UA123496C2 - Фармацевтична композиція, що містить плазміноген, та її застосування - Google Patents

Abstract

Запропоновані фармацевтичні композиції, які містять Glu-плазміноген. В одному варіанті реалізації винаходу композиція містить модифікатор осмотичного тиску, наповнювач і стабілізатор, причому значення рН композиції становить від близько 5,0 до близько 8,0. В іншому варіанті реалізації винаходу композиція містить в суспензії кількість частинок розміром 10 мкм або більше, що становить менш ніж 6000 частинок на ємність, де номінальним вмістом ємності становить 100 мл або менше. Включено застосування вказаних композицій як лікарського засобу. 13 WO 2016/095013 PCT/CA2015/000606

Description

(57) Реферат:

Запропоновані фармацевтичні композиції, які містять Сіи-плазміноген. В одному варіанті реалізації винаходу композиція містить модифікатор осмотичного тиску, наповнювач і стабілізатор, причому значення рН композиції становить від близько 5,0 до близько 8,0. В іншому варіанті реалізації винаходу композиція містить в суспензії кількість частинок розміром мкм або більше, що становить менш ніж 6000 частинок на ємність, де номінальним вмістом ємності становить 100 мл або менше. Включено застосування вказаних композицій як лікарського засобу.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

001) Цей винахід відноситься до галузі медицини. Більш конкретно, винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить плазміноген, та її терапевтичного застосування.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

ІЇ002| Плазміноген являє собою зимоген плазміну, як проілюстровано на Фіг. ТА.

Амінокислотна послідовність прекурсору плазміногену людини зображена на Фіг. 18.

Плазміноген людини містить 791 амінокислоту (прекурсор - 810 амінокислот) з молекулярною масою близько 90 кДа і рі близько 7,0, хоча диференціальне глікозилювання та/або видалення

М-кінцевого активаційного пептиду може давати діапазон рі від 6,2 до 8,0. Він являє собою одноланцюговий білок із 24 внутрішньоланцюговими дисульфідними містками, 5 крингл- доменами (залученими до зв'язування із фібрином та інгібітором альфа 2-антиплазміну), домен серинпротеази (Р) і активаційний пептид (АР), що складається із перших 77 амінокислот.

Наявний один М-зв'язаний сайт глікозилювання та один О-зв'язаний сайт, хоча другий О- зв'язаний сайт вже був ідентифікований (соЇдрегд 2006). Приблизно 7095 плазміногену в циркуляції містить тільки О-зв'язане глікозилювання, тоді як решта містить М- і О-зв'язані цукри. 003) Нативний плазміноген одержаний у двох основних формах, СіІи-плазміноген (СіІи-Ро) і

І уз-плазміноген (І уз-Ро), названі за М-кінцневою амінокислотою, що являє собою глутамінову кислоту або лізин. Сі0и-Руд складається із повної амінокислотної послідовності, позначеної як генна послідовність (виключаючи активаційний пептид), тоді як Гу5з-Рд є результатом розщеплення Сіцш-Ра між ГГ уз-77 і Гуз78 (підкреслені на Фіг. 18). Період напіввиведення ГІ уз-РО є значно коротшим, ніж сіІи-Ра (2-2,5 дні для СіІш-Ро, 0,8 днів для І у5-Ро). СіШ-Рд є домінантною формою Ро, яка присутня в плазмі, з дуже невеликою кількістю І у5-Рд, виявленого в циркуляції (Міоїапа, В.М., Вугпе, В., Савзіейпо Б.). (1978) Те ейпесі ої с-,ю0-Атіпо Асідв оп Нитап

Ріазтіподеп 5ігисішиге апа Асіїмайоп. / Віої Снет. 253 (15): 5395-5401; СоїІеп 0, Опа ЕВ, дойп5оп

А). (1975) Нитап Ріазтіподеп: іп Міго апа Іп Мімо Емідепсе їТог Ше Віоіодіса! Іпіедийу ої МНе-

Тегтіпа! Сішатіс Асіа Ріазтіподеп. Тиготбровів Незеагсй. 7 (4):515-529)).

ІЇ004| Плазміноген синтезується в печінці і секретується у плазму. Плазміноген розподіляється по всьому організму, і, якщо присутні умови для активації, профермент плазміногену перетворюється на активний фермент, плазмін, під дією активатора плазміногену

Зо тканинного типу (РА) або урокіназного активатора плазміногену (и-РА). Далі плазмін розщеплює фібрин і перетворює латентні матричні металопротеїнази (рго-ММР) на активні

ММР, які, в свою чергу, руйнують позаклітинний матрикс (ПКМ), що є частиною процесу ремоделювання/загоєння тканини. Активація плазміногену, опосередкована І-РА, в першу чергу залучена до гомеостазу фібрину, тоді як генерація плазміну за допомогою ци-РА, в ході якої утворюється комплекс з його рецептором и-РАК, приймає участь в ремоделюванні тканини.

І00О5) Плазмін досліджують або досліджували щодо його потенційного застосування з метою кліренсу тромботичних оклюзій у штучних пристроях і трансплантатах для гемодіалізу та для лікування заднього відшарування скловидного тіла (РМО) (05 6969515; 05 2010/0104551).

І0О6)| Плазміноген досліджується для застосування при терапевтичних показаннях, таких як загоєння ран, загоєння перфорації барабанної перетинки, загоєння рани періодонту, інфекційне захворювання, оздоровлення порожнини рота, діабетичні виразки, показання для тромболізу, таких як коронарний тромбоз, реперфузійне ураження тканини, ішемія, інфаркт, набряк мозку, покращення мікроциркуляції і модуляція шляху активації комплементу (05 8637010; 05 8679482; 05 8318661; УМО 95/12407; ЕР 0631786). До цього часу плазміноген ще не був виведений на ринок як фармацевтичний препарат.

І007| Історично, І уб-Род був присутній на фармацевтичному ринку для гематологічних цілей протягом певного періоду часу, але не застосовувався в науковій або медичній галузі з 2000 року. Склад І уз-Ру описаний у СОЇ еї а!., 1998, Те Мем Епдіапа дошигпаї ої Меадісіпе, Мої. 339,

Мо. 23, рр. 1679-1686. Хоча доступний Іу5-Руд досліджували в клініці для лікування дерев'янистих кон'юнктивітів, клінічного прояву базового стану гіпоплазміногенемії (дефіцит плазміногену типу І). Отже, Кгай еї а! випробовували системне введення концентратів І уз-Ра (Ктай, у, цер МУ, 2ешег Р, Зсп!ивіег М (2000) при дерев'янистому кон'юнктивіті у дівчинки з тяжким дефіцитом плазміногену типу !. У гаєїез Агсп Сіп Ехр ОрпПаїтої. 238(9):797-800 повідомлялося, що щоденна інфузія Губ5-Рд дитині з тяжкою гіпоплазміногенемією призводила до часткового лізису кон'юнктивальної псевдомембрани. Зспої еї аї. (1998) повідомляли, що у дитини б-місячного віку лікування препаратом ГГ узх-Рд у вигляді безперервної інфузії і пізніше у вигляді щоденної ін'єкції болюсу приводило до повної регресії дерев'янистого кон'юнктивіту в межах 4 тижнів і нормалізації гіперв'язкого секрету дихальних шляхів, а також загоєння шкірної рани. Зспизгег еї аїЇ (Зспизіег М, Нидіє В, Теї5 К (2007) Ріазтіподеп аеїйсіепсу. У Тпготр Наетозі бо 5(12):2315-2322) повідомляли, що рівні плазміногену у пацієнтів з гомозиготною або гетерозиготною (наявність двох різних мутантних алелів у певному генному локусі, по одній на кожній із пари хромосом) гіпоплазміногенемією становили від « 1 до 9 мг/дл для рівнів у плазмі антигену плазміногену та від « 195 до 5195 для функціональної активності плазміногену

Важливо відзначити, що у більшості з таких пацієнтів присутні певні залишкові рівні активності плазміногену. Таким чином, очікується, що заміщення плазміногену буде ефективним, оскільки він є ендогенним білком і не спричинятиме проблем з імуногенністю або фібрінолітичною активністю. Хоча концентрати плазміногену для системного або місцевого застосування були явно описані як ефективна терапія, що приводить до усунення і зупиняє повторне утворення уражень (Умайб5 Р, Биге5п Р, Меег Е, ЕїЇ5 А, АЇїрізені М, Ва/)7аг І, Маггіпоно М, Апагемжм М,

МабззісоПе Р, Нооїйтап ОО (2002) ЄЕПесіїме ієайтепі ої ІПдпеоиб5 сопі|ішпсіїмів мйй оріса! ріазтіподеп. Ат .) Орпійаї!тої 133(4):451-455, Неідетапп ОС, ММШатв СА, Нагпігег М, ОНапіап А,

Сіїгоп МЕ (2003) Тгтєаїтепі ої Ідпеоив сопійпсіїмів м/йй горіса! ріазтіп апа оріса! ріазтіподеп.

Согтвеа 22(8):760-762; апа Зспой, 1998), на ринку відсутній очищений продукт плазміногену для місцевої або системної терапії. 008) Тільки зовсім нещодавно були проведені клінічні випробування застосування сі-Ра для лікування дефіциту плазміногену типу І: (ідентифікатор Сіїпіса! Тгіа!5.дом МСТО2312180) і одного з його клінічних проявів -- дерев'янистого кон'юнктивіту -- із застосуванням локальних очних крапель СіІш-Ро (ідентифікатор СііпісаІТгіаі5.дом: МСТО1554956).

ЇОО9| Білки можуть бути стабілізовані шляхом зміни їх структурних характеристик (внутрішньо) талабо шляхом управління компонентами, що знаходяться у контакті з ними (іззовні). Зберігання деяких білків у фармацевтичних препаратах є проблематичним через їх фізико-хімічні характеристики, що, на жаль, часто призводить до структурної нестабільності.

Вони, наприклад, можуть зазнавати різних видів деградації, прикладами яких є наступні: 1) хімічні процеси, що призводять до утворення споріднених домішок, які можуть включати реакції гідролізу, окиснення, дезамідування або структурні перебудови, такі як ізо-азр або внутрішньомолекулярні вкорочення, або 2) фізичний процес, що призводить до агрегації/полімеризації, створюючи структурні зміни, що можуть вплинути на біологічну активність і потенційно посилити імуногенність.

ЇО010| Розробка рецептури звичайно позначає процес, в ході якого активний

Зо фармацевтичний інгредієнт (АФІ) характеризують достатньою мірою для того, щоб він міг бути перетворений на фармацевтично прийнятну субстанцію лікарського засобу. Необхідне дослідження біофізичних характеристик лікарських речовин для підтвердження наявності правильно складеної та біологічно активної структури. Для вивчення третинної структури білків у розчині та для оцінки стабільності і впливу різних умов складання на структуру білка можуть бути застосовані декілька спектроскопічних способів (флуоресценція, КД, ДСК, ДРС і т.д.). (МоїКіп, О.В. єї аї. "Реетоптиіайцйоп 5ійШдіе5 а5 ап езвзепійа! диїде то Топтиіайоп демеІортепі апа тапигасіиге ої ргоївіп рпагтасецшііса!" ЮОемеюртепі апа тапитасіиге ої ргоївіп рпагтасецііса!5.

Еадйеа Бу 5ієме Г. Маї апа Міснавє! У). АКег5, Кіимег Асадетіс 2002 Спаріеєг 1, раде 1-39; Спепод,

МУ. еї аї. "Сотрагізоп ої Нідн-Тпгоцдприї Віорпузіса! Меїподз ю Ідепійу еіабіїїгіпуд Ехсірієпів Тога

Моаве! Ідс2 Мопосіопа! Апіїбоду: Сопіоптаїййопа! єтаріїйу апа Кіпеїїс Аддгедайоп Меазигетепів"

Уоита! ої РНаптасешіса! Зсієпсеб5, Мої. 101, Мо 5, раде 1701-1720, 2012). Крім того, у фармацевтичній промисловісті структурна цілісність АФІ часто підтверджується шляхом проведення біологічного аналізу вивільнення лікарської речовини. Узяті разом, вони підтверджують, що переважна композиція не була ненавмисно модифікована в процесі складання. Плазміноген являє собою білок, який головним чином застосовується для одержання плазміну при показаннях для тромболізу, таких як коронарний тромбоз, кліренс тромботичних оклюзій у штучних пристроях і трансплантатах для гемодіалізу, при реперфузійному ураженні тканини, для лікування ішемії, інфаркту, набряку мозку або для покращення мікроциркуляції (М/О 95/12407; 05 6969515; ЕР 0631786).

ІЇ0011| Введення плазміногену також може бути корисним при багатьох терапевтичних показаннях, таких як показання для тромболізу, такі як коронарний тромбоз, лікування реперфузійного ураження тканини, лікування ішемії, інфаркту, набряку мозку або для покращення мікроциркуляції, загоєння ран, загоєння перфорації барабанної перетинки, загоєння рани періодонту, інфекційні захворювання, оздоровлення порожнини рота, діабетичні виразки, лікування суб'єктів з дефіцитом плазміногену та модуляції шляху активації комплементу (УМО 95/12407; ЕР 0631786; 5 8637010; 05 8679482; 05 8318661). 0012) Існує декілька проблем, що зустрічаються при введенні плазміногену в композиції.

Деякі проблеми є результатом забруднення композиції плазміногену плазміном, який розкладає плазміноген. Для запобігання деградації плазміногену застосовувалися різні підходи, в тому бо числі додавання апротиніну, лізину, фенілметансульфонілфлуориду, соєвого інгібітору трипсину або інгібітору серинпротеази (05 4177262; 05 4361653, 05 5304383). 0013) Інші труднощі представлені каламутністю або присутністю нитчастих речовин, коли плазміноген солюбілізують у водному розчиннику. Для подолання цього недоліку було запропоновано комбінувати плазміноген, наприклад, з неіонною поверхнево-активною речовиною або сумішшю сахарози, амінокислот і альбуміну (МО 94/15631). (0014) Не існує відомого промислового складу Сіи-Род для терапевтичного застосування у людини. Єдиними відомими складами Сіи-Род є склади для дослідження. 0015) Таким чином, існує потреба в розробці фармацевтичної композиції плазміногену.

