spherical particles with a diameter of around 22 nm, and tubular particles.
  • Envelopes which contain Dane particles, have surface antigens (HBsAg), core antigens (HBcAg) and e-antigens (HBeAg), and DMAs (long and short chains) that carry genetic information.
  • DMA surface antigens
  • HBcAg core antigens
  • HBeAg e-antigens
  • HBsAg HBcAg and HBeAg are also being developed for non-sensitive patients (eg, dialysis patients) (Ref. 5).
  • HBsAg is purified mainly from the blood of patients with subclinical infection (carrier), but can be collected from humans. The quantity is limited and cannot meet the demand at all. In addition, it cannot be said that 100% protection against contamination of blood and foreign substances such as viruses can be achieved.
  • FIG. 1 shows the results of subculture of huGK-14 on a serum medium and a serum-free medium.
  • FIG. 2 shows the results of SDS polyacrylamide electrophoresis of adr-type hepatitis B virus surface antigen produced by huGK-14, the virus surface antigen and the virus large surface antigen.
  • FIG. 3 shows the results of SDS polyacrylamide * electrophoresis of adr-type hepatitis B virus surface antigen obtained by culturing in the presence of tunicamycin.
  • Fig. 4 shows an example of the entire primary structure of the DNA of the adr-type hepatitis B virus surface antigen and the medium surface antigen and the large surface antigen.
  • Fig. 5 shows the adr-type B 'hepatitis virus surface antigen and the medium surface antigen. An example of the amino acid sequence of the large surface antigen is shown.
  • huGK-14 is a novel human hepatoma cell line huSP (reference 19) established by Koike et al. that produces HBsAg.
  • HBsAg production was extremely high compared to huSP, and huSP was a high serum-requiring cell line. It has the property that it can be cultured in serum. There is a clear biological variation between the two cell lines. This serum requirement is demonstrated by the following test.
  • the medium used is DM-160 as the basal medium, and the results are compared with and without serum.
  • Each medium was inoculated with huGK-14 in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to 4 ⁇ 10 * cells / cm 2 .
  • the cells were treated with trypsin according to a conventional method, and the cells were inoculated on a new plate. Subculture was repeated in the same manner in units of 14 to 16 days thereafter. The results are shown in FIG.
  • huGK-14 could be cultured in a serum-free medium, and proliferation was observed even when the number of passages was increased.
  • huGK-14 can be cryopreserved almost permanently, registered and stored at the Institute for Research on Cancer, and is ready for distribution.
  • a substance having HBsAg antigenicity By culturing the cells, a substance having HBsAg antigenicity can be obtained from the culture supernatant.
  • this material is separated and purified and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, six bands with different molecular weights appear. This constitutes three pairs of bands, each molecular weight (in daltons) as a major band (22,000 and 26,000), a relatively minor band. (31,000 and 35,000) and (43,000 and 46,000) are shown in Fig. 2 (Fig. 2).
  • Each new paper Each paired polypeptide is caused by the presence or absence of a sugar chain, and is purified from the medium obtained after culturing by adding tunicamycin (sugar chain synthesis inhibitor) 3; ig / ml to the medium.
  • tunicamycin sucgar chain synthesis inhibitor
  • the higher molecule is a polypeptide with a sugar chain because it is unified into the smaller band of each paired node. Looking at the molecular weight (22,000 and 26,000), the molecular weight is unified to 22,000 as shown in Fig. 3.
  • These three pairs of bands have molecular weights (22,000 and 26,000) and the guests that make up the two bands make up the surface antigen, while the two guests (31,000 and 35,000) make up the two bands.
  • a substance is considered to be a medium surface antigen, and a substance that constitutes two bands of molecular weight (43,000 and 46,000) is a large surface antigen. Purification of major mRNA from huGK-14 cells and examination of surface antigens has also proved that a sequence encoding the surface antigen was detected.
  • the molecular weight (31, 000 and 35, 000) Oyo Pi molecular weight (43, 000 and 46,000) is material of the this is a surface antigen that is added P re-S pre-S antibody (anti-pre-S antibody ) (Table 1 in Example 1, Table 4).
  • Fig. 4 shows the entire primary structure of the DNA of adr-type hepatitis B virus determined by the present inventor, Koike et al. (Reference 20).
  • the molecular weight of 22,000 is a DNA sequence encoding a surface antigen.
  • numbers 3 and 184 are counted from the first amino acid (amino acid encoded by the initiation codon).
  • the numbers are different (corresponding to numbers 166 and 347 in Figure 5).
  • the amino acid sequence which plays a role as an antigenic determinant of surface antigens, is almost one amino acid, counting from the first amino acid (the amino acid encoding the start codon). It is thought to be between 10 and 156. Therefore, it is considered that the difference between the several amino acids does not affect antigenicity.
  • the amino acid sequence coding for pre-S added to the N-terminal side has a difference of several amino acids. However, they are indistinguishable as long as they have the biological and immunological activity as surface antigens or pre-S-added surface antigens as well.
  • Polypeptide and glycopolypeptide of this surface antigen, and polypeptide with amino acid added to the N-terminal side of the surface antigen Tides and glycopolypeptides can be separated if necessary by using anti-pre-S antibodies (References 28 and 24).
  • composition comprising the surface antigen and the surface antigen to which Pre-S is added is easy to purify because it is collected from a culture supernatant using a serum-free medium, and high dullness can be obtained. It is possible, and since a human-derived cell line is used as a host, an extremely high vaccine effect including addition of sugar chains can be expected.
  • adr-type hepatitis B virus surface antigen and / or a polypeptide or glycopolypeptide composition comprising at least one of virus surface antigen and Z or the virus large surface antigen;
  • the present inventors used a human liver-derived mutant strain huGK-14.
  • the biological properties of this cell are as follows.
  • a DNA fragment containing a gene encoding the adr-type hepatitis B virus surface antigen is integrated at about eight chromosomal haploids.
