WO1984003511A1 - Method for producing very pure albumin and for depyrogenating albumin-containing starting substances - Google Patents

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WO1984003511A1
WO1984003511A1 PCT/EP1984/000061 EP8400061W WO8403511A1 WO 1984003511 A1 WO1984003511 A1 WO 1984003511A1 EP 8400061 W EP8400061 W EP 8400061W WO 8403511 A1 WO8403511 A1 WO 8403511A1
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albumin
solution
starting
mixture
plasma
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PCT/EP1984/000061
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Inventor
Robin Hugh Stead
Original Assignee
R & Z Biolog Gmbh & Co Kg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/06—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining high-purity albumin from albumin-containing starting substances, for. B. human blood plasma, from which the coagulation factors have been removed, by heat treatment of the albumin-containing starting solution in the presence of albumin-stabilizing substances, an alcohol and in the range of neutral pH values, subsequent cooling of the mixture, possibly with a lowering of the pH value, and removal of the precipitate formed, which essentially contains globulins, and processing of the solution containing only albumin.
  • the invention further relates to the depyrogenation of substances obtained in this way, and the latter method can also be applied to other albumin-containing substances.
  • albumin can be obtained from human blood plasma with a yield above 90% with a purity of almost 100% by this method.
  • the information regarding the purity of the albumin corresponds to the results that could be achieved with the examination methods at that time. Newer, improved examination methods have shown that the method obtained according to the above method
  • the invention is therefore based on the object to improve the heat-ethanol process so that a
  • Very high purity albumin can be obtained.
  • the process is also said to be suitable for obtaining albumin from fractions obtained in the fractionation by known processes, which are usually not worked up to give albumin.
  • This object is achieved according to the invention by a method in which the heat treatment of the starting solution adjusted to an albumin content of 2-25% by weight is carried out in the presence of 8.0-9.0% by volume of isopropanol and in the temperature range of 66-70 ° C.
  • the essential part of the new process is the heating of the starting albumin solution in the presence of isopropanol.
  • the influence of short-chain alcohols on the solubility of the proteins could be partly attributed to the effect that these substances have on the hydrogen bonds between water molecules and water and dissolved proteins.
  • an alcohol can have a structure-destroying or building effect.
  • One expression of this effect is the dipole correlation factor in mixtures of alcohols with water
  • the correlation factor of isopropanol differs significantly from that of ethanol, methanol or n-propanol, especially when considering the influence of temperature on the correlation factor at different alcohol concentrations.
  • Blood plasma, albumin-containing blood fractions or their supernatants, placenta extracts or slightly contaminated albumin preparations can serve as starting substances in the method according to the invention. Since globulins present are denatured by the action of heat, usable protein fractions are expediently z. B. coagulation factors or gamma globulins, separated in the starting material by known methods.
  • the process solution which has been adjusted to an albumin content (corresponding to 100 parts) of 2-25% by weight with 30-100 parts of COHN fraction IV and with dissolved or soluble plasma proteins mixed, the proportion of which is 10 to 20 parts of the protein substance of the plasma or plasma equivalent. It is believed that the pyrogens that block the determinants of albumin are attracted due to the greater affinity for the lipoproteins introduced into the mixture. They can then be removed with them.
  • the process solution is preferably mixed with isopropanol in the concentration indicated above. However, ethanol or propanol in a comparable concentration can also be used as the alcohol component.
  • the mixture is then heated to a temperature of 68 ° C. ⁇ 2 ° to fill in the non-albumin components and is held at this temperature for about 30 minutes.
  • the non-albumin portions in the solution mainly the ⁇ , ⁇ and ⁇ globulins, are denatured and precipitated, while albumin is not denatured and remains in the solution.
  • the suspension is then cooled to 10 ° C.
  • Precoat filtration is preferably used in the method according to the invention.
  • the use of precoat filtration for the separation of precipitated Ni ⁇ ht-albumin in blood fractionation is known from DE-PS 25 56 733.
  • the filtration is carried out in a pressure vessel with horizontally arranged filter elements.
  • Diatomaceous earth with the brand names HyfloSuper-Gel, Celite 545 or Perlite are used as filter aids.
  • the precoat filtration is carried out in a pressure vessel with vertically arranged filter elements, the filtrate collected in a metering tank being circulated between the pressure vessel and the metering tank until clarification.
  • a porous, volcanic silicate (perlite) which has a particle size range of 2-11 ⁇ m, is preferably used as the filter aid.
  • the precoat is carried out on a filter fabric with a mesh size of preferably between 70 and 140 ⁇ m.
  • a uniform coating of the filter elements is achieved, which has the consequence that the average size of the particles that are still in the solution after the precoat filtration is significantly reduced in comparison with the known method. Subsequent fine filtration is no longer necessary. It is advantageous furthermore, that the method can be carried out in a single boiler if it is provided with a combined heating and cooling jacket. As a result of the improvement relating to heat precipitation and filtration, the time required to work up a batch can be reduced by half compared to the known heat-ethanol process to one day if the suspension obtained is processed further immediately after the heat precipitation.
  • the process can be adapted very flexibly to shift times and weekly working hours.
  • the exact period of the waiting time can be adapted to the practical requirements; the capacity of the technical fractionation unit can be significantly increased.