І0016| В цьому документі присутні посилання на декілька інших документів, вміст яких включений до цього документу шляхом посилання у всій їх повноті.

КОРОТКИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ

І0017| Цей винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить плазміноген, та її застосування. 0018) Цей винахід стосується наступних пунктів 1-61:

І0019| 1. Фармацевтична композиція, що містить: 00201 - плазміноген, або його біологічно активний варіант; 00211 - модифікатор осмотичного тиску; і (Оггі - стабілізатор; 00231 причому рН композиції становить від близько 3,0 до близько 10,0.

І0024| 2. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що її значення рн становить від 5,0 до 8,0; або від 6,0 до 8,0; або від 6,5 до 7,5.

І0025| 3. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що концентрація плазміногену або його біологічно активного варіанту становить від близько 0,01 мг/мл до близько 80 мг/мл, або від близько 5 мг/мл до близько 60 мг/мл.

І0026| 4. Фармацевтична композиція за п. З, яка відрізняється тим, що концентрація плазміногену або його біологічно активного варіанту становить близько 40, 30, 20, 10 або 5 мг/мл.

І0027| 5. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-4, яка відрізняється тим, що плазміноген або його біологічно активний варіант представляє, щонайменше, 8095 від

Зо загального вмісту білка в композиції або більше 90 95 від загального вмісту білка в композиції. (0028) 6. Фармацевтична композиція за п. 5, яка відрізняється тим, що вміст плазміногену або його біологічно активного варіанту становить більш ніж 95 або 98 95 від загального вмісту білка в композиції.

І0029| 7. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-6, яка відрізняється тим, що стабілізатор містить (ї) амінокислоту, (ії) сіль амінокислоти, (ії) аналог амінокислоти або (ім) будь-яку суміш (Її), (ії) та/або (ії).

І0030) 8. Фармацевтична композиція за п. 7, яка відрізняється тим, що амінокислота, сіль амінокислоти або аналог амінокислоти являє собою аргінін, пролін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, аланін, цистеїн, лізин, аналог лізину або епсилон-амінокапронову кислоту.

І0031| 9. Фармацевтична композиція за п. 8, яка відрізняється тим, що стабілізатор є аргініном. 0032) 10. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-9, яка відрізняється тим, що стабілізатор присутній у концентрації від близько 20 мМ до близько 200 мМ

І0033| 11. Фармацевтична композиція за п. 10, яка відрізняється тим, що стабілізатор присутній у концентрації від близько 25 мМ до близько 75 мМ. (0034) 12. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-11, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску являє собою натрій хлорид, кальцій хлорид, магній хлорид, сахарозу, трегалозу, сорбіт, маніт, гліцерол, лактозу, сорбіт, декстрозу, циклодекстрин, рафінозу, поліетиленгліколь, гідроксиетилюрохмаль, гліцин, глутамінову кислоту, аланін, декстран, ПВП (полівінілпіролідон) або будь-яку їх комбінацію.

Ї0035| 13. Фармацевтична композиція за п. 12, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску є натрій хлоридом. (0036) 14. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-13, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску присутній у концентрації від близько 30 мМ до близько 250 мМ.

І0037| 15. Фармацевтична композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску присутній у концентрації від близько 25 мМ до близько 50 мМ, або в концентрації близько 35 мМ.

І0038| 16. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-15, що додатково містить (516) наповнювач.

(0039) 17. Фармацевтична композиція за п. 16, яка відрізняється тим, що наповнювач являє собою гліцин, глутамінову кислоту, аланін, маніт, сорбіт, гідроксиетилкрохмаль, декстран, ПВП (полівінілпіролідон), маніт, поліетиленгліколь, сорбіт, мальтит, лактит, мальтотриїтол, ксиліт або будь-яку їх комбінацію.

І0040| 18. Фармацевтична композиція за п. 17, яка відрізняється тим, що наповнювач є манітом або сорбітом. 0041) 19. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 16-18, яка відрізняється тим, що наповнювач присутній у концентрації від близько 50 мМ до близько 300 мМ.

І0042| 20. Фармацевтична композиція за п. 19, яка відрізняється тим, що наповнювач присутній у концентрації від близько 50 до близько 125 мМ.

І0043| 21. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-20, що додатково містить відновлюючий цукор. (0044) 22. Фармацевтична композиція за п. 21, яка відрізняється тим, що відновлюючий цукор являє собою фруктозу, манозу, мальтозу, лактозу, арабінозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, галактозу, глюкозу, сахарозу або будь-яку їх комбінацію.

І0045| 23. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-22, що додатково містить невідновлюючий цукор. (0046) 24. Фармацевтична композиція за п. 23, яка відрізняється тим, що невідновлюючий цукор являє собою сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелецитозу, рафінозу або будь-яку їх комбінацію. (0047) 25. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-24, яка відрізняється тим, що осмоляльність фармацевтичної композиції становить від близько 180 мОсм до близько 350

МмОсм.

І0048| 26. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-25, що додатково містить консервант. 0049) 27. Фармацевтична композиція за п. 26, яка відрізняється тим, що консервант являє собою м-крезол, бензиловий спирт, метанол, етанол, ізопропанол, бутилпарабен, етилпарабен, метилпарабен, фенол, гліцерол, ксиліт, резорцин, катехол, 2,6-диметилциклогексанол, 2-метил- 2,4-пентадіол, декстран, полівінілпіролідон, 2-хлорфенол, бензетоній хлорид, мертіолят

Зо (тимеросал), бензойну кислоту (пропілларабен) М.м. 180,2, бензойну кислоту М.м. 122,12, бензалконій хлорид, хлорбутанол, натрій бензоат, натрій пропіонат, цетилпіридиній хлорид або будь-яку їх комбінацію.

І0050| 28. Фармацевтична композиція за п. 26 або п. 27, яка відрізняється тим, що концентрація консерванту становить від близько 0,005 до близько 10 95 мас./об.

І0051| 29. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-28, яка відрізняється тим, що вказаний плазміноген або його біологічно активний варіант є плазміногеном людини. 0052) 30. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-29, яка відрізняється тим, що вказаний плазміноген або його біологічно активний варіант більш ніж близько на 80 95 складається із Сіи-плазміногену. 0053) 31. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-29, яка відрізняється тим, що вказаний плазміноген або його біологічно активний варіант є Сіи-плазміногеном. (0054) 32. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-31, яка відрізняється тим, що в композиції кількість частинок розміром 10 мкм або більше становить менш ніж 6000 частинок на 100 мл. (0055) 33. Фармацевтична композиція за п. 32, яка відрізняється тим, що кількість частинок становить менш ніж 2000 або 1000 частинок на 100 мл.

Ї0056| 34. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-33, придатна для внутрішньовенного, підшкірного, місцевого, внутрішньошкірного, офтальмологічного та/або внутрішньом'язового введення.

І0057| 35. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-34, що являє собою рідку композицію, придатну для ліофілізації рідку композицію, придатну для заморожування рідку композицію, ліофілізовану композицію, заморожену композицію або відновлену композицію. (0058) 36. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-34, що являє собою рідину, гель, крем або мазь.

І0059| 37. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-36 для застосування як лікарський засіб. 0060) 38. Фармацевтична композиція, що містить плазміноген або його біологічно активний варіант, в якій кількість частинок розміром 10 мкм або більше становить менш ніж 6000 частинок на 100 мл. бо 0061) 39. Фармацевтична композиція за п. 38, яка відрізняється тим, що кількість частинок становить менш ніж 2000 або 1000 частинок на 100 мл. (0062) 40. Фармацевтична композиція за п. 38 або п. 39, що додатково містить стабілізатор. 0063) 41. Фармацевтична композиція за п. 40, яка відрізняється тим, що стабілізатор містить () амінокислоту, (ії) сіль амінокислоти, (ії) аналог амінокислоти або (ім) будь-яку суміш (Її), (ії) та/або (іїї). (0064) 42. Фармацевтична композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що амінокислота, сіль амінокислоти або аналог амінокислоти являє собою аргінін, пролін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, аланін, цистеїн, лізин, аналог лізину або епсилон-амінокапронову кислоту. 0065) 43. Фармацевтична композиція за п. 42, яка відрізняється тим, що стабілізатор є аргініном. (0066) 44. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 40-43, яка відрізняється тим, що стабілізатор присутній у концентрації від близько 25 мМ до близько 75 мМ. (0067) 45. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-44, яка відрізняється тим, що концентрація плазміногену або його біологічно активного варіанту становить від близько 0,01 мг/мл до близько 80 мг/мл. (0068) 46. Фармацевтична композиція за п. 45, яка відрізняється тим, що концентрація плазміногену або його біологічно активного варіанту становить від близько 5 мг/мл до близько 60 мг/мл.

І0069| 47. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-46, яка відрізняється тим, що вміст плазміногену або його біологічно активного варіанту становить більш ніж близько 95 95 від загального вмісту білка в композиції або більш ніж 98 95 від загального вмісту білка в композиції.

І0070| 48. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-47, яка додатково містить модифікатор осмотичного тиску.

І0071| 49. Фармацевтична композиція за п. 48, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску являє собою натрій хлорид, кальцій хлорид, магній хлорид, сахарозу, трегалозу, сорбіт, маніт, гліцерол, лактозу, сорбіт, декстрозу, рафінозу, поліетиленгліколь, гідроксиетилкрохмаль, гліцин, глутамінову кислоту, аланін, декстран, ПВП (полівінілпіролідон) або будь-яку їх комбінацію.

Зо І0072| 50. Фармацевтична композиція за п. 49, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску є натрій хлоридом. 0073) 51. Фармацевтична композиція за п. 48, п. 49 або п. 50, яка відрізняється тим, що модифікатор осмотичного тиску присутній в концентрації від близько 30 мМ до близько 250 мМ.

І0074| 52. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-51, яка додатково містить наповнювач. 0075) 53. Фармацевтична композиція за п. 52, яка відрізняється тим, що наповнювач являє собою гліцин, глутамінову кислоту, аланін, маніт, сорбіт, гідроксиетилкрохмаль, декстран, ПВП (полівінілпіролідон), маніт, поліетиленгліколь, сорбіт, мальтит, лактит, мальтотриїтол, ксиліт або будь-яку їх комбінацію.

І0076| 54. Фармацевтична композиція за п. 53, яка відрізняється тим, що наповнювач є манітом або сорбітом.

І0077| 55. Фармацевтична композиція за п. 52, п. 53 або п. 54, яка відрізняється тим, що наповнювач присутній в концентрації від близько 50 мМ до близько 300 мМ. (0078) 56. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-55, яка відрізняється тим, що осмоляльність фармацевтичної композиції становить від близько 180 мОсм до близько 350

МмОсм. (0079) 57. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-61, яка відрізняється тим, що значення рН фармацевтичної композиції становить від близько 6,5 до близько 8,0. (0080) 58. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-57, яка відрізняється тим, що плазміноген або його біологічно активний варіант є плазміногеном людини. (0081) 59. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-58, яка відрізняється тим, що вказаний плазміноген або його біологічно активний варіант складається із понад 80 95 СІШ- плазміногену. (0082) 60. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-58, яка відрізняється тим, що вказаний плазміноген або його біологічно активний варіант є Сіи-плазміногеном.

І0083| 61. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 38-60 для застосування як лікарський засіб.

І0084| Інші аспекти винаходу будуть очевидними для фахівця в цій галузі техніки з наступного опису, формули винаходу та узагальнення в цьому документі. 60 КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

(0085) Фіг. ТА являє собою схематичне зображення первинної структури плазміногену, на якому проілюстровано його крингл-домени, сайт розщеплення плазміном і сайт зв'язування із стрептокіназою. (0086) На Фіг. 18 проілюстрована амінокислотна послідовність прекурсору плазміногену людини. Послідовність зрілої форми наведена напівжирним накресленням шрифту, і два залишки лізину, між якими відбувається розщеплення з утворенням І уб5-Ро, підкреслені.

І0087| Фіг. 2 являє собою зображення флакона, що містить плацебо (без Ро) Складу 1 після ліофілізації. (0088) Фіг. З являє собою зображення флакона, що містить Склад 1 (описаний у Табл. 1А) після ліофілізації. 0089) Фіг. 4 являє собою зображення флакона, що містить плацебо (без Ро) Складу 2 після ліофілізації. 00901 Фіг. 5 являє собою зображення флакона, що містить Склад 2 (описаний у Табл. 1А) після ліофілізації. 00911 Фіг. 6 являє собою зображення флакона, що містить плацебо (без Ро) Складу З після ліофілізації. 00921 Фіг. 7 являє собою зображення флакона, що містить Склад З (описаний у Табл. 1А) після ліофілізації. 0093) Фіг. 8 являє собою зображення флакона, що містить плацебо (без Ро) Складу 4 після ліофілізації. (0094) Фіг. 9 являє собою зображення флакона, що містить Склад 4 (описаний у Табл. 1А) після ліофілізації. 0095) Фіг. 10 являє собою зображення флакона, що містить плацебо (без Ро) Складу 5 після ліофілізації. 0096) Фіг. 11 являє собою зображення флакона, що містить Склад 5 (описаний у Табл. 1А) після ліофілізації.