  • the suitable growth temperature is 36.5 ⁇ 1 ° C.
  • Antigen production increases rapidly after cell density reaches saturation.
  • the Iliams E basal medium is the most suitable, and the antigen can be recovered for a long time only by replacing the medium.
  • huGk-14 is clearly mutated compared to huSP (19, 23).
  • huGK-14 is first cultured in a single cell, and when it reaches an appropriate number of cells, it is transferred and adhered to a culture device suitable for large-scale culturing, such as self-factory (Nunc) or microcarrier. Perform culture.
  • huGK-14 is capable of dividing and growing only in a basal medium containing amino acid as a main component.
  • the cells are grown in a medium supplemented with serum, and the cells are not grown until the cell growth enters the stationary phase. It is desirable to replace with a serum medium. Antigen production is scarcely observed during the cell growth phase, and a fresh paper is used after the cell density reaches saturation. Increase sharply. For this reason, DM-160 (Kyokuto Pharmaceutical) supplemented with 4% or more of fetal calf serum is suitable as the medium for the initial growth in the petri dish and the growth phase in the mass culture device.
  • the medium be changed every 2-3 days.
  • dexamethasone an inducer of antigenic substances, and fibronectin, a cell adhesion factor, (Sigma), etc., were added to Williams E basic medium (Flow).
  • the medium is changed every 6 days and the product is obtained for more than 3 months.
  • Dexamethasone significantly increases the production of the antigenic substance as compared to the case without the addition.
  • Amount of Dekisamesazo emissions is arbitrary about 10_ S M is desired.
  • the culture temperature and gas phase conditions are not strictly limited, but air containing 36.5 ⁇ 1 ° C and about 5% carbon dioxide is appropriate. It is.
  • Dexamethasone as an antigen production promoter can be determined by the following test. This product also contains the surface antigen with pr.eS added. Addition concentration of dexamethasone, was 10_ S M. Table 1 shows a comparison between the case where dexamethasone was not added and the case where dexamethasone was added using the William E basal medium. New paper Medium production (ng / mfi) Williams E1, 340 without dexamethasone
  • the culture supernatant is concentrated 10- to 30-fold using an ultraporous membrane (Amicon) and loaded onto a column to which an anti-HBsAg monoclonal antibody has been bound.
  • This monoclonal antibody was prepared by Synotest Laboratories, Inc., and is used to produce the adr-type hepatitis B virus surface antigen produced by the human liver cancer-derived mutant huGK-14 and the surface antigen in the virus. It also binds to any of the virus large surface antigens.
  • the monoclonal antibody binding column can be obtained by packing the IgG fraction of the monoclonal antibody to a column in which Sepharose 4B (Pharmacia) is bound by the CNBr activation method.
  • Monoclonal antibodies that bind to HBsAg bind not only to surface antigens but also to pre-S-added surface antigens, all of which have a common surface antigen polypeptide, This is because the antibody binding site is located on the surface antigen polypeptide site.
  • new phosphor paper containing KSCN The antigen fraction is eluted with the buffer solution, and the antigen fraction is subjected to ultracentrifugation using an equilibrium centrifugation method using cesium chloride.
  • Antigen-sized antigen A purified sample of the surface antigen is obtained.
  • the purified product was subcutaneously injected into guinea pigs (guinea pigs), and the antibody titer was found to be high (see Table 5 in Example 2). This is considered to be extremely good as a peptide.
  • the purified sample is a major guest.
  • the surface antigen (two bands) polypeptide and glycopolypeptide, and the quantity of surface antigen (pre-S added to a lesser extent) Includes 4 bands) polypeptide and glycopolypeptides.
  • Anti-pre-S antibodies are used for surface antigen polypeptides and daricopolypeptides to which surface antigen polypeptides and glycopolypeptides and pre-S are added This allows separation.
  • the antigen-binding site of the anti-pre-S antibody is located on the side chain of 55 amino acids added to the N-terminal side of the surface antigen, and does not bind to the surface antigen.
  • the surface antigen added to pre-S consists of a medium surface antigen and a large surface antigen, but the 55 amino acid sequences added to the N-terminal side of the surface antigen are common (see Fig. 5). ).
  • Example 1 Culture, recovery and purification New paper
  • the growth medium used was DM-160 basal medium (Far East Pharmaceutical) supplemented with 4% inactivated fetal calf serum (GIBC0) and kanamycin sulfate (Meiji Seika) 60 ⁇ g / ⁇ .
  • the culture was performed in air containing 5% carbon dioxide gas.
  • the inoculation density of the mutant huGK-14 was 2.5 * 10 4 cells / cm 2 . Initially, after inoculating a 15 cm plastic dish and growing, immediately before the cell density reaches saturation (1 * 10 s cells / cm 2 ), the plastic dish is used for 6 plastic dishes (about 1.5 cells).
  • the cell factory is a plastic adhesion incubator with an adhesion area of 6000 cm 2 . Seeding density of each stage shall apply in 2.5 * 10 4 Ce ll S / cm 2 about it was subcultured in l * 10 s cells / cra 2 about. Conversion to a serum-free medium was performed when the time exceeded about 1 * 10 s cells / cm 2 in a cell factory.
  • the serum-free medium was dexamethasone (Sigma) 10- S M, sulfate kanamycin 60;.
  • adhesion factors flop a Lee Burone actin Ui Li AMMS E basal medium (Sigma) was added (Flow Co.) while maintaining the culture conditions 6 days The medium was changed every 15 times to collect the supernatant.
  • the supernatant was recirculated and concentrated using a waterfall device (extra-orifice, flat membrane type, cut-off molecular weight 100,000, Millipore), and a concentrated solution of about 30 times was obtained.
  • the concentrate is re-centrifuged in a continuous centrifuge at 11500 Xg for 10 minutes to remove insolubles, and then a monoclonal antibody that binds to the peptide site of the surface antigen (Coordinated by Synotetest Research Institute)
  • the IgG fraction was loaded onto a Sepharose 4B column (5 ⁇ 5.5 cm Pharmacia).