  • the filtrate obtained during the precoat filtration can optionally be mixed with 0.5 - 4% by weight of a highly disperse, colloidal silica to remove traces of lipoproteins. This process step is absolutely necessary when processing pyrogenic starting substances. After acting at a suitable temperature, the silica is removed again by precoat filtration using suitable filter aids.
  • the process can produce a high purity albumin. This will be shown in the following by a comparison with the product of the heat-ethanol process.
  • two immune electrophoresis diagrams are attached as a figure.
  • the immunoelectrophoresis diagrams shown in the figure were recorded from the heat-precipitated filtrate containing only albumin with ethanol or isopropanol. Polyyalent anti-human antiserum served as a comparison. The diagrams show that an albumin with a very low content of impurities can be obtained in both processes.
  • ⁇ 1 -antitrypsin is the most common remaining impurity in albumin solutions during heat precipitation, the remaining content is a measure of the efficiency of the process. A content of ⁇ 1 -antitrypsin is only visible when examining IEP diagrams if a test solution with a. Albumin concentration of 20% is present; this method is therefore less suitable for quantitative analysis.
  • the solid components (blood cells and platelets) are separated from human blood and the coagulation factors removed. Coagulation factor VIII and fibrinogen are removed by cryo-ethanol sedimentation, the prothrombin complex is removed by absorption.
  • the starting solution then contains about 4-5% by weight of plasma protein.
  • the starting solution is processed in a reaction vessel that can be heated and cooled via an outer jacket.
  • Neutralized caprylic acid sodium caprylate
  • isopropanol is also added to the mixture.
  • the pH is then adjusted to 6.6 by 0.1 NHCl and the mixture is heated. The temperature is brought up to 68 ° C in about 45 minutes with even heat. The mixture is held at this temperature for 30 minutes.
  • the mixture obtained is then cooled to 10 ° C. and the pH value by further addition of 0.1 N.
  • a rinsing solution is circulated several times, which after concentration is combined with the main filtrate by ultrafiltration.
  • the collected filtrates are concentrated to an albumin content of 15% by ultrafiltration and then isopropanol and other constituents are removed by diafiltration with a five-fold exchange volume of distilled water.
  • concentrated NaCl solution is added to maintain an osmolality of 100 mOsm.
  • the albumin solution is then concentrated to the desired protein content and, if necessary after the addition of table salt and other additives, sterile filtered and bottled.
  • the albumin obtained is practically 100% pure, as can be seen from the figure's immuno-electrophoresis diagram.
  • the yield is up to 98%, based on the amount of albumin in the starting solution.
  • Example 1 used and processed analogously.
  • Example 3
  • Human blood plasma is used as the starting solution, from which the gamma globulins have been removed by precipitation with polyethylene glycol (PEG).
  • the starting solution is processed according to Example 1 to an albumin solution.
  • Human blood plasma is used as the starting solution, from which the gamma globulins have been removed by ion exchangers according to the CONDIE method (US Pat. No. 4,136,094). This starting solution is also processed to an albumin solution in accordance with Example 1.
  • An albumin solution is used as the starting solution, from which the immunoglobulins A and M have been removed in the rivanol ammonium sulfate process (SMETANA et al., Acta Med. Scand. 155 (1956), 65). This solution is processed according to Example 1 to an albumin solution.
  • COHN fraction V which is present as a paste, is converted with a physiological saline solution (0.9% by weight NaCl) into a solution with a 5% by weight protein content.
  • This solution serves as a starting solution for a method according to Example 1 and is also processed to an albumin solution.
  • Example 7
  • the supernatant obtained in the fractionation according to the COHN method in the second fractionation step contains about 1.6% by weight of proteins and about 18 vol.
  • the ethanol is removed by diafiltration and at the same time the protein concentration is brought to 5% by weight
  • This concentrate serves as the starting solution which is processed analogously to Example 1 to an albumin solution.
  • the fraction IV obtained in the third fractionation step in the COHN fractionation is adjusted to a protein content of 10% by weight with physiological saline solution (cf. Example 6). 5% by volume of human plasma (based on the final content) from which the coagulation factors have been removed are added to this reconstituted solution.
  • the further additions of isopropanol and sodium caprylate to this solution correspond to those in Example 1, as did the adjustment of the pH to 6.6.
  • the new starting solution is left within 40 minutes.
  • the suspension formed is then cooled to 10 ° C. After lowering the pH to 4.4, the suspension is left to stand for 12 hours.
  • a precoat filtration follows for further processing of the suspension.
  • the filtrate obtained is sterile filtered and concentrated to an albumin content of 13% by ultrafiltration.
  • the solution, the volume of which is then 150 liters, is diafiltered with twice the exchange volume of distilled water.
  • the solution is then under Röhxen with 2
  • Aerosil ® By weight Aerosil ® added.
  • the Aerosil ® is left to act for 3.5 hours at 48 ° C. Then becomes Mixture of perlite filter aid in an amount of 13 wt .-%, based on the starting amount.
  • This is followed by another precoat filtration in a pressure vessel with vertically arranged filter elements that have a mesh size of 70 - 5 ⁇ m. The filtrate collected in a dosing tank is circulated between the pressure vessel and the dosing bench until it is clarified.
  • the clear, albumin-containing solution is sterile filtered, concentrated to a content of 10% by weight of albumin by ultrafiltration and then diafiltered to remove low molecular weight contaminants.