І0097| Фіг. 12 являє собою зображення флаконів ліофілізованої композиції Мо РГО498, що містить 20 мг/мл плазміногену в 10 мМ Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, і 28,5 мМ аргініну (0,5 Об). 0098) Фіг. 13 являє собою зображення флаконів ліофілізованої композиції Мо РО449, що

Зо містить 10 мг/мл плазміногену в 10 мМ розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2, 28,5 мМ аргініну (0,5 Фо) і 54 мМ маніту (1 95). 00991 Фіг. 14 являє собою зображення флаконів ліофілізованої композиції Мо РО459, що містить 20 мг/мл плазміногену в 10 мМ розчині Ма фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 28,5 мМ аргініну (0,5 Фо) і 54 мМ маніту (1 95). 00100) Фіг. 15 являє собою зображення флаконів, що містять 5 мг/мл плазміногену у воді (Зразок 0), у 10 мМ натрій-цитратному буфері, рН 6,5 (Зразок 1), 10 мМ натрій-фосфатному буфері, рН 7,2 (Зразок 2), і 10 мМ Трис-НСІ буфері рН 8,0 (Зразок 3), окрім стандартів каламутності 0,02, 20, 100, 800 нефелометричних одиниць каламутності (НОК), відповідно. 00101) Фіг. 16 являє собою зображення тих же флаконів, що проілюстровані на Фіг. 12, за винятком того, що 35 мМ Масі і 28,5 мМ (0,5 95) Агу були додані для Зразків 1, 2 і 3.

І00102| На Фіг. 17, 18 ї 19 представлені графіки, що ілюструють каламутність протягом 4 годин для композицій, що містять 10 мг плазміногену, 35 мМ масі, 0,5 95 гліцину, аргініну, аланіну і без амінокислоти, при рн 6,5 у натрій-цитратному буфері (Фіг. 17), при рН 7,2 в натрій- фосфатному буфері (Фіг. 18), і при рН 8,0 у Трис-буфері (Фіг. 19). 001031 Фіг. 20, 21 і 22 являють собою графіки, що ілюструють каламутність протягом 4 годин для композицій, що містять 10 мг плазміногену, 35 мМ масі, 0,5 95 маніту і 0,5 95 гліцину, аргініну, аланіну та без амінокислоти, при рн 6,5 в натрій-цитратному буфері (Фіг. 20), рН 7,2, в натрій-фосфатному буфері (Фіг. 21) і при рН 8,0 у Трис-буфері (Фіг. 22).

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

00104) В цьому документі описана фармацевтична композиція, що містить плазміноген або його біологічно активний варіант. (00105) В цьому документі також описана фармацевтична композиція, що містить: - плазміноген або його біологічно активний варіант; - модифікатор осмотичного тиску; і - стабілізатор; причому значення рН композиції становить від близько 3,0 до близько 10,0; переважно від близько 5,0 до близько 8,0; більш переважно, від близько 6,0 до близько 8,0; і, ще більш переважно, від близько 6,5 до близько 7,5. 00106) Цей винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить плазміноген або 60 його біологічно активний варіант з підвищеною робастністю. Цей винахід відноситься до фармацевтичної композиції, що містить плазміноген або його біологічно активний варіант, в якій кількість частинок розміром 10 мкм або більше становить менш ніж 6000 частинок на 100 мл композиції або менш ніж 5000 частинок на 100 мл композиції, або менш ніж 4000 частинок на 100 мл композиції, або менш ніж 3000 частинок на 100 мл композиції. або менш ніж 2000 частинок на 100 мл композиції, або менш ніж 1000 частинок на 100 мл композиції. В одному варіанті реалізації цього винаходу кількість частинок залишається низькою після ліофілізації і відновлення. В одному варіанті реалізації цього винаходу у відтворюваних складах однієї і тієї ж композиції варіація кількості частинок відсутня.

І00107| Термін "плазміноген" в цьому документі відноситься до будь-якої форми нативного поліпептиду плазміногену (наприклад, плазміногену, СіІи-плазміногену або Іуз-плазміногену) будь-якої тварини, наприклад ссавця (наприклад, людини). Плазміноген являє собою профермент, що перетворюється на активний фермент плазмін під дією активатора плазміногену тканинного типу (-РА) або урокіназного активатора плазміногену (и-РА). Далі плазмін розщеплює фібрин і перетворює латентні матричні металопротеїнази (рго-ММР) на активні ММР, які, у свою чергу, додатково руйнують позаклітинний матрикс (ПКМ), що є частиною процесу ремоделювання/загоєння тканини. Термін "біологічно активний варіант" в цьому документі відноситься до мутантного поліпептиду плазміногену, що зберігає біологічну активність нативного плазміногену, тобто можливість перетворюватися на поліпептид плазміну (ЕРА та/або и-РА), що здатний розщеплювати фібрин і перетворювати латентні матричні металопротеїнази (рго-ММР) на активні ММР. Варіант може містити одну або декілька амінокислотних замін, делецій/вкорочень (М-кінцевих, С-кінцевих та/або делецій/вкорочень внутрішніх амінокислот), додавань (М-кінцевих, С-кінцевих та/або внутрішніх амінокислотних додавань). Біологічно активні варіанти можуть виявляти біологічну активність (наприклад, ферментативну активність результуючого плазміну), що є нижчою, вищою або аналогічною по відношенню до нативного поліпептиду плазміногену. У варіантах реалізації винаходу варіант володіє щонайменше 60, 70, 75, 80, 85, 90 або 95 95 ідентичністю амінокислотної послідовності з амінокислотною послідовністю нативного поліпептиду плазміногену. Біологічно активні варіанти плазміногену описані, наприклад, у М/О2012/093132, ММО2013/024074 і УМапо еї аї. (1995, Ргоївїп

Зсіепсе 4, 1758-1767) і включають вкорочені варіанти плазміногену, звичайно під назвою "мідіплазміноген", "мініплазміноген", "мікроплазміноген" і "дельта-плазміноген", які позбавлені одного або більше крингл-доменів та/або їх частин. В одному варіанті реалізації винаходу плазміноген є плазміногеном людини. У відповідності до ще одного варіанту реалізації винаходу композиція містить нативний плазміноген людини. Плазміноген може бути одержаний з декількох джерел. Він може бути одержаний за допомогою рекомбінантного синтезу або екстрагований із крові, плазми або одержаного із крові розчину та очищений. Плазміноген може бути добутий із крові або плазми шляхом фракціонування за Сопп або осадження. Плазміноген може бути очищений із плазми або одержаного із крові розчину шляхом зв'язування в ході афінної хроматографії, як у способі описаному у УМО 2006/120423, або одержаний рекомбінантним шляхом. 00108) В одному варіанті реалізації винаходу плазміноген або його біологічно активний варіант присутній у концентрації від близько 0,01 мг/мл до близько 80 мг/мл; переважно від близько 1 мг/мл до близько 60 мг/мл, переважно від близько 5 мг/мл до близько 60 мг/мл; переважно від близько 5 мг/мл до близько 40 мг/мл; переважно від близько 2 мг/мл до близько 30 мг/мл, більш переважно, від близько 2 мг/мл до близько 20 мг/мл, і, більш переважно, близько 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 14,13,12,11,10,9,8,7,6,5,4,3,2,1,0,5,0,1, 0,05 або 0,01 мг/мл.

ІЇ00109| В одному варіанті реалізації цього винаходу чистота плазміногену або його біологічно активного варіанту, що міститься у фармацевтичній композиції, становить більш ніж близько 80 95 або більш ніж близько 90 95, або більш ніж близько 95 95, або більш ніж 98 95.

Термін "близько" позначає варіацію значення в межах 10 95. 00110) рН композиції може становити від близько 3,0 до близько 10,0; від близько 5,0 до близько 8,0; від близько 6,0 до близько 8,0; або від близько 6,5 до близько 7,5. У варіантах реалізації цього винаходу рН композиції становить близько 3,0, 3,5, 4,0, 4,5,5,0,5,5,6,0,6,1,6,2, 6,3,6,4,6,5,6,6,6,7,6,8,6,9,7,0,7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 або 10.0. Для підтримання такого рН композиції ця композиція переважно містить буферну речовину. Численні буферні речовини можуть застосовуватися в межах об'єму цього винаходу, що включає наступні буферні речовини, в залежності від бажаного значення рн.

й - 3,0,3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, від 6,5 до 7,0, 7,5, 8,0 і будь-яке або 5,5 або 8,0 істидиновий й або від 6,5 до 7,0

ІЇ00111| В одному варіанті реалізації цього винаходу буфер містить комбінацію двох буферних речовин; таку як цитрат/фосфат, цитрат/гістидин, ацетат/гістидин або сукцинат/гістидин. В одному варіанті реалізації цього винаходу буфер не містить цитратної буферної речовини. В іншому варіанті реалізації цього винаходу буфер є цитратним, фосфатним (КаНнРОЗ/МанНРоО»), гістидиновим або сукцинатним. У іншому варіанті реалізації винаходу буфер є фосфатним (КаНнРО./МанРрОо»), гістидиновим або сукцинатним. 00112) У варіанті реалізації винаходу концентрація буфера становить від близько 10 мМ до близько 50 мМ або від близько 10 мМ до близько 30 мМ, наприклад, від близько 2 мМ до близько 10 мМ. 00113) В цьому документі термін "модифікатор осмотичного тиску" відноситься до сполуки, яка застосовується для корекції осмотичного тиску фармацевтичної композиції. В одному варіанті реалізації винаходу модифікатор осмотичного тиску присутній у кількості, яка робить композицію ізотонічною. В іншому варіанті реалізації винаходу модифікатор осмотичного тиску присутній у кількості, яка робить композицію гіпертонічною або гіпотонічною. В одному варіанті реалізації винаходу модифікатор осмотичного тиску є натрій хлоридом, кальцій хлоридом, магній хлоридом, калій хлоридом, Маг5О4, 2пСіІ», боратом, фармацевтично прийнятною одноосновною сіллю, фармацевтично прийнятною двохосновною сіллю, фармацевтично прийнятною трьохосновною сіллю, фармацевтично прийнятною тетраосновною сіллю, сахарозою, трегалозою, сорбітом, манітом, гліцеролом, лактозою, сорбітом, декстрозою, циклодекстрином, рафінозою, цукровим спиртом, поліетиленгліколем, гідроксиетилкрохмалем, гліцином, глутаміновою кислотою, аланіном, ПВП (полівінілпіролідон) декстраном або будь- якою їх комбінацією. Термін "ізотонічний" означає, що композиція за цим винаходом має по суті такий же осмотичний тиск, як осмотичний тиск крові людини. Осмотичний тиск ізотонічних композицій звичайно становить від близько 250 до близько 330 мОсм. Осмотичний тиск можна виміряти із застосуванням, наприклад, осмометра, що вимірює тиск пари або температуру замерзання. В одному варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція містить суміш двох модифікаторів осмотичного тиску. В іншому варіанті реалізації винаходу фармацевтична

Зо композиція містить суміш трьох модифікаторів осмотичного тиску. В одному варіанті реалізації винаходу модифікатор осмотичного тиску є цукром або містить цукор або суміш цукрів. У одному варіанті реалізації винаходу модифікатор осмотичного тиску є натрій хлоридом. В одному з варіантів реалізації винаходу концентрація модифікатора осмотичного тиску становить від близько 30 ММ до близько 250 мМ, або від близько 20 мМ до близько 150 мМ, або від близько 30 мМ до близько 100 мМ. В одному варіанті реалізації винаходу концентрація модифікатора осмотичного тиску становить близько 34 мМ або близько 35 мМ або близько 68

ММ або близько 75 мМ. У варіанті реалізації винаходу концентрацію модифікатора осмотичного тиску регулюють таким чином, щоб результуючий осмотичний тиск композиції знаходився у межах необхідного діапазону. 00114) В одному варіанті реалізації винаходу композиція додатково містить наповнювач. У цьому документі термін "наповнювач" відноситься до сполуки/агента, яка збільшує об'ємну масу композиції. Приклади наповнювачів включають, але не обмежуючись цим, гліцин, глутамінову кислоту, аланін, манітол, гідроетилкрохмаль, декстран, ПВП (полівінілпіролідон), маніт, сорбіт, одержаний з олігосахариду цукровий спирт, мальтит, лактит, мальтотриїтол, ксиліт, поліетиленгліколь, сахарозу, глюкозу, мальтозу, ХогріоЇ, Масі або будь-яку їх комбінацію.

Додатково, вказані агенти можуть служити модифікаторами осмотичного тиску. У варіантах реалізації винаходу концентрація наповнювача становить від близько 50 мМ до близько 300 мМ або від близько 100 мМ до близько 200 мМ або близько 150 мМ або від близько 50 мМ до близько 150 мМ або близько 108 мм або близько 54 мМ.

ІЇ00115| В одному варіанті реалізації цього винаходу модифікатор осмотичного тиску і наповнювач присутні в таких концентраціях, що співвідношення модифікатора осмотичного тиску/лаповнювача становить від близько 1,0 до близько 15,0 (мас./мас.); від близько 1,0 до близько 10,0, від близько 3,0 до близько 10,0, від близько 5,0 до близько 10,0, наприклад, близько 5,0, близько 8,0 або 10,0. В одному варіанті реалізації винаходу концентрація наповнювача регулюється на базі концентрації модифікатора осмотичного тиску таким чином, що співвідношення модифікатора осмотичного тиску/лаповнювача знаходиться у бажаному діапазоні. 00116) У варіантах реалізації винаходу композиція додатково містить один або більше додаткових фармацевтично прийнятних інгредієнтів, таких як носії, допоміжні речовини,

Зо наповнювачі, розбавлювачі, стабілізатори, буфери і т.п.