  • the plate was washed with a phosphate buffer containing 0.5 M NaCl, and subsequently eluted with a phosphate buffer containing 3 MKSCN.
  • the eluate is then dialyzed and centrifuged in an ultracentrifuge (130,000 xg, 48-hrs) using the equilibrium centrifugation method with cesium chloride (CsC1). And 0.22 / im membrane.
  • CsC1 cesium chloride
  • Table 2 shows the degree of purification at each step. Show. '
  • the amount of HBsAg antigen is new paper that includes surface antigen with pre-S added to surface antigen.
  • the purified sample was separated by SDS polyacrylamide electrophoresis according to the method of Laemmli et al. (Reference 25).
  • the obtained gel was stained with silver according to the method of Oaklay et al. (Reference 26).
  • Bovine serum albumin (MW 66,000), ovalbumin (MW 45,000), ⁇ -lactoglobulin (MW 18,400) was used as the standard protein.
  • the sample showed 4 bands, 46,000, 43,000, 35,000, 31,000, 26,000, 22, and 0.00, respectively, in descending order of molecular weight. (See Figure 2)
  • molecular weights of 26,000 and 22,000 are major products, and the lipase node appears.
  • Molecular weights of 46,000 and 43,000 and 35,000 and 31,000 are relatively thin, of which the band of 35,000 shows a slightly broader band.
  • HuGK-14 was cultured in the medium.
  • HuGK-14 was cultivated in a medium supplemented with 3 ⁇ g / m) 2 of tunicamycin, and surface antigens, medium surface antigens and large surface antigens were purified from the resulting culture.
  • the purified product thus obtained was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis, the band corresponding to the higher molecule that seems to have a sugar chain disappeared, and was the same as the lower band. It was unified in the position.
  • Figure 3 shows molecular weights of 22,000 and 26,000, which represent major bands. 26,000 locations have disappeared and a band has appeared at 22,000. Therefore, surface antigen, medium surface antigen, and large surface antigen can be converted to polypeptide and glycopolypeptide respectively. Exists.
  • This purified sample was proved to be a composition of a surface antigen to which a surface antigen and pre-S were added by measuring the reactivity with an anti-pre-S antibody (this test was Conducted by Atsuhiko Machida, Tokyo Metropolitan Research Institute, and Masatada Jichi, Jichi Medical University.
  • the assay was performed by reacting 5% tannic acid-treated hidge erythrocytes with a phosphate buffer containing anti-pre-S antibody for 37 hours and 2 hours, and then using a microplate (type V) to make a double dilution system. Then, the purified sample (50 ⁇ g / &) was diluted by a factor of 2 in the membrane and examined for the passive red blood cell collection reaction by 25-fold dilution (Reference 24, Reference 27).
  • the antibody was positive with anti-pre-S antibody and an antibody titer of 1: 4.
