WO1986003411A1 - Process for preparing novel protein - Google Patents

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WO1986003411A1
WO1986003411A1 PCT/JP1984/000585 JP8400585W WO8603411A1 WO 1986003411 A1 WO1986003411 A1 WO 1986003411A1 JP 8400585 W JP8400585 W JP 8400585W WO 8603411 A1 WO8603411 A1 WO 8603411A1
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WO
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dna
reference example
plasmid
protein
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PCT/JP1984/000585
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French (fr)
Inventor
Shuichi Ikeyama
Osamu Nishimura
Masakazu Kikuchi
Yukio Fujisawa
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for producing a protein. More specifically, it relates to a method for producing hepatitis B virus surface antigen P31 protein by genetic recombination technology.
  • Hepatitis B is a common viral disease, particularly in tropical Africa, Southeast Asia and the Far East, and has been epidemiologically suggested to cause chronic hepatitis, cirrhosis, and even primary liver cancer.
  • the etiology is hepatitis B virus (HBV), a type of DNA virus, which is a 42-nm-diameter spherical particle and bears the name of the discoverer, Den (Dane).
  • HBV surface antigen hereinafter referred to as
  • HBsAg It is abbreviated as HBsAg, and is divided into subtypes such as adr, adw, ayr.ay, etc. depending on its antigenicity, but is found in Japan.
  • HBsAg is limited to being obtained from the blood of human infected individuals, and the obtained small particles etc. satisfy the demand as materials for diagnostic reagents.
  • HBsAg gene HBsAg structural gene
  • HBsAg gene was determined for the ayw type, which is common in Europe and the United States [Galibert, F. et al., Nature, 281]. , 646
  • P31 has 55 amino acid residues in the pre-S region added to the N-terminus of P-I.
  • the receptor for polymerized human serum albumin (poly-HSA) exists in this region. It has also been clarified. Further reported the 1 9 8 4 years, the P- 3 1 protein is also revealed to have a sugar chain.
  • this receptor is also present on the surface of hepatocytes, it is thought that den particles adhere to hepatocytes via poly-HSA and proliferate. Therefore, if the poly-HSA receptor on den particles is masked with an antibody against: P31, the particles will not be able to bind to hepatocytes, and it is expected that HBV infection can be more effectively prevented.
  • the present invention provides a method for culturing a transformant containing a DNA having a nucleotide sequence encoding hepatitis B virus surface antigen P31 to produce and accumulate hepatitis B virus surface antigen P31 in the culture.
  • a method for producing a hepatitis B virus surface antigen P31 protein characterized in that the obtained P31-containing solution is purified in a purification step including one-step mouth-matography treatment.
  • NA can be of any subtype (adr, adw, ayr, ayw), for example, they can be prepared by the methods described below.
  • Plasmid PBR322-EcoHIZHBV933 (abbreviated as pHBV933) incorporating 3.2 kb of adw-type HBV DNA described in JP-A-58-194948 or Nucleic Acids Res., 11, 1747 (1983). :) can be double digested with the restriction enzymes Hpal and ficoRI to obtain a 961 bp DNA fragment containing a part of the pre-S region. This fragment [3 41 ⁇ TTAA 5,] appropriate adapters comprising sequences - can be produced DN A that co one de the P 3 1 by coupling.
  • the DNA encoding P31 can be prepared by binding the above adapter to this fragment.
  • DNA encoding adw-type HBsAgP31 is represented by the nucleotide sequence order of 28 to 873 of the DNA sequence shown in Fig. 1.
  • DNA is adr-type HBsAgP31.
  • Examples of the DNA to be subjected include ⁇ A represented by the base sequence of 10 to 855 in the DNA sequence shown in FIG.
  • the DNA encoding P31 may be virus-derived or chemically synthesized.
  • DN'A which encodes P31
  • the promoter region may be any region as long as it contains a site necessary for initiating mRNA synthesis by the binding of RNA polymerase.
  • a recombinant DNA capable of expressing a P31-encoding DNA can be constructed by inserting a DNA encoding P31 into the 3 and terminus of a promoter region which can function in Escherichia coli.
  • DNA encoding P31 can be added to the expression vectors P TRP-601 and PTRP771 described in JP-A-58-210796 by the action of T4 DNA ligase. Buy. Using this reaction solution, E. coli (eg,
  • trp-p trp promoter
  • a recA promoter Japanese Patent Laid-Open No. 59-65099
  • a lac promoter a lac promoter
  • an IP promoter a lac promoter
  • Transformants harboring the novel recombinant plasmid DNA containing P31-encoding DNA obtained as described above express, for example, ampinline resistance, tetracycline resistance, or resistance to both drugs. You can choose the shape.
  • the 294 strain is a known bacterium [Backman, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174C 1974) :!
  • the transformant thus selected is cultured in a medium known per se.
  • a medium for example, L-9 broth, Penassay (broth), and M-9 medium containing glucose and amino acid [Mi'ller, J., Experiments in Molecular Genetics, 431-433 (Cold Spring)
  • a drug such as 3-indryacrylic acid can be added in order to make the promoter work efficiently.
  • Culture of the transformant is usually performed at 15 to 43 ° C., preferably 2.8 ° (up to 40 ° C., for 2 to 24 hours, preferably 4 to 16 hours, and if necessary, aeration and stirring may be applied.
  • yeast transformant When, for example, yeast is used as a host, a yeast transformant can be used as follows. Yeast ⁇ 3 [Broach, JR et al., Gene,, 121 (1979)], pSHl5 and pSHl9 [Harashima, S. et al., Mo CeU. Biol., 4, 771 (1984))
  • yeast promoter region for example, the inhibitory acid phosphatase gene promoter region [Meyhack'B. Et al., EMBOJ., 6, 675 (1982;), the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene; Promoter—a region [Hoiland, JP and Holland, MJ, J. Biol.
  • Plasmid DNA was isolated from the transformants selected in this manner by an extraction method (Birnboim, HC and Doly, J., Nucleic Acids Res.,, 1.513 (1979)), and Yeast, such as Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cer evi siae, e.g., fah AH22R ⁇ (leu2 his4 canlcir + pho80) [Proc. Natl. Acad Sci.
  • Saccharomyces cerevisiae AH22 R ⁇ was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-110134, and from September 4, 1984, the Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) ) Has been deposited under accession number FE RM P—78 24.
  • the obtained yeast transformant is cultured in a medium known per se.
  • a medium for example, Burkhoider's minimum medium !: Bosti an, ⁇ ⁇ L. et al.
  • Culture of yeast transformants is usually 15 ° C to 40 ° C, preferably 24 ° C ( ⁇
  • the reaction is carried out at 37 for 10 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, and if necessary, ventilation and stirring can be applied.
  • Bacillus subtilis or animal cells When using Bacillus subtilis or animal cells as a host, insert a DNA encoding P31 into the 3 'end of the promoter region that can function in Bacillus subtilis or animal cells.
  • the ability to produce P31 by transforming a host with the recombinant DNA and culturing the transformant by the method of itself, and the host is: preferable.
  • the resulting P31 may be glycosylated or non-glycosylated.
  • transformants containing HBsAgDNA are known to inhibit the growth of the transformants themselves by the production of surface antigen gene products. When used, growth inhibition is eliminated and P31 production is increased.
  • P31 activity is determined, for example, by binding the sample to cellulose activated with cf mucyan, and then reacting with Ausria H- 125 (Dynabot :). I-Direct to react with anti-HBsAg antibody,-".
  • ⁇ ' ⁇ ⁇ ⁇ Immunoas say method [Fujisawa, Y. et al., Nucleic Acids Res., 1 1,
  • the cells are collected by a known method, and in the case of a transformant of E. coli, the cells are suspended in a buffer containing a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, and the mixture is stirred in a cold place and then centrifuged.
  • a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride
  • a method of obtaining a supernatant containing the urea may be used as appropriate.
  • the cells are collected, suspended in a buffer, lysozyme is added thereto, homogenized, lysed, and a buffer containing urea (3 to 10 M) is added. After adding and stirring (0.5 to 8 hours at 10 to 10 hours), centrifugation is performed to obtain a supernatant;
  • the cells are destroyed by mechanical crushing with Zymolyase (manufactured by Kirin Brewery Co., Ltd.) or glass beads.
  • P31 can be extracted more advantageously by adding a surfactant such as Triton X-100, deoxycholate, or a protein denaturant such as guanidine hydrochloride.
  • Separation and purification of the P 3 I protein from the above-mentioned extract are performed by a purification process including affinity mouth chromatography.
  • affinity mouth chromatography is affinity chromatography using polymerized human serum albumin (poly-HSA) as a ligand and antibody against HBsAg, specifically antibody treatment using monoclonal antibodies. .
  • poly-HSA polymerized human serum albumin
  • Affine (Seikagaku Corporation), Affigel-15 (Piorad) and the like are used, and a formyl cell mouth fin is particularly preferred.
  • Poly-HSA can be produced by polymerizing human serum albumin using a crosslinking agent (eg, gludaraldehyde). This is bound to the above carrier using, for example, a reducing agent (NaCNBH 3 etc.) and, if desired, washed to obtain a conjugate of the carrier and poly-HSA, which is usually packed in a column and reused.
  • a crosslinking agent eg, gludaraldehyde
  • a reducing agent NaCNBH 3 etc.
  • the P31-containing solution (cell extract supernatant) is buffered (phosphate buffer, etc.). Adsorb to the column equilibrated in step 2. and elute with buffer.
  • a surfactant such as Tween 20
  • a protein denaturant urea
  • the eluted solids containing the P31 protein are collected and, if desired, concentrated by ultrafiltration.
  • the above concentrate is desirably reduced using an SH reagent such as dithiothreitol, and then subjected to chromatography using a hydrophobic column such as high-performance liquid chromatography using a reversed-phase column or hydrophobic chromatography. Preferably, it is subjected to a treatment.
  • an SH reagent such as dithiothreitol
  • an alkylated (about d- 18 ) siliconized carrier for example, AP-220203A (Cs) (Y
  • an alkylated carrier (about d-18), for example, butyltopearl (Toyo Soda Co., Ltd.)
  • the elution solvent for example, water, d- 6 lower alcohol (ethanol, sigma-panol, etc.), acetonitrile, etc. are converted to trifluoroacetic acid or the like as the elution solvent. It is preferable to use the mixture adjusted to 2 to 5.0, and the elution rate is 0.1 to 10 0 ⁇ Zmiru, preferably 0.5 to 30 ⁇ Zmin.
  • the obtained fraction containing the P31 protein can be subjected to lyophilization, if desired, to give a white powder.
  • a sample is reacted with a plastic plate coated with poly-HSA, and then the P31 protein bound to poly-HSA is analyzed.
  • Horseradish protein oxidase (HRP) -conjugated anti-HBsAg monoclonal antibody is used for detection, or enzymatic immunoassay (ELISA), or P31 protein conjugated to poly-HSA is isolated from australia.
  • 2 5 (Dainapo' preparative Co., American) can be used Rajioi Munoatsusi (RIA) method for detecting using 125 1-HBsAg antibody of.
  • P31 produced in Escherichia coli containing DNA having a nucleotide sequence encoding HBsAg P31 can be purified by the method of the present invention to obtain substantially pure HBsAg P3 having the following properties: One protein can be obtained.
  • SDS-polyacrylamide is homogeneous by slab gel electrophoresis.
  • Amino terminus has methionine (or its formyl form) or glutamine as an amino acid.
  • the substantially pure P31 protein produced by the method of the present invention has the same biological activity as known HBsAg small particles produced from blood of a known HBV-infected person, and the HBsAg small particles Can be used as a vaccine for diagnosis, prevention and treatment of HBV.
  • the measurement of the activity of P31 protein (specific activity) for determination of protein purity was performed by the ELISA method.
  • put the poly one HSA was allowed to advance physisorption I Munopure preparative [pi (Nunc) in Hiken'eki (P 3 1 protein-containing solution) 1 0 0 obtained in 1 of Example 4 4.
  • the reaction was performed with C for 1 ⁇ .
  • the plate was then washed with PBS containing 5% comb serum and 0.05% Teen 20.Hoseradish peroxidase-conjugated anti-HBsAg monoclonal antibody solution 100 was added to each well of the plate.
  • the reaction was carried out at 37 ° C for 2 hours.
  • the plate was washed again with the above buffer, and then 0-phenylenediamine (0 mi) and aqueous hydrogen peroxide (4> ⁇ £ / IOid) were added. 0) 100 was added and reacted at room temperature for 30 minutes. After 50 ⁇ L of sulfuric acid was added to stop the enzymatic reaction, the absorbance at 492 nm was measured using Titertec Multiscan MC. For the quantification, the purified sample obtained in Example 7 was used as a standard, and the absorbance value (0.05.D.) given by the standard 1 was defined as one unit. Calculated as the number of units at 3-time.
  • FIG. 1 shows the DNA sequence encoding adr-type HBsAgP31 (: upper row) and the corresponding amino acid sequence (lower row).
  • FIG. 2 shows the DNA sequence encoding adw-type HBsAgP31 (upper) and the corresponding amino acid sequence (lower).
  • FIG. 3 shows a construction diagram of the plasmid PPH017-1, wherein symbols E, S, B, H and X represent EcoRI, Sa1I, BamHI, HindI and Xhol, respectively.
  • - Figure 4 shows the construction diagram of plasmid PPKT700-1, where the symbols E, S, B, H and X represent EcoRI, Sa1I, BamHI-, HindI and Xhor, respectively.
  • FIG. 5 shows the construction of 'plasmid PGLD906-1, where the symbols E, S, B, H and X represent EcoRI, Sail, BamHI, Malawi and Xol, respectively.
  • FIG. 6 shows the construction of the expression plasmid pTRP P31 R for adr-type HBsAgP31 for Escherichia coli, where the symbols £, B, C and P represent EcoRI, BamHI, Clal and Ps11, respectively.
  • Figure 7 shows the expression plasmid pTRP of adw-type HBsAgP31 for E. coli.
  • Fig. 8 shows the expression plasmid of adr-type HBsAgP31 for yeast pGLD P31 R, pPHO! ⁇ : ⁇ ? ! ⁇ P31—
  • the construction diagram of R is shown, where symbols E, B, S, H, X and C are EcoRI, BamHI, Sa1I, Represents Malawi, Xho I and CI al.
  • FIGS. 9 and 10 show construction diagrams of the expression plasmid pPHO P31 1W of adw-type HBsHgP31 for yeast, and the symbols, P, B, C, S and H are EcoHI, PstI, BamHI, C1aI, Sa1I and Hindl.
  • FIG. 11 shows the results of SDS-polyacrylamide slab gel electrophoresis in (1) and ( 2 ) described after Example 7.
  • E. coli plasmid containing a 7.9 kb DNA fragment containing the suppressive acid phosphatase gene (PH05) and the constitutive acid phosphatase gene (P ⁇ H03) derived from the yeast Saccharomyces cerevisiae S288C Natl. 'Acad. Sci. USA, 7_7, 6541 C 1980; Restriction enzyme 83111111 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) at j, 50 and Sail (restriction enzyme: 20 units) Takara Shuzo)
  • Plasmid DNA was isolated from the transformants selected using ampicillin resistance as an index by the above-described alkaline extraction method, and the molecular weight and the degradation pattern by restriction enzymes were examined.
  • pS Hi 9 0.63 kb isolated from pJAl
  • the plasmid pPHOl2 into which the DNA fragment was inserted was separated (see FIG. 3).