І00117)| В одному варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція додатково містить цукор, наприклад, відновлюючий та/"або невідновлюючий цукор. В цьому документі "відновлюючий цукор" є таким, який містить геміацетальну групу, що здатна відновлювати іони металів або ковалентно реагувати з лізином та іншими аміногрупами у білках, а "невідновлюючий цукор" позначає такий, що не володіє такими властивостями відновлюючого цукру. В одному з варіантів реалізації винаходу відновлюючий цукор являє собою фруктозу, манозу, мальтозу, лактозу, арабінозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, галактозу, глюкозу або будь-яку їх комбінацію. В одному варіанті реалізації винаходу невідновлюючий цукор являє собою сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелецитозу, рафінозу або будь-яку їх комбінацію. В одному варіанті реалізації винаходу фармацевтичну композицію за цим винаходом ліофілізують у присутності відновлюючого цукру В одному варіанті реалізації цього винаходу фармацевтичну композицію за цим винаходом ліофілізують у присутності невідновлюючого цукру. 00118) У деяких варіантах реалізації винаходу осмотичний тиск фармацевтичної композиції за цим винаходом становить від близько 180 мОсм до близько 350 моОсм, або від близько 250 мОсм до близько 350 мОсм, або від близько 200 мОсм до близько 300 мОсм. У деяких варіантах реалізації, наприклад, в процесі приготування вказаної композиції для ліофілізації її осмотичний тиск може становити більш ніж 350 мОсм. В такому випадку розчин після розведення може мати об'єм, більший за об'єм композиції, для того, щоб розбавити компоненти і зменшити осмотичний тиск. Крім того, у випадку, якщо композиція призначена для введення невеликого об'єму, осмотичний тиск композиції може бути вищим за 350 моОсм.

І00119| В цьому документі термін "стабілізатор" відноситься до агента, який стабілізує плазміноген у розчині. В одному варіанті реалізації винаходу стабілізатор містить амінокислоту, сіль амінокислоти, аналог амінокислоти або будь-яку їх суміш. У додатковому варіанті реалізації винаходу амінокислота, сіль амінокислоти, аналог амінокислоти або їх суміш являє собою аргінін, пролін, глутамінову кислоту, аспарагінову кислоту, гліцин, аланін, цистеїн, лізин, аналог лізину, такий як епсилон-амінокапронова кислота або будь-яку їх комбінацію. У переважному варіанті реалізації винаходу вказана амінокислота може бути присутня у формі основи амінокислоти, такої як лізину гідрохлорид і аргініну гідрохлорид. У одному варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція містить дві амінокислоти, солі амінокислот та/або аналоги бо амінокислот. У іншому варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція містить три амінокислоти, солі амінокислот та/(або аналоги амінокислот. У деяких варіантах реалізації винаходу концентрація амінокислоти становить від близько 10 мМ до 300 мМ, від близько 20 мМ до близько 200 мМ або від близько 10 мМ до близько 100 мМ, або від близько 25 мМ до близько 75 мМ, або близько 10 мМ, або близько 25 мМ, або близько 50 мМ, або близько 75 мМ, або близько 100 мМ, близько 150 мМ, близько 200 мМ, близько 250 мМ або близько 300 мМ. (00120) В іншому варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом додатково містить антиоксидант. В одному з варіантів реалізації винаходу антиоксидант являє собою метіонін, окиснений глутатіон (сіІи-Сувз-Спу)г (613 кДа), аскорбінову кислоту, М-ацетилі-ї - цистеїн/гомоцистеїн, глутатіон, б-гідрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоксильну кислоту (ТтоїохФ), ліпоєву кислоту, натрій тіосульфат, платину, гліцин-гліцин-гістидин (трипептид), бутильований гідрокситолуен (БГТ) або будь-яку їх комбінацію. В деяких варіантах реалізації винаходу концентрація антиоксиданту становить від близько 10 мМ до близько 200 мМ, наприклад, близько 10 мМ, близько 50 мМ, близько 100 мМ, близько 150 мм або близько 200

ММ.

І00121| В іншому варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом додатково містить поверхнево-активну речовину. В цьому документі термін "поверхнево- активна речовина" відноситься до сполуки/агента, що знижує поверхневий натяг між рідиною і твердою речовиною при розчиненні у розчині. В одному варіанті реалізації винаходу поверхнево-активна речовина являє собою Полісорбатф 80, Полісорбатф 20, Ріпгопісю Е-68 або

ВгіФ 35; полоксамери (наприклад, полоксамер 188 або РіигопісФб Е-68); ТгйопФ; натрій додецилсульфат (НДС); натрій лаурилсульфат; натрій октилглікозиду; лаурил-, міристила, лінолеїл- або стеарилсульфобетаїн; лаурил-, міристил-, лінолеїл- або стеарилсаркозин; лінолеїл-, міристил- або цетилбетаїн; лауроамідопропіл-, кокамідопропіл-, лінолеамидопропіл- міристамідопропіл, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропіл-бетаїн (наприклад, лауроамідопропіл); міристамідопропіл, пальмідопропіл- або ізостеарамідопропіл-диметиламін; - метил-кокоїл-натрій, олеїлтаурат або динатрійметил; і серія МОМАОШАТ М (Мопа Іпдивілев, Іпс.

Патерсон, Нью-Джерсі), поліетилгліколь, поліпропілгліколь або кополімери етилену і пропіленгліколю або будь-яку їх комбінацію У варіанті реалізації винаходу концентрація поверхнево-активної речовини регулюється для зменшення агрегації плазміногену, його

Зо біологічно активного варіанту або фрагменту та/або мінімізації утворення частинок в композиції та/або зменшення адсорбції. В одному варіанті реалізації винаходу поверхнево-активна речовина присутня у композиції в концентрації від близько 0,001 до 1 95 (мас./об.), від близько 0,002 95 до близько 0,02 95 (мас./0о6.) або від близько 0,002 95 до близько 0,006 95 (мас./о06.). У деяких варіантах реалізації винаходу композиція містить поверхнево-активну речовину, що є полоксамером. У деяких варіантах реалізації цього винаходу композиція містить Ріигопістю 68.

У конкретних варіантах реалізації винаходу композиція містить від близько 0,01 95 (мас./об.) до близько 1 95 (мас./об.) РіогопісФф Еб8, наприклад, близько 0,1 95 (мас./об.) Рійгопіс Ф 68. В одному з варіантів реалізації винаходу композиція по суті не містить або взагалі не містить неіонної поверхнево-активної речовини, наприклад, композиція містить менш ніж близько 0,02 сь, 0,01 У, 0,006 95 або 0,004 95 (мас./об.) неіонної поверхнево-активної речовини. (00122) В іншому варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом додатково містить полімерний стабілізатор. В одному варіанті реалізації винаходу полімерний стабілізатор являє собою гепарин (від 6 до 30 кДа); поліамінокислоту (від 2 до 100 кДа), таку як полі(сІш), полі(Аб5р) і полі(сіш, Ріє); карбоксиметилцелюлозу (10-800 сП); циклодекстрин; сульфат декстрану або будь-яку їх комбінацію. У деяких варіантах реалізації винаходу концентрація полімерного стабілізатора становить від близько 0,001 95 до близько 0,50 95 або від близько 0,001 95 до близько 0,25 9.

І00123| В іншому варіанті реалізації фармацевтична композиція за цим винаходом додатково містить поліетиленгліколь, наприклад, ПЕГ 200, ПЕГ 400, ПЕГ 1000, ПЕГ 4000, ПЕГ 8000, ПЕГ 10000 або будь-яку їх комбінацію. В одному з варіантів реалізації винаходу концентрація поліетиленгліколю становить від близько 0,5 95 до близько 10 95 (мас./маб.). 00124) В одному варіанті реалізації цього винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом додатково містить консервант. В цьому документі "консервант" відноситься до сполуки/агента, що може бути додана до фармацевтичної композиції для суттєвого зменшення активності бактерій у ній, і, таким чином, спрощується одержання, наприклад, багатодозової фармацевтичної композиції. Приклади консервантів включають м-крезол, бензиловий спирт, метанол, етанол, ізопропанол, бутилпарабен, етилпарабен, метилпарабен, фенол, гліцерол, ксиліт, резорцин, катехол, 2,6-диметилциклогексанол, 2-метил-2,4-пентадіолу, декстран, полівінілпіролідон, 2-хлорфенол, бензетоній хлориду, мертіолят (тимеросал), бензойну кислоту 60 (пропілпарабен) М.м. 180,2, бензойну кислоту М.м. 122,12, бензалконій хлориду, хлорбутанол,

натрій бензоат, натрій пропіонат або цетилпіридиній хлорид. Консервант вибирають для сумісності з буфером та іншими компонентами фармацевтичної композиції (тобто, розчин є прозорим). Наприклад, якщо буфер є натрій ацетатом або натрій фосфатом, сумісні консерванти включають метанол, етанол, ізопропанол, гліцерол, резорцин, 2-метил-2,4- пентадіол, мертіолят (тимеросал), бензалконій хлорид, натрій бензоат або цетилпіридиній хлорид. Концентрація консерванту для застосовування у композиції за цим винаходом може бути визначена відповідно до рішення фахівців у цій галузі техніки. У деяких варіантах реалізації винаходу концентрація консерванту становить від близько 0,005 95 до близько 10 95 (мас./об.), від близько 0,1 до близько 1,0 95 (мас./0б.) або від близько 0,3 до близько 0,7 95 (мас./о6.). У деяких варіантах реалізації винаходу концентрація консерванту становить близько 0,005,0,1,0,3, 0,5, 0,7 або 1,0 95 (мас./об.).

І00125| В іншому варіанті реалізації фармацевтична композиція за цим винаходом не містить консерванту.

ІЇ00126| Один або більше додаткових фармацевтично прийнятних носіїв, допоміжних речовин або стабілізаторів, таких як описані у Кетіпдіоп'є Ріаптасеціїса! 5сіепсев5, 194 еайіоп,

Сепагто А. Еа.(1995), можуть бути введені до цієї композиції за умови, що вони не чинять значного негативного впливу на бажані характеристики фармацевтичної композиції за винаходом. Додаткові складові елементи композиції за цим винаходом можуть включати воду, наприклад, воду для ін'єкцій, рослинне масло, загусник, такий як метилцелюлоза, анти- адсорбент, зволожуючий агент, антиоксиданти, в тому числі аскорбінову кислоту і метіонін, хелатувальні агенти, такі як ЕДТА; комплекси металів (наприклад, комплекси 2п-білок), біорозщеплювані полімери, такі як поліестери, та/або солеутворюючі протиїіони, такі як натрій і т.д. Прийнятні носії, наповнювачі або стабілізатори присутні у такій кількості, що вони є нетоксичними для суб'єктів у застосовуваних дозах і концентраціях.

І00127| В одному варіанті реалізації винаходу загальна маса твердої речовини у фармацевтичній композиції за цим винаходом становить від близько 3,5 95 до близько 8 95 при ліофілізації, переважно від близько 3,5 95 до близько 6 95 та більш переважно від близько 3,8 95 до 5,595. Збільшення концентрації компонентів у фармацевтичній композиції за винаходом приводить до збільшення загального 95 твердої речовини у ліофілізованій композиції і

Зо покращення зовнішнього вигляду осаду ліофілізованої композиції. 00128) В одному з варіантів реалізації винаходу плазміноген або його варіант являє собою

І уз- або СіІи-плазміноген. У іншому варіанті реалізації винаходу плазміноген або його варіант являє собою СіІи-плазміноген. В одному з варіантів реалізації винаходу плазміноген або його варіант складається із різних видів та/або варіантів плазміногену. Переважно, вміст (їШ- плазміногену становить більш ніж 50 95 від загального вмісту плазміногену або його варіантів або більш ніж 60 95, або більш ніж 70 95, або більш ніж 80 95, або більш ніж 90 95.

І00129| Варіантом реалізації цього винаходу є фармацевтична композиція, що містить плазміноген або його варіант, причому в композиції загальна кількість білка, що не є плазміногеном або його варіантом, становить менш ніж близько 10 95, менш ніж близько 5 95 або менш ніж близько 2 95. Варіантом реалізації цього винаходу є фармацевтична композиція, що містить плазміноген або його варіант, причому композиція не містить або практично не містить додаткового білка (тобто, на додаток до плазміногену або його варіанту). В одному варіанті реалізації цього винаходу композиція не містить або практично не містить альбуміну. В одному варіанті реалізації цього винаходу композиція не містить або практично не містить апротиніну. В одному варіанті реалізації цього винаходу композиція не містить або по суті не містить інгібітору трипсину. В одному варіанті реалізації цього винаходу композиція не містить або по суті не містить інгібітору серинпротеази. В одному варіанті реалізації цього винаходу композиція не містить або практично не містить плазміну. В одному варіанті реалізації цього винаходу композиція по суті не містить або взагалі не містить поверхнево-активної речовини, тобто концентрація поверхнево-активної речовини становить менш ніж 0,01 мМ.

І00130| В одному варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція, що містить плазміноген за цим винаходом, є стабільною при кімнатній температурі протягом щонайменш 2 годин, 24 годин, тижня або місяця.

І00131| В одному варіанті реалізації винаходу фармацевтична композиція, що містить плазміноген за цим винаходом, є стабільною при температурі нижче 0"С протягом щонайменше 3 місяців, протягом щонайменше 6 місяців, протягом щонайменше 12 місяців або протягом щонайменше 24 місяців. Вказана температура нижче за 0 "С становить близько - 20 "С, близько -30 "С, близько -60 "С, близько -70 "С або близько -80 "С.

І00132)| У деяких варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція, що містить 60 плазміноген, є рідкою композицією, придатною для ліофілізації рідкою композицією, придатною для заморожування рідкою композицією, ліофілізованою композицією, замороженою композицією або відновленою композицією.

І00133| Термін "Фармацевтична композиція" позначає композицію для фармацевтичних, медичних або терапевтичних цілей. 00134) Всі комбінації компонентів, описаних в цьому документі (рН, буфер, модифікатор осмотичного тиску, наповнювач, стабілізатор і т.д.) та їх відповідні концентрації для фармацевтичної композиції за цим винаходом, конкретно включені до цього винаходу.