  • the purified sample 500 ⁇ g / mfi
  • the reaction with anti-HBs antibody was examined.
  • the antibody titer was extremely low, showing 1: 128.
  • the purified sample was a composition of the surface antigen to which the surface antigen and pre-S were added.
  • Guinea pigs (guinea pigs) were examined for their ability to produce antibodies by subcutaneous injection of the substance of the present invention.
  • This purified sample 12.8 jci g, 25.6; physiological saline containing ⁇ g ⁇ ⁇ ⁇ as antigen for healthy guinea pigs (400 to 500 g) 3 times at 2-week intervals New paper They were injected and blood was collected two weeks later. The collected blood was coagulated at room temperature and the serum was separated by centrifugation to obtain a sample for measurement. The antibody titer of this sample was measured by passive hemagglutination using the method of Stavitsky et al. (Reference 27). The results are shown in Table 5.
  • the substance of the present invention showed an extremely high antibody titer.
  • Recombinant plasmid, transformed yeast and method for producing hepatitis B virus surface antigen Recombinant plasmid, transformed yeast and method for producing hepatitis B virus surface antigen

Description

明 細 書
発明の名称
B型肝炎ワクチンおよびその製造方法
産業上の利用分野
本発明は adr型 B型肝炎ウィルス表面抗原および/または該 ウィルス中表面抗原おょぴノまたは該ウィルス大表面抗原の 1種以上よ り なるポリぺプタ イ ドおよびノまたはそれに糖鎖 のついたグリ コポリぺプタイ ドの組成物、 その製造方法およ びこれを有効成分と して含有する B型肝炎予 ヮクチンに関 する。
従来の技術
B型肝炎は、 日本を含む極東、 東南アジア、 アフ リ カにお いて多発している ウィルス性疾患である。 欧米においても検 出されるがその割合は比較的小さい。 この病気の原因は B型 肝炎ウイルス（HB であ り、 抗原決定基によ り 4つ（adw， adr ayw , ayr) のサブタイプに分類される。 日本で検出されるの は adr型と adw型であ り、 特に adr型が多いと されている。 欧米では ayw型と adw型が多い。
HBV は、 生物学、 分子生物学および免疫学的研究から次第 にその構造と機能が明らかにされてきている。 感染者の血液 には完全な DNA型ウィルスの構造を持つた Dane粒子と呼ばれ る直径 42nmの球形粒子と、 直径 22nm前後の小型球形粒子それ に管状粒子などが見られる。 Dane粒子の脂賓を含むェンベロ 一プは表面抗原（HBsAg)を持ち、 内側にはコァ抗原（HBcAg)と e抗原（HBeAg)さ らには遺伝情報を担う DMA (長鎖、 短鎖）と DMA
新た な ,弔紙 ノ
- 2- ポリ メラ一ゼを含んでいる。
1970年頃から、 ウィルス表面抗原に対する抗体がそのゥィ ルス感染の防御になる と考らえられる こ とから（文献 1 〜 4 ) HBsAg を精製してワクチンを生産しょ う とする試みが盛んに 行われるよ う になっ た。 また 1982年頃から， HBsAg の N末端 側に付加されたァ ミ ノ酸配列（Pre-S) についてもワ クチン効 果を高める可能性がある と して研究が始まっ た。 また HBcAg HBeAgについても非敏感性患者（例、 透析患者） などを対象に 開発'が進め られている（文献 5 )。
これらの開発研究は、 1980年頃迄は主と して感染者の血液 を原料と して HBsASgを精製する方法で行われ、 アメ リカ、 フ ランスに続いて日本でも 1984年に血液由来の HBsAgが B型肝 炎の予防ワクチンと'して初めて認可された（文献 β )。 1980年 頃からは分子生物学の進展を基盤と して、 専ら組換え DNA法 を用いた HBsAgや pre-Sの付加された HBsAgの研究開発に 目 が向けられるよう になっ た。 現在迄に 4つのサブタ イプのう ち既に 3つのサブタ イプ（ayw , adw , adr)について HBVの DNA の全一次構造が決定されている（文献？〜 9 , 20)。
発明が解決しょう とする問題点
し力、しながら HBsAgや pre-Sの付力 Dされた HBsAgはヮクチ ン と して相当量必要とされるにも拘わらず量産は非常に困難 である とされていた。 まず HVBはヒ トゃチンパンジーに しか 感染せず他の動物や培養細胞に感染しない。 このために主 に不顕性感染'者（キヤ リ ア一）の血液を原料と してこれらの HBsAgを精製するわけであるが、 ヒ ト感染者から採取できる 量は限られており到底需要を満たすには至らない。 また血液 中の夾雑物やウィ ルス等の混入を 100 %防御できる とは言え ない。