  • the DNA sequence was clarified by the Dideoxynuc leotide method [Sanger, JF, et al., Proc. Nat.l. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] (see FIG. 3). ⁇
  • DNA Polymerase I Large Fragment (New England Bio Labs) to a reaction solution of 30 liters !: 40 mM phosphate buffer solution (40 mM). pH 7.5, 6.6 mM MgC 2 , 1 mM 2-mercaptoethanol, 33 / ⁇ d ATP, 33 ⁇ dGTP, 33 ⁇ dTTP, 3 ⁇ dCTP) at 12 ° C for 30 minutes
  • the protein was deproteinized with phenol and DNA was precipitated with cold ethanol.
  • the DNA fragment (50 Ong) and the Sail linker phosphorylated under the above-mentioned conditions were added.
  • reaction solution! 1 OmM Tris-HCl (pH 7.5, 7 mM MgCl 2 , 175 mM NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol) 37.
  • Reference Example 1 1 OmM Tris-HCl (pH 7.5, 7 mM MgCl 2 , 175 mM NaCl, 7 mM 2-mercaptoethanol) 37.
  • the 2.1 kb!> NA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1.
  • the 2.1 kb DNA fragment 0.5 "and the Hindi-DNA of plasmid PBR322 were electrophoresed.
  • the mixture was mixed with 0.54% of 3.74 kb DNA obtained by digestion with Sal I, and bound by the action of T41) NA ligase under the conditions described in Reference Example 1.
  • E. coli using the reaction solution the DH 1 was transformed, it was obtained plasmid pPKTlOl you desired from the transformant of ampicillin resistance (see FIG. 4) 0
  • Sal I K ⁇ i ⁇ d ppPTKl 01 1 £ was added to 10 units of BAL31 nuclease at a reaction volume of 20 [2 OmM Tris-HCl C pH 8.1, 1 2 in CaCl 2 , 12 mM MgCl 2 , 1 mM EDTA] for 5 minutes at room temperature. Immediately, the reaction was stopped by adding 1 volume of phenol, and the DNA was precipitated with cold ethanol (BAL digestion).
  • pPTKlOl 50 g of the phosphorylated Xhol linker described in Reference Example 1 was mixed with 0.2 ⁇ l of BAL-digested pPTKlOl, and the action of ⁇ 4DN ligase was performed under the conditions described in Reference Example 1. Thereafter, Escherichia coli DH1 was transformed with the reaction solution, From the transformants showing ampicillin resistance, plasmid ⁇ 67 was obtained in which 0.69 kb was removed from the Sail site of pPKTlOl in the direction of the promoter region. Examination of the DNA sequence by the Dideoxynucleotide method proved that the action of BAL31 in PPKT 567 eliminated the PGK structural gene and up to the 5'-neighboring region-24 (see Fig. 4). :).
  • the plasmid pSHl9—1 DN A 15? Add 24 units of restriction enzyme Hindi to 10 After reacting at 37 ° C for 10 minutes in a reaction solution (1 OmM Tris-HCl (pH 7.5), 7 mM MgCl 2 , 6 OmM NaCl), add 0.2 M EDTA 10 ⁇ immediately to stop the reaction The reaction mixture was subjected to electrophoresis using 0.7% agarose slab gel under the conditions described in Reference Example 1, and an 8.3 kb DNA fragment that had been cleaved at one site with Hindi was used as a reference example.
  • Escherichia coli DH1 was transformed by the method described in 1 to obtain about 1200 tetracycline-resistant transformants, and the colony 'Hive! ; Strongly with die zero one sucrose emissions by 32 P-labeled probe Roh, it separates a transformant that I pre. Plasmid pGLD9 was isolated from this transformant by the above-described extraction method, and digested with Hindi.A 2.2 kb insert DNA was detected. Was found to hybridize with the probe (see Figure 5).
  • the DNA polymerase I large * fragment was applied to the 0.36 kb DNA fragment 1 under the conditions described in Reference Example 1, and the cohesive end of aq I was changed to a blunt end.
  • this fragment was mixed with 50 ng of the phosphorylated Xhol linker described in Reference Example 1 and bound by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in Reference Example 1. I let it. After the reaction, an excess amount of Xhol was added, and the mixture was allowed to act at 37 ° C for 4 hours.Then, under the conditions described in (1) of Reference Example 2, the phosphoric acid was bound using a Sepharose 4B A 6 kb DNA fragment was separated.
  • Hha I was allowed to act in 50 ⁇ £ of a reaction solution [10 mM Tris-HC1 (pH 7.5; 50 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol)] at 37 ° C for 2 hours. After that, the gel was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose-slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After the electrophoresis, a 0.75 kb DNA fragment was separated from the gel by the method described in Reference Example 1 (No. 5). See figure :).
  • the sample was subjected to electrophoresis using 1.0% agarose 'slab gel under the conditions described in Reference Example 1. After electrophoresis, the fractionated from the gel by the method described DNA fragment 8 .0 kb in Reference Example 1. ,
  • the binding rate of poly-HSA to cellulofine was about 73, and about 24 ⁇ poly-HSA-bound poly-HSA-cellulofine of about 40 m was obtained per 1 m £ of cell mouth fin.
  • This gel was suspended in PBS containing 0.1 M Etanoruamin, After shaking at room temperature for 3 hours was added a Na CNBH 3 20 0, gel was transferred onto a glass filter, P BS, 8 M urea solution, 6 M hydrochloric acid grayed Anijin Next, the column was washed sequentially with 25 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) and packed in a column having an inner diameter of 5 to produce a poly-HSA- 'cell mouth fine column.
  • Example 1 Construction of recombinant DNA molecule expressing adr-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and transformation of Escherichia coli with the DNA molecule
  • the plasmid pBR 322 -BamHI / HBr 33 ODNA (also abbreviated as pHBr 330) described in JP-A-59-74895 and Nucleic Acids Res. Ll, 1747 (1983;) ) was prepared by the method of Reference Example 1 described in JP-A-58-210796.
  • the sample was subjected to electrophoresis using a slab / slab gel under the conditions described in Reference Example 1.
  • reaction mixture of 2 ⁇ 9 of plasmid pBR322 DNA and 2 units of each restriction enzyme BamHI and C1al (New England BioLabs :) was added to the reaction mixture.
  • the above adapter 1 was chemically synthesized using the Triester method !: Crea, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5765 (1978)]. Using this reaction solution, Escherichia coli 294 was transformed, and a plasmid pHBr P31 DNA to which the above three types of DNA were bound was obtained from ampinulin-resistant transformants (see FIG. 6).
  • the DNA polymerase I large 'fragment was allowed to act on 50 ong of BamHI-digested pHBrP31 under the conditions described in Reference Example 1 to make the adhesive end blunt-ended and then deproteinized with phenol.
  • the DNA was precipitated with cold ethanol.
  • the DNA fragment .30 Ong and 5 Ong of a Pstl linker [1-Pd (GCTGCAGC)] (New England BioLabs) phosphorylated at the 5 'end by the method described in Reference Example 1
  • the binding was performed by the action of T4 DNA ligase under the conditions described in (1).
  • the reaction solution was used to transform E.
  • reaction solution 100 ⁇ ⁇ with 20 units of the restriction enzyme Clal and Pstl (Takara Shuzo) was added to the pHBrP 31-1750 in the reaction mixture !: 2 OmM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2, 5 0 mM (NH 4 ) 2 S0 4 ] after act 37 ° C, 3 hours in, the reaction solution was subjected to electrophoresis in. the conditions described in example 1 by using 1.0% Agarosu-slab Was. After electrophoresis, 1.42 kb DNA
  • the strain (Escherichia coli 294 / pTRP P31-R) was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-144355, and
  • Example 2 A set expressing the adw-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene
  • PBR—EcoRIZHBV933 DNA (abbreviated as pHBV933) was prepared by the method of Reference Example 1 described in JP-A-58-201796 ⁇ . 2 ⁇ 2 units of restriction enzyme Hpa
  • the DNA was precipitated with a filter.
  • the DNA 30 Ong and the phosphorylated Pstl
  • reaction solution was used to transform E. coli 294 strain.
  • the sample was subjected to electrophoresis using a slab gel under the conditions described in Reference Example 1.
  • the gel was separated from the gel by the method described above (see FIG. 7).
  • the gel was separated from the gel by the method described above (see FIG. 7).
  • the reaction solution was used to transform Escherichia coli strain 294, and the plasmid pTRP P31-W bound with the three DNAs was transformed from a tetracycline-resistant transformant by the method described in Reference Example 1. separated.
  • the E. coli strain harboring the plasmid pTRP P31-W2 (Esche-richia coli 294 / pTRP P31-W2) was deposited with the Fermentation Research Institute as IF0-144356, and It has been deposited with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FR.1) under the accession number F ERM P-710 from July 10, 1997.
  • Example 3 Construction of a recombinant DNA molecule for yeast expressing the adr-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene and transformation of yeast with the DNA molecule
  • OMPI The yeast host Saccharomyces cerevisiae AH22R— was transformed by the method of Hinnen et al. using pPHO P 31—; (See Fig. 8).
  • strain Sacharomyces cecevisiae AH22R-ZpPHO
  • transformants can be cultured by a usual method to obtain the desired P31.
  • Example 4 Expression of adw hepatitis B virus surface antigen P31 gene-construction of recombinant DNA molecule for yeast and transformation of yeast with said DNA molecule.
  • a 0.96 kb DNA fragment was separated from the gel by the universal method described in Reference Example 1 (see FIG. 9).
  • TATGTTACGTCACCTTAA 5 was bound by the action of T 4 DNA ligase under the conditions of Example 1 ⁇ -5 yourself mounting.
  • the reaction solution was used to transform Escherichia coli 294 strain, and plasmid pHBVP31 DNA to which the above three types of DNA were bound was obtained from an ampinulin-resistant transformant (see FIG. 9).
  • the DNA polymerase I large-fragment was allowed to act on the 0.98 kb DNA fragment of 2 ⁇ under the conditions described in Reference Example 1 to make the cohesive ends blunt, followed by deproteinization with phenol and cold ethanol. To precipitate the DNA.
  • the 0.9 8 kb DNA fragment Sal I linker [5 '- P- d (CGTCGACG) , Bethesda Research Inc.] was engaged sintering, to produce a cohesive end by Sail treatment , fractions containing a of 0.99 kb DNA fragment (DNA encoding adw type P 31) using a Sepharose 4 B power ram with cold ethanol to precipitate the DN a (see FIG. 9)
  • the strain (Saccharomyces cerevisiae AH22R-ZpPHOP31-W) was deposited with the Fermentation Research Institute as IFO-110136, and from September 4, 1984 Industrial Technology Research Institute (FR Deposit No. FERM P-782826 in I).
  • Plasmid containing the GLD promoter can also be constructed according to the method described above.
  • Example 5 Enzyme expressing the adw-type hepatitis B virus surface antigen P31 gene
  • a Sail linker was bound to the 0.98 kb DNA fragment according to the method described in (1) of Example 3, and cohesive ends were generated by Sail treatment.
  • the 0.99 kb DNA fragment was separated using a Sepharose 4B column.
  • This transformant can be cultured by a usual method to obtain the desired P31.
  • Each transformant containing the P31 gene expression plasmid obtained in Examples 1 and 2 was cultured in an M-9 medium containing 1.0 glucose and 1.0 casamino acid at 37 ° C for 6 hours. Was collected and washed with a buffer [30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA].
  • a buffer [30 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA].
  • Lysate consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 5 nm lysozyme
  • OMPI WIPO And lysed Guanidine hydrochloride was added to the lysate to a final concentration of 5 M, and the mixture was incubated at 0.37 ° C for 2 hours. The lysate was centrifuged at room temperature at 15,000 rpm for 15 minutes to obtain a supernatant. The P31 activity of this supernatant was measured by the direct immunoassay described above.
  • HBsAg 1 unit Expression in c Example 6 P 3 1 gene yeast is a count value of 125 I anti-HBsAg antibody of Osuria B one 125 the kit that binds to 1 ng of HBsAg small particles
  • Each yeast transformant containing the P31 gene expression plasmid obtained in Examples 3 and 4 was cultured in Burkiiolder and its low-phosphate medium at 30 ° C for 2 days, and the cells were collected. It was scrambled with saline.
  • the cells were cultured by the method described in Example 6, and the cryopreserved cells of Escherichia coli 294 / pTRP P 31 -R obtained by freezing at 100 ° C. were added to 100 mM.
  • the suspension was uniformly suspended in 200 ⁇ of a buffer solution (pH 7.5) containing EDTA and 25 mM sodium phosphate. To this suspension was added 696 methyl fluoridesulfonyl fluoride and 100 lysozyme, and the mixture was heated at 37 ° C for 15 minutes. mM sodium phosphate buffer
  • the substantially pure P31 protein (adr type) produced by the above method had the following properties.
  • (1) Unity The substantially pure P31 protein (adr type) produced by the above method had the following properties.
  • the molecular weight of the P31 protein was calculated to be about 32,000 daltons from SDS-polyacrylamide slab gel electrophoresis (see FIG. 11).
  • P31 protein 20 was added to a glass hydrolysis test tube, and constant boiling boiling hydrochloric acid containing 4% thioglycolic acid was added.Then, the tube was sealed under reduced pressure. Hydrolysis was carried out for 72 and 96 hours. After hydrolysis, the tube was opened, hydrochloric acid was removed under reduced pressure, the residue was dissolved in 0.02 N hydrochloric acid, and amino acid analysis was performed using a Hitachi 8335 amino acid analyzer. Cystine and cysteine were subjected to the formic acid oxidation of the P31 protein according to Haas' method C Methods in Enzymol, 11, 1997 (19667), and then subjected to reduced pressure at constant boiling point in hydrochloric acid.
  • the N-terminal amino acid sequence is analyzed by applying an automated edman degradation method using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems, Inc., Model 470 ⁇ , Ameri force) to 62 ⁇ l of P31 protein. did. Futurylthiohydantoin amino acids (PTH-amino acids) were identified by high performance liquid chromatography using a Micropack SP-ODS column (Varian, America). Table 5 shows the PTH-amino acids detected in each step.
  • Test tube for decomposition glass hydrazine after sealed under vacuum by adding heat de anhydrous gin 0.1 ⁇ , between 6 beta heated at 1 0 0 ° C I did.
  • the resulting hydrazine hydrolyzate was freeze-dried and then dissolved in distilled water. Benzaldehyde was added to this solution, stirred at room temperature for 1 hour, and centrifuged to obtain a supernatant.
  • the supernatant was lyophilized and subjected to amino acid analysis using a Hitachi 8335 amino acid analyzer. As a result, 4. 7 n mole of isoleucine was detected.
  • the cells of Escherichia coli 294 / pTRP P 31-W2 obtained by culturing according to the method described in Example 6 are also substantially purified by the same method as described above.
  • P31 protein (adw type) can be produced.
  • the HBsAg P31 protein produced is useful as a pectin, useful for diagnosis of HBV and prevention of HBV infection.