Репрезентативні приклади фармацевтичних композицій плазміногену (Ро) відповідно до цього винаходу представлені у Табл. 1А.

Таблиця 1А «ря вне осмотичного тиску 73 мМ сахарози 67 мМ гліцину 68,4 мм масі; цитратний 73 мМ сахарози 33.5 ММ гліцину 34,22 мМ Масі цитратний 117 мм сахарози 67 мМ гліцину 68,4 мм масі; цитратний 117 мм сахарози 67 мМ гліцину 34,22 мМ Масі цитратний 73 мМ сахарози 67 мМ гліцину 34,22 мМ Масі цитратний во |вмомлі! дм 73 мМ сахарози 67 мМ гліцину 75,3 мМ Масі итратний 10 мм . 79 мМ сахарози 40 мМ гліцину 75:.4М Масі во) вмимл! доми 77 ММ сахарози 47 мМ гліцину 75 мМ Масі цитратний 9 | вмимл! доми 75 мМ сахарози 54 мМ гліцину 75 мМ Масі цитратний 10 мм 50-150 мМ . 50-150 мМ маніту| 25-75 мМ гліцину 35-150 мм масі цитратний 10 мм 50-150 мМ . 10 мм 50-150 мМ .. 50-150 мМ маніту| 25-75 мМ аргініну | 35-150 мм масі цитратний 10 мм 50-150 мМ .. 10 мм 50-150 мМ . 50-150 мМ маніту| 25-75 мМ гліцину 35-150 мм масі фосфатний 10 мм 50-150 мМ . 10 мм 50-150 мМ .. 10 мм . с. 50-150 мМ маніту| 25-75 мМ аргініну | 35-150 мм масі 10 мм 50-150 мМ .. (00135) Інші характерні приклади фармацевтичних композицій у відповідності до цього винаходу представлені у Табл. 18 нижче для композицій, що містять від близько 0,01 мг/мл до близько 80 мг/мл і переважно від 5 до 60 мг/мл плазміногену або його варіанту, значення рн яких становить від 6,5 до 8,0. У всіх наведених прикладах переважна частина плазміногену в основному складається із Сіи-плазміногену, а загальний вміст плазміногену або його варіанту знаходиться в діапазоні від 5 мг/мл до 60 мг/мл.

Таблиця 18 ен сни» ее пиши и ПО ох ОСИ СТ Ето ПО 2 | 77777771717171717- 11111111 | 25 мМаріннунсі // З5мм Мас! З 8 77777771717117- 11111. | БО мМаргіннунсі // З5ммМ Мас! З 6 | лОбмМманту | 25мМаргіннунсі | З5ммМ Мас! 8 | 5омМсорбту | 25мМаргіннунсі | Зб5ммМ Мас! 9 | БОмМсорбту | 5ОмМаргіннунсі | Зб5ммМ Мас! 212 | 77771117 -111111711111111111111-1111111111111111111115оммМмас!/ 713 | 7777717171717171717- 11111111 25мМаріннунсі 0 5омМ Мас! 714 | 77771717171717- 11111111 | 5омМаріннунсі 7 5омМ Мас! 23 17777717171717171717-1111111111111|7111 о 25мМаргіннунсї7/// 0/7 -11111СсС1С 24 177777777171717117-1111111111111|7111 о 5омМаргіннунсї//// 0/7 -11111СсС21С 25 | 7777171717171717171-1111111111110 71111 75мМаргіннунсїї7/// 0/7 -111111СсС1С шви ти ТТ вто НОЯ ПО 27 1177111111171-1111111111111|7111 о 25мМаргіннунсї/// 0/7 -11111СсС1С 28 17777771 -1111111111111|17111 о 5ОомМаргіннунСїї/// 0/7 -111111СсС1С 29 1777777771717117-1111111111111 71111 75мМаргіннунсїї7//// 0/7 -11111СсС1С 80 17777717 -1111111111110 | лбомМаргіннунсї/7/ | 77777777 -77717С7С211 00136) В одному варіанті реалізації цього винаходу фармацевтична композиція, що містить плазміноген за цим винаходом, є придатною для внутрішньовенного, підшкірного, місцевого, внутрішньошкірного, офтальмологічного або внутрішньом'язового введення.

І00137| У відповідності до одного з варіантів реалізації винаходу фармацевтична композиція за цим винаходом призначена для введення людині. Переважно фармацевтична композиція за цим винаходом призначена для внутрішньовенного, підшкірного, місцевого, внутрішньом'язового або офтальмологічного введення. В одному варіанті реалізації винаходу композиція за цим винаходом знаходиться у формі рідини, гелю, крему або мазі. 00138) Плазміноген, введений у композицію за цим винаходом, може бути одержаний із декількох джерел. Він може бути одержаний за допомогою рекомбінантного синтезу або екстрагований та очищений із крові, плазми або одержаного із крові розчину. Плазміноген може бути добутий із крові або плазми шляхом фракціонування за Сопп або осадження. Плазміноген може бути очищений із плазми або одержаного із крові розчину шляхом зв'язування в ході афінної хроматографії наприклад, способом, описаним у УМО 2006/120423. Варіант плазміногену включає, але не обмежуючись цим, будь-які модифікації амінокислотної послідовності або будь-яке додавання до нього хімічної групи або будь-яке додавання до нього амінокислоти або амінокислотної послідовності. Фрагмент плазміногену включає, але не обмежуючись цим, будь-які делеції амінокислот або амінокислотної послідовності у вказаному фрагменті.

ІЇ00139| В цьому документі термін "близько" передбачає охоплення ж або -10 95 від відповідної величини. 00140) Термін "суб'єкт" включає живі організми, які можуть одержати користь від введення плазміногену, його варіанту або фрагменту. Термін "суб'єкт" включає тварин, таких як ссавці або птахи. Переважно суб'єктом є ссавець. Більш переважно, суб'єктом є людина. Найбільш переважно, суб'єктом є людина, яка потребує лікування.

І00141| В цьому документі "профілактика" або "попередження" означають щонайменше зниження вірогідності ризику (або сприйнятливості до) набуття захворювання або розладу (тобто, те, що перешкоджає щонайменше розвитку одного із клінічних симптомів захворювання у пацієнта, який може бути схильним або є схильним до захворювання, але який ще не зазнає або у якого не проявляються симптоми захворювання). Біологічні і фізіологічні параметри для ідентифікації таких пацієнтів наведені у цьому описі, а також добре відомі лікарям. 00142) Терміни "лікування" або "лікувати" пацієнта включають застосування або введення композиції за винаходом суб'єкту (або нанесення, або введення композиції за винаходом у тканину або орган суб'єкта) з метою сповільнення, стабілізації, вилікування, зцілення, полегшення, послаблення, модифікації, усунення, зменшення тяжкості погіршення, полегшення, покращення або впливу на захворювання або стан, симптом захворювання або стану, або ризик (або сприйнятливість до) захворювання або стану. Термін "лікування" відноситься до будь-якого позначення успіху лікування або полегшення пошкодження, патології або стану, зокрема, будь- якого об'єктивного або суб'єктивного параметра, такого як полегшення; ремісія; зменшення швидкості погіршення; зменшення тяжкості захворювання; стабілізація, зменшення симптомів або утворення ураження, патології або стану, більш прийнятного для суб'єкта, сповільнення швидкості дегенерації або зниження функції; зменшення інвалідизації в кінцевій точці дегенерації; або покращення фізичного або психічного стану суб'єкта. У деяких варіантах реалізації винаходу термін "лікування" може включати збільшення тривалості життя суб'єкта та/або відтермінування необхідності у додатковому лікуванні. 00143) В цьому документі термін "терапевтично ефективна кількість" позначає кількість сполуки, яка, при введенні суб'єкту з метою лікування або профілактики конкретного розладу, захворювання або стану, є достатньою для проведення такого лікування або профілактики

Зо вказаного розладу, захворювання або стану. В цьому документі термін "терапевтично ефективна кількість" додатково позначає кількість плазміногену, його варіанту або його фрагменту, що є ефективною з точки зору загоєння ран, загоєння перфорації барабанної перетинки, загоєння рани періодонту, лікування інфекційного захворювання, оздоровлення або підтримання здорового стану ротової порожнини, лікування заднього відшарування скловидного тіла (ВСТ), діабетичної виразки і показань для тромболізу у суб'єктів із дефіцитом плазміногену, таких як коронарний тромбоз, лікування реперфузійного ураження тканини, лікування ішемії, інфаркту, набряку мозку, для покращення мікроциркуляції, лікування суб'єктів з дефіцитом плазміногену та модуляції шляху активації комплементу у суб'єктів. Дози і терапевтично ефективні кількості можуть варіювати, наприклад, в залежності від різних факторів, включаючи вікову активність, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і раціон суб'єкта, час уведення, спосіб уведення, швидкість виведення і будь-яку комбінацію лікарських засобів, якщо це доречно, вплив на суб'єкта, якого лікар бажає досягти, і конкретний(ї) розлад(и), на який страждає суб'єкт. Крім того, терапевтично ефективна кількість може залежати від параметрів крові суб'єкта (наприклад, ліпідний профіль, рівні інсуліну, глікемії), тяжкості патологічного стану, функції органу або базового захворювання або ускладнень. Такі придатні дози можуть бути визначені за допомогою будь-яких доступних аналізів, включаючи аналізи, описані в цьому документі. Якщо фармацевтичну композицію за винаходом слід вводити людям, наприклад, лікар може спочатку призначати відносно низьку дозу, в подальшому підвищуючи дозу до досягнення належної відповіді. В кінцевому рахунку, доза для введення буде залежати від рішення лікаря.

Набори

І00144| Сполука(и) за винаходом може бути упакована як частина набору, що може включати ємність (наприклад, упаковку, коробку, ампулу, тощо). Набір може комерційно застосовуватися у відповідності до способів, описаних у цьому документі, і може включати інструкції для застосування у способі за винаходом. 00145) Композиція за винаходом може бути введена або не введена пацієнту одночасно з іншим активним інгредієнтом, перед або після нього, а також тим же способом введення або за допомогою іншого способу введення. Таким чином, до цього винаходу додатково включені набори, які, при застосуванні лікуючим лікарем, можуть спростити введення пацієнту 60 відповідних кількостей композиції за цим винаходом, окремо або в поєднанні з іншим активним інгредієнтом. (00146) Набори за винаходом можуть додатково містити фармацевтично прийнятну рідину для розведення ліофілізованої композиції. Наприклад, якщо активний інгредієнт постачається у твердому вигляді і повинен бути розведений для парентерального введення, набір може включати герметично закупорений контейнер з придатною фармацевтично прийнятною рідиною, в якій активний інгредієнт може бути розчинений для утворення стерильного розчину без механічних включень, придатного для парентерального введення. 00147) У деяких варіантах реалізації винаходу композиція за цим винаходом міститься в ампулі, флаконі, пробірці, шприці або іншій ємності для одноразового або багаторазового введення. Такі ємності можуть бути виготовлені із скла або полімерного матеріалу, наприклад, такого як поліпропілен, поліетилен, полівінілхлорид, або поліолефін. В деяких варіантах реалізації винаходу ємності можуть містити ущільнення або іншу систему закупорювання, таку як гумова пробка, крізь яку може проникати голка для відбору одиничної дози і повторної герметизації після витягання голки. Всі такі ємності для ін'єкційних рідин, ліофілізованих композицій, розведених ліофілізованих композицій або порошків для розведення та ін'єкцій, відомі в цій галузі техніки, розглядаються для застосування в описаних у цьому документі композиціях і способах. У конкретному варіанті реалізації винаходу ємність являє собою пристрій для введення за типом шприц-ручки, що містить одну дозу або декілька доз. Такий пристрій для введення за типом ручки може бути багаторазовим, наприклад, багаторазова шприц-ручка, яка вміщує одноразовий картридж, який містить одну дозу або декілька доз, або весь пристрій може бути одноразовим, наприклад, одноразовою шприц-ручкою, що містить одну дозу або декілька доз. У деяких варіантах реалізації винаходу, в яких пристрій для введення за типом шприц-ручки містить декілька доз, доза може бути попередньо встановленою, тобто, фіксованою. В інших варіантах реалізації цього винаходу доза може бути варіюючою, тобто, відбирається користувачем. У деяких варіантах реалізації винаходу пристрій для доставки за типом шприц-ручки обладнаний люеровським наконечником, люеровським конусом або іншим з'єднувальним наконечником для голки, який полегшує приєднання одноразової голки. В інших варіантах реалізації винаходу пристрій за типом шприц-ручки обладнаний закріпленою, тобто незйомною голкою. В іншому конкретному варіанті реалізації винаходу ємність є шприцем. У

Зо деяких варіантах реалізації винаходу шприц обладнаний люеровським наконечником, люеровським конусом або іншим з'єднувальним наконечником для голки, який полегшує приєднання одноразової голки. В інших варіантах реалізації винаходу шприц обладнаний закріпленою, тобто незйомною голкою. У деяких варіантах реалізації винаходу шприц попередньо заповнений однією дозою або декількома дозами.