  • the solution obtained is concentrated to an albumin content of 25% by weight. After adjusting the osmolality by adding salt and the pH value to neutral values, the solution is sterile filtered and filled.
  • the starting substances according to Examples 1 to 8 are treated according to the first process steps, i. H. the starting solution, which contains 8 to 9 vol .-% isopropanol, is heated to a temperature in the range of 66-70 ° C and held at this temperature for 20 to 50 minutes. In a modification of the previously mentioned process steps, the suspension is then cooled to 20 ° C.
  • a clear liquid containing albumin is processed according to the previous examples.
  • the time required to produce the ready-to-use albumin solution is one day using this method.
  • the resulting mixture is then cooled to 18 ° C and the pH is adjusted to 4.2.
  • the temperature of the mixture is then reduced to 4 ° C and the mixture is left to stand for 8-12 hours.
  • filter aid diatomaceous earth
  • the filtrate is filtered sterile and concentrated to a volume of 150 l by ultrafiltration. After adjusting the pH to 7.0, the solution is mixed with twice the exchange volume
  • filter aid perlite
  • the filtrate is filtered sterile, concentrated to a volume of 150 l by ultrafiltration and diafiltered with 3 times the exchange volume of water. Then, after adjusting the osmolality and the pH of the solution, the albumin concentration is adjusted to the desired value.
  • Example 10 ethanol is used in the starting solution of Example 10 as the alcohol component in a concentration of 9% by volume. Otherwise the procedure is analogous to example 10.
  • propanol is used as the alcohol component in the starting solution of Example 10 in a concentration of 8% by volume. Otherwise, the procedure is analogous to example 10.
  • a pyrogenic albumin solution obtained in the heat-ethanol process is used as the starting solution and worked up by the process according to Example 10.
  • Pyrogenic, albumin-containing rinsing solutions are concentrated to a protein content of 5% by known methods.
  • the solution obtained serves as a starting solution for a process according to Example 10 and is processed to an albumin solution.

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Description

Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Albumin und zur Depyrogenierung albuminhaltiger Ausgangssubstanzen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Albumin aus albuminhaltigen Ausgangssubstanzen, z. B. menschlichem Blutplasma, dem die Gerinnungsfaktoren entzogen worden sind, durch Hitzebehandlung der albuminhaltigen Ausgangslösung in Gegenwart von albuminstabilisierenden Substanzen, einem Alkohol und im Bereich neutraler pH-Werte, anschließender Abkühlung der Mischung, gegebenenfalls unter Erniedrigung des pHWertes, und Abtrennung des gebildeten Niederschlages, der im wesentlichen Globuline enthält, sowie Aufarbeitung der nur Albumin enthaltenden Lösung. Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Depyrogenierung derartig gewonnener Substanzen, wobei dieses letztgenannte Verfahren auch auf andere albuminhaltige Substanzen angewandt werden kann.
In den letzten drei Jahrzehnten betrafen Fortschritte auf dem Gebiet der Plasmafraktionierung im technischen Maßstab hauptsächlich ein unter dem Namen "COHN-Methode" bekanntes Verfahren (COHN et al. J. Amer. Chem. Soc., Vol. 68, pp. 459 - 475; Vol. 72, pp. 465 - 474). Bei diesem Verfahren wird durch Alkoholzugabe in der Kälte eine selektive Fällung von Plasmaproteinen erzielt. Albumin läßt sich nach diesem Verfahren aus Blutplasma bei einer Ausbeute von etwa 70 % mit einem Reinheitsgrad von 95 - 98 % gewinnen. Eine Verbesserung der Albumingewinnung stellt das sogenannte Hitze-Äthanol-Verfahren dar, das durch die DE-PS 24 15 079 bekannt ist. Durch Zusatz von Äthanol in einer Konzentration von 6 - 10 Vol.-% zur Plasmaausgangslösung und anschließender Erhitzung der Lösung bei geeigneten pH-Werten und Temperaturen lassen sich die Nicht-Albumin-Eiweiß-Stoffe besser ausfällen und von der albuminhaltigen Lösung abtrennen. Albumin läßt sich nach diesem Verfahren aus menschlichem Blutplasma bei einer Ausbeute oberhalb von 90 % mit einer Reinheit von nahezu 100 % erhalten. Die Angabe bezuglich der Reinheit des Albumins entspricht den Ergebnissen, die man mit den damaligen Untersuchungsmethoden erzielen konnte. Neuere, verbesserte üntersuchungsmethoden haben ergeben, daß auch das nach dem oben genannten Verfahren gewonnene
Albumin nicht frei von vasoaktiv wirkenden Bestandteilen ist.
Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, das Hitze-Äthanol-Verfahren so zu verbessern, daß ein
Albumin sehr hoher Reinheit gewonnen werden kann. Das Verfahren soll sich auch zur Gewinnung von Albumin aus bei der Fraktionierung nach bekannten Verfahren anfallenden Fraktionen eignen, die üblicherweise nicht zu Albumin aufgearbeitet werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Hitzebehandlung der auf einen Albumin-Gehalt von 2 - 25 Gew.-% eingestellten Ausgangslösung in Gegenwart von 8.0 - 9.0 Vol.-% Isopropanol und im Temperaturbereich von 66 - 70º C erfolgt.