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Description

明 細 書
新規な蛋白質の製造法 技術分野
本発明は新規な蛋白質の製造法に関する。 さらに詳しくは遺伝子組み 換え技術による B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1蛋白質の製造法に関す
。
背景技術
B型肝炎は、 特に熱帯アフ リ カ、 東南アジアおよび極東において多発 するウィ ルス性疾患であり、 慢性肝炎や肝硬変、 さらには原発性肝ガン の原因にもなることが疫学的に示唆されている。 病因は、 DNAウィ ル スの 1種である B型肝炎ゥィルス （： Hepatitis B virus;以下、 HBV と略称する )で、 それは直径 42 nmの球状粒子で発見者の名を冠して デン（ Dane 粒子と呼ばれる。 その外層には、 HBV表面抗原（以下、
HB s A gと略称する があり、 その抗原性の違いによって adr,adw, ayr.ay などのサブタイプに分けられているが、 日本で.見いだされる
のは adw型および adr型である。
B型肝炎患者の血中には、. デン粒子のほかに小型粒子や管状粒子が検 出され、 これらの粒子にはデン粒子と同じ型の HBs Agが認められてい る。 ウイルスの表在性抗原に対する抗体がそのウイルスの感染を防御す ることは他のゥィルスでも知られており、 HB Vの場合にも HBsAgを もとに B型肝炎に対するワクチンの製造が考えられる。 ところ力 t、 HB
Vはヒトゃチンパンジーにしか感染せず、 培養細胞への感染の試みは成 功していない。 そのため HBsAgはヒ ト感染者血中からの入手に限定さ れており、 得られた小型粒子などは診断用試薬の材料としての需要を満
/ M= \ - ^〇
' たしても、 ワクチンの大量の製造のためには不十分 状態である。
分子生物学の最近の進歩により非細菌性の蛋白質をコードする DNA を細菌に導入し、 形質転換させることが可能になってきだ。 この遺伝子 組み換えの技術を応用し、 HBsAg構造遺伝子（以下、 HBsAg遺伝子 と略称する：）を細菌内で発現させることができれば、 HBV感染の危険 性のない HBsAgを大量に調製することが可能になり、 B型肝炎ワクチ ンの実用化への道が開かれる。
現在知られている 4種のサブタィプすなわち adw, adr, ayw, ayrの うち、 欧米に多い ayw型については HBsAg遺伝子の存在部位およびそ の塩基配列が決定され〔 Galibert , F. ら， Nature, 281, 646
1979)； Charnay , P. ら， Nucleic Acids Res.', 7， 335 1979； 〕 ，雑種蛋白質として大腸菌内での発現が報告されている〔 Charnay, P. ら , Nature, 286, 893C 1980；； Edman, J. C. ら , Nature,
Figure imgf000004_0001
また、 日本で多く見出されている adw型および adr型については、 本 発明者らの一部は HBsAg遺伝子を含む DN Aの創製に成功し、 当該遺 伝子の DN A塩基配列ならびにゲノム上の位置を決定し、 さらにこの組 み換え ϋΝΑを含有する形質転換体を培養して HBsAgを大量生産する 途を開いた（特開昭 5 8 - 1 9 4 8 9 7号公報，特開昭 5 8 - 2 0 1 7 9 6号公報 ,特開昭 5 9 - 7 4 9 8 5号公報 )。
最近、 Machida, A. b C Grastroenterology,8_5, 268(1983 )； 1^1 誌， 8 6 , 9 1 0 ( 1 9 8 4 ) ] によって示されたように、 B型肝炎ク ィルス e抗原陽性の患者血漿から得られた HBsAg小型粒子中には、 従 来同定されていた P— I (分子量 2 2〜 2 4キロ ' ダルト ン ） ， P— Π (分子量 2 5〜 2 9.5キロ · ダルト ン ） どの主耍ぺプチドに加えて 〔 Peterson, D. L.ら， P roc. Natl . Acad. Sc i. U S A , 7 4 , 1 5 3 0 ( 1 9 7 7 )〕 ， P 3 1蛋白質（分子量 3 1 キロ ' ダルトン ）と P 3 5蛋白質（ P 3 1に糖が結合した複合蛋白で分子量3 5キ口 · ダルトン )が存在していることが証明された。 P 3 1は P— Iの N末端に pre― S領域の 5 5個のアミノ酸残基が付加したもので、 この領域中に重合ヒ ト血清アルブミン （ poly— H S A )の受容体が存在していることも明ら かにされている。 さらに上記 1 9 8 4年の報告で、 上記 P— 3 1蛋白質 が糖鎖を有することも明らかにされている。—方、 肝細胞表面にもこの 受容体があることから、 poly— H SAを介してデン粒子が肝細胞に付着 し増殖がおこると考えられている。 従って、 デン粒子上の pol y— H S A受容体が: P 3 1に対する抗体でマスクされれば、 該粒子は肝細胞と結 合できなくなり H B V感染がより有効に予防できると期待されている。
発明の開示
本発明は B型肝炎ウ ィルス表面抗原 P 3 1をコードする塩基配列を有 する D N Aを含有する形質転換体を培養し、 培養物中に B型肝炎ウィル ス表面抗原 P 3 1を生成蓄積せしめ、 得られる該 P 3 1含有液をァフィ 二テイク口マトグラフィ一処理を含む精製工程で精製することを特徴と する B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1蛋白質の製造法を提供十るもので ¾>る。
'- tr 、 ipo 本発明で用いられる B型肝炎ゥィルス表面抗原 P 3 1をコ一ドする D
N Aはいずれのサブタイプ（ adr ,adw, ayr , ayw )のものであっても よく， たとえばそれらは下記の方法によって調製することができる。
特開昭 5 8 - 1 9 4 8 9 7号公報あるいは Nucleic Acids Res., 11, 1747 (1983 )に記載されている 3.2 kb の adw型 HBVDNAが 組み込まれたプラスミ ド PBR322— EcoHIZHBV933 ( pHBV933 と略称：）を制限酵素 Hpal と ficoRIで 2重消化すると、 pre— S領 域の一部を含む 9 6 1 bpの DNA断片を得ることができる。 この断片 に〔 341 ^ TTAA5,〕の配列を含む適当なアダプタ—を結合 させることによって P 3 1をコ一ドする DN Aを作製することができる。 まだ、 特開昭 5 9 - 7 4 9 85号公報または Nuc 1 e i c Acids Res., 11 , 17 47 ( 1983； に記載されている 3.19 kbの adr型 HBVDN Aが組み込まれだプラス ミ ド p B R322— B amH I/HB r 330 ( pHB r 3 3 0と略称）を、 制限酵素 EcoRIと BamHIで 2重消化すると、 pre— S領域の一部を含む 1 39 8 b pの D N A断片を得ることができ る。 この断片に上記のアダプタ一を結合させることによって P 3 1をコ ―ドする DNAを調製す'ることができる。
adw型 HBsAgP 3 1をコ一ドする DN Aとしては第 1図に示される DN A配列のうち、 塩基配列順序 2 8〜87 3で示される. DN Aが、 adr型 HBsAg P 3 1をコ一ドする DNAとしては第 2図で示される D N A配列のうち、 塩基配列順序 1 0〜8 5 5で示される ϋΝ Aがあげら れる。
また、 P 3 1をコードする DNAはウ ィ ルス由来のものでも、 化学合 成したものでもよい。
ayr型および ayw型 HJSsAg P 3 1をコードする D N Aも上記した方
OMPI
W " 法に準じて調製すること力 :、できる。
この P 3 1をコ一ドする DN'Aを各種宿主（例、 大腸菌，枯草菌，酵 母，動物細胞 )で機能するプロモータ一領域の 3， 末端に揷入すること により、 ： P 3 1をコードする DN Aを発現させうる組み換え DN Aを構 築することができる。
プロモータ一領域は、 RNAポリメラ一ゼが結合することによって mRNA合成を開始させるのに必要な部位を含む領域であれば、 いかな るものであってもよい。
たとえば大腸菌を宿主として用いる場合、 P 3 1をコードする DNA を大腸菌で機能しうるプロモータ一領域の 3， 末端に挿入すれば、 P31 をコ一ドする DNAを発現しうる組み換え DNAカ 築できる。 たとえ ば、 特開昭 5 8— 2 0 1 7 9 6号公報に記載の発現用べクタ一 P TRP- 601 , PTRP771などに、 P 3 1をコードする DNAを T 4 DNAリ ガーゼの作用により揷入する。 この反応液を用いて、' 大腸菌（例、
C 6 0 0株， 2 9 4株， W3 1 1 0株， RR l株， PR 1 3株など：）を 公知の方法〔 Cohen,S.N.ら ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)〕もしくはそれに準ずる方法によって形質転換する。
使用するプロモータ—は、 trpプロモ一タ一（ trp— p )に限定する 必要はなく、 たとえば recAプロモータ一〔特開昭 59— 65099号〕 ， lacプロモータ一，； IPしプロモータ一などを使用してもよい。
上記のようにして得られた P 3 1をコ一ドする DN Aを含む新規な組 み換えプラスミド DN Aを保持する形質転換体は、 たとえばアンピンリ ン耐性，テトラサイクリン耐性あるいはこれら両薬剤耐性を表現形とし て選ぶことができる。 なお、 2 94株は公知の菌〔 Backman,K.ら ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 73 , 4174C 1974 )：!であり財団法人
Ο，ΜΡΙ 発酵研究所（ Institute for Fermentation, Osaka )〕 ( I PO と略 "ることもある：）に、 I F 0— 1 4 1 7 1として寄託もされてい る。 これらの耐性株の中から P 3 1をコードする DNAを含有する新規 な組み換えプラス ミ ド DN Aを保持する菌株を探し出すには、 たとえば 次の手法が用いられる。 前述したアダプターの一方の鎖， 5AATTCC ACTGCATTGTAT3' を T 4ポリ ヌク レオチド ·キナーゼによって r _32p_AT P を用いて放射性同位^^で標識し、 これを探釺（ プ ローブ:） として、 それ自体公知のコロニー 'ハイブリダイゼー^ヨン法 〔 Grun stein, M. and Hogness, D. S.， Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 1 , 3961( 1975 )〕 によって、 すでに得た薬剤耐性の形質転換体の 中から陽性を示すクローンを確実に探し出すことができる。
このようにして選択された形質転換体をそれ自体公知の培地で培養す る。 培地としては、 例えば Lブロス ，ペナセィ （ Penassay ：)ブロスお よびグルコース， 力ザ' ミノ酸を含む M— 9培地〔Mi'ller, J., Experi— ments in Molecular Genetics, 431—433 ( Cold Spring
Harbor Laboratory, New York, 1972〕〕 力 ^挙げられる。 ここに、 必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 たとえば 3 一ィ ンド リルァク リル酸のような薬剤を加えることができる。
該形質転換体の培養は通常 1 5〜43°C ，好ましくは 2.8° ( 〜 4 0¾ で 2〜 2 4時間，好ましくは 4〜1 6時間行い、 必 により通気や攪拌 を加えることもできる。
宿主として、 たとえば酵母を利用するときには、 酵母形質転換体を次 のように «することができる。 ：^菌一酵母シャ卜ル ·ベクタ一 YE pi 3 〔Broach,J.R. ら， Gene， ， 121 ( 1979 )〕 , pSHl5と pSHl 9〔Harashima, S.ら， Moし CeU.Biol., 4 , 771 ( 1984)〕 に、 酵母プロモータ一領域，たとえば抑制性酸性ホスファターゼ遺伝子 プロモータ一領域〔 Meyhack'B.ら， EMBOJ. , 6., 675( 1982；] , グリセルアルデヒ ド 3—リン酸デヒ ドロゲナ一ゼ遺伝子のプロモータ —領域〔 Hoi land, J. P. and Holland,M. J., J. Bi ol. Chem, 2_55 , 2596 ( 1980〕 〕 ，あるいは 3—ホスホグリセ口 リン酸キナーゼ遺伝 子のプロモータ一領域〔 Dobson.M. J. ら , Nucleic Acids Res., 10 , 2625C 1982；： を挿入したのち、 その直後に Ρ 3 1をコードす る DNAを T 4DNAリガーゼの作用によって結合させる。 この反応液 を用いて、 前述の宿主大腸菌を前述の Cohenらの方法によって形質転換 する。 このようにして得られた P 3 1をコードする DNAを含む新規な 組み換え DN Aを保持する形質転換体は、 たとえばアンピシ リ ン耐 を 表現型として選ぶことができる。 この耐性株の中から P 3 1をコードす る D N Aをもつ新規な組み換えプラスミ ド D N Aを保持する菌株を探し 出すには、 前述の方法が同様に用いられる。 ·
このようにして選択された形質転換体からプラスミ ド DNAをアル力 リ抽出法〔 Birnboim,H. C. and Doly， J., Nucleic Acids Res., , ·1.513( 1979)〕によって単離し、 これを用いて酵母、 たとえば口 ィシン要求性のサッカロ ミセス · セレビシェ（ Saccharomyces cer evi siae , たとえ fま AH 2 2 R~ ( leu 2 his 4 can l cir + pho80)〔Proc. Natl. Acad Sci. USA 8_0 , 1 ( 1983) J あるいは AH 2 2 R— より誘導された K 3 3 - 7 B C pho.80-AH22 , pho8— 2：)または K 3 3 — 8 D ( pho80-AH22, pho8-2 trpi を、 公 知の方法〔 Hinnen'A. ら， Proc. Nat 1 · Acad. Sc i . USA , 75 , 1927 ( 1978)〕またはそれに準ずる方法によって形質転換す'る。 璋 '主としての酵母はこれらに限定されることはない力' サッカロミ セス .