そこで組換え DNA法を用いて大腸菌や酵母を宿主と した形 質転換体を得、 所望の抗原を量産する研究が盛んに行なわれ ている。 これらの研究の成果については数多く の報告がある が（文献 10〜： 14)、 同時に新しい問題点も明らかにされてきた 例えば大部分の宿主においては、 HBsAgをコー ドする DNAの発 現はかな り小さいものと されている（文献 13)。 大腸菌を宿主 と した場合には HBsAgは菌体内で壊れ易い性質のものであ リ また産生する HBsAgによって大腸菌の増殖が困難になるとの 報告がある（文献 14)。 酵母を宿主と した場合についても発現 はかな り少ないほか、 分離精製が難し く所望量の HBsAgの生 産は難しいと されている。 更に大腸菌.や酵母細胞から抽出さ れる HBsAgは免疫原性が低いとの指摘がある（文献 15，16)。
当初、 組換え DNA法を用いた研究における宿主と して酵母 を選択する こ とは、 抗原を生産するのに最も適したものと思 われていたが、 生産された抗原は免疫原性が低いこ とから、 その活性はかな り の部分宿主に依存しているよ う に考えられ るよ う になってきた。 例えば糖鎖の付加はその免疫原性に影 響がある との見方が強まっ た。 そこで例数は少ないが、 抗原 性を持つポリぺプタ イ ド コー ド している DNAを含む発現べ ク タ 一を用いて動物細胞の培養サイ クルに合わせて感染 · 発 現させる方法（文献 17)および抗原性を持つポリぺプタイ ドを コー ドする DNAを哺乳動物細胞に組込んで発現させる研究が 注目 されてきている（文献 18 )。 前者の場合産生方法が複雑で あ り、 HB sAg の生産量も高く ない。 後者の場合も組換え体の 維持が難かし く 、 産生量も到底所望量には達しているとは言 えない（文献 17， 18 )。 またいずれの場合も細胞培養に充分な 血清を必要とするこ と から大量培養にはコス トがかかりすぎ る欠 がある。
図面の説明
図 1 は huGK- 14の血清培地および無血清培地での継代培養 結果を示す。 図 2 は huGK- 14が産生する adr型 B型肝炎ウイ ルス表面抗原および該ウイルス中表面抗原および該ウイルス 大表面抗原の SDSポリ アク リルア ミ ド電気泳動結果を示す。 図 3はッニカマイシン存在下で培養して得られた adr型 B型 肝炎ウィルス表面抗原の SDSポリ アク リルアミ *ド電気泳動結 果を示す。 図 4 は adr型 B型肝炎ウィ ルス表面抗原および中 表面抗原おょぴ大表面抗原の DNAの全一次構造の 1例を示す 図 5は adr型 B型'肝炎ウィ ルス表面抗原および中表面抗原お ょぴ大表面抗原のア ミ ノ酸配列の 1例を示す。
問題点を解決するための手段
本発明者らはかかる欠点を解消し、 B型肝炎に対する予防 ワ クチン と して有効な抗原を大量に生産すべく研究を行った と ころ、 ヒ ト肝癌細胞株の中から、 adr型 HBVの DMAの一部が 組込まれており、 HB sAgおよび pre- Sの付力 Uされた iiB sAgよ り なる抗原組成物を著量産生する変異細胞株 huGK- 14をク ロ一 ニングする こと に成功した。 huGK- 14 は、 先に小池らによつ て樹立されたヒ ト肝癌細胞株 huSP (文献 19 )を HB sAgの産生量 新た な ^紙 の高いコ ロニーのセレク ト を繰り返し、 さ らに数多く のク ロ 一二ングの結果、 huSPと比べて極めて HBsAg産生量が高く 、 かつ huSPが高い血清要求性細胞株であるのに対して無血清で も培養できる性質を得たものである。 この 2つの細胞株の間 には生物学的に明らかに変異が見られる。 この血清要求性に ついては次の試験によ り証明される。
培地は DM-160を基礎培地と し、 血清を添加した場合と添加 しない場合と を比較する。 各々の培地に huGK-14を 24穴プレ 一卜 tこ 1 X 104cells/cm2 ~ 4 X 10*cells/cm2となるよう 接 種した。 増殖の結果、 細胞密度が飽和状態になった時点で常 法に従い ト リ プシン処理し、 細胞を新たなプレー トに接種し た。 同様な方法で以後 14日〜 16日の単位で継代培養を繰り返 した。 結果を図 1 に示した。
huGK-14 は、 無血清培地での培養が可能で、 しかも継代数 が増加しても増殖が認められた。
huGK- 14は一 196 にほぼ永久的に凍結保存が可能であって 財団法人癌研究会研究所に登録保管されてお り 、 頒布可能な 状態にある。
この細胞を培養するこ と によ リ培養上清から HBsAgの抗原 性を持つ物質が得られる。 この物質を分離精製し SDS-ポリ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動にかける と分子量の異なる 6つ のバン ド が表れる。 これは 3対のバン ド を構成してお り 、 各々 の分子量 （単位ダル ト ン） はメ ジャ ーなバン ド と して の （22，000と 26，000)、 比較的マイ ナーなバン ド と しての (31，000と 35，000)および（43, 000と 46，000)を示す（図 2 )。 各 新た な用紙 各対となるポリぺプタイ ドは糖鎖の有無に起因するものであ リ、 培地にッニカマイシン（糖鎖合成阻害剤） 3 ； i g/mlを添加 して培養した後得られた培地から精製された表面抗原ば、 各 々対となるノ ン ドの小さい方のバン ドに一本化されることか ら高い方の分子は糖鎖のついたポリぺプタ イ ドである。 分 子量（22，000と 26，000)についてみる と 図 3 のよ う に分子量 22, 000に一本化される。
これら 3対のバン ドは分子量（22 , 000と 26，000)と 2本の バン ドを構成する物賓が表面抗原、 （31 , 000と 35 , 000)の 2 本のパン ドを構成する物質が中表面抗原、 分子量 （43, 000と 46, 000)の 2本のバン ドを構成する物質が大表面抗原と考えら れる。 表面抗原については huGK-14細胞からメジャ一な mRNA を精製し調べた結果、 表面抗原をコー ドしている配列が検出 されることでも証明している。 分子量（31 , 000と 35, 000)およ ぴ分子量（43, 000と 46,000)の物質が Pre-Sが付加された表面 抗原である こ とは pre-S抗体（anti-pre-S抗体）との結合性試 験によ り証明された（実施例 1表 4 )。 図 4 に、 本発明者であ る小池らが決定した adr型 B型肝炎ウィ ルスの DNAの全一次 構造（文献 20)を示すが、 分子量 22, 000は表面抗原をコー ドす る DNA配列から計算されるポリぺプタ イ ド分子量 25， 363と近 似しており、 分子量 31 , 000は表面抗原をコー ドする DNAの 5 末端側に 55個のア ミ ノ酸をコー ドする DNAの付加された中表 面抗原の塩基配列から計算されるポリ ぺプタ イ ドの分子量 31,163、 分子量 43, 000は表面抗原をコードする DNAの 5'末端 側に 163個のア ミ ノ酸をコー ドする DNAの付加された大表面抗 新た な用紙 原の塩基配列から計算されるポリぺプタイ ドの分子量 42，565 とほぼ一致する（図 5参照）。 一般に N末端に付加された 55個 および/または 163個のア ミ ノ酸を pre- Sと称している。