Der wesentliche Teilschritt des neuen Verfahrens ist die Erhitzung der Albuminausgangslösung in Gegenwart von Isopropanol. Isopropanol [(CH3)2CH OH] zeigt Eigenschaften, die sich von denen seiner geradkettigen Homologen [CH3(CH2)n OH] mit n = 0, 1 oder 2 deutlich unterschei den. Der Einfluß der kurzkettigen Alkohole auf die Löslichkeit der Proteine könnte teilweise der Wirkung zugeschrieben werden, die diese Substanzen auf die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Wassermolekülen und Wasser und gelösten Proteinen ausüben. In Abhängigkeit von seiner chemischen Struktur und anderen Faktoren, wie Alkoholkonzentration und Temperatur, kann ein Alkohol eine strukturzerstörende oder aufbauende Wirkung haben. Einen Ausdruck für diesen Effekt ist in Mischungen von Alkoholen mit Wasser der Dipol-Korrelations-Faktor
(Haested, J. B. , Aqueous Dielectrics, Chapman and Hall, London, 1973, S. 187). Der Korrelationsfaktor des Isopropanols unterscheidet sich deutlich von denen des Äthanols, Methanols oder n-Propanols, insbesondere wenn man den Einfluß der Temperatur auf den Korrelationsfaktor bei verschiedenen Alkoholkonzentrationen betrachtet.
Als Ausgangssubstanzen können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Blutplasma, albuminhaltige Blutfraktionen oder deren Überstände, Plazentaextrakte oder leicht verunreinigte Albuminpräparate dienen. Da durch die Hitzeeinwirkung anwesende Globuline denaturiert werden, werden zweckmäßigerweise zunächst verwertbare ProteinFraktionen z. B. Gerinnungsfaktoren oder Gammaglobuline, im Ausgangsmaterial nach bekannten Verfahren abgetrennt.
Bei der Durchführung des Verfahrens wird die Lösung der
Ausgangssubstanz bei Raumtemperatur auf einen pH-Wert im Bereich von 6.4 - 7.0, vorzugsweise 6.6 0,05 eingestellt und die Lösung mit ca. 0,04 Mol einer albuminstabilisierenden Substanz nach der Definition von BALLOU {J. Biolog. Chem. 153 (1944) , S. 599) versetzt. Anschließend wird die Mischung mit Isopropanol bis zu einer Konzentration von 8.0 - 9.0 Vol.-% versetzt. Die beidem Verfahren erzielbare Reinheit und die Ausbeute des Albumins sind sehr stark abhängig von der Isopro panol-Konzentration. Es hat sich gezeigt, daß ein Gehalt von 8.5 ± 0.05 Vol.-% Isopropanol in der Lösung einen optimalen Wert darstellt.
Wenn pyrogene, albuminhaltige Ausgangssubstanzen aufgearbeitet werden sollen, wird zur Entfernung der Pyrogene vor der Hitzebehandlung die auf einen Albumingehalt (entsprechend 100 Teile) von 2 - 25 Gew.-% eingestellte Verfahrenslösung mit 30-100 Teilen an COHN-Fraktion IV und mit gelösten bzw. lösbaren Plasmaproteinen gemischt, deren Anteil an der Proteinsubstanz des Plasmas oder Plasmaäquivalentes 10 - 20 Teile beträgt. Dabei wird angenommen, daß die Pyrogene, die die Determinanten des Albumins blockieren, aufgrund der größeren Affinität zu den in die Mischung eingebrachten Lipoproteinen hingezogen werden. Sie sind dann mit ihnen entfernbar. Bei diesem Verfahren wird vorzugsweise die Verfahrenslösung mit Isopropanol in der oben angegebenen Konzentration versetzt. Als Alkoholkomponente können aber auch Äthanol oder Propanol in vergleichbarer Konzentration eingesetzt werden.
Unabhängig von den Ausgangssubstanzen wird die Mischung danach zur Ausfüllung der Nicht-Albuminanteile auf eine Temperatur von 68º C ± 2º erhitzt und bei dieser Temperatur ca. 30 Minuten gehalten. Während der Erhitzung werden die Nicht-Albuminanteile in der Lösung, hauptsächlich die α-, β-und γ-Globuline, denaturiert und ausgefällt, während Albumin nicht denaturiert wird und in der Lösung verbleibt.
Die Suspension wird anschließend auf 10ºC abgekühlt.
Sie kann sofort weiterverarbeitet werden. Wenn sie längere Zeit stehen soll, z. B. über Nacht, wird der pH¬
* vgl . Definition Fig. 1 a, DE-OS 24 15 079 Wert auf 4.4 abgesenkt. Auch bei Standzeiten bis zu 72 h können keine Änderungen der Eigenschaften festgestellt werden.
Zur Abtrennung der denaturierten Nicht-Albuminteile bieten sich mehrere Trennverfahren, z. B. die Sedimentation, Filtration oder Zentrifugation an. Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die AnschwemmFiltration verwendet. Deτ Einsatz der Anschwemmfiltration zur Abtrennung von ausgefällten Niσht-Albuminanteilen bei der Blutfraktionierung ist durch die DE-PS 25 56 733 bekannt. Bei dem bekannten Verfahren wird die Filtrierung in einem Druckkessel mit horizontal angeordneten Filterelementen durchgeführt. Als Filterhilfsmittel dienen Kieselgure mit den Markenbezeichnungen HyfloSuper-Gel, Celite 545 oder Perlite. Bei diesem Verfahren ist jedoch im Anschluß an die Anschwemmfiltrierung immer noch eine zeitaufwendige Feinfiltration erforderlich, um feine Teilchen zu entfernen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Anschwemmfiltrierung in einem Druckkessel mit senkrecht angeordneten Filterelementen durchgeführt, wobei das in einem Dosiertank gesammelte Filtrat bis zur Klärung im Kreislauf zwischen Druckkessel und Dosiertank geführt wird. Als Filterhilfsmittel dient dabei vorzugsweise ein poröses, vulkanisches Silikat (Perlite), das einen Korngrößenbereich von 2 - 11 μm aufweist. Die Anschwemmung erfolgt an einem Filtergewebe mit einer Maschenweite vorzugsweise zwischen 70 und 140 um.