Ο ΡΙ WIP _ セレビ ΐ ェが好ましレ、o
なお、 Saccharomyces cerevisiae AH22 R~ は財団法人発酵研 究所に I FO— 1 0 1 3 4として寄託され、 また、 昭和 5 9年 9月 4 日から工業技術院微生物工業技術研究所 (： FR I )に受託番号 F E RM P— 78 2 4として寄託されている。
得られた酵母の形質転換体は、 それ自体公知の培地で培養する。 培地 としては、 だとえば Burkhoider 最小培地!： Bos ti an, Κ· L. ら ，
Proc.Nat 1. Acad. Sci. USA , _ , 4505 ( 1980；：力 ^挙げられる。 酵母の形質転換体の培養は通常 1 5°C〜4 0¾ ，好ましくは 2 4° (〜
3 7 で 1 0〜 9 6時間，好ましくは 2 4〜7 2時間行い、 必要により 通気や攪拌を加えることもできる。
宿主として、 だとえば枯草菌，動物細胞を使用する場合にお'いては枯 草菌，動物細胞で機能しうるプロモーター領域の 3' 末端に P 3 1をコ ードする DN Aを挿入し、 自体^ Πの方法により、 該組み換え DN Aで 宿主を形質転換させ、 形質転換体を培養することにより、 P 3 1を製造 することができる力;、 宿主としては: «菌，酵母がより好ましい。
生成される P 3 1はグリコシル化されていても、 また、 グリコシル化 されていなくてもよい。
一般に、 HBsAgD N Aを含有する形質転換体は表面抗原遺伝子産物 の産生により、 形質転換体自体の生育が阻害されることが知られている 力 本発明によれば P 3 1をコードする DN Aを用いると生育阻害が解 除され、 P 3 1の産生量が増大する。
^物の: P 3 1活性は、 だとえば試料をブ cfムシアンで活性化された セルロース ·ぺ一パーに結合させたのち、 オースリア H— 1 2 5 ( ダイ ナボッ卜社製：）の125 Iー抗 HBsAg抗体と反応させる direct 、- ".·'ίΡΟ~^ immunoas say法〔 Fuj isawa ,Y.ら, Nuc lei c Ac i ds Res. , 1 1 ,
3 5 8 1 ( 1 9 8 3 )〕 によって測定することができる。
培養後、 公知の方法で菌体を集め、 大腸菌の形質転換体の場合には菌 体を尿素， 塩酸グァニジン どの蛋白変性剤を含む緩衝液に懸濁し、 冷 所で攪拌したのち、 遠心分離によ P 3 1を含む上澄液を得る方法、 あ るいは緩衝液に懸濁し、 超音波処理、 リゾチームおよび（または）凍結 融解によって菌体を破壌したのち、 遠心分離によ P 3 1を含む上澄液 を得る方法などが適宜用い得るが、 例えば菌体を集めて緩衝液に懸濁し、 リゾチームを加えてホモジナイズして溶菌後、 尿素（ 3〜 1 0 M )を含 む緩衝液を加え攪拌（ ひ〜 1 0 で0. 5〜8時間）後、 遠心分離して上 澄を得る方法力;好ましい。
酵母の形質転換体の場合にはザィモリエース 〔キリンビール㈱製〕 あ るいはガラスビースなどによる機械的破壌によつて菌体を破壊する。 こ こへ、 トリ ト ン X— 1 0 0， デォキシコーレートなどの界面活性剤， あ るいは塩酸グァニジン どの蛋白変性剤を加えることによって P 3 1を より有利に抽出することができる。
上記抽出液からの P 3 I蛋白質の分離， 精製は、 ァフィ二ティーク口 マトグラフィ一処理を含む精製工程により行われる。
ァフィ二ティーク口マトグラフィ一として、 重合ヒ ト血清アルブミン （ poly -H S A )をリガン ドとするァフィ二ティークロマトク'ラフィ一や H BsAgに対する抗体、 と わけモノクローナル抗体を用いる抗体力ラム 処理が挙げられる。
po ly-H S Aをリガンドとするァフィニティークロマトグラフィ ーは
P 3 1蛋白質の精製に極めて有利に用いられる。
ァフィ 二ティークロマトク'ラフィ一の担体としてフオノレミ ノレセノレ口フ
ΟΜΡΙ ァイ ン（生化学工業）， ァフ ィ ゲル一 1 5 (パイオラ ッド社）などが用 いられ、 と わけフオルミルセル口ファイ ンが好ましい。
po ly-H S Aはヒト血清アルブミンを架橋剤（例えばグルダルアルデ ヒド）を用いて重合することによ 製造できる。 これを上記担体に、 例 えば還元剤（ NaCNBH3¾ど）を用いて結合させ、 所望により洗浄し担体 と poly— H S Aの結合物を得て、 これを通常カラムに詰めて^ ¾用する。
P 3 1蛋白質を poly—H S Aをリガンドとするアブイ二ティ一クロマト グラフィ一によ 精製するには、 前記 P 3 1含有溶液（菌体抽出上澄） を、 緩衝液 〔リン酸緩衝液など〕 で平衡化した上記カラムに吸着させ、 緩衝液で溶出する。 該緩衝液には界面活性剤（ Tween 2 0など）または 蛋白変性剤（尿素） どを適量加えて使用でき、 これら添加物の種類や 濃度を組合せ、 適切 溶出液として用いることができる。
P 3 1蛋白質を含む溶出固分を集め、 所望によ ]9限外 ^過等により濃 縮する。
上記濃縮液は、 望ましくはジチオスレィ トールなど S H試薬を用いて 還元した後、 さらに逆相カラムを用いる高速液体ク Dマトグラフィ一ま たはハイ ドロホービッククロマトグラフィ 一等の疎水性力ラムを用いる クロマトグラフィ一処理に付すことが好ましい。
上記高速液体クロマトグラフィ一用の担体としては、 アルキル（ d— 18程度）化ケィ素のもの、 例えば A P— 2 0 2 3 0 0 A ( Cs ) ( Y
Μ C島久）， クルトラポア R Ρ S C (ベックマン社）， ハイポア R Ρ 3 0 4 (バイ オラッ ド社）などが挙げられ、 と わけ A Ρ— 2 0 2 3 0 0 A ( C 8 ) が有利に使用される。
またハイ ドロホービッククロマトグラフィ一用の担体としてはアルキ ル（ d -18 程度）化された担体、 例えばブチルト ョパール（東洋曹達
O PI
レ W1PO 工業）， ォクチルセファ ロース （ フアルマシア社）などが挙げられる。
とりわけ逆相力ラムを用いる高速液体ク口マトグラフィ一が有利に用い られる。
上記逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィ一は、 例えば溶出 溶媒として、 水， d— 6の低級アル力ノール（エタノール， プ σパノー ル ど）， ァセトニト リル ¾どをトリフルォロ酢酸等によ ρΗ 1. 2〜 5. 0に調整して用いるのが好ましく、 溶出速度は 0. 1〜1 0 O ^Zmiru 好ましくは 0. 5〜 3 0 ^Zminであることが好ましい。
得られる P 3 1蛋白質を含有する画分は、 所望によ 凍結乾燥に付し、 白色粉末とすることができる。
かくして生成される P 3 1蛋白質の純度の測定（比活性 )には、 例え ば試料を poly— H S Aをコートしたブラスチックブレートと反応させた のち、 poly— H SAに結合した P 3 1蛋白質をホースラディ ッシュ パ 一ォキシダーゼ（ H R P )を結合した抗 HBsAg モノクロ一ナル抗体を 用いて検出するェンザィムィムノアッセィ （ E L I S A)法あるいは poly - H SAに結合した P 3 1蛋白質をオースリァ Π— 1 2 5 (ダイナポッ ト社製， アメ リカ ）の1251—抗 HBsAg抗体を用いて検出するラジオィ ムノアツセィ （ R I A )法を用いることができる。
本発明の製造法によれば、 医薬等として使用しうる高度に精製された 実質的に純粋な P 3 1蛋白質を得ることができる。
例えば、 HBsAg P 3 1をコードする塩基配列を有する D N Aを含有 する大腸菌で産生した P 3 1を本発明の方法によ 精製するこ'とにより 下記の性状を有する実質的に純粋 ¾ HBsAg P 3 1蛋白質を得ることが できる。
(1) S D S -ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動で均一であり、 これ
O PI による分子量測定値（還元条件下）は3 2， 0 0 0 ± 1, 0 0 0 ダルトン て ¾)る。
(2) ァ ミノ末端:アミノ酸としてメチォニン（もしくはそのホルミル体） またはグルタ ミンを有する。
(3) カルボキシ末端アミノ酸としてイ ソ イ シンを有する。
(4) poly— H S Aと結合する。
(5) 1 X 1 0 6 ュニット /^以上の比活性を有する。
本発明の方法によ 製造される実質的に純粋 P 3 1蛋白質は、 公知 の H B V感染者の血液を原料に製造された H BsAg小型粒子と同様の生 物活性を有し、 該 HBsAg小型粒子と同様にして H B Vの診断や予防、 治療のためのワクチンとして用いることができる。
本願明細書において蛋白質純度決定のための P 3 1蛋白質の活性の.（ 比活性）測定は ELI SA法で行った。 即ち、 参考例4の①で得た poly 一 H S Aをあらかじめ物理吸着させたィ ムノプレー ト Π (ヌンク社製） に被検液 ( P 3 1蛋白質含有溶液） 1 0 0 を入れ4。 Cで 1晚反応さ せた。 ついでプレートを 5 %クシ血清および 0. 0 5 % T een 2 0を含む P B Sで洗ったのち、 ホースラディ ッシュ . パーォキシダーゼを結合し た抗 HBsAg モノクローナル抗体溶液 1 0 0 をプレー トの各穴に加 え 3 7 °Cで 2時間反応させた。 プレートを再度、 上記緩衝液で洗ったの ち 0 —フヱ二レンジアミン （ 0 mi )および過酸化水素水（ 4> μ£ / I O id )を含むクェン酸一リン酸緩衝液（ pH 5. 0 ) 1 0 0 を加え 室温で 3 0分間反応させた。 2 Ν硫酸 5 0 を加え酵素反応を停止した のちタイターテツクマルチスキャン M Cを用いて 4 9 2 nmにおける吸 光度を測定した。 定量は実施例 7で得た精製標品を標準品として用い、 標準品 1 の与える吸光度の値（ 0. 0 5 0 . D. )を 1ユニットとした 3 - ときのュニット数として算出した。
なお、 本願明細書および図面において、 塩基やアミノ酸るどを略号で 衣示する場合、 IUPAC- I UB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるには当談分野における慣用略号に基づく ものであ i?、 その例を次に挙げる。 またアミノ酸に関し光学異性体があ うる場合は、 特に明示し ¾ければ L一体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
RN A リボ核酸
m RNA メッセンジャー R NA
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ ト シン
d AT P デォキシアデノシン三リン酸
d TTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
d C T P デォキ i シチジン三リン酸
A P アデノシン三リン酸
E DTA エチレンジァ ミ ン四酢酸
S DS ドデシル硫酸ナ卜 リ ウム
DTT ジチオスレィ トーノレ G l y グリシン A 1 a ァラニン V a 1 ノくリ ン L e u イ Vソ l i e ィ ソロイ シン S e r セ リ ン T h r スレ才ニン C y s システィン 1/2 Cys ハーフシスチン
Me t メチォニン
G 1 u グルタ ミン酸
A s p ァスパラギン酸
L y s リ ジン A r g アルギニン H i s ヒスチジン P h e つェニルァラニン T y r チロシン . T r p ト リプ卜 ファン
P r o プロリ ン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタ ミン Apr アンピシ リ ン耐性遺伝子
Tcr テトラサイ クリ ン耐性遺伝子
PR λΡη プロモーター ars 1 オー ト ノマス ' レプリ ケ一シヨン · シークェンス
C PI ' (autonomous replication sequence l )
I R ィ ン ノく一テツド · リピー ト (inverted repeat )
図面の簡単な説明
第 1図は adr型 HBsAgP 3 1をコ一ドする DN A配列 (：上段）およ び対応するアミノ酸配列（下段 )を示す。
第 2図は adw型 HBsAgP 3 1をコードする D N A配列（上段〕およ び対応するァミノ ¾列（下段 )を示す。
第 3図はプラスミ ド PPH017— 1の構築図を示し、 記号 E , S ， B , Hおよび Xはそれぞれ Ec oRI , S a 1 I , BamHI , Hi n d Iおよび Xholを表わす。 - 第 4図はプラスミド PPKT700— 1の構築図を示し、 記号 E ， S , B , Hおよび Xはそれぞれ EcoRI , Sa 1 I , BamHI-, Hi n d I および Xhorを表わす。
第 5図は'プラスミ ド PGLD906— 1の構築図を示し、 記号 E , S , B , Hおよび Xはそれぞれ EcoRI, Sai l, BamHI , Hindu および X olを表わす。
第 6図は大腸菌用 adr型 HBsAgP 3 1の発現プラスミ ド pTRP P 3 1一 Rの構築図を示し、 記号 £ , B , Cおよび Pはそれぞれ Eco RI , BamHI， Clalおよび Ps 11を表わす。
第 7図は大腸菌用 adw型 HBsAgP 3 1の発現プラスミ ド pTRP
P 3 1一 W 2の構築図を示し、 記号 £ , B , Cおよび Pはそれぞれ Eco RI , BamHI , Clalおよび Pst Iを表わす。
第 8図は酵母用 adr型 HBsAgP 3 1の発現プラス ミド pGLD P31 一 R , pPHO ！^丄ー：^ぉょび ？!^^ P31— Rの構築図を示し、 記 号 E , B , S , H , Xおよび Cはそれぞれ EcoRI , BamHI , Sa 1 I , Hindu, Xho Iおよび CI alを表わす。
第 9および 1 0図は酵母用 adw型 HBsHgP 3 1の発現プラスミ ド pPHO P 3 1 一 Wの構築図を示し、 記号 ， P , B , C ， Sおよび H はそれぞれ E co HI , Pst I , BamHI , C 1 a I , S a 1 Iおよび Hi ndl を表わす。
第 1 1図は実施例 7の後に記載した (1), (2)における S D S—ポリアク リルァミ ドスラブゲル電気泳動の結果を示す。
発明を実施するだめの最良の形態
参考例 1 酵母抑制性酸性ホスファタ一ゼ ' プロモータ一（ΡΗΟδ— P)
を含有する発現用ベクターの作製
酵母 Saccharomyces cerevisiae S 2 8 8 C 株由来の抑制性酸性ホ スファターゼ遺伝子（PH05)と構成性酸性ホスファタ一ゼ遺伝子（ P ■ H03 )を含む 7.9 k b DNA断片を含む大腸菌プラスミ ド（pJAl) 〔 Kramer ,R. A. and Anderson , N, Proc. Natl. 'Acad. Sci. USA， 7_7 , 6541 C 1980 ; j , 5 0 に2 0ュニットの制限酵素83111111 〔宝酒造㈱製〕と 2 0ュニッ卜の制限酵素 Sail 〔宝酒造㈱製〕を
I 0 0 £ の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl (ρΗ 8.0 , 7 mM Mg C 12 , 1 0 0 mM NaCl , 2 mM 2 —メルカプトエタノール〕中で 3 7 *C , 3時間作用させた後、 1.0 %ァガロース（ Sigma 社製） 'スラブ ゲルを用いて緩衝液〔 1 0 OmM Tris-HC 1 , 1 0 OmM ホウ酸， 2 mM EDT A ( ρΗ 8.3 ) 〕中.， 1 4 0 V， 2時間電気泳動にかけた。 泳動後、 0.6 3 kb DNA断片を含むゲル片を透析チューブ内に封入し、 泳動用緩衝液内に沈め、 該 DN A断片をゲルから電気的に溶出した C DcDonell,M.W. ら ， J.Mol.Biol, H Q , 1 19 ( 1977 )〕。 透析チ ュ一ブ内液をフエノール抽出さらにエーテル抽出した後'、 NaClを 0.2 Mになるように加え、 つづいて 2倍量の冷エタノールを加えて一 2 0°C で DN Aを沈澱させた。
1 のプラス ミ ド pSHl 9 に 2ユニッ トの制限酵素 BamHIと 2 ュニッ 卜の制限酵素 Sal Iを 2 0 の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 8.0 , 7 mM MgCl„ , 1 0 0 mM NaCl , 2 mM 2—メルカプ 卜エタノール〕中で3 7°C , 2 作用させた後、 該反応液を 0.8%ァ ガロース ·スラブゲルを用いて上述の条件下で電気泳動にかけだ。 泳動 後、 8.0 kb DNA断片を上述の方法によってゲルから分取し、 フエノ —ルで除蛋白し、 冷エタノ一ルで DN Aを沈澱させた（第 3図参照：)。 該 8.0 kb DNA断片 4 0 0 n gと前記 0.6 3 kb DNA断片 2 0 0 n とを混合し、 2 0 ^ の反応液!： 6 6 mM Tris-HCl ( pH 7.6 , 6.6 mM MgCl 2 , 1 OmMジチォスレイ 卜 ール ， lmM AT P ， 2ュニ ッ 卜の T4 DNAリガ一ゼ（宝酒造㈱製） 〕中、 1 4°Cで一夜作用させ て DN Aを結合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を前記
Cohen らの方法に従って形質転換しだ。 アンピシリ ン耐性を指標とし て選択された形質転換体の中から、 プラスミ ド DNAを前記アルカリ抽 出法によって単離し、 分子量と制限酵素による分解パターンを調べ、 pS Hi 9の BamHI— Sail部位に、 pJAl から単離された 0.6 3 kb
DNA断 i ^揷入されたプラスミ ド pPHOl 2を分離した（第 3図参照)。
3 μ 9 のプラスミ ド pJPHOl 2 DNAに 2ュニットの制限酵素 Sal I を 2 0 ^ の反応液に 1 0 mMTris—HCl(pH 7.5 ), 7mMMgC 12 , 1 7 5 mM NaC 1 , 0.2 M E D T A , 7 mM 2—メルカプ卜エタノー ル 〕中で 3 7¾ , 2時間作用させた後、 フエメールで除蛋白し、 冷エタ ノールで DNAを沈澱させた。 この DNA， 3/ί 9 に 1 2ユニッ トの
B A L 3 1ヌク レア一ゼ（ Bethesda Research Laboratories社製 )を
OMPI 1 5 0μ£ の反応液〔 2 0 mM Tr is-HC 1 ( pH 8.1 ) , 1 2 mM Ca Cl2， 1 2 mM MgCl2 , 1 mM EDTA〕中で 3 0 °C , 2分間作用さ せた後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノールで DNAを沈澱させた
(第 3図参照）。
2 0 Ong の Xhol リンカ一 d ( CC TCGAGG； [New England
BioLabs 社製〕に 3ユニッ トの T 4ポリヌク レオチド · キナーゼ〔宝 酒造㈱製〕を 5 0 の反応液！： 5 OmM Tris-HCl(pH 7.6 ) , 1 OmM MgCl2， 1 0 mM 2 一メルカプトエタノ一ル , 1 0 0 μ Ιί ΑΤΡ〕中で 3 7°C , 1時間作用させて、 5'末端をリン酸化しだ。.