尚、 adr型 B型肝炎ウィルス DN A配列の中でも更にバ リ エ一 ショ ンがあるこ とが知られている。 これは同一ア ミ ノ酸を意 味する 3つの塩基の組み合わせに違いがある場合ばかりでな く 、 その DN Aがコー ドするア ミ ノ酸の数個について異なる例 も示されている（比較文献 2 1 , 2 2 )。 図 5の表面抗原のァ ミ ノ 酸配列と文献 21のア ミ ノ酸配列では、 最初のアミ ノ酸 （開始 コ ドンのコー ドするア ミ ノ酸） から数えて 3番と 165番と 184 番が異なる（図 5では、 1 66番と 3 28番と 347番に当たる）。 又、 図 5 の表面抗原のア ミ ノ酸配列と文献 2 2のア ミ ノ酸配列では 最初のア ミ ノ酸（開始コ ドンのコードするア ミ ノ酸）から数え て 3番と 1 84番が異なる（図 5では、 166番と 347番に当たる）。 最近の研究動向では、 表面抗原の抗原決定基と しての役割を 持つア ミ ノ酸配列は最初のア ミ ノ酸 （開始コ ドンのコー ドす るア ミ ノ酸） から数えてほぼ 1 1 0〜156番の間にある と考えら れている。 それ故、 前記ア ミ ノ酸数個の差異は抗原性に影響 を持つものではないと考えられる。 又、 N末端側に付加され た pre- Sをコー ドするア ミ ノ酸配列についても同様にア ミ ノ 酸数個の差異がある 。 し かし、 これらは表面抗原あるいは p re - S の付加された表面抗原と しての生物学および免疫学的 活性を同様に有する限リ区別し得ないものである。
この表面抗原のポリぺプタイ ドおよびグリ コポリぺプタ イ ドと、 表面抗原の N末端側にア ミ ノ酸の付加されたポリぺプ 新た な用紙 タ イ ドおよびグリ コポリぺプタイ ドは anti-pre-S抗体（文献 28, 文献 24) を用いることによ り必要に応じて分離するこ と が可能である。
この表面抗原、 Pre-S の付加された表面抗原からなる組成 物は、 血清を用いない培地を用いた培養上清から採取する こ とから精製が容易であり、 高い鈍度を得るこ とが可能である またヒ 卜由来細胞株を宿主とする こ とから、 糖鎖の付加など を含めて極めて高いワクチン効果を期待できるものである。
adr型 B型肝炎ウィルス表面抗原および/または該ウィルス 中表面抗原および Zまたは該ウィ ルス大表面抗原の 1種以上 よ り なるポリぺプタイ ドおょぴ またはグリ コポリぺプタ イ ドの組成物を製造するために、 本発明者はヒ ト肝疡由来変異 株 huGK-14を用い-た。 この細胞の生物学的性賈は次の通りで ある。
1. ヒ ト由来肝癌細胞株 huGK-14
(1) ヒ 卜肝癌細胞由来変異株である。
(2) 染色体モー ド数は 51である。
(3) adr型 B型肝炎ウィルス表面抗原をコー ドする遗伝子を 含む DNAフ ラグメ ン トが、 染色体ハプロイ ド当 り約 8 ケ 所組み込まれている。
(4) adr型 B型肝炎ウイルス表面抗原および該ウィ ルス中表 面抗原および該ウィ ルス大表面抗原からなる組成物を著 量産生する。
" (5) 細胞は不正円形で上皮性である。
(6) 接着型の細胞である。
' 新た な用鈹 (7) 生育温度は 36.5 ± 1°Cが適している。
(8) 抗原の産生量は、 細胞密度が飽和状態に達した後急激 に増加する。
(9) 細胞の増殖は DM- 160基礎培地に 4 %以上の血清を添加 したものが適当である。
(10) 無血清培地でも良好な分裂増殖を示す。
(11) 細胞密度が飽和状態に達.した後の維持培地と してはゥ イ リ アムス E基礎培地が最も適しており、 培地交換のみ で長期にわた り抗原の回収が可能である。
(12) デキサメサゾン添加によ り、 adr型 B型肝炎ウィ ルス表 面抗原および該ウィ ルス中表面抗原および該ウィ ルス大 表面抗原からなる組成物の産生量を増加させるこ と がで さる。 - _
huGk-14は huSP (文献 19， 23)と比較して明らかに変異がみ られる。
2. 細胞培養方法
huGK-14 は最初シャ一'レで培養し適当な細胞数に達した時 点でセルファク ト リ ー（Nunc社）、 マイ ク ロ キャ リ ア一等大量 培養に適した培養装置に植継ぎ接着培養を行なう 。 huGK-14 は、 ア ミ ノ酸を主成分とする基礎培地だけでも分裂増殖が可 能である。 しかし HBVに対して抗原となるポリぺプタイ ドお よびグリ コポリぺプタ イ ドを効率的に生産するためには、 血 清添加した培地で増殖させ、 細胞の増殖が定常期に入る手前 で無血清培地に交換するのが望ま しい。 抗原の産生は細胞の 増殖期には殆どみられず、 細胞密度が飽和状態に達した後急 新た な 用紙 激に増加する。 このため最初のシャー レでの増殖および大量 培養装置でめ増殖フェーズにおける培地と しては DM- 160 (極 東製薬）に牛胎児血清 4 %以上添加したものが適しており、
2〜 3 日間隔で培地交換を行なう のが良い。 大量培養装置で の物賓生産フェーズでは、 ウイ リ アムス E基礎培地（Flow社） に抗原物質のィ ンデューサーであるデキサメサゾンの他、 細 胞接着因子である フ ァ イブロネクチン（Sigma社） 等を加えた ものを用い、 6 日間隔で培地を交換して 3 ヶ月以上にわたつ て産生物を敢得する。 デキサメサゾンによ り抗原物質の産生 は、 無添加の場合と比較して有意に増大する。 デキサメサゾ ンの添加量は、 10_S M程度が望ま しい。 増殖フェーズ、 物質 生産フ X—ズいずれの場合も培養温度、 気相条件は厳密に限 定されるものではないが、 36 . 5 ± 1 °C、 5 %程度の炭酸ガスを 含む空気が適当である。
尚、 huGK- 14 の表面抗原産生量を最適培地を用いて測定し たと ころ、 次の結果を示した。 この産生量には、 pre-Sの付 加された表面抗原も含む。
細胞株種 HBsAg産生能 培 地 '