Аналізи стабільності (00148) "Стабільні" композиції включають композиції, у яких білок (плазміноген або його варіант) в композиції по суті зберігає свою фізичну стабільність та/або хімічну стабільність та/або біологічну активність в процесі зберігання. Різні аналітичні методи для визначення стабільності білка доступні в цій галузі техніки і розглянуті, наприклад, у ГІ ее, М, 1991, Рерііде апа Ргіоїєїп Огид Овєїїмегу, 247-301 (Магсе! ЮОеккКег, Іпс, Мем/ МогКк, МУ) ії допез, 1993, Адм. Югид

Оеєїїмегу Неу. 10: 29-90. Стабільність може бути виміряна при вибраній температурі протягом вибраного періоду часу. В одному варіанті реалізації винаходу композиція є стабільною при кімнатній температурі (близько 25 "С) або при 40 "С протягом щонайменше 1, 2, 3, 4, 5 або 6 місяців та/або є стабільною при 2-8 "С протягом щонайменше 1, 2, 3, 4, 5 або 6 місяців. Крім того, у деяких варіантах реалізації винаходу композиція є стабільною після заморожування (наприклад, -30 "С). У деяких варіантах реалізації винаходу критерії стабільності є наступними: (1) композиція залишається прозорою при візуальній інспекції; (2) варіації концентрації, рН і осмотичного тиску композиції становлять не більш ніж близько х 10 905; (3) утворюється не більш ніж близько 10 95, не більш ніж близько 5 95 або не більш ніж близько 1 95 агрегатів, за даними

ЕК-ВЕРХ; і (4) руйнується не більш ніж 10 мас. 95, не більш ніж близько 5 95 або не більш ніж

З 96 плазміногену, за даними відомих в цій галузі техніки і добре валідованих аналітичних методів.

ІЇ00149| Термічна денатурація: Можуть бути проведені експерименти з термічною денатурацією у форматі високопродуктивного скринінгу (ВСП) складу для плазміногену або його варіанту або фрагменту із застосуванням Орійт 2'М виробництва РаїЇ; або іншої(их) альтернативної (их) біофізичної(их) методик(и) для контролю деградації білка (стандартна ПЦР (з використанням нагрівального блоку)), флуориметр або КД-спектрофотометр (з контролем температури). Для прикладу, система Оріїт 2 одночасно вимірює діапазон показників стабільності білка, в тому числі температуру переходу розгортання (Тт) температуру початку бо агрегації (Тадо) і швидкість агрегації.

ІЇ00150| Вплив допоміжних речовин на термостабільність: Вузький діапазон значення рн визначають при оптимальному діапазоні рН та більш високій температурі плавлення (Тт) і температурі початку агрегації (Тадд). Якщо більш висока Тт одержана у фізіологічному діапазоні 6,5-7,5; проводять наступне(ї) випробування, щонайменше із З буферними системами. 001511) Крім того, ІЕФ (ізоелектрофокусування) або кієФ (капілярне ізоелектрофокусування) може бути проведене для оцінки фізичної конформації плазміногену в розчині.

І00152| Відсоток стабілізації базується на вимірюваннях ферментативної активності плазміногену для кожного буфера/допоміжної речовини і для контрольного розчину, що містить тільки плазміноген, через 1-8 годин інкубації при 60 "С. В іншому випробуванні стабілізація може бути оцінена при 37 "С протягом 1-8 годин. Відсоток стабілізації обчислюється наступним чином:

Відсоток Стабілізації - 100 х (5-ТИ

І00153| Де 5 являє собою залишкову ферментативну активність ферментного розчину з допоміжною речовиною, яка повинна бути протестована через 10 днів при 35 "С; а Т позначає активність контролю без допоміжної речовини, що зберігається в таких же умовах. (00154) Агрегація і підрахунок частинок (ПЧ): ПЧ здійснюють за допомогою тесту підрахунку частинок із затінюванням світла. Фахівці з аналізу повинні використовувати відповідний прилад, дія якого заснована на принципі затінювання світла, і який забезпечує можливість автоматичного визначення розміру і кількості частинок. Вибраний датчик повинен бути придатним для передбачуваного діапазону розміру частинок і очікуваної кількості частинок.

Стандартний діапазон розміру частинок звичайно варіює від 2 до 100 мм. Фахівці з аналізу повинні перевіряти характеристики пристрою, використовуючи О5Р Підрахунок частинок К5, диспергованих у відповідному об'ємі вільної від механічних включень води. Необхідно дотримуватися обережності, щоб уникнути агломерації частинок під час диспергування в процесі калібрування. 00155) Методи: зразки продукту випробовують у такий спосіб, якийнайбільш адекватним чином відображає введення (наприклад, витісняється вміст шприца). Для парентеральних препаратів достатнього об'єму (тобто достатньо великого об'єму для спрощення тестування), тестування окремих блоків часто є діагностичним. Для парентеральних продуктів недостатнього

Ко) об'єму обережно, але ретельно змішують кожен блок, потім об'єднують вміст відповідної кількості блоків в окремій ємності, щоб одержати об'єм, необхідний для одного випробування (звичайно 0,2-5,0 мл). Якщо здійснюється розведення, слід упевнитися, що об'єм холостого контейнера є достатнім для продукту і розбавлювачів, і що в аналіз уведена невелика кількість механічних включень, якщо уведена взагалі. Обережно відкривають кожен блок, видаляють герметичну пробку, уникаючи забруднення вмісту перед відбором проб, розведенням або, при необхідності, об'єднанням. Якщо вказаний розчинник продукту, наприклад, для твердих речовин або ліофілізованих порошків для парентерального введення, розведення або розбавлення необхідно здійснювати відповідною кількістю вказаного розчинника. В такому випадку власне розчинник може бути протестований, щоб гарантувати, що він не є суттєвім джерелом частинок.

Віднімання кількості частинок розчинника від загальної кількості не дозволяється. Усунення пухирців газу є ключовою стадією, зокрема, для білкових продуктів, які легко захоплюють гази.

Рекомендується два способи: залишити рідкий продукт відстоюватися при тиску навколишнього середовища або під слабким (наприклад, 75 мм. рт.ст.) вакуумом. Можуть бути застосовані інші способи, які продемонстрували свою придатність. Слід уникати ультразвуку. Після дегазації зразків їх слід обережно збовтати для суспендування всіх частинок шляхом обережного, але ретельного перемішування вмісту зразка за допомогою відповідних засобів, наприклад, повільно обертаючи ємність в руках. В будь-якому випадку не рекомендується перемішувати рідкий продукт, перевертаючи ємність. Негайно після перемішування відбирають не менше чотирьох аліквот, об'єм кожної з яких відповідає пропускній спроможності приладу (звичайно 0,2-5,0 мл). Підраховують кількість частинок з розміром у вибраному діапазоні, зокрема, частинок з розміром 10 ії 25 мм або більше. Відкидають результат, одержаний для першої аліквоти, та обчислюють середню кількість частинок у кожному діапазоні розміру для інших аліквот випробовуваного препарату. Для контролю відбору зразків використовують об'єм тари, який повинен бути характерним для датчика динамічного діапазону та об'єму голки. 00156) Оцінка: Вимоги регуляторних органів, таких як Управління санітарного нагляду за якістю харчових продуктів і лікарських засобів (ЕСА) та О5Р/ЕР/Р (Об'єднана Державна

Фармакопея), Розділи (787, 788 та 789), Європейська Фармакопея (ЕР 2.9.20 Механічні включення) і Японська Фармакопея (Р 16: 6.06, 6.07 Випробування на нерозчинні механічні включення), щодо механічних включень наступним чином визначають прийнятний рівень бо частинок в рідкому препараті для застосування у людини. Для парентеральних продуктів, що являють собою розчини терапевтичного білка для інфузій або ін'єкцій, які постачаються в контейнерах з номінальним вмістом 100 мл або менше: середня кількість частинок, присутніх у випробовуваних блоках, не повинна перевищувати 6000 на ємність для частинок розміром 10 мкм або більше, і не повинна перевищувати 600 на ємність для частинок розміром 25 мкм або більше. Для ін'єкційних розчинів терапевтичного білка, що постачаються у контейнерах з номінальним вмістом більш ніж 100 мл, і препаратів для парентеральної інфузії або ін'єкцій із номінальним вмістом більше 100 мл: середня кількість частинок, присутніх у випробовуваних блоках, не повинна перевищувати 25 на мл для частинок розміром 10 мкм або більше ії не повинна перевищувати З на мл для частинок розміром 25 мкм або більше. Крім того, загальна кількість частинок розміром 10 мкм або більше не повинна перевищувати 6000 на ємність і частинок розміром 25 мкм або більше не повинна перевищувати 600 на ємність. Продукти, які використовуються з кінцевим фільтром під час введення (в лінії), звільнені від цих вимог, за умови, що доступні наукові дані для виправдання звільнення від вимог. Однак, очікується, що фільтрати будуть відповідати вимогам. Для продуктів, що постачаються або спочатку розводяться в об'ємі « 100 мл, і далі розводяться для інфузії в об'ємі » 100 мл, вміст частинок слід оцінювати як до, так і після розведення, причому його оцінюють на базі їх кінцевого об'єму.

Отже, спосіб ОЗР/ЕР/УР таким чином включений до цього документу. У цьому документі термін "частинка" відноситься до "механічного включення" і навпаки; вказані терміни можуть бути використані взаємозамінним чином.

І00157| Дослідження кінетики з вимірюванням за методом розсіювання світла при 476 нм/600 нм з використанням Орійт-2"М або стандартного УФ-спектрофотометра в УфФф-діапазоні на довжині хвилі 350 нм: для швидшого скринінгу різних стабілізуючих допоміжних речовин обирають умови прискореного старіння, такі як підвищена температура (65 "С) і кислий розчин (рН 4,5) або основний розчин (рН 9,5). Компоненти композиції для підвищення Тадд оцінюють як функцію часу при постійній температурі (55-60 "С) протягом щонайменше 1-4 годин. Кінетичну поведінку агрегації плазміногену в розчині вимірюють при температурі 55-60 70 з контролем температури (визначається початкова Тт) протягом до 4 годин. Здійснюють скринінг допоміжних речовин щодо їх впливу на інгібування агрегації плазміногену, за даними вимірювання методом розсіювання світла при 267 нм, 467 нм і 350 нм (Спепо, УМ. еї аї.

Зо "Сотрагізоп ої Нідп- Тигопдприї Віорпузіса! Меїнодз ю Ідепійу єгабіїгіпу Ехсірієпів Тог а Модве!

Ід Мопосіопа! Апіїбоду: Сопіоптаїййопа! єїаріїну апа Кіпеїїс Аддгедайоп Меазитетепів" Уситаї! ої Рнаптасеціїса! Зсієпсев, Мої. 101, Мо 5, раде 1701-1720, 2012). 00158) Вплив концентрації білка на термічну стабільність: однією з переваг Орійт-2"М або

Флуориметра з подвійним скануванням (ФПС з фарбником бЗурго) є можливість проводити вимірювання Тт і Тадд у висококонцентрованих білкових розчинах. Незалежно від того, чи проводиться дослідження потенційних кандидатів щодо відносної стабільності, чи скринінг різних умов для стабілізації білків у складі, може бути важливим ідентифікувати властивості білкового розчину при високих концентраціях, коли кількість доступних методів визначення є обмеженою.

ІЇ00159| Вплив складу композиції на кінцевий осмотичний тиск: у кінцевій фармацевтичній композиції концентрація буферної речовини, допоміжної речовини і солі переважно не повинна бути дуже високою через практичні обмеження парентеральної ін'єкції. Натомість, більш помірні концентрації, такі як більшою мірою фізіологічні, є переважними для одержання осмотичного тиску в діапазоні від 240 до 400 мОсм. Таким чином, осмотичний тиск обчислюють з метою початкового визначення цього діапазону; однак у випадку в/в ін'єкції додатково можуть бути застосовані концентрації з вищим осмотичним тиском в ході розробки способу ліофілізації, якщо після розведення плазміноген або його варіант або фрагмент буде розбавлений розчином для розведення. 00160) Слід зазначити, що терміни "склад" і "композиція" можуть бути використані в цьому документі альтернативно і призначені для позначення одного і того.

Ї00161| Заголовки включені до цього документу для цілей посилання і допомоги у знаходженні конкретних розділів. Вказані заголовки не призначені для обмеження об'єму концепцій, описаних у цьому документі, і вказані концепції можуть знаходити застосування в інших розділах по всьому опису. Таким чином, цей винахід не слід інтерпретувати як обмежений варіантами його реалізації, проїілюстрованими у цьому документі, але слід інтерпретувати в найширшому об'ємі, що узгоджується з розкритими у цьому документі принципами і новими ознаками.

І00162| Форми однини включають відповідні посилання на множину, якщо контекст явно не диктує іншого. бо І00163| Якщо не вказано інше, всі числа, що виражають кількості інгредієнтів, умови реакції,

концентрації, властивості і т.п., використані в описі і формулі винаходу, слід розуміти як модифіковані у всіх випадках терміном "близько". Щонайменше, кожен чисельний параметр слід розуміти принаймні у світлі кількості приведених значущих цифр, та із застосуванням звичайних методів округлення. Відповідно, якщо не вказано зворотне, кількісні параметри, наведені у цьому документі і доданій формулі винаходу, являють собою наближення та можуть варіювати в залежності від необхідних властивостей, які повинні бути одержані. Незважаючи на те, що чисельні діапазони і параметри, які встановлюють широкий об'єм винаходу, є наближеннями, чисельні значення, наведені у конкретних прикладах, вказані настільки точно, наскільки це можливо. Однак, будь-яке чисельне значення за своєю природою містить певні похибки, що виникають в результаті варіацій в умовах експериментів, тестових вимірюваннях, статистичних аналізах і т.п. (00164) Необхідно розуміти, що приклади і варіанти реалізації винаходу, описані в цьому документі, слугують тільки меті ілюстрації, і що в їх світлі різноманітні модифікації або варіації будуть запропоновані фахівцям в цій галузі техніки і повинні бути включені в об'єм цього винаходу та об'єм доданої формули винаходу.

ПРИКЛАДИ

(00165) Наступні приклади додатково ілюструють цей винахід, але не призначені для його обмеження.