40ngの 5'末端がリン酸化された Xhol リ ンカ一〔 5し P— d ( CC
TCGAGG; 〕と 4 0 0 ngの前述の BAL— 31で処理された pPHO 1 2 DNAとを混合し、 前述の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用で結 合させた。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を Cohen らの方法に従 つて形質転換した。 アンピシリ ン耐性を指標として選択された形質転換 体の中から、 プラスミ ド！) NAを前記アルカリ抽出法によって単離し、 BamHI と Xhol による 2重消化物の大きさが 0.5 5 kb であるプラス ミ ド pPHO 17を選択した。 BAL— 3 1ヌクレア〜ゼ処理によって、 PHO 5 の開始コドン ATGの上流 2 Ob p が除去されだことが、
Dideoxynuc leoti de 法「 Sanger，JF, ら , Proc.Nat.l .Acad. Sci. USA, 74 , 5463 ( 1977)〕による DNA塩基配列の分析によって明 らかになつた〔第 3図参照）。 ·
次に、 該プラスミ ド pPHO 17 , に 4ュニッ卜の制限酵素 Xho
I 〔宝酒造㈱製〕を 2 0μ£ の反応液!： 6mM Tris-HCl (ρΗ7.9 1 5 0 mM NaC 1 , 6 raM MgCl2 , 6 mM 2—メルカプ卜エタノール 〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷ェタノ
_ΟΜΡΙ 、. —ルで DN Aを沈澱させた。
該 DNA 1 に 5ュニッ卜の DN Aポリメラ一ゼ I ラージ · フ ラグメ ン 卜 （New England Bio Labs社製）を 3 0 ι€ の反応液!： 4 0 mM リン酸力リ ゥム緩衝液（ pH 7.5 , 6.6 mM MgC 2 , l mM 2—メ ルカプ卜エタ ノール ， 3 3/ίΜ d ATP , 3 3 μΜ dGTP , 3 3 μΜ dTTP , 3 ΒμΜ dCTP〕中で 1 2°C , 3 0分間作用させて、 接 着末端を平滑末端にした後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノールで D ΝΑを沈澱させだ。 該 DNA断片 5 0 Ong と、 前述の条件下でリン酸 化された Sail リンカ一〔 5'— P— d ( GGT CGACC ) 〕 （ New England BioLabs社製 , 5 0 ng とを混合し、 前述の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用で結合させだ。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4 株を Cohen らの方法に従って形質転換させ、 アンピシリ ン耐性の形質 転換体の中から、 プラスミ ド pPHO 17の Xhol部位が Sail部位に変 換したプラスミ ド pPHO 1 7-1 を取得しだ（第 3図参照）。
参考例2 酵母ホスホグリセ.リン酸キナーゼ · プロモーター (： P GK-
P；を含有する発現用ベクターの作製
① ホスホグリセリ ン酸キナ一ゼ遺伝子（ のクロ一ユング
Cryer.D.R.らの方法！： Methods in Cell Biology, Vol. XII, P.39~44( 1975 )〕によって調製された Saccharomyces cere - visiae協会 3号株（ I FOから入手できる )の染色体 DNA , 3 5 0 /ig に 2 0 0ユニットの制限酵素 HindU 〔宝酒造㈱製〕を 1 Wの反応 液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 7 mM MgC 12 , 6 0 mM NaCl 〕中 3 7 , 3時間作用させた後、 1 %ァガロース · スラブゲル を用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 ァガロ ースゲルを分割することにより DNA断片を大きさの順に 1から 1 0の 画分に分,けた。 各画分のァガロースゲル片をそれぞれ透析チューブに封 入し、 参考例 1に記載の条件下でゲル片から DNAを電気的に溶出した。 溶出液をフエノ 一ル処理した後、 冷エタノールを加えて DNAを沈澱さ せた。 各画分からの DN A 0.5/i？ を 1 %ァガロース ' スラブゲルを 用いて参考例 1に記載の条件 Tで電気泳動を行った後、 二卜ロセルロー スフィルタ一 （ Schleicher and Schul 1 社製 に Southernの方法 〔 Southern, E.M., J. Mol. Biol" 9_8 , 503 ( 1975 )〕に従って DN Aを吸着させた。 P GK〔 Dobson, Μ· J. ら， Nucleic Acids Res, 10. 2625 ( 1982)〕の N末端側からの 5個のァミノ酸をコー ドする オ リ ゴヌク レオチドに相捕な 5し TGAAGATAAAGACAT—S^Crea, R. ら〔； Proc.Natl. Acad. Sci. USA , 75 , 5765( 1978 )〕の方法 によって合成し、 該ォリ ゴヌク レオチ ド 1 に 1 。 のト!：3 2!5〕- ATP C Amersham社製） と 1 0ュニットの T 4ポリヌク レオチ ド - キナーゼとを 3 Q t£ の反応.液 (： 5 OmM Tris-HCl( pH 7.6 , 1 0 mM MgC 12 , 1 0mM2—メルカプトエタノ ール〕中で 3 7°C ， 30分間作用させ、 5/末端を32 Pで標識した。 該反応液に 2 0 O mM EDTAC pH 8.0 )を 1 0 ί 添加し、 1容量のフエノ ールで除蛋白 した後、 TEN緩衝液 (： 1 OmM Tris-HCl pH 8.0 ) , 2 0 0 mM NaCl , 1 mM E DT A〕で平衝化したセファロース 4 B( Pharmacia 社製 ' カラム（ 0.2 5 x 2 5 ） に力けて void volume 付近に溶出 される標識された該ォリ ゴヌクレオチドを集め、 PGK遺伝子をスクリ —ニングするためのプローブとして用いた。 上記の二卜 ロセル口一スフ ィルターと該プロ一ブを甩いて前記 Southernの方法でプロッティング を行ったところ、 プローブは、 2.6 k b〜 2.9 k b DNA断片が含まれ る分画番号 3の試料と強くノ、イブリダィズしだ。
_OMPI 次に、 クロ一ユング 'ベクタ一 pTR 262〔 Roberts' T.M. ら，
Gene, 1 2 , 123 ( 1980)〕 ， 1 0 ^ に 1 0ュニッ トの制限酵素
Hindiを 5 0 の反応液〔 1 0 mM Tris-HC 1 ( pH 7.5 ) , 7 mM MgCl2 , 6 OmM NaCl〕中で 3 7°C , 2時間作用させだ後、 フエノ —ルで除蛋白し、 冷エタノールで DN Aを沈澱させた（ Hindu 消化 pTR262 )。 Hindll消化 pTR262 0Λ μ ^ と分画番号 3の DNA 0.2 μ？ とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で Τ 4 DNAリガ一ゼの 作用によって結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 DH 1 [Maniatis, T. ら , Molecular Cloning, Co Id Spring Harbor Laboratory, 254〜255 ( 1982； を形質転換させ、 テ卜ラサイク！； ン耐性を示 す形質転換体約 1 3 0 0個を得だ。 この中から P GK遺伝子を含有する 形質転換体を、 上述の32 P標識合成プローブを用いるコロニー ·ハイブ リダィゼ一シヨン〔 Suggs, S.V. ら ， Proc. Natl. Acad. Sci.
US A , 6 61 3 (1 9 8 1) J によつて選択しだ。 ォ一卜ラジオグ ラフィ一で強いシグナルが認められた形質転換体から、 前述のアル力リ 抽出法によってプラスミ ド pPKT3を単離し、 Hinduで分解したとこ ろ 2.9 5 k b DNAのィ ンサ一 卜が検出され、 Sou the rnの方法で調べ ると該インサ一卜は該プローブとハイプリすることが確認された。
② P GKプロモータ一断片の単離
プラスミ ド pPKT3DNA 5 0 μ 9 に 5 0ュニッ卜の制限酵素
Hindiを 1 0 0 i £の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ； , 7 mM MgC 12 , 6 0 mM NaC 1 〕中で 3 7°C， 2時間作用させた後、 1 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動 にかけだ。 泳動後、 2.9 5 k b DNA断片を参考例 1に記載の方法によ つてゲルから分取しだ（第 4図参照：)。 該 2.9 5 kb DNA断片 5 に 5ユニッ トの制限酵素 S al Iを
2 0 £ の反応液！： 1 OmM Tris-HCl ( pH 7.5 , 7mM MgCl2, 1 75mM NaCl , 7mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7。C , 3 時間作用させだ後、 1.2 %ァガロース ·スラブゲルを用いて参考例 1に 記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 2.1 kb !>NA断片を参考 例 1に記載の方法によってゲルから分取した。 該 2.1 k b DNA断片 0.5 " と、 プラス ミ ド PBR322の Hindi-Sal I 消化によって得ら れた 3.74 k b DNA 0.5 ^ とを混合し、 参考例 1に記載の条件下 で T 41) NAリガ一ゼの作用によって結合させた。 該反応液を用いて大 腸菌 DH 1を形質転換させ、 アンピシリ ン耐性の形質転換体から所望す るプラスミ ド pPKTlOl を取得した（第 4図参照）0
次に、 PGK遺伝子の構造遺伝子領域を取り除くために、 まず該プラ スミ ド pPKTlOl DNA 1 0 に 1 0ユニットの制限酵素 Sail を 3 0 ^ の反応液〔 1 0 mM Tri s -HC 1( pH 7.·5 , 7 mM Mg Cl2 , 1 7 5mM NaCl , 0.2 M EDTA , 7mM 2—メルカプ卜エタ ノール〕中で3 7 , 3時間作用させ、 フエノールで除蛋白し、 エタ ノールで DN Aを沈澱させた (： Sail消ィ匕 pPTKlO U。 つづいて、 Sal I消ィ匕 pPTKl 01 1 £ に 1 0ュニットの BAL31ヌクレア一ゼ を 2 0 の反応液〔 2 OmM Tris-HCl C pH 8.1 , 1 2 mM Ca Cl2, 1 2mM MgCl2 , 1 mM E D T A〕中で室温， 5分間作用させ だ後、 直ちに 1容量のフエノールを加えて反応を停止させ、 冷エタノー ルで DNAを沈澱させた（ BAL消化 pPTKlOl 。 参考例 1に記載 されたリン酸化 Xhol リ ンカ一 50 ng と B AL消化 pPTKlOl 0.2 μ とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で Τ 4 DN Αリガーゼの作用 によって結合させた。 その後、 該反応液で大腸菌 DH 1を形質転換させ、 アンピシリ ン耐性を示す形質転換体の中から、 pPKTlOl の Sailサ ィ トからプロモータ一領域の方向へ 0.6 9 k b が除かれだブラスミ ド ρΡΚΤδ 67を得だ。 Dideoxynucleotide法によって DN A塩基配列を 調べたところ、 PPKT 567では B AL 3 1の作用によって P GK構造 遺伝子と 5'—近傍領域— 2 4までが除かれたことが証明された（第 4図 参照:)。
発現用ベクターの構築
；¾菌—酵母シャトル 'ベクタ一 PSH19 5μ9 に 6ユニッ トの制 限酵素 Sai lを 2 0μ£ の反応液 (： 1 O mM Tris-HCl ( pH 7.5 , 7 mM MgCl2， 1 7 5 mM NaCl , 0.2 mM ED T A , 7 mM 2—メ ルカプトエタノール〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 フエノールで 除蛋白し、 冷エタノールで沈澱させた。 該 DNA Ιμ9 に DNAポリ メラ一ゼ I ラージ ' フラグメン トを参考例 1に記載の条件下で作用さ せ、 Sail の接着末端を平滑末端に変えた。 該 DNA断片 5 0 0 n g と 参考例 1に記載されたリン酸化 Xhol リ ンカ一 5 0 ng とを混合し、 参 考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用によって結合させた。 該反応液で大腸菌 DH1を形質転換させ、 アンピシリン耐性の形質転換 体の中から、 PSH19の Sa 部位が Xhol部位に転換したプラスミ ド PSH19-1 を保持する形質転換体を得た（第 4図参照：).。
該プラスミ ド pSHl9— 1 DN A 1 5 ？ に 2 4ュニッ 卜の制限酵 素 Hindi を 1 0
Figure imgf000025_0001
の反応液 (： 1 OmM Tri s-HCl( pH 7.5 ) , 7mM MgCl2, 6 OmM NaCl 〕中で 37°C , l 0分間作用させだ後、 直ちに 0.2M EDTAを 10 ^添加し反応を停止させだ。 反応液を、 0.7%ァガロース ·スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動にかけ、 Hindiで 1箇所切断されだ 8.3 kb DNA断片を参考例
O PI 1に記載の方法でゲルから分取しだ。 該 8.3 k b DNA断片3 に 1 0ュニッ トの制限酵素 Xhol〔宝酒造㈱製〕を 3 0 の反応液〔 1 0 mM Tr is-HCl ρΗ 7.5 ) , 7 mM MgCl2 , 1 0 0 mM NaCl, 7 mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 0.7 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動を行つだ。 泳動後、 .7.7 k b DNA断片を参考例 1に記 の方法に よってゲ から分取しだ（第 4図参照:)。
参考例 2の②に記載のプラスミ ド pPKT567DNA 1 0卢 に、 各 1 0ュニットの制限酵素 Hindiと Xholとを 0 ^の反応液〔50mM Tr is-HCl C ρΗ 7.6 , 5 0 mM NaCl , 1 mM ジチオスレイ ト一 ル， 1 OmM MgCl2〕中で 3 7 , 2時間作用させた後、 1.2 %ァガ ロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動を行い、. 1.4 OkbDNA断片をゲルから分取した（第 4図参照）。
該 1.40kbDNA断片 0.2. と上述の 7.7 kb DNA断片 0.5
とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガ一ゼの作用によ つて結合させだ。 該反応液で大腸菌 DH lを形質転換させ、 アンピシ リ ン耐性の形質転換体の中から、 所望するプラスミ ド PPKT700 を保持 する形質転換体を取得しだ。 次に、 参考例 1に記載した方法に従って、 該プラスミ ド PPKT 700 の Xhol部位が Sail部位に変換されたプラ ス ミ ド PPKT700— 1を作製した（第 4図参照:)。
参考例 3 酵母グリセルアルデヒ ド 3—リン酸脱水素酵素 ·プロモー ター（ GLD— Ρ )を含有する発現用べクタ一の作製 ① グリセルアルデヒ ド 3—リン酸脱水素酵素遺伝子 (： GL D )のク 口一二ング
GL Dのうちの pgap491 〔 Holland, J. P. ら ， J. Biol. Chem,
"：
— '.MPI 258, 529 1( 1983)：の N末端側からの 5個のァミノ酸をコ一ドす るオ リゴヌクレオチ ドに相補な 5し AGCAACTCTAACCAT— 3'を前 述の Crea,R.らの方法によって合成し、 参考例 2の①に記載の方法に従 つて32 pで標識し、 プローブとして用いだ。 参考例 2の①に記載した二 卜 ロセル口一スフィ ルターと該プローブを用いて Southernブロッティ ングを行つだところ、 プローブは 2 ·0〜2·3 k b DNA断片が含まれる 分画番号 7の試料と強くハイ プリダイズしだ。
参考例 2の①に記載された Hindu 消化 pTR262 0, 1卢？ と分画番 号 7の DNA0.2 とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DN Aリ ガ一ゼの作用によって結合させだ。 該反応液を用いて、 参考例 2の