huGK- 14 2 , 400ng/ml ウイ 'J ァムス E培地
+デキサメサゾン 尚、 デキサメサゾンの抗原産生促進物質と しての効果は次 の試験によ り判断できる。 この産生物には pr.e-Sの付加され た表面抗原も含む。 デキサメサゾンの添加濃度は、 10_S Mと した。 ウィ リ アム E基礎培地を使用 してデキサメサゾン無添' 加と添加の場合を比較すると表 1 の通りである。 新た な用紙 培 地 産生量 (ng/mfi ) デキサメサゾン無添加ウイ リ アムス E 1 , 340
デキサメサゾン添加ウイ リ アムス E 2 , 400
3 . 精 製
精製するためには、 回収した培養上清から表面抗原おょぴ 中表面抗原おょぴ大表面抗原を限外口過、 ァ フィ 二ティ ーク 口マ トグラフィ 一、 遠心分離等を組み合おせて用いるが、 こ の う ちァ フィ 二ティ 一ク ロマ ト グラ フィ ーにモ ノ ク ローナル 抗体を用いる と非常に高い純度とィールド（回収率）がえられ る。 精製の手頫は次の通りである。
培養上清を限外口過膜（Amicon社）によ り 10- 30倍に濃縮し、 抗 HB sAgモ ノ ク ローナル抗体を結合したカ ラムに負荷する。 このモ ノ ク ローナル抗体は、 株式会社シノテス ト研究所が調 整したものであ り、 ヒ ト肝癌由来変異株 huGK- 14が産生する adr型 B型肝炎ウィルス表面抗原および該ウィルス中表面抗原 およぴ該ウィ ルス大表面抗原のいずれにも結合する。 モ ノ ク 口一ナル抗体結合カラムは、 このモ ノ ク ローナル抗体の IgG 分画をセフ ァ ロース 4B (Pharmacia社） に CNBr活性化法で結合 させたカラムに充填する ことで得られる。 HBsAg に結合する モ ノ ク 口一ナル抗体は表面抗原た'けでなく pre- Sの付加され た表面抗原とも結合するが、 これはいずれも共通して表面抗 原ポリぺプタ イ ド持ち、 抗体との結合部位が表面抗原ポリぺ プタイ ド部位にある こ と による。 その後 KSCNを含むリ ン酸緩 新た な甩紙 衝液で溶出し抗原分画を濂縮し、 ついで抗原の組成物分面を 塩化セシウムを用いた平衡遠心法を使用して超遠心分離し、 更に口過膜に通すことで表面抗原および中表面抗原おょぴ大 表面抗原の精製標品が得られる。
4 . 免疫原性試験
精製品をモルモッ ト（guinea pig )に皮下注射し抗体価を し らベたと ころ高い抗体価を示し（実施例 2表 5参照）、 ヮクチ ンと して極めて良好なものと考えられる。
5 . 精製表面抗原と表面抗原前駆体との分離
精製標品はメジャーな物賓と して表面抗原（バン ド 2本）の ポリぺプタイ ドおよぴグリ コポリぺプタイ ド、 量的には少な いが pre- Sの付加された表面抗原（バン ド 4本）のポリぺプタ ィ ドおよぴグリ コポリぺプタイ ドが含まれる。 表面抗原のポ リぺプタ イ ドおよびグリ コポリぺプタ イ ドと pre- Sの付加さ れた表面抗原のポリぺプタイ ドおよびダリ コポリぺプタイ ド は、 ant i- pre- S抗体を使用する こ と によ り分離できる。 この ant i- pre- S抗体の抗原との結合部位は、 表面抗原の N末端側 に付加された 55個のア ミ ノ酸の側鎖に位置しており表面抗原 とは結合しない。 pre- S に付加された表面抗原は、 中表面抗 原と大表面抗原よ りなるが、 表面抗原の N末端側に付加され た 55個のァ ミ ノ酸配列は共通である（図 5参照）。
実施例
つぎに実施例を示すが本発明はこれによ りなんら制限され るものではない。
実施例 1 培養 · 回収 ， 精製 新た な用紙 増殖用培地には DM-160基礎培地（極東製薬） に非働化した 牛胎児血清（GIBC0社） 4 %を加え、 硫酸カナマイシン（明治製 菓） 60 μ g/βを添加したものをもちいた。 培養条件は、 5%炭 酸ガスを含む空気、 37 で行なった。 変異株 huGK-14の接種 密度は、 2.5*104cells/cm2と した。 最初、 15cmのプラ スチ ッ クシャ ーレ に接種して増殖させた後、 細胞密度が飽和状態 になる直前（1* 10s cells/cm2)でプラスチッ クシャ ー レ 6枚分 (細胞数約 1.5* 10s以上） を多段式接着培養装置セルフ ァ ク ト リー（Nunc社） 1台に植え継ぎ， 更に増殖させた。 セルプ ア ク ト リーは接着面積 6000cm2をもつプラスチッ ク製の接着培養 器である。 各段階の接種密度は 2.5*104 CellS/cm2程度であつ て l*10scells/cra2程度で植え継ぎを した。 無血清培地への転 換はセルプ ア ク ト リ一"で約 1* 10s cells/cm2を超えた時点を適 期と した。 無血清培地と しては、 デキサメサゾン （Sigma社） 10-S M、 硫酸カナマイ シン 60 ;ί g/mJ2、 接着因子プ ア イ ブロネ クチン（Sigma社）を添加したウイ リ アムス E基礎培地（Flow社） を使用 した。 この培養状態を維持したまま 6 日間毎の培地交 ' 換を 15回繰り返して上清を回収した。
得られた培養上清中の抗原および pre-Sの付加された表面 抗原の定量には、 オースザィム HBsAgキ ジ ト（ダイナボッ ト社） を使用 した。 定量はポジティ ブコ ン トロールを希釈して測定 し、 0D492における吸光度と HBsAgとの相関を求めた標準曲線 から換算によって求めた。 結果は表 2 に示す。
次にモ ノ ク ロナール抗体を用いて精製を行う 。
培養上清回収液に 0.01 %アジ化ナ ト リ ウムを添加し、 ついで 新た な用紙 連続遠心機（11500xg、 滞留時間 10分） に烘紿し、 細胞等を除 去し、 上清液を得た。
この上清液を瀑縮装置 （限外口過、 平膜式、 カ ッ トオフ分 子量 10万、 ミ リポア社）で循還濃縮し、 約 30倍の濃縮液を得 た。 この濃縮液を連続遠心機 11500Xg 10分に再度かけ、 不溶 物を除去した後、 表面抗原のぺプタイ ド部位に結合するモ ノ ク ロナ一ル抗体（株式会社,シ ノテス ト研究所調整）の. IgG分画 結合セフ ァ ロース 4Bカラム（ 5 X 5.5cm Pharmacia社）に負荷 した。
次いで、 0.5MNaCl含リ ン酸緩衝液で洗浄し、 続いて 3MKSCN 含 リ ン酸緩衝液で溶出 した。 ついで溶出液を透析後、 塩化 セシ ゥ ム C s C 1に よ る平衡遠心法を用いて超遠心機にかけ (130000xg、 48-hrs), 抗原面分を取り 出し、 緩衝液で透析し た後、 0.22 /i m 膜で口過し檫品と した。 以上のよ う に して、 表面抗原および pre-Sの付加された表面抗原（表面抗原ぺプタ イ ド部位を持つ） の精製標品が得られるが、 各段階での精製 度を表 2 に示す。 '