Es wird eine gleichmäßige Belegung der Filterelemente erzielt, was zur Folge hat, daß die mittlere Größe der Teilchen, die sich nach der Anschwemmfiltrierung noch in der Lösung befinden, im Vergleich zum bekannten Verfahren deutlich herabgesenkt ist. Eine anschließende Feinfiltration ist nicht mehr erforderlich. Vorteilhaft ist weiterhin, daß das Verfahren in einem einzigen Kessel durchführbar ist, wenn dieser mit einem kombinierten Heiz- und Kühlmantel versehen ist. Durch die Verbesserung, die die Hitzefällung und die Filtration betreffen, läßt sich der Zeitbedarf zur Aufarbeitung einer Charge im Vergleich zum bekannten Hitze-Äthanol-Verfahren um die Hälfte auf einen Tag reduzieren, wenn im Anschluß an die Hitzefällung die erhaltene Suspension gleich weiterverarbeitet wird.
Wegen der flexiblen Wartezeiten während des Sedimentierens (1 - 72 h) bei einem pH-Wert von etwa 4.4 kann das Verfahren sehr flexibel an Schichtzeiten und Wochenarbeitszeiten angeglichen werden. Die genaue Zeitspanne der Wartezeit kann den praktischen Anforderungen angepaßt werden; die Kapazität der technischen Fraktionierungseinheit kann hierdurch signifikant erhöht werden.
Das bei der Anschwemmfiltrierung gewonnene Filtrat kann gegebenenfalls zur Entfernung von Spuren von Lipoproteinen mit 0,5 - 4 Gew.-% einer hochdispersen, kolloidalen Kieselsäure versetzt werden.Bei der Aufarbeitung pyrogener Ausgangssubstanzen ist dieser Verfahrensschritt unbedingt erforderlich. Die Kieselsäure wird nach Einwirken bei geeigneter Temperatur durch erneute Anschwemmfiltrierung unter Verwendung geeigneter Filterhilfsmittel entfernt.
Durch das Verfahren läßt sich ein Albumin mit hoherReinheit herstellen. Dies soll im folgenden durch einen Vergleich mit dem Produkt des Hitze-Äthanol-Verfahrens gezeigt werden.
Zur Erläuterung der erzielbaren Reinheit sind zwei Immun-Elektrophorese-Diagramme als Figur beigefügt. Vom nur Albumin enthaltenden Filtrat der Hitze-Fällung mit Äthanol bzw. Isopropanol wurden die in der Figur gezeigten Immun-Elektrophorese-Diagramme aufgenommen. Als Vergleich diente dabei polyyalentes anti-humanes Antiserum. Die Diagramme zeigen, daß bei beiden Verfahren ein Albumin mit sehr niedrigem Gehalt an Verunreinigungen erhalten werden kann.
Da α1-Antitrypsin bei der Hitzefällung die am häufigsten vorkommende verbleibende Verunreinigung bei AlbuminLösungen ist, ist der verbleibende Gehalt ein Maßstab für die Effizienz des Verfahrens. Ein Gehalt an α1-Antitrypsin wird bei einer Untersuchung von IEP-Diagrammen aber erst sichtbar, wenn eine Testlösung mit einer. Albuminkonzentratiόn von 20 % vorliegt; diese Methode ist daher für die quantitative Untersuchung weniger geeignet.
Jedoch zeigt die Analyse des α1-Antitrypsingehaltes durch radiale Immundiffusion, daß Albumin-Testlösungen, bei denen mit Isopropanol anstelle von Äthanol gearbeitet wird, einen deutlich geringeren Gehalt an α1-Antitrypsin aufweisen.
Tabelle 1 α1-Antitrypsin
Beim Verfahren einges. Alkohol mg/100 ml Anteil im Albumin (%)
Aethanol 7,2 0.036
Isopropanol 4.0 0.020
Die Erfindung wird weiterhin anhand der nachfolgenden, detaillierten Beispiele erläutert werden. Beispiel 1
Aus Humanblut werden die festen Bestandteile (Blutzellen und Blutplättchen) abgetrennt und ihm die Gerinnungsfaktoren entzogen. Der Gerinnungsfaktor VIII und das Fibrinogen werden durch Cryo-Äthanol-Sedimentation, der Prothrombin-Komplex wird durch Absorption entfernt. Die Ausgangslösung enthält dann etwa 4 - 5 Gew.-% Plasmaeiweiß. Die Verarbeitung der Ausgangslösung erfolgt in einem über einen Außenmantel aufheizbaren und kühlbaren Reaktionskessel. Der Ausgangslösung wird neutralisierte Caprylsäure (Natrium-Caprylat) bis zu einer Konzentration von 0.04 Mol zugefügt. Bei Raumtemperatur wird zur Mischung weiterhin 8.4 Vol.-% (bezogen auf die Gesamtlösung) Isopropanol zugegeben. Danach wird der pH-Wert durch 0.1 NHCl auf 6.6 eingestellt und die Mischung erhitzt. Die Temperatur wird in etwa 45 Minuten bei gleichmäßiger Wärmezuführung bis auf 68ºC gebracht. Bei dieser Temperatur wird die Mischung 30 Minuten gehalten. Anschließend wird die erhaltene Mischung auf 10º C abgekühlt und der pH-Wert durch weitere Zugabe von 0.1 N
HCl auf pH 4.4 erniedrigt. Nach weiterer Abkühlung auf 2 bis 3º C wird die Mischung etwa 1 bis 72 Stunden stehengelassen. Anschließend wird ein Kieselgur-Filterhilfsmittel, wie an sich bekannt, hinzugefügt und eine Anschwemmfiltrierung, wie sie bereits aus dem Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt.