①に記載した方法で大腸菌 DH 1を形質転換させ、 テ トラサイク リン耐 性形質転換体約 1 2 0 0個を取得し、 コロニー 'ハイブ！；ダイ ゼ一ショ ンによって32 P標識プローブと強くノ、ィ プリする形質転換体を分離しだ。 この形質転換体から前述のアル力リ抽出法によってプラスミ ド pGLD9 を単離し、 Hindi で分解しだところ、 2.2 k b イ ンサー 卜 D N Aが検 出され、 Southernの方法で調べるとこのイ ンサ一卜 DNAは該プロ一 ブとハイブリすることが廳忍された（第 5図参照 ）。
② GLDプロモータ一断片の単離
プラス ミ ド pGLD9 DNA 1 0 0 ^に 5 0ュニッ 卜の制限酵素 Hindi [を 2 0 0 μ £の反応液〔 1 0 mM Tris— HC pH 7.5) , 7 mM MgCl2 , 6 0 mM NaC 〕中で 3 7°C , 3時間作用させだ後、 1.0 ァ ガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にか けた。 泳動後、 2.2 kb DN A断片を参考例 iに記載の方法によってゲ ルから分取した。 該 2.2 kb DNA断片 1 0卢 に 1 0ュニッ トの制 酵素 Hi nf l〔宝酒造㈱製：!を 5 0 ^の反応液〔 1 0 Tris-HCl
C PI ( pH 7.5 , 7 mM MgC 12 , 1 0 0 mM NaCl , 7 mM 2—メルカプ 卜エタノール〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 GLD用プローブを 用いて Southernの方法によってハイブリダィジー i ヨンを行つだとこ ろ、 該プローブは 0.5 kb DNA断片と結合した（第 5図参照）。
該 0.5 kb DNA断片 5 ？ に、 各 1.0ュニットの制限酵素 Hhal
〔宝酒造㈱製〕と Taql ( New England BioLabs社製：）とを 30/^ の反応液〔 1 0 mM Tris-HCH pH 7.5； , 5 0 mM NaCl , l 0 mM MgCl2, l mMジチオスレィ トール〕中で 3 7¾ , 3時間作用さ せた後、 1.5 %ァガロース ·スラブゲルを用いて参考例 1に記載された 条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.3 6 kb DNA断片を参考例 1 に記載の方法によってゲルから分取した（第5図参照〕。
該 0.3 6 kb DNA断片 1 に DNAポリメラ一ゼ I ラージ *フ ラグメントを参考例 1に記載の条件下で作用さサ、 aq Iの接着末端を 平滑末端に変えた。 次に、 この断片 と参考例 1に記載されたリ ン 酸ィ匕 Xhol リ ンカ一 5 0 ng とを混合し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガ一ゼを作用させて結合させた。 反応後、 過剰量の Xholを 加え 3 7°C , 4時間作用させ、 次に参考例 2の①に記載した条件下でセ ファロ一ズ 4 B ·カラムを用いてリン力一の結合した 0.3 6 kb DNA 断片を分離した。
一方、 上述の 2.2 kb DNA断片 1 0 に DNAポリメラ一ゼ I ラージ ·フラグメン 卜を参考例 1に記載の条件下で作用させ、 接着末端 を平滑末端に変えた後、 参考例 1に記載された条件下でリン酸化された BamHl リンカ一!： 5，一P_d ( CGC GGATCCGCG)〕（ New England BioLabs社製:） 5 0 ng を参考例 1に記載の条件下で Ϊ 4 D NAリガ一ゼの作用により結合させた。 反応後、 2 0ュニッ卜の BamH Iを加えて、 3 7°C , 3時間作用させ、 次に参考例 2の①に記載した条 件下でセファローズ 4 Β ·カラムを用いてリンカーの結合した 2.2 kb DN A断片を分離した。 該 DNA断片 6 ^ に 2ユニットの制限酵素
Hha Iを 5 0 μ£ の反応液〔 1 0 mM Tris— HC1( pH 7.5； , 50 mM NaCl , 1 0 mM MgCl2 , 1 mMジチオスレィ 卜 一ル〕中で 3 7°C , 2時間作用させた後、 1.0 %ァガロース · スラブゲルを用いて参考例 1 に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.7 5 kb DNA断片を 参考例 1に記載の方法によってゲルから分取した（第 5図参照：)。
③ 発現用ベクターの構築
参考例 2の③に記載のプラスミ ド pSHl 9—1 DNA l O i? に各
1 0ュニッ卜の制限酵素 BamHl と Xho Iとを 5 0 μ の反応液!： 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 , 7 mM MgCl2 ， l 0 0 mM NaCl , 7 mM 2 -メルカプトエタノール〕中で 3 7。C , 2時間作用させた後、
1.0 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動にかけた。 泳動後、 8.0 kb の DNA断片を参考例 1に記載の方法 によってゲルから分取した。 ，
該 8.0 kb ϋΝ A断片 50 0 ng ,参考例 3の②に記載の 0.3 6 k b D Ν Α断片 20 0 ngおよび 0.7 5 kb DN A断片 2 0 0 n g とを混合 し、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作甩により結合さ せた。 該反応液を用いて大腸菌 DH 1を形質転換させ、 アンピシリ ン耐 性形質転換体の中から 3種の DN A断片が結合したプラスミ ド pGLD 906 を保持する組み換え体を分離した。 次に、 参考例 1に記載した方 法に従って、 該ブラスミ ド PGLD906 の XhoI¾ ^が Sail 部位に変 換されたプラスミ ド PGLD906— 1を作製した（第 5図参照）。
OMPI 参考例 4 poly— HSA—セル口フ ァイ ンカラムの製造
① 重合人血清アルブミンの製造
人血清アルブミン（アルブミン一二チヤク ； 日本製薬製， 東京）溶液
2 0 m£ ( 血清アルブミン 4 ^含有）にリン酸緩衝液一食塩水（ P B S ； 8. 1 mMNa P04 , 1.5mMKH2 P04 , 3.7mMKC^, 137mMNaC^, pH7.2) 1 8 0 me, 2 %グルタルアルデヒド溶液 6 0 mを加え均一に混 和したのち室温で 1時間静置した。重合反応は本溶液を蒸留水 1 0 に 対して 5 で透析することによ 停止させた。 ついで、 透析外液を 3回 変えることによ 反応液中に残存するグルタルァルデヒ ドを完全に除き 重合人血清アルブミン （ poly— HSA)溶液 2 7 5 fflを得た。
② poly— HSA—セル口フ ァイ ンカラムの製造
上記のようにして得られた poly— HS A溶液 9 0 に 1 0倍濃度に調 製した P B S 1 0 を加えたのちホルミルセル口 ファイ ン（チッソ社製, 東京） 4 0 ^を加えて混和したのち室温で 3 0分間反応させた。 ついで 本混合液に NaCNBH3l.6 ^を加え密拴したのち室温で 1 8時間振とう した。 混合液をガラスフィルタ一上に移してゲルを P B Sで洗いホルミ ルセルロ フアイ ンに結合し かつた poly— HSAを除いた。 この操作で の poly— HS Aのセルロフマィンへの結合率は約 7 3 でセル口フアイ ン 1 m£当り約 2 4 ^の poly— HSAの結合した poly— HSA—セルロ フ ァイン 4 0 mが得られた。 本ゲルを 0.1 Mェタノールァミンを含む P B Sに懸濁し、 Na CNBH320 0 を加え室温で 3時間振とうしたのち、 ゲルをガラスフィルター上に移し、 P BS， 8 M尿素溶液， 6 M塩酸グ ァニジンついで 2 5 mMリン酸ナト リ クム緩衝液（ pH7.5 )で順次洗浄 したのち内径 5 のカラムに詰め poly— HS A—'セル口フ ァイ ンカラム を製造した。 実施例 1 adr型 B型肝炎ウィ ルス表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する組 み換え DN A分子の構築および該 DN A分子による大腸菌の 形質転換
特開昭 5 9 - 7 4 9 8 5号公報および Nucleic Acids Res. l l , 1747 ( 1 983；)に記載されているプラス ミ ド pBR 322 -BamHI / HBr 33 ODNA ( pHB r 3 3 0とも略す）は、 特開昭 5 8— 2 0 1 7 9 6号公報に記載されている参考例 1の方法によって調製した。 該プラ
ス ミ ド pHBr 330 50 に各 2 0ュニッ トの制限酵素 EcoRI〔宝 酒造㈱製〕と BamHIとを 1 0 0 /^ の反応液!： 1 0 0 mM Tris— HC 1 ( H7.5 ) , 7 mM MgC 1„ , 5 0 mM NaCl , 7 mM 2—メ ルカプトエタノール〕中で 3 7 °C , 3時間反応させた後、 1.0 ァガ口
ース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。
泳動後、 1.4 kb DNA断片を参考例 1に記載の万法によってゲルから 分取した（第 6図参照）。 '
2μ9 のプラスミ ド pBR 322 DNAに各 2ュニッ卜の制限酵素 Bam HIと C 1 al (New England BioLabs 社製：）とを 2 0 の反応液
1 0 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 7 mM MgCl 2 , l 0 0 mM NaCl , 2 mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7 °C , 2時間反応さ せた後、 0.8 ァガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 4.0 1 kb DNA断片を参考例 1に記 載の方法によつてゲルから分取した。
5 0 0 ngの前記 4.0 1 kb DNA断片 , 5 0 Ongの前記 1. kb DNA 断片および参考例 1で記載の方法によって 5'末端がリン酸化された合成
マ 々 ri CGATACAATGCAGTGG > . η η σ ァダスター d ( TA GTTACGTCACCTTAA 5' ) ° 0 ng
とを参考例 1に記載の条件下で T4DNAリガーゼの作用によつて結合さ
, 霍 \
( OMPI
V； WIPO Λ せた。 なお、 上記アダプタ一はト リエステル法!： Crea, R. ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 75 , 5765 ( 1978 )〕を用いて化学合成 された。 この反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換させ、 アンピン リン耐性の形質転換体から前記 3種の DNAが結合したプラスミド pHBr P 3 l DN Aが得られた（第 6図参照）。
1 ^のプラス ミ ド pHBrP3 l DNAに 2ュニッ 卜の制限酵素 BamHI を 2 0 の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( H8.0 ).7mM MgCl2, 1 0 0 mM NaCl， 2 mM 2—メルカプトエタノ ール〕中で 3 7。C , 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノ ールを加えて D NAを沈殿させた（BamHI消化 pHBrP 3 1 )。
50 ongの BamHI消化 pHBrP 3 1に DNAポ リ メラーゼ I ラ ージ 'フラグメントを、 参考例 1に記載の条件下で作用させて、 接着末 端を平滑末端にした後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノ ールで DN A を沈殿させた。 該 DNA断片.30 Ongと、 参考例 1に記載の方法で 5'末 端がリン酸化された Pstl リンカー〔 一 P— d ( GCTGCAGC ) 〕 (New England BioLabs社製） 5 Ongとを参考例 lで記載の条件下 で T4DNA リガーゼの作用により結合させた。 該反応液を用いて大腸 菌 2 9 4株を形質転換させ、 形質転換体を参考例 1に記載の方法によつ て調べ、 プラス ミ ド pHBrP 3 1の BamHI部位が Psti に変換し たプラスミ ド pHBrP 3 1 - 1 7を分離した（第 6図参照）。
該 pHBrP 3 1 - 1 7 50 に各 2 0ュニッ 卜の制限酵素 Clalと Pstl 〔宝酒造㈱製〕とを 1 0 0 ^の反応液!： 2 OmM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 1 0 mM MgCl 2 , 5 0 mM (NH4) 2S04〕中で 37°C， 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 %ァガロース · スラブゲルを用いて 参考例 1に記載の.条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 1.42 kbDNA
OMM 断片を参考例 1に記載の方法でゲルから分取した。
特開昭 5 8 - 2 0 1 7 9 6号公報および Nucleic Acids Res., 11.
3581 ( 1 983：)に記載の発現用べクタ一 P TRP 771 50/^に制 限酵素 Clalと Pstlとを前記 100 ί の反応液中で同一条件下で反応 させた後、 反応液を 1.0 ァガロース ·スラブゲルを用いて参考例 1に 記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 3.3 kbDNA断片を参考例
1に記載の方法でゲルから分取した。
2 0 0 ng の該 1.4 2 kbDNA ( P 31をコードする DNA )と 500 n の 3.3 kbDNAとを参考例 1に記載の条件下で T4DNA リガーゼ の作用によって結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転 換させ、 参考例 1の方法に従って該 P 3 1をコードする DNAが発現用 ベクターに挿入されたプラス ミ ド pTRP P 3 1一 Rを保持する大腸 菌株（ 2 9 4 ZPTRP P3 1— R )を分離した（第 6図参照）。
なお、 当該菌株（ Escherichia coli 294/pTRP P31— R)は 財団法人発酵研究所に I FO— 1 4 3 5 5として寄託され、 また、 昭和
5 9年 7月 1 0日から工業技術院微生物工業技術研究所（ F R I ：)に受 託番号 F ERM P— 7 7 0 9として寄託されている。
実施例 2 adw型 B型肝炎ウィルス表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する組
み換え D N A分子の構築および該 D N A分子による大腸菌の 形質転換
特開昭 5 8— 1 9 48 9 7号公報，特開昭 5 '8— 2 0 1 7 9 6号公報 および Nucleic Acids Res. , 11 . 1 747 ( 1 983 )に記載されて いるプラス ミ ド pBR— EcoRIZHBV933 DNA ( pHBV 933と略 す）は、 特開昭 5 8 -20179 6号^に記載されている参考例 1の方. 法によって調製した。 2 ^の該プラスミ ドに 2ユニッ トの制限酵素 Hpa
OMPI I 〔宝酒造㈱製：!を 2 0 ^の反応液！： 1 OmM Tris— HCi(pH7.5 ),
7mM MgCl 2 , 10 OmM KC 1 , 7mM 2—メルカプトエタノール〕
中で 3 7°C， 2時間作用させた後、 フエノ ールで除蛋白し、 冷エタノ ー
ルで DN Aを沈殿させた。 該 DNA 30 Ongとリン酸化された Pstl リ
ンカー〔 5'— P— (GCTGCAGC)〕 5 Ong とを、 実施例 1で記載さ
れた条件下で結合させた後、 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転
換させ、 形質転換体を参考例 1に記載の万法によって調べ、 プラスミ ド
PHBV933の Hpalサイ 卜が： Pstlサイトに変換したプラスミド pHBV
933— 5を得た（第 7図参照）。
5 0 0 の該プラス ミ ド PHBV933— 5 DNAに 5 0 0ュニッ トの
制限酵素 Pstlを 8 0 0 ^ の反応液〔 2 0mM Tris-HCl (ρΗ7.5).