表 2
HBsAG抗原量 収率
1888.9^g 100% 抗 HBsAg 2391.4/ig 1795.4 95
モノクローナル抗体力ラム
超遠心分離 (CsCl平衡遠心） 1621.5 1363.8 72.2 口過（0.22;im) 1644 779.3 41.3
(注) HBsAg抗原量は表面抗原に pre-Sの付加された表面抗原も含む 新たな用紙 次に精製標品を Laemmliらの方法（文献 25)に準じ SDSポリ アク リルア ミ ド電気泳動によって分離した。 得られたゲルを Oaklayらの方法（文献 26)に準じて銀染色を した。
標準蛋白と して牛血清アルブミ ン（分子量 66， 000)卵白アル ブミ ン（分子量 45, 000) β _ラ ク トグロブリ ン（分子量 18，400) を用いた。 標品は Sつのバン ドを示し分子量の高いほう から 各々 46， 000、 43, 000、 35, 000、 31 , 000, 26, 000 , 22，0.00を示 した。 （図 2参照）
このうち分子量 26， 000と 22, 000はメジャーな産生物であ り 濂ぃノ ン ドが表われる。 分子量 46，000および 43，000および 35, 000および 31, 000は、 比較的うすく そのう ち 35，000のバン ドはややブロー ドなバン ドを示す。
又、 3対の対応するポリぺプタ イ ドの分子量の違いが糖に 起因するものである こ と を証明するために糖鎖合成阻害物質 であるッニカマイシン（Sigma社）添力！]培地で huGK-14を培養し た。 ッニカマイシン 3 μ g/m)2を添加した培地で huGK-14を培 養し、 得られた培養液から表面抗原および中表面抗原および 大表面抗原を精製 し た。 こ う して得られた精製品について SDS ポリ アク リルア ミ ドゲル電気泳動にかけたと ころ糖鎖が ついている と思われる高い方の分子に対応するバン ドが消失 し、 低し方のバン ドと同じ位置に 1本化された。 メ ジャ一な バ ン ド を示す分子量 22， 000と 26， 000について図 3 で示す。 26，000の位置が消失し、 22, 000の位置に 1本のバン ドとなつ てあ らわれた。 この こ と から表面抗原および中表面抗原およ び大表面抗原は、 各々ポリぺプタ イ ドとグリ コポリぺプタ イ ΐた な用紙 ドが存在する。
本精製標品について表面抗原と pre-Sの付加された表面抗 原の組成物であるこ とは、 anti-pre-S抗体との反応性を測定 することによ り証明された（この試験は都立臨床研究所 町田 篤彦氏、 自治医科大学 真 忠氏によ り実施された。 ：)。
測定は 5 %タ ンニン酸処理したヒッジ赤血球と anti-pre-S 抗体を含むリ ン酸緩衝液と を 37 、 2 hr反応させ、 ついでマ イク 口プレー ト（V型）を使って倍々希釈系を作り、 精製標品 (50 β g/ &)の膜次 2倍希釈 25 £づっ入れ受身赤血球籙集反応 を調べる方法による（文献 24、 文献 27)。
結果、 anti-pre-S抗体と抗体価 1 ： 4で陽性を示した。 同 様に精製標品（500 μ g/mfi)を腹次 2倍希釈し、 抗 HBs抗体との 反応を'調べたと ころ抗体価は 1 ： 128と極めて髙ぃ反応性を示 した。
これによ り本精製標品は表面抗原と pre-Sの付加された表 面抗原の組成物であることが証明された。
表 4
anti-pre-S抗体との反応 抗 HBs抗体との反応
1： 4 1： 128 実施例 2 ワ クチン と しての免疫原性試験
モルモ ッ ト（guinea pig)に本発明物質を皮下注射する こ と によ り抗体産生能を調べた。
本精製標品 12.8 jci g、 25.6 ;ί gを含む生理食塩水 ΐ Βΐβを抗原 と して各々健康モルモッ ト（400〜500 g )に 2週間間隔で 3回 新たな用紙 注射し、 その 2週間後に採血した。 採血した血液は、 室温で 凝固させ遠心分離で血清を分離し測定用サンプルと した。 こ のサンプルを Stavitskyらの方法（文献 27)を用いて受身赤血 球凝集反応によ り抗体価を測定した。 結果は表 5 に示す。
本発明物質は、 極めて高い抗体価を示した。
表 5
. 注射量 回 抗 体 価
本発明物質 12.8 g 1 ： 128
26.6 g . 1 ： 362 文 献
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形質転換酵母から誘導される免疫原性 HBsAg
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新た な甩紙

Claims

請 求 の 範 囲
( 1 ) adr型 B型肝炎ウイルス表面抗原および/または該ウイル ス中表面抗原およびノまたは該ウィ ルス大表面抗原の 1種 以上よ りなるポリぺプタイ ドおよび またはグリ コポリぺ プタイ ドの組成物。
( 2) 表面抗原が B型肝炎ウィ ルス表面抗原と しての活性を持 ち分子量 22， 000〜 28 , 000である特許請.求の範囲第 1項記載 の組成物。
( 3) 中表面抗原は B型肝炎ウィルス表面抗原と しての活性を 持ちかつ pre- S活性を持つ分子量 31，000〜36， 000である特 許請求の範囲第 1項記載の組成物。
(4) 犬表面抗原は B型肝炎ウィルス表面抗原と しての活性を 持ちかつ pre- S活性を持つ分子量 43，000〜47， 000である特 許請求の範囲第 1項記載の組成物。'—
(5) ヒ ト肝癌由来細胞株 huGK- 14を培養し、 得られた培養物 から ad r型 B型肝炎ウィルス表面抗原および または該ゥ ィ ルス中表面抗原および/または該ウィ ルス大表面抗原の 1種以上よ りなるポリぺプタ イ ドおよび/またはダリ コポ リぺプタ イ ドの組成物を採取するこ と を特徵とする前記組 成物の製造方法
(6) adr型 B型肝炎ゥィルス表面抗原および/または該ゥィル ス中表面抗原および または該ウィ ルス大表面抗原の 1種 以上よ りなるポリぺプタ イ ドおよぴ またはグリ コポリぺ プタイ ドの組成物を有効成分とする B型肝炎ワ クチン。
新た な 紙
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