Zur Überprüfung der ausreichenden Klärung wird an einer 50 ml-Probe gestestet, die unter Druck durch eine Filtermembran mit 0,2 μm großen Poren geführt wird. Feinteilige Verunreinigungen führen zur unmittelbaren Blokkierung der Filtermembran, während bei ausreichender Klärung die Lösung ohne Schwierigkeiten das Filter passiert. Am Ende der Filtration wird die erhaltene Lösung über ein Schutzfilter durch eine Filterpatrone mit 0,2 μm Poren geführt, die zuvor sterilisiert wurde. Das Filtrat, das nun vollkommen steril ist, wird in einem Sterilbehälter gesammelt.
um auch das im Trübvolumen des Filterkuchens befindliche Albumin zu gewinnen, wird eine Spüllösung mehrmals im Kreislauf geführt, die nach Aufkonzentrierung durch ültrafiltration mit dem Hauptfiltrat vereinigt wird.
Die gesammelten Filtrate werden durch ültrafiltration auf einen Albumingehalt von 15 % konzentriert, und anschließend werden durch Diafiltration mit fünffachem Austauschvolumen an destilliertem Wasser Isopropanol und andere Bestandteile entfernt. Bei diesem Verfahrensschritt wird konzentrierte NaCl-Lösung zur Aufrechterhaltung einer Osmolalität von 100 mOsm zugesetzt.
Danach wird die Albumin-Lösung bis zum gewünschten Proteingehalt konzentriert und, gegebenenfalls nach Zugabe von Kochsalz und anderen Additiven, sterilfiltriert und in Flaschen abgefüllt. Das gewonnene Albumin ist praktisch von 100 %iger Reinheit, wie aus dem ImmunElektrophorese-Diagramm der Figur ersichtlich ist. Die Ausbeute beträgt bis zu 98 %, bezogen auf die Menge an Albumin in der Ausgangslösung.
Beispiel 2
Humane Plazenta-Extrakte mit einem Gehalt von ca. 2.5
Gew.-% Albumin werden anstelle der Ausgangslösung gemäß
Beispiel 1 verwendet und analog verarbeitet. Beispiel 3
Als Ausgangslösung wird Humanblutplasma eingesetzt, dem durch Fällung mit Polyäthylenglykol (PEG) die Gammaglobuline entzogen worden sind. Die Ausgangslösung wird gemäß Beispiel 1 zu einer Albuminlösung weiterverarbeitet.
Beispiel 4
Als Ausgangslösung wird Humanblutplasma eingesetzt, dem nach Verfahren von CONDIE (US-PS 4 136 094) durch Ionenaustauscher die Gammaglobuline entzogen worden sind. Diese Ausgangslösung wird ebenfalls gemäß Beispiel 1 zu einer Albuminlösung weiterverarbeitet.
Beispiel 5
Als Ausgangslösung wird eine Albuminlösung eingesetzt, der beim Rivanol-Ammoniumsulfat-Verfahren (SMETANA et al., Acta Med. Scand. 155 (1956), 65) die Immunglobuline A und M entzogen worden sind. Diese Lösung wird gemäß Beispiel 1 bis zu einer Albuminlösung weiterverarbeitet.
Beispiel 6
COHN-Fraktion V, die als Paste vorliegt, wird mit einer physiologischen Kochsalzlösung (0.9 Gew.-% NaCl) in eine Lösung mit 5 Gew.-% Proteingehalt überführt. Diese Lösung dient als Ausgangslösung für ein Verfahren gemäß Beispiel 1 und wird auch bis zu einer Albuminlösung verarbeitet. Beispiel 7
Der bei der Fraktionierung nach dem COHN-Verfahren im zweiten Fraktionierungsschritt (Trennung der Fraktion II/III vom Überstand (vgl. Figur la der DE-OS 24 15 079) gewonnene Überstand enthält etwa 1.6 Gew.-% Proteine und ca. 18 Vol.% Äthanol. Durch Diafiltration wird das Äthanol entfernt und gleichzeitig die Proteinkonzentration auf 5 Gew.-% gebracht. Dieses Konzentrat dient als Ausgangslösung, die analog zum Beispiel 1 zu einer Albuminlösung verarbeitet wird.