1 OmM MgCl2, 5 OmM ( NH4 ) 2 S04 J 中で 3 7。C， 2 0分間作甩
させた後、 直ちにフエノールで除蛋白した。 該反応液を 1.0 アガロー
ス . スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。
泳動後、 Pstlによる部分分解物 1.7 kbDNA 断片を参考例 1に記載
の方法によつてゲルから分取した（第 7図参照）。
3 ^の該 1.7 kb DNAを 6ュニッ トの制限酵素 EcoRIと 2 0 ^の
反応液！： 1 0 0 mM Tris-HCl ( pH7.5 ) , 7mM MgCI2 , 5 OmM
NaCl， 7mM 2—メルカプトェタノ ール：！中で 3 7 °C , 1時間反応さ
せた後、 1.0 ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件
下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.9 7 kbDNA断片を参考例 1に記載
の方法によつてゲルから分取した（第 7図参照）。
5 0 0 ngの該 0.9 7 kb DNA断片， 5 0 0 ngの実施例 1に記載の
3.3 kb DNA ( pTRP 771の Clal— Ps 11消ィ匕物）および 5· Ongの
実施例 1に記載のリソ酸化ァダプタ一 d ΟΜΡΙ WIPO Λ ] 、 3 TATGTTACGTCACCTTAA5. )とを参考例 1 <ニ言己載の条 件下で T4DNA リガーゼの作用によって結合させた。 該反応液を用い て大腸菌 2 9 4株と形質転換させ、 テトラサイクリン耐性の形質転換体 から参考例 1に記載された方法を用いて前記 3種の D N Aが結合したプ ラスミ ド pTRP P31— W を分離した。 該プラス ミ ドの Clal部位に、 特開昭 5 8 - 2 0 1 7 9 6号公報に記載のプラスミ ド PTRP6 0 1を Clalと HpaJI 〔宝酒造㈱製〕で消化して得られた約 330 bpの trpプ ロモ一ターを含む断片を挿入して、 プラスミ ド pTRP P31-W2 (第
7図参照）を完成した。
なお、 該プラスミ ド pTRP P31— W2を保持する大腸菌株（Esche— richia coli 294/pTRP P 31 -W2 )は財団法人発酵研究所に I F 0 - 1 4 3 5 6として寄託され、 また、 昭和 5 9年 7月 1 0日から工業 技術院微生物工業技術研究所（ F R .1 )に受託番号 F ERM P - 7 7 1 0として寄託されている。
実施例 3 adr型 B型肝炎ウィルスの表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する 酵母用組み換え DN A分子の構築および該 DN A分子による 酵母の形質転換
① 実施例 1に記載されたプラス ミ ド pHBrP31 DNA, 50/ ^に各 2 0ユニッ トの制限酵素 Clalと BamHIとを 1 0 0 ^の反応液!： 100 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 7 mM MgCl2 , 1 0 0 mM NaCl , 2mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7 °C , 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 ¾6ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 1.4 2 kb D N A断片を参考例 1に記 載の方法でゲルから分取した。 ，
2μ9 の該 1.4 2 kb DNA断片に DNAポ リメラーゼ I ラージ · v フラグメントを参考例 1に記載の条件下で作用させて接着末端を平滑末 端にした後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノ ールで DNAを沈殿させ た。 該DNA l.5/ί と参考例 1に記載のリン酸化 San リンカ一，
5 0 ng とを参考例 1に記載の条件下で T4DNAリガーゼの作 fflにより 結合させた。 該反応液に 1 0ュニッ 卜の制限酵素 Sailを添加し、 3 7 °C， 3時間作用させて接着末端を生成させた。 反応後、 フエノ ールで除 蛋白し、 試料を参考例 2の①に記載された条件下でセファローズ 4 B · カラムにかけ、 void volume 付近に溶出されてくる 1.4 3 kb DNA 断片（ adr型 P 3 1をコードする DN A )を含む画分を集め、 冷ェタノ 一ルで該 DN Aを沈殿させた（第 8図参照）。
\μ9 の参考例 1に記載された発現用ベクター ΡΡΗΟ 17— 1 DNA に 2ユニッ トの制限酵素 Sailを 20 の反応液〔6mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 6 mM MgClタ , 1 5 0 mM NaCl f 6 mM 2—メルカ プトェタノ一ル J中で 3 7 °C'， 2時間作用させ、 次に 0.1ュニッ トのァ ルカリ性ホスファターゼを添加して 6 5°C， 3 0分間反応を続けた。 反 応後、 フエノールで除蛋白し、 冷エタノ ールを加えて DNAを沈殿させ た（ Sa 消化 pPHO l 7 - 1 )。
次に、 20 0 ngの前記 1.4 3 kbDNA断片と 2 0 0 ngの Sail 消 化 PPH01 7— 1とを、 参考例 1に記載の条件下で T 4 DN A リガーゼ の作用により結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換 させ、 形質転換体を参考例 1に記載された方法によって調べ、 adr型 P 3 1をコードする DN Aを含む 1.4 3 kb DNA断片が P HO 5プロ モーターと順方向に挿入されたプラスミ ド pPHO P 3 1一 Rを保持 する菌株（Escherichia coli 294/pPHOP 3 1一 R )を分離した。 この形質転換体よりアルカ リ抽出法によって分離された該プラスミ ド
OMPI pPHO P 31—； を用 ヽて酵母宿主 Saccharomyces cerevisi ae AH22R—を前述の Hinnenらの方法で形質転換させ、 該プラスミ ドを 保持する酵母形質転換体（AH22R~VpPHOP3 1— R )を分離した (第 8図参照）。
なお、 当該菌株（ Saccharomyces cecevisiae AH 22 R—ZpPHO
P 3 1-R：)は財団法人発酵研究所に I F 0— 1 0 1 3 5として寄託され、 また、 昭和 5 9年 9月 4日から工業技術院微生物工業技術研究所（F R 1 )に受託番号1"£11]\1 P— 7 8 2 5として寄託されている。
② 参考例 2の③に記載された発現用べクター P PKT 700-lDNA , 1 μ9 に 2ュニッ トの制限酵素 Sailを 3 7 で 2時間作用させ、 つづ いて 0.1ュニッ 卜のアルカリ性ホスファターゼを実施例 3の①に記載さ れた条件下で作用させた後、 冷エタノ ールで DNAを沈殿させる（Sail 消化 PPKT 700 - 1 )。
次に、 実施例 3の①に記載の 1.4 3 kbDNA 断片 2 0 0 ngと Sail 消化 pPKT 700— 1 20 Ong とを参考例 1に記載の条件下で T 4 D NAリガーゼの作用により結合させる。 該反応液を用いて、 実施例 3の ①に記載した方法によって、 adr型 P 3 1をコードする DN Aを含む
1.4 3 kb DNA断片が P GKプロモータ一と順方向に挿入されたプラ スミ ド PPKTP31— Rを保持する菌株（ 294 15 ？ 31—1 を 分離し、 該プラスミ ドで酵母宿主 K33— 8Dを形質転換し、 酵母形質転 換体（K33— 8DZPPKT P3 i—; R)を取得する（第 8図参照）。
③ 参考例 3の③に記載された発現用ベクター pGLD906— 1DNA, 1 μ9 に2ュニッ 卜の制限酵素 Sailを 3 7 °Cで 2時間作用させ、 つづ いて 0.1ュニッ トのアル力リ性ホスファターゼを実施例 3の①に記載の. 条件下で作用させた後、 冷エタノールで DNAを沈殿させる（Xhol消
OMPI WIPO ィ匕 pGLD906 - 1 )0
次に、 実施例 3の①に記載の 1.4 3 kbDNA断片 2 0 0 ngと Sa 消化 PGLD 906— 1とを参考例 1に記載の条件下で T 4 DNAリガー ゼの作用により結合させる。 該反応液を用いて、 実施例 3の①に記載し た方法によって、 adr型 P 3 1をコ―ドする DNAを含む 1.4 3 kb D N A断片が GLDプロモーターと順方向に揷入されたプラスミ ド pGLD P31-R を保持する菌株（ 294ZPGLD P31— R)を分離し、 該プ ラスミ ドで酵母宿主 K33— 7Bを形質転換し、 酵母形質転換体（K33— 7B/pGLD P31-R) を取得する（第 8図参照）。
これら形質転換体を通常の方法で培養して、 目的とする P 3 1を得る ことができる。
実施例 4 adw型 B型肝炎ウイルスの表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する- 酵母用組み換え D N A分子の構築および該 DN A分子による . 酵母の形質転換 . .
① 実施例 2に記載されたブラス ミ ド pHBV 9 33 DNA , 2 μ9 に 2 ュニッ トの制限酵素 Hpa Iを 2 0 の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) ， 7 mM .MgCl2 ， l 00 mM Cl ， 2—メルカプトエタ ノ ール：！中で 3 7 °C , 2時間作用させた後、 フエノールで除蛋白し、 冷 エタノールで DNAを沈殿させた。 該 DNA 3 0 0 ngと、 参考例 1に 記載されたリン酸化 Sal I リ ンカ一 5 0 ng とを混合し、 参考例 1に記 載された条件下で T 4 DNAリガーゼの作用によつて結合させた。 該反 応液を用いて大腸菌2 9 4株を形質転換させ、 アンピン リ ン耐性の形質 転換体の中からプラスミ ド PHBV 9 33の Hpal部位が Sail 部位に 変換したプラスミ ド PHBV 933— 8を得た（第 9図参照）。
1 00μ9 の該プラス ミ ド pHBV 933— 8 D Ν Αに、各 1 0 0ュニ
ΟΜΡΪ
- WIPO ッ トの制限酵素 EcoRIと Sal Iを 2 0 0 /^の反応液 〔 1 0 0 mM
Tris-HCl ( ρΗ7.5 ) , 7 mM MgCl2 , 5 OmM NaCl , 7mM 2 一メルカプトエタノール〕中で 3 7 °C , 2時間作用させた後、 反応液を 1.2 %ァガロース ' スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気 泳動にかけた。 泳動後、 adw型 P 31をコードする DN A断片を含む
0.9 6 kb DNA断片を参考例 1に記載の万法によってゲルから分取し た（第 9図参照 )。
2 0 ^のプラスミ ド PBR 322DNAに、 各 2 0ユニッ トの制限酵 素 Clalと Sal Iとを 1 0 0卢 の反応液〔 6 mM Tris-HCl ( pH 7.9 ) , 1 5 0 mM Ν a C 1 , 6 mM M g C 12 ， 6 mM 2—メルカプト ェタノール：|中で 3 7 V， 2時間反応させた後、 1.0 ァガロース . ス ラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかけた。 泳動後、 3.7 4 kbDNA断片を参考例 1に記載の方法によってゲルから分取した。 該 3.7 4 kbDNA断片 5 ひ 0 ng、前記 0.9 6 kb DNA断片 5 0 0 ng および実施例 1に記載のリン酸化アダプター d
c 5'CGATACAATGCAGTGG3, ヽ κ Λ η„ レ 弁 ah
C 3,TATGTTACGTCACCTTAA5, 5011 とを 例 1 {ー5己 載の条件下で T 4 DNAリガーゼの作用によって結合させた。 該反応液 を用いて大腸菌 2 9 4株を形質転換させ、 アンピンリン耐性の形質転換 体から前記 3種の DNAが結合したプラスミ ド pHBV P31 DNAが 得られた（第 9図参照）。
5 0 の該プラス ミ ド pHBV P31 DNAに各 2 0ユニッ トの制 限酵素 Sal Iと Clalとを 1 0 0 ^の反応液〔 1 OmM Tris-HCl ( ρΗ 7.5 ， 7 mM MgC ， l 75mM NaCI ， 0.2 mM EDTA, 7 mM 2—メルカプトエタノール〕中で 3 7 °C , 3時間作用させた後、 反応液を 1.Q %ァガロース · スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件
Ο. Ρϊ 下で電気泳動にかけた。 泳動後、 0.9 8 kbDNA 断片を参考例 1に記 載の方法でゲルから分取した（第 9図参照 )。
2 ^の該 0.98 kb DNA断片に DNAポリ メラーゼ I ラージ - フ ラグメン トを参考例 1に記載の条件下で作用させて接着末端を平滑末端 にした後、 フエノ ールで除蛋白し、 冷エタノ ールで DNAを沈殿させた。 実施例 3の①に記載の方法によって、 該 0.9 8 kbDNA断片に Sal Iリ ンカー〔 5'— P— d ( CGTCGACG ) , ベセスダ · リサーチ社〕を結 合させ、 Sail処理によって接着末端を生成させ、 セファローズ 4 B力 ラムを用いて 0.99 kb DNA断片（ adw型 P 31をコードする DNA ) を含む画分を集め、 冷エタノールで該 DN Aを沈殿させた（第9図参照） c 実施例 3の①に記載の Sal I消ィ匕 pPHO 17— 1， 200 ngと上記
0.99 kbDNA断片 20 0 ng とを参考例 1に記載の条件下で T 4 D NAリガーゼの作用により結合させた。 該反応液を用いて大腸菌 29 4 株を形質転換させ、 形質転換体を参考例 1に記載された方法によつて調 ベ、 adw型 P 31をコードする DNAを含む 0.991^0 断片が？110 5プロモーターと順方向に挿入されたプラスミ ド pPHO P 31 -W ¾- 保持する菌株（Escherichia coli 294/pPHO P31— W)を分離し た。 該形質転換体よりアル力リ抽出法によって分離されだ該プラスミ ド pPHO P31一 Wを用いて酵母宿主 AH 22R一を前述の Hinnenらの方 法で形質転換させ、 該プラスミ ドを保持する酵母形質転換体（Saccha— romyces cerevisiae AH 22 R一 ZpPHO P31— W)を分離した (第 9図参照）。
なお、 当該菌株 ( Saccharomyces cerevisiae AH 22 R— ZpPHO P 31— W)は財団法人発酵研究所に I FO— 1 0 1 3 6として寄託され、 また、 昭和 59年 9月 4日から工業技術院微生物工業技術研究所（ F R I )に受託番号 FERM P- 7 8 2 6として寄託されている。