Приклад 1: Стабільність плазміногену в замороженому складі

І00166)| Результати випробування стабільності фармацевтичної композиції, що містить 5 мг/мл плазміногену людини, добутого із плазми у відповідності до способу афінності зв'язування, описаного у МО 2006/120423, 10 мМ цитрату, 150 мм Масі, рн 6,5 (серія: 2002.рс02 Ро140210.01) зберігають при -20 "С, -30 "С ії -80 "С протягом періоду до 6 місяців.

Дані стабільності показують, що плазміноген є стабільним у вказаних умовах заморожування.

Плазміноген серії: 2002.рс02 Ро140210.01 випробовували при -20 "С, -30 "С і -80 "С. Рівень агрегації досліджували за допомогою ЕК-ВЕРХ, рівень чистоти -- за допомогою ДНО-ПААГ у відновлюючих і невідновлюючих умовах, рівень активності -- за активністю ВС5, і концентрацію білка -- за оптичною густиною при довжині хвилі 280 нм (АВбгво). Результати даних стабільності через 6 місяців показали, що всі аналізи індикації продемонстрували стабільність необхідних

Зо параметрів специфікації.

Приклад 2: Аналіз осмотичного тиску та аналізи загального відсоткового вмісту твердих речовин

І00167| Осмотичний тиск складів 1-6 і загальний відсоток твердих речовин після ліофілізації для складів 1-9 представлені у Табл. 2. Вміст складів 1-9 визначений у Табл. 1А.

Таблиця 2 твердого залишку

Ме | мумл | мМ | мМ | мМ | 9 | мОсм «( 17171175 2. ЮЩщЩщ| 73 | 67 | 68| 39 | 265 73 1 5 щЩ | 7 | 67 | 68 | 54 | 309 76 Її 5 5 щЩщ | 73 | 67 | 75 | 398 | 272 78 1 5 щЩщ| 265 | 47 | 75 | 39 | врозробціЙ 9 | юЮюЮюжщь5 5 БжюК | 26 | 54 | 75. | 39 | врозробціЙ 00168) Осмотичний тиск знаходиться у фізіологічному діапазоні 240-400 мОсм. Одержаний осмотичний тиск випробовуваних композицій переважно знаходиться в межах або дуже близько до фізіологічного діапазону осмотичного тиску. Загальний 96 твердого осаду (г твердої композиції після ліофілізації на 100 мл рідкої композиції до ліофілізації) становить близько 4 95 для всіх композицій і плацебо, що знаходиться в переважному діапазоні від 3,5 до 8 95.

Приклад 3: Молекулярна маса плазміногену

І00169| Молекулярна маса очищеного і введеного у фармацевтичну композицію за цим винаходом плазміногену становить 87000 (М.м.), що визначено шляхом обчислення первинної амінокислотної послідовності плазміногену і підтверджено за допомогою мас-спектрометрії.

Приклад 4: Дослідження зовнішнього вигляду залишку після ліофілізації

І00170| Склади 1-5 були ліофілізовані у відповідності до циклічного способу, детально описаного в Табл. 5. Вміст Складів 1-5 визначений у Табл. ТА.

Таблиця 5 тадія зберігання, базове| температури о (хвилини) тиску (мі значення (СІ І(хвилини

Завантаження - зате 75170015 свят

Еваклаця --:/1777771108501111111-11Ї1111111-11 11111501

Первинна.///////177717171710-2211117711111190 17713860 | 50727 00171) Фіг. 2-11 являють собою зображення флаконів, що містять по 12,5 мл Складів 1-5, відповідно, або відповідного плацебо (без плазміногену). Таким чином, було досліджено вплив присутності плазміногену на стабільність композиції. Органолептична інспекція зовнішнього вигляду осаду, який був утворений за допомогою способу ліофілізації. Усі зневоднені брикети зберегли рівномірну щільність, без будь-якої зміни кольору. Оплавлення було присутнє менше ніж у 10 95 досліджених флаконів для плацебо Складів 2, З і 5. Зсідання було присутнє менш ніж у 10 95 досліджених флаконів для плацебо Складу 1. Менше 10 95 випробовуваних флаконів для Складів 1-5 і плацебо Композиції 4 продемонстрували базальну ретракцію. В цілому, зовнішній вигляд брикету є задовільним.

І00172| Вміст композиції диктує температуру зсідання. Кожна чиста аморфна допоміжна речовина має характерну температуру Т9 и зсідання; температура зсідання для складу являє собою усереднену по масі температуру всіх композицій в аморфній фазі. Важливою є розробка складу з максимальною температурою зсідання, оскільки швидкість сушіння є прямо пропорційною температурі зразка під час ліофілізації.

І00173| Нарешті, температура зсідання буде знижуватися, якщо солі (Масі) і допоміжні речовини не є максимально кристалізованими. Наприклад, Ту" гліцину становить -45 "С, і його внесок в аморфну фазу може зменшити температуру зсідання до неприйнятно низьких значень.

Приклад 5: Вплив амінокислоти на агрегацію плазміногену в розчині

ІЇ00174| Плазміноген сам по собі утворює у воді ряд агрегатів плазміногену, які є неприйнятними з точки зору ЕВА, тобто в кількості, більшій ніж 6000 частинок розміром 10 мкм або більше на 100 мл композиції (див. зразок 0406 у Табл. 6). Різноманітні склади на базі сахарози були розроблені для введення плазміногену у склади. Хоча більшість із цих складів успішно проходять поріг 6000 частинок розміром 10 мкм або більше на 100 мл, були розроблені склади з меншим вмістом частинок, та було вивчено вплив амінокислоти на стабілізацію плазміногену. Такі додаткові композиції містять 10 мг плазміногену і 35 мМ масі, причому були

Зо випробувані три буферні склади/рн, тобто 10 мМ натрій цитрату (рН 6,5), 10 мМ натрій фосфату (рН 7,2) ї 10 мМ Трис-НСЇ (рн 8,0). Були співставлені присутність і відсутність амінокислоти, вибраної з аргініну, аланіну і гліцину в концентрації 0,595. Склади досліджували свіжовиготовленими, тобто перед ліофілізацією. В Табл. 6 наведений ПЧ для частинок розміром 10 мкм або більше і розміром 25 мкм або більше. Присутність амінокислоти показала, що стабілізуючий вплив сприяє зниженню рівня агрегації.

Таблиця 6

Перед ліофілізацією

Ра (5 мг/мл), 12 мМ цитратного буфера, 73 мМ сахарози, 68 мМ

Рад (5 мг/мл), 12 мМ цитратного буфера, 117 мМ сахарози, 68

Рад (5 мг/мл), 12 мМ цитратного буфера, 117 мМ сахарози, 68 то (мханвя и ззю | в

Перед ліофілізацією

Номер Опис зразка ПЧ (к-сть/мл) й

РО080 |Ро (10 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5 0147 | 0

Ра (10 мг/мл), 10 мм натрій цитрату, 35 мМ Масі, 66 мм (0,5 95)

Е0081 й 109 гліцину, рН 6,5

Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, 28,5 мМ

РООВ2 | (0,5 ор) аргініну, рн 6,5 122 1

ЕОО8З Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, 26 мм (0,5 9) 91 4 аланіну, рН 6,5 гО102 Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2

ЕО103 Ро (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, 66 мМ (0,5 Ов) 124 гліцину, рН 7,2

Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ

ОТО (0,5 ор) аргініну, рн 7,2 128 З

Е0105 Ра (о мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, 26 ммО0О,5 Фо) 180 2 аланіну, рН 7,2 г0106 Ра (10 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ масі, рН 8,0 0107 го по мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 66 мм (0,5 95) БИ ЕІ -- 0108 го (о мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,5 95) вену вв 0109 Ро по мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 26 мм (0,5 96) ванну дв

Приклад 6: Вплив маніту в поєднанні з амінокислотою на агрегацію плазміногену (00175) Досліджено вплив присутності наповнювача, 0,5 95 маніту, на склади, що містять 10 5 мг плазміногену, 35 мМ Масі і 10 мМ натрій цитрату (рН 6,5), 10 мМ натрій фосфату (рН 7 2) або мМ Трис-НСІ (рН 8,0)) з амінокислотою (0,5 95 аргінін гідрохлориду, аланіну або гліцину) та без неї, і результати наведені у Табл. 7. У цьому дослідженні випробовували свіжевиготовлені склади (перед ліофілізацією). Як правило, присутність маніту зменшувала кількість частинок. Як правило, комбінація маніту і амінокислоти сприяє зменшенню кількості частинок, і, зокрема, у 10 випадку комбінації аргініну з манітом.

Таблиця 7

Перед ліофілізацією

Номер Опис зразка ПЧ (к-сть/мл) й

ЕО114 Ра (9 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, рН 6,5 3810

Рад (9 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ масі, 27 мМ

ГО115 0,5 95) маніту, рН 6,5 805

Рад (9 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ масі, 66 мМ

Гот116 0,5 96) гліцину, 27 ММ (0,5 95) маніту, рН 6,5 З62 13

Е0117 Рад (9 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ масі, 28,5 мМ 520 14 0,5 9) аргініну, 27 мМ (0,5 9о) маніту, рН 6,5

Е0118 Ра (9 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, 26 мМ 4 0,5 90) аланіну, 27 мМ (0,5 9о) маніту, рН 6,5

Е0119 Ро (9 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, З мМ Мас рН 1133. |в

Рд (9 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, 27 мМ

Го120 0,5 95) маніту, рН 7,2 107 З

Е0124 Рд (9 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, 66 мм 194 0,5 90) гліцину, 27 мМ (0,5 Фо) маніту, рН 7,2

Е0122 Рад (9 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, 28,5 мМ 95 2 0,5 9) аргініну, 27 мМ (0,5 9о) маніту, рН 7,2

Е0123 Рд (9 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ Масі, 26 мМ 113 5 0,5 90) аланіну, 27 мМ (0,5 9о) маніту, рН 7,2

Е0124 Ро (9 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мм масі, рН 8,0 86 | 2

Перед ліофілізацією

Номер Опис зразка ПЧ (к-сть/мл) й - 0125 го (о момл); 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 27 мМ (0,5 95) манту вв | о

Ра (9 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мм масі,

РО126 66 мм 0,5 96) гліцину, 27 ММ (0,5 95) маніту, рН 8,0 163 З 0127 Род (9 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,5 95) 13 З аргініну, 27 мМ (0,5 95) маніту, рН 8,0

Е0128 Ра (9 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мм масі, 119 26 мМ (0,5 95) аланіну, 27 мМ (0,5 95) маніту, РН 8,0

Приклад 7: Вплив консерванту на агрегацію плазміногену

І00176)| Досліджено вплив присутності консерванту, такого як 0,1 95 фенолу, у складах, що 5 містять 9 або 10 мг плазміногену. 35 мМ Масі ії 10 мМ натрій цитрату (рН 6,5), 10 мМ натрій фосфату (рН 7,2) або 10 мМ Трис-НСЇІ (рН 8,0)) з 0,5 95 аргінін гідрохлориду або комбінації 0,5 95 маніту і 0,595 аргінін гідрохлориду. В цьому дослідженні випробовували свіжевиготовлені склади (перед ліофілізацією). Кількість частинок (ПЧ) наведена у Табл. 8. Переважно, присутність фенолу не здійснює істотного впливу на кількість частинок.

Таблиця 8

ПЧ перед

Номер Опис зразка ліофілізацією (к- зразка сть/мл)

ЕО114 Ра (9 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, рН 6,5 3810

Е0143 Рада (10 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, 28,5 мМ 0,5 9) аргініну, рН 6,5

Рада (10 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, 28,5 мМ рота 0,5 965) аргініну, 0,1 95 фенолу, рН 6,5 191 27

Е0145 Рада (10 мг/мл), 10 мМ натрій цитрату, 35 мМ Масі, 28,5 мМ 1538 0,5 9) аргініну, 27 мМ (0,5 9о) маніту, 0,1 95 фенолу, рН 6,5

Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ

Го155 0,5 95) аргініну, рН 7,2 1097 7

Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ

Го156 0,5 95) аргініну, 0,1 95 фенолу, рН 7,2 4370

Е0157 Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ 747 0,5 9) аргініну, 27 мМ (0,5 9о) маніту, 0,1 96 фенолу, рН 7,2

ЕО158 Ра (10 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,5 95) 169 А аргініну, РН 8,0

Ра (10 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,5 95)

РО159 | аргініну, 01 95 фенолу, рн 8,0 168 З

ЕО160 Ра (10 мг/мл), 10 мМ Трис, 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,5 95) 175 4 аргініну, 27 мМ (0,5 95) маніту, 0,1 96 фенолу, рН 8,0

І00177| Порівнювали декілька консервантів. У Табл. 9 наведено порівняння 0,595 КМЦ, 0,1 96 фенолу і 0,5 9о декстрану у варіаціях складів, що містять 10 мг плазміногену, 35 мМ Мас і 10 мМ натрій цитрату (рН 6,5), 10 мм натрій фосфату (рН 7,2) або 10 мМ Трис-НСІ (рН 8,0) і 0,5 95 аргініну гідрохлориду. В цьому дослідженні випробовували свіжевиготовлені склади (перед ліофілізацією). Наявність декстрану або фенолу не має значного впливу на агрегацію.

Однак, КМЦ значно збільшувала агрегацію. Це не є дивним, оскільки відомо, що КМЦ підвищує в'язкість розчину і часто застосовується при виготовленні очних крапель.

Таблиця 9

ПЧ перед

Номер Опис зразка ліофілізацією (к- зразка сть/мл)

Е0119 Ра (9 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, рН 7,2. 193.16

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма фосфату, гОо569 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,595) аргініну, рН 7,2, 19 1 профільтрований (0199), Б/Т1-1х

Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ

Гобто 0,5 95) аргініну, 0,5 95 КМЦ, рн 7,2 7783 !

ЕО571 Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ 25 4 0,5 9о) аргініну, 0,1 96 фенолу, рН 72

ЕО572 Ра (10 мг/мл), 10 мМ натрій фосфату, 35 мМ масі, 28,5 мМ 37 4 0,5 95) аргініну, 0,5 95 декстрану, рН 7,2

Приклад 8: Вплив амінокислоти і її концентрації на агрегацію плазміногену 00178) Аргінін у кількості 0,595 і 195 випробовували в складах, що містять 10 мг/мл плазміногену, 35 мМ Масі, 10 мМ натрій фосфату (Марі), рН 7,2, після ліофілізації і розведення.

Кількість частинок (ПМ) наведена у Табл. 10, з якої можна побачити, що обидві концентрації аргініну ефективно підтримують низьке значення ПЧ.

Таблиця 10

Номер о Розведення | Об'єм Перед пюофітвацією ПЧ зразка пис зразка анг (мл) (мл) к-сть/мл

Ра 10 мг/мл, 28 мМ (0,595) Аго,

РО211 0 |з5ММ масі, 10 мм Марі, рн 7,2 12.5 4 87 2

Ра 10 мг/мл, 57 мМ (1 95) Аго, 35 мМ

ЕО213 Масі, 10 мМ Марі, рн 7,2 12.5 4 124 11 00179) Аргінін, гліцин і аланін в кількості 1 96 порівнювали у складах, що містять 10 мг/мл плазміногену, 35 мМ Масі, 10 мМ натрій фосфату, рН 7,2 (Марі), після ліофілізації і розведення.

Кількість частинок (ПЧ) наведена у Табл. 11, з якої можна побачити, що аргінін краще, ніж аланін і гліцин, підтримує низьке значення ПЧ в умовах дослідження, хоча всі три вказані амінокислоти забезпечують прийнятні значення ПЧ, тобто, менш ніж 6000 частинок розміром 10 мкм або більше на 100 мл.

Таблиця 11 ' Перед ліофілізацією ПЧ зр. ака Опис зразка аНоонту, м. (к-сть/мл)

РО 10 мг/мл, 57 мМ (1 95) Ак9, 35 0215) ММ масі, 10 мМ Марі, рн 72 12,5 4 178

Ра 10 мг/мл, 57 мМ (1 95) Су, 0217 )з54М масі, 10 мМ Марі, рн 72 12,5 4 ВВ З

РО 10 мг/мл, 57 мМ (1 95) Аа, 35

Приклад 9: Загальний відсоток твердої речовини і осмотичний тиск

І00180| Осмотичний тиск декількох складів із вмістом 10 мг/мл плазміногену та відсоток твердих речовин, застосовуваних для одержання вказаних препаратів, наведені у Табл. 12.

Осмотичний тиск декількох складів із вмістом 20 мг/мл плазміногену та відсоток твердих речовин, застосовуваних для одержання вказаних складів, наведені у Табл. 13. Одержаний осмотичний тиск випробовуваних складів переважно знаходиться в межах або дуже близько до фізіологічного діапазону осмотичного тиску. Загальний відсоток твердих речовин обчислюється на базі вмісту плазміногену, модифікатора осмотичного тиску і наповнювача у складі і є хорошим індикатором розміру одержаного осаду після ліофілізації.

Таблиця 12 пис зразка зразка твердих речовин ше)

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 г0469 мМ масі, рН 6,5, 28,5 мМ (0,5 9о) аргініну, 54 мМ (1 Ов) 2,5 209 маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0470 мМ масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 108 мМ 3,5 377 2 У) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0471 мМ масі, рН 6,5, 28,5 мМ (0,5 9о) аргініну, 54 мМ (1 Ов) 2,5 205 сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0472 мМ масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 108 мМ 3,5 298 2 Уо) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0474 ММ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 Фо) 3,0 263 маніт

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0475 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Фо) аргініну, 108 мМ (2 Ов) 4,0 325 маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0476 ММ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 Фо) 3,0 252 сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0477 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Фо) аргініну, 108 мМ (2 Ов) 4,0 294 сорбіту

Ра нерозфасований (10 мг/мл) у 10 мМ розчині Ма о фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну "

Рад (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0449 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 9бо) аргініну, 2,5 248 54 ММ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма г0450 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 9бо) аргініну, 3,5 345 108 мМ (2 95) маніту

Рад (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0451 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 9бо) аргініну, 2,5 235 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0452 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 9бо) аргініну, 3,5 374 108 мМ (2 95) сорбіту

Рад (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0454 фосфату, 35 мм масі, рн 7,2, 57 мМ (1 Фо) аргініну, 54 3,0 304

ММ (1 95) маніту пис зразка зразка твердих речовин ше)

Рад (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0455 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 57мМ (1 Фо) аргініну, 108 4,0 255

ММ (2 95) маніту

Рад (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0456 фосфату, 35 мм масі, рн 7,2, 57 мМ (1 Фо) аргініну, 54 3,0 277

ММ (1 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0457 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 57 мМ (1 95) аргініну, 4,0 284 108 мМ (2 95) сорбіту тек ПАДЕНЕ ння ех

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 г0489 ММ масі, рН 8,0, 28,5 мМ (0,5 9с) аргініну, 54 мМ (1 95) 2,5 176 маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 г0490 мМ масі, рН 8,0, 28,5 мМ (0,5 Фо) аргініну, 108 мМ 3,5 324 2 до) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Е0491 ММ масі, рН 8,0, 28,5 мМ (0,5 9с) аргініну, 54 мМ (1 95) 2,5 200 сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Ег0492 мМ масі, рН 8,0, 28,5 мМ (0,5 Фо) аргініну, 108 мМ 3,5 199 2 У) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 г0494 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) 3,0 248 маніт

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Е0495 ММ масі, рН 8,0, 57 мМ (1 9о) аргініну, 108 мМ (2 95) 4,0 277 маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Е0496 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) 3,0 239 сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований Р2146 у 10 мМ Трис-

Е0497 НОСІ, 35 мм Масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 ММ 4,0 290 2 У) сорбіту

Таблиця 13 пис зразка зразка твердих речовин ше)

Ра нерозфасований (20 мг/мл) у 10 мМ Ма цитрату, 35 о

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0479 мМ масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Фо) аргініну, 54 мМ (1 95) 3,5 245 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 г0480 ММ масі, рН 6,5, 28,5 мМ (0,5 9о) аргініну, 108 мМ (2 95) 4,5 307 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0481 мМ масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Фо) аргініну, 54 мМ (1 95) 3,5 255 сорбіту пис зразка зразка твердих речовин ше)

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 0482 ММ масі, рН 6,5, 28,5 мМ (0,5 9о) аргініну, 108 мМ (2 95) 4,5 306 сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 г0484 ММ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) 4,0 264 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 г0485 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 мМ (2 95) 5,0 ЗА маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 г0486 ММ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) 4,0 337 сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35

Е0487 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 мМ (2 95) 5,0 370 сорбіту пис зразка зразка твердих речовин | НО

Ра нерозфасований Р24129 (20 мг/мл) у 10 мм розчині о

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рН 7.2, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0459 фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 3,5 265 54 ММ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма г0460 фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 4,5 293 108 мМ (2 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0461 фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 3,5 279 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0462 фосфату, 35 мМ Масі, рН 7,2, 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 4,5 310 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0464 фосфату, 35 мм масі, рн 7,2, 57 мМ (1 Фо) аргініну, 54 4,0 350

ММ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма г0465 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 5,0 412

ММ (2 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0466 фосфату, 35 мм масі, рн 7,2, 57 мМ (1 Фо) аргініну, 54 4,0 366

ММ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма

Е0467 фосфату, 35 мм масі, рН 7,2, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 5,0 419

ММ (2 95) сорбіт пис зразка зразка твердих речовин | НО

ЕЕ Кс іній Вісь НЕТ УНІ НІС

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 пис зразка зразка твердих речовин ше)

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Ег0499 мм масі, рн 8,0, 28,5 мМ (0,5 Фо) аргініну, 54 мМ (1 95) 3,5 260 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 гОо500 ММ масі, рн 8,0, 28,5 мМ (0,5 9о) аргініну, 108 мМ (2 95) 4,5 313 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

ЕО501 мм масі, рн 8,0, 28,5 мМ (0,5 Фо) аргініну, 54 мМ (1 95) 3,5 200 сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Его502 ММ масі, рн 8,0, 28,5 мМ (0,5 9о) аргініну, 108 мМ (2 95) 4,5 319 сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 гОо504 ММ масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) 4,0 314 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

ЕОо505 ММ масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 мМ (2 95) 5,0 310 маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35 гО506 ММ масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) 4,0 282 сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Трис-НСЇ, 35

ЕО507 ММ масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) аргініну, 108 мМ (2 95) 5,0 279 сорбіту

Приклад 10: Підрахунок частинок (ПЧ) 00181) Кількість частинок (ПЧ) для частинок розміром 10 мкм або більше для складів, описаних у Табл. 12, наведений у Табл. 14; а кількість частинок (ПЧ) для частинок розміром 10 мкм або більше для складів, описаних у Табл. 13, наведена у Табл. 15.

Таблиця 14

Перед Ліофілізація /

Номер зразка Опис зразка ліофілізацією ПЧ | розведення ПЧ 10 мкм (к-сть/мл)| мкм (к-сть/мл)

Ра нерозфасований (10 мг/мл) у 10 мМ Ма

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма г0468 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 35 224 аргінін

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0469 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 37 136 аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0470 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) З 152 аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0471 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 21 159 аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0472 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 94 258 аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0473 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 45 342 аргініну

Перед Ліофілізація /

Номер зразка Опис зразка ліофілізацією ПЧ | розведення ПЧ 10 мкм (к-сть/мл)| мкм (к-сть/мл)

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0474 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 61 218 аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0475 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 129 138 аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0476 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 112 401 аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіт

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0477 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 155 159 аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра нерозфасований (10 мг/мл) у 10 мМ

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0448 розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рн 72, 135 198 28,5 ММ (0,5 95) аргініну

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0449 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рН 7,2, 171 104 28,5 ММ (0,5 95) аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0450 розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рн 72, 267 254 28,5 ММ (0,5 95) аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0451 розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рн 72, 122 133 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіт

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рН 7,2,

Го452 28,5 ММ (0,595) аргініну, 108 ММ (295) 214 176 сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0453 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 37 262

ММ (1 95) аргініну

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0454 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 63 84

ММ (1 9) аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0455 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 109 150

ММ (1 9) аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0456 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 169

ММ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіт

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0457 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 85 223

ММ (1 9в) аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра нерозфасований (10 мг/мл) у 10 мМ

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0488 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 150 414 0,5 9о) аргініну

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0489 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мМ 151 387 0,5 9) аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0490 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 91 528 0,5 9) аргініну, 108 мМ (2 9о) маніту

Перед Ліофілізація /

Номер зразка Опис зразка ліофілізацією ПЧ | розведення ПЧ 10 мкм (к-сть/мл)| мкм (к-сть/мл)

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0491 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мМ 240 589 0,5 95) аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Ег0492 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 120 507 0,5 95) аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0493 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 103 223 аргінін

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0494 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 507 аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0495 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 67 256 аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0496 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 131 375 аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (10 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0497 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 62 456 аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Таблиця 15

Номер Перед Ліофілізація / зразка Опис зразка ліофілізацією ПЧ | розведення ПЧ 10 10 мкм (к-сть/мл) мкм (к-сть/мл)

Ра нерозфасований (20 мг/мл) у 10 мМ Ма

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0478 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 171 358 аргініну

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0479 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 118 572 аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма г0480 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 132 515 аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0481 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 427 аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма 0482 цитрату, 35 мМ Масі, рн 6,5, 28,5 мМ (0,5 Ов) 101 585 аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма г0483 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 132 286 аргініну

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма г0484 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 115 537 аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма г0485 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 154 362 аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Номер Перед Ліофілізація / зразка Опис зразка ліофілізацією ПЧ | розведення ПЧ 10 мкм (к-сть/мл) мкм (к-сть/мл)

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма г0486 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 114 535 аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма

Е0487 цитрату, 35 мМ масі, рН 6,5, 57 мМ (1 Ов) 194 384 аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра нерозфасований (20 мг/мл) у 10 мМ

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0458 розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рн 72, 75 398 28,5 ММ (0,5 95) аргінін

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ те МН рн 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0460 розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рн 72, 128 198 28,5 ММ (0,5 95) аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0461 розчині Ма фосфату, 35 мМ Масі, рн 72, 123 659 28,5 мМ (0,5 95) аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рН 7,2,

Го462 28,5 ММ (0,595) аргініну, 108 ММ (295) 103 317 сорбіту пев та вою г0463 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 93 270

ММ (1 95) аргініну

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0464 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 386

ММ (1 9) аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0465 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 139 172

ММ (1 9) аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ г0466 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рН 7,2, 5 67 681

ММ (1 95) аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

Е0467 розчині Ма фосфату, 35 мМ масі, рн 7,2, 57 93 261

ММ (1 9в) аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра нерозфасований (20 мг/мл) у 10 мМ

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ го498 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 629 3,382 0,5 9в) аргінін

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ 0,5 9) аргініну, 54 мМ (1 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ гОо500 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 1007 896 0,5 9) аргініну, 108 мМ (2 9о) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

ЕО501 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 649 1,401 0,5 95) аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

ЖИ ож емо»

Опис зразка ліофілізацією ПЧ | розведення ПЧ 10 зразка 10 мкм (к-сть/мл) мкм (к-сть/мл)

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ гОо502 Трис-НСІ, 35 мМ масі, рн 8,0, 28,5 мм 793 684 0,5 95) аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

ЕОо5оЗ Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 459 703 аргініну

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ гОо504 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 505 68 аргініну, 54 мМ (1 95) маніт

Ра (20 мг/мл) Нерозфасований Р2147 у 10

ЕОо505 ММ Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