Beispiel 8
Die bei der COHN-Fraktionierung im dritten Fraktionierungsschritt gewonnene Fraktion IV wird mit physiologischer Kochsalzlösung (vgl. Beispiel 6) auf einen Proteingehalt von 10 Gew.-% eingestellt. Zu dieser rekonstituierten Lösung werden 5 Vol.-% Humanplasma (bezogen auf den Endgehalt) , dem die Gerinnungsfaktoren entzogen worden sind, hinzugefügt. Die weiteren Zugaben an Isopropanol und Natrium-Caprylat zu dieser Lösung entsprechen denen im Beispiel 1, ebenso die Einstellung des pHWertes auf 6.6. Die neue Ausgangslösung wird innerhalb von 40 Minuten belassen. Die gebildete Suspension wird danach auf 10º C abgekühlt. Nach Erniedrigung des pHWertes auf 4.4 wird die Suspension 12 Stunden stehengelassen. Zur Weiterverarbeitung der Suspension schließt sich eine Anschwemmfiltrierung an. Das erhaltene Filtrat wird steril filtriert und durch Ultrafiltration auf einen Albumingehalt von 13 % konzentriert. Die Lösung, deren Volumen anschließend 150 1 beträgt, wird mit dem doppelten Austauschvolumen an destilliertem Wasser diafiltriert. Die Lösung wird danach unter Röhxen mit 2
Gew.-% Aerosil® versetzt. Man läßt das Aerosil® 3.5 Stunden bei 48º C einwirken. Anschließend wird zur Mischung Perlit-Filterhilfsmittel in einer Menge von 13 Gew.-%, bezogen auf die Ausgangsmenge, gegeben. Es schließt sich eine erneute Anschwemmfiltration in einem Druckkessel mit senkrecht angeordneten Filterelementen an, die eine Maschenweite von 70 - 5 μm aufweisen. Das in einem Dosiertank gesammelte Filtrat wird bis zur Klärung im Kreislauf zwischen Druckkessel und Dosierbank geführt.
Die klare, Albumin enthaltende Lösung wird steril filtriert, durch ültrafiltration auf ein Gehalt von 10 Gew.-% Albumin konzentriert und zur Entfernung niedermolekularer Verunreinigungen anschließend diafiltriert. Die erhaltene Lösung wird auf einen Albumingehalt von 25 Gew.-% konzentriert. Nach Einstellung der Osmolalität durch Salzzugabe und des pH-Wertes auf neutrale Werte wird die Lösung sterilfiltriert und abgefüllt.
Beispiel 9
Die Ausgangssubstanzen gemäß den Beispielen 1 bis 8 werden gemäß den ersten Verfahrensschritten behandelt, d. h. die Ausgangslösung, die einen Gehalt von 8 bis 9 vol.-% Isopropanol aufweist, wird auf eine Temperatur im Bereich von 66 - 70º C erhitzt und bei dieser Temperatur 20 bis 50 Minuten gehalten. In Abänderung der bisher genannten Verfahrensschritte wird die Suspension danach auf 20º C abgekühlt.
Jeweils 100 1 der Suspension werden mit 13 kg Filterhilfsmittel (Perlite) unter Rühren versetzt und anschließend weitere 20 Minuten gerührt. Die Suspension wird in eine Anschwemmfiltereinrichtung überführt, in der in einem Druckkessel die Filterplatten senkrecht angeordnet sind. Das Filtrat der Suspension wird in der Filtereinrichtung zwischen Druckkessel und Dosiertank bis zur Klärung im Kreisluaf geführt (vgl. Beispiel 8).
Eine klare, Albumin enthaltende Flüssigkeit wird gemäß den vorangegangenen Beispielen weiterverarbeitet. Der Zeitbedarf zur Herstellung der gebrauchsfertigen Albuminlösung beträgt nach diesem Verfahren einen Tag.
Beispiel 10
28 kg eines gefriergetrockneten, pyrogenen Albuminpulvers werden in 100 1 pyrogenfreiem, destillierten Wasser aufgelöst. Zur Lösung werden 10 kg der COHN-Fraktion IV in pastöser Form hinzugefügt und verrührt. Weiterhin werden bei Raumtemperatur 30 1 Humanblutplasma zugegeben und verrührt. Nach weiterer Zugabe von 0.04 Mol Natriumcaprylat und Isopropanol bis zu einem Gehalt von 8.5 Vol.-% in der Lösung wird der pH-Wert der Lösung auf 6.7 eingestellt. Die Lösung wird anschließend innerhalb von 35 Minuten auf eine Temperatur im Bereich von 65 - 68º C aufgeheizt und bei dieser Temperatur 30 Minuten gehalten.
Die erhaltene Mischung wird anschließend auf 18º C abgekühlt und der pH-Wert auf 4.2 eingestellt. Die Temperatur der Mischung wird danach auf 4º C erniedrigt, und die Mischung 8 - 12 Stunden stehengelassen.
Zur Weiterverarbeitung werden 32 kg Filterhilfsmittel (Kieselgur) in die Mischung eingeführt und nach weiterem 20minütigem Rühren abfiltriert. Das Filtrat wird steril filtriert und durch ültrafiltration auf ein Volumen von 150 1 eingeengt. Nach Einstellung des pH-Wertes auf 7.0 wird die Lösung mit dem 2fachen Austauschvolumea an
Wasser diafiltriert. Danach werden 3 kg Aerosil zur
Lösung hinzugefügt. Die erhaltene Suspension wird auf 40º C erhitzt und bei dieser Temperatur drei Stunden stehengelassen.