また、 adw型 P 3 1をコードする DNAと P GKプロモーターまたは
GLDプロモーターを含有するプラスミ ドも上記の方法に従って構築す ることができる。
実施例 5 adw型 B型肝炎ゥィルス表面抗原 P 3 1遺伝子を発現する酵
母組み換え D N Aの構築および該 D N Aによる酵母の形質転 換
5 0 の前記プラス ミ ド PTRP P31-W2に 2 0ュニッ 卜の制限 酵素 Pstlを 1 0 0 《の反応液〔 1 O mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , l 0 mM MgCl2 , 5 0 mM N a C 1 , l mM ジチオスレィ ト ール〕中 で 3 7°C， 2 0分間作用させ、 部分分解した後、 反応液を 0.8 %ァガロ ース ·スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動にかける。 泳動後、 Pstlでただ 1か所切断された 4.6 kb の線状 DNA分子を参 考例 1に記載の万法でゲルから分取する（第 1 0図参照）。
5 の該 4.6 kbDNA分子に 5ユニッ トの制限酵素 Clalを、 3 0 μί の反応液〔 1 0 mM Tris-HCl ( pH 7.5 ) , 7 mM MgCl2 ， 1 O mM NaCl 〕中で、 3 7 C , 3時間作用させた後、 反応液を 1.0 ^ァガロース .スラブゲルを用いて参考例 1に記載の条件下で電気泳動 にかける。 泳動後、 0.9 8 kb DNA断片を参考例 1に記載の方法でゲ ルから分取する。
該 0.9 8 kb DNA断片0.8 μ9 を 2.5ュニッ トの 4 DNAポリメ ラーゼ〔宝酒造稱製〕を用いて、 2 0卢 の反応液〔 3 3mM Tris— acetate ( pH 7.9 ) , 6 6 mM酢酸力リウム， 1 0 mM酢酸マグネシ ゥム， 5 mMジチオスレィ ト ール 〕中、 3 7。(て' 1 5分間処理し、 接着 末端を平,骨末端にした後、 フエノールで除蛋白し、 '冷エタノールで DN
O PI
：. . WIPO Aを沈澱させる。 実施例 3の①に記載の方法によって、 該 0.9 8 kb D N A断片に Sail リンカ—を結合させ、 Sail処理によって接着末端を 生成させ、 セファローズ 4 Bカラムを用いて、 0.9 9 kb DNA断片
( adw型 P 3 1をコ一ドする DNA )を含む画分を集め、 冷ェタノール で該 DNAを沈澱させる。
実施例 3の①に記載の Sail消化 pPHO 17-1 200 ngと上記
0.9 9 kb DNA断片 200 ngとを参考例 1に記載の条件下で T 4DN Aリガーゼの作用により結合させる。 該反応液を用いて大腸菌 2 9 4株 を形質転換させ、 形質転換体を参考例 1に記載された方法によつて調べ、 adw型 P 31をコードする DN Aを含む 0.9 9 kb DNA断片が P HO 5プロモーターと順方向に挿入されたプラス ミ ド PPHO P31— Wを保 持する菌株（ 294ZPPHO P31-W) を分離する。 該形質転換体よ りアル力リ抽出法によって分離された該プラスミ ド pPHO P31— Wを 用いて酵母宿主 AH 22 R一を前述の Hinnenらの方法で形質転換させ、 該プラスミ ドを保持する酵母形質転換体（AH22R一/ PPHO P31— W)を分離する（第 1 0図参照）。
この形質転換体を通常の方法で培養して、 目的とする P 3 1を得るこ とができる。
実施例 6 P 3 1遺伝子の大腸菌における発現
実施例 1と 2で得られた P 3 1遺伝子発現プラスミ ドを含む各形質転 換体を、 1.0 グルコース ， 1.0 カザミノ酸を含む M— 9培地で、 37 °C， 6時間培養した後、 菌体を集め、 緩衝液〔 3 O mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 5 0 mM NaCl , 5 mM EDTA〕で洗浄した。 菌体を
1 0 mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 5 mM EDT A , l mMフエ二 ルメチルスルホニルフルオラィ ド， 5 ノ m リゾチームからなる溶菌液
OMPI WIPO一 に懸濁し、 溶菌した。 該溶菌液に最終濃度 5 Mになるように塩酸グァニ ジンを添加し、.3 7 °Cで 2時間ィ ンキュベーシヨンした。 溶菌液を室温 で 15,000 rpm, 1 5分間遠心分離にかけて上澄液を得た。 この上澄 液の P 3 1活性を、 前述の direct immunoassayによって測定した。
その結果を第 2表に示すが、 P 3 1の生成量はブロス 1/ ^あたりとして 計算された。 また、 この生成量は特開昭 5 8 - 2 0 1 7 9 6号公報記載 の表面抗原の産生量より高いことがわかった。
2 ¾
形 質 転 換 体 HBsAg (単位 ^ブロス）
Escherichia col i 294/pTRP P31 -R 220
Escherichia col i 294/ RP P31 -W2 300
HBsAg 1単位は 1 ngの HBsAg小型粒子に結合するオースリア B 一 125キット添付の125 I 抗 HBsAg抗体のカウント数の値である c 実施例 6 P 3 1遺伝子の酵母における発現
実施例 3と 4で得られた P 3 1遺伝子発現プラスミ ドを含む各酵母形 質転換体を、 Burkiiolderおよびその低リン酸培地で、 3 0 °C， 2日間 培養した後、 菌体を集め、 生理食塩水で洗争した。
Miyanohara, A. ら〔前出〕の方法に従って菌体を Zymolyase 〔生 化学工業㈱製〕によってスフエロプラス トにした後、 スフエロプラス ト に 0.1 ¾δト リ トン X— 1 0 0を添加して Ρ 3 1を抽出した。 溶菌液を室 温で 15,000 rpm, 15分間遠心分離にかけて上澄液を得た。 この上澄 液の P 3 1活性をオースザィム Π 〔アポッ ト㈱製〕を用いて測定した。
その結果を第 3表に示すが、 P 3 1の生成量はブロス 1 あたりとして 計算された。
- ¾>J 卜-..
--•'ΜΡ ' 第 3 表
酵 母 形 —質 —転 —換— 体 P31( ^/^ブロス）
S accharomyces cerevisiae AH 22 R /pPHO P 31— R 1200 S accharomyces cerevisiae AH 22 R /pPHO P 31— W 1100
P 3 1は、 HBsAg 粒子を標準品としてオースザィ 厶 Πで測定した c 実施例 7 実質的に純粋 ¾ P 3 1蛋白質の製造
① 菌体からの抽出
実施例 6記載の方法で培養し、 一2 0 で凍結して得た Escherichia coli 294/pTRP P 31 -R の凍結保存菌体 1 0 0 を 1 0 mM
EDTA, 2 5 mMリ ン酸ナト リ ウムを含む緩衝液（ p H 7.5 ) 200 ^ に均一に懸濁した。 この懸濁液に 6 9 6 のフ ユ二ルメチルスルホニル フルオラィ ドおよび 1 0 0 のリゾチームを加え 3 7てで 1 5分間加温 したのち、 2 0 0 r (D 8 M尿素を含む 2 5 mMリン酸ナトリクム緩衝液
( pH 7.5 )を加えてォムニミキサー（サーバル社製 )を用いて 4 0 0 0 rpm で 3 0秒間 2回ホモジナイズした。 ホモジネートにさらに 8 M尿 素を含む 2 5 m Mリ ン酸ナト リ クム緩衝液 6 0 0 mを加え 4てで 4時間 攪拌した。 この溶菌液に 2 5 mMリ ン酸ナト リ クム緩衝液（ pH7.5 ) 3 0 0 を加えさらに 1時間攪拌したのち 1 8,9 0 0 で 7 0分間遠 心分離して上清 3 9 0 0 m （ 9· 7 X 1 03 ュニッ ト /r )を得た。
② poly— HS A—セル口ファイ ンカラムによる精製
上記で得た上清を 2 5 mMリン酸ナトリクム緩衝液（ pH7.5 )で平衡 化した参考例 4で得た poly— HSAセル ΰファイ ンカラム （ 5 X 2 ) に通して P 3 1蛋白質を吸着させ、 カラムを 0.0 5 % Tween 20 含む
P B S 3 0 0 mi, 0.0 5 % Tween 20， 0.5 M NaC^を含む PBS 220
O PI ― 3―
mi, 0· 0 5 %Tween 2 0を含む P B S 8 0 m， 4 ¥尿素を含む2 5 111 リン酸ナトリゥム緩銜液（ pH 7.5 ) 3 0 0 ^で順次洗ったのち、 7. 5 M 尿素を含むリン酸ナトリクム緩衝液（ PH 7.5 ) 3 0 0 ^を用いて Ρ 3 1 を溶出させた。活性画分 2 5 0 ^を ΥΜ— 5メンブラン（アミコン社製, アメ リカ）を用いて 7. 2 （ 2. 3 X 1 06ュニット ,r )に濃縮した。 得 られた濃縮液 7 ^に 1 4 0 の DTTを加え 8 0 °Cで 1 5分間還元した のち、 メンブランフイ ノレター (ァクロデ'イ スク ；口径 0. 2 m ： ゲルマ ン社製）を用いて^過した。
③ 逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィ ーによる精製
上記で得られた^液のうち 5 0 0 /^ を AP 2 0 2 3 0 0 A ( Cs ) 逆相カラム（ YMC島久社製）に吸着させ、 トリフルォロ酢酸一ァセト ニト リル— n—プロピルアルコール系を溶出溶媒とする高速液体クロマ トグラフィ一を行つた。
カラム， A P 2 0 2 3 0 0 A ( C8 ) ( 4 6 X 1 5 0藤） ； カラム温 度， 3 0 て ；溶出溶媒 A, 0. 1 %ト リフルォロ酢酸— 9 9. 9 %水；溶出 溶媒 B, 0. 1 % ト リ フルォ口酢酸 - 9. 9 5 %ァセ トニ ト リル一 4 9.9 5 % n—プロピルアルコール ；溶出プロク *ラム， 0分 ( 4 5 % A+ 5 5 96 B ) - 2 5分（ 2 5 ¾ A+ 7 5 % B ) - 4> 7分（ 2 5 ¾ A + 7 5 ¾B )ー4 9分（ 5 %A+ 9 5 % B ) — 5 0分（ 4 5 %A+ 5 5 % B ) ；溶 出速度 1 ^Zmin；検出波長 2 8 0 n m。本条件下で保持時間約 4 1分 の画分 8 ^ ( 3. 1 X 1 04 ュニット ^を集め凍結乾燥に付し、 実質 的に純粋な P 3 1蛋白質（ adr型 ） 1 4 9 ( 1 X 1 06 ユニット )を含む白色粉末を得た。
上記方法で製造した実質的に純粋 ¾ P 3 1蛋白質（ a d r 型）は下記 の性状を有していた。 (1) 単一性：
ラェムリの方法 Nature, 2 2 7 , 6 8 0 ( 1 9 7 0 )〕 に準じて S D S—ポリアク リルアミ ドスラブゲル電気泳動を行ったあと銀染色試 薬「第 1 」 （第 1化学製， 東京）で染色した結果、 P 3 1蛋白質は単一 のパンドを示した（第 1 1図参照）。
(2) 分子量： -
P 3 1蛋白質の分子量は、 S D S—ポリアク リルアミ ドスラブゲル電 気泳動から約 3 2, 0 0 0ダルトンと算出された（第 1 1図参照）。
(3) アミノ酸組成：
P 3 1蛋白質 2 0 をガラス製加水分解用試験管にと 、 4 %チォ グリコール酸を含む定沸点塩酸を加えて、 減圧下に封管レたのち、 1 1 0 で2 4 , 4 8 , 7 2 , 9 6時間加水分解した。 加水分解後、 開管し, 減圧下に塩酸を除去し、 残渣を 0.0 2 N塩酸に溶解して日立製 8 3 5型 アミノ酸分析計によ アミノ酸分析を実施した。 シスチンおよびシステ ィンはハースの方法 C Methods in Enzymol, 1 1 , 1 9 7 ( 1 9 6 7 )〕 に従い、 P 3 1蛋白質を過ギ酸酸化したのち、 減圧下、 定沸点塩 酸中で 2 4時間加水分解して、 アミノ酸分析計によ！）システィン酸とし て定量した。 アミノ酸分析値は、 2 4, 4 8および 7 2時間の加水分解 で得られた値を平均して求めた。担し、 イ ソロイ シン， ロイ シンおよび フ ヱ二ルァラニンは 9 6時間の加水分解で得られた値をまたセ リンぉょ びスレオニンの値は加水分解時間を 0時間に外挿して求めた。 その結果 を第 表に示す。 4 アミノ酸 モノレ％
A s p Ά s n 5.8
T h r 7. 8
S e r 9. 6
G 1 u/G 1 n 5. 3
P r o 1. 5
G 1 y 7. 0
A 1 a 4 7
1 / 2 C y s 3.9
V a 1 5. 2
M e t 2. 5
I 1 e 5. 2
L e u 2. 7
T y r 2. 4
P h e 6. 4
し y s 1. 5
H i s 1. 0
A r g 3. 8
T r p 3. 6
' OMPI (4) N末端アミノ酸配列：
P 3 1蛋白質 6 2 μψ に気相プロティ ンシークエネータ一（アプライ ド ·パイォシステムズ社製 4 7 0 Α型， ァメリ力）を用いる自動ェドマ ン分解法を適用して、 N末端アミノ酸配列を分折した。 フ ユ二ルチオヒ ダントインアミノ酸（ PTH—アミノ酸）はミクロパック S P— OD S カラム（バリアン社製， ァメ リカ）を用いる高速液体クロマ トグラフィ 一によ 同定した。各ステップで検出された PTH—ァミノ酸を第 5表 に示す。
第 5 表 ステップ 検出された PTH—アミノ酸
1 メチォニン
2 ク'ノレタ ミン
3 トリブトフ ァ ン
4 ァスパラギン
1)
5 X
6 スレオニン 同定出来ず
OMPI 鶴 (5) C末端アミノ酸：
該 P 3 1蛋白質6 2 0 β? をガラス製ヒドラジン分解用試験管にと 、 無水ヒ ド ジン 0. 1 ^を加えて減圧下に封管したのち、 1 0 0 °Cで 6 Β 間加熱レた。 得られたヒ ドラジン分解物を凍結乾燥したのち、 蒸留水に 溶解した。 この溶液にベンズアルデヒドを添加し、 室温で 1時間攪拌し、 遠心分離を行 つたのち、 上清を得た。 この上清を凍結乾燥し、 日立製 8 3 5型アミノ酸分析計によ アミノ酸分析を実施した。その結果、 4. 7 n mole のイ ソロイシンが検出された。
実施例 6記載の方法で培養して得た Escherichia col i 294/pTRP P 3 l—W 2の菌体についても上記と同様の方法によ 実質的に純粋る
P 3 1蛋白質（ adw型）を製造できる。
産業上の利用可能性
本発明によ！)製造される HBsAg P 3 1蛋白質は H BVの診断や H B Vの感染防止に有用 ¾ヮクチンとして有用である。
OMPI

Claims

請 求 の 範 囲
B型肝炎クイルス表面抗原 P 3 1をコードする塩基配列を有する D N Aを含有する形質転換体を培養し、 培養物中に B型肝炎ウィルス表面抗 原 P 3 1を生成蓄積せしめ、 得られる該 P 3 1含有液をァフィニティー クロマトグラフィ一処理を含む精製工程で精製することを特徴とする B 型肝炎ウィ ルス表面抗原 P 3 1蛋白質の製造法。
CMPI
、 IPO
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