Anschließend werden zur Suspension 19 kg Filterhilfsmittel (Perlite) mit einer Korngrößenverteilung im Bereich von 2 - 11 μm hinzugefügt, und die festen Bestandteile der Suspension durch Anschwemmfiltrierung entfernt. Das Filtrat wird steril filtriert, durch ültrafiltration auf ein Volumen von 150 1 konzentriert und mit dem 3-fachen Austauschvolumen an Wasser diafiltriert. Danach wird ggf. nach Einstellung der Osmolalität und des pH-Wertes der Lösung die Albuminkonzentration auf den gewünschten Wert eingestellt.
Beispiel 11
Anstelle von Isopropanol wird in der Ausgangslösung des Beispiels 10 als Alkoholkomponente Äthanol in einer Konzentration von 9 Vol.-% eingesetzt. Ansonsten wird analog zum Beispiel 10 verfahren.
Beispiel 12
Anstelle von Isopropanol wird in der Ausgangslösung des Beispiels 10 als Alkoholkomponente Propanol in einer Konzentration von 8 Vol.-% eingesetzt. Im übrigen wird analog zum Beispiel 10 verfahren.
Beispiel 13
Als Ausgangslösung wird eine im Hitze-Äthanol-Verfahren gewonnene, pyrogene Albuminlösung eingesetzt und nach dem Verfahren gemäß Beispiel 10 aufgearbeitet. Beispiel 14
Pyrogene, albuminhaltige Spüllösungen werden nach bekannten Verfahren auf einen Proteingehalt von 5 % konzentriert. Die erhaltene Lösung dient als Ausgangslösung für ein Verfahren gemäß Beispiel 10 und wird bis zu einer Albuminlösung verarbeitet.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e ;
1. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Albumin aus Plasmaproteinlδsungen oder albuminhaltigen AusgangsSubstanzen, z. B. menschlichem Blutplasma, dem die
Gerinnungsfaktoren entzogen worden sind, durch Hitzebehandlung der albuminhaltigen Ausgangslösung inGegenwart von albuminstabilisierenden Substanzen, einem Alkohol und im Bereich neutraler pH-Werte, anschließender Abkühlung der Mischung, ggf. unter Erniedrigung des pH-Wertes, und Abtrennen des gebildeten Niederschlages, der im wesentlichen Globuline enthält, sowie Aufarbeitung der nur Albumin enthaltenden Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß die Hitzebehandlung der auf einen Albumin-Gehalt von 2 ¬
25 Gew.-% eingestellten Ausgangslösung in Gegenwart von 8.0 - 9.0 Vol.-% Isopropanol und im Temperaturbereich von 66 - 70º C erfolgt.
2. Verfahren zur Gewinnung von hochreinem Albumin aus albuminhaltigen, pyrogenen Ausgangssubstanzen, die z. B. ein Endprodukt gemäß den Verfahrensschritten nach Anspruch 1, aber auch eine gemäß anderen Verfahren hergestellte Ausgangslösung, aufgelöstes Albuminpulver oder dgl. sein können, dadurch gekennzeichnet, daß zur Entfernung der Pyrogene die auf einen Albumingehalt (entsprechend 100 Teile) von 2 - 25 Gew.-% eignestellte Verfahrenslösung mit 30 - 100 Teilen an COHN-Fraktion IV und mit gelösten bzw. lösbaren Plasmaproteinen gemischt wird, deren Anteil an der Proteinsubstanz des Plasmas oder Plasmaäquivalentes 10 - 20 Teile beträgt, Hitzebehandlung der Verfahrensmischung bei 60 - 70º C in Gegenwart von albuminstabilisierenden Substanzen, einem Alkohol der
Zusammensetzung CH3 - (CH2)n-OH mit n = 1 oder 2 oder Isopropanol im Bereich neutraler pH-Werte, anschließendes Abkühlen der Mischung, ggf. unter Er niedrigung des pH-Wertes, ggf. Abtrennen der Hauptmenge des gebildeten Niederschlages durch bekannte Trennverfahren und Konzentration des Albumingehaltes in der verbleibenden Restlösung, Hinzufügen einer ausreichenden Menge hochdisperser, kolloidaler Kieselsäure zur verbleibenden Lösung bzw. Mischung, Einwirken der Kieselsäure und deren Entfernung durch geeignete Filterhilfsmittel, ggf. erneute Anschwemmfiltrierung und Aufarbeitung der nur Albumin enthaltenden Lösung.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein bzw. beide Anschwemmfilterierungsschritte in einem Druckkessel mit senkrecht angeordneten Filterelementen erfolgt bzw. erfolgen, wobei das in einem Dosiertank gesammelte Filtrat bis zur Klärung im Kreislauf zwischen Druckkessel und Dosiertank geführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß einer bzw. beide Anschwemmfiltrierungsschritte unter Verwendung eines porösen, vulkanischen Silikates (Perlite) im Korngrößenbereich von 2 - 11 μm durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß. im Anschluß an die Anschwemmfiltrierung die im wesentlichen nur Albumin enthaltende Lösung zur Entfernung von Spuren von Lipoproteinen mit 0.5 - 4 Gew.-% hochdisperser, kolloidaler Kieselsäure versetzt wird und anschließend die verbrauchte Kieselsäure wieder entfernt wird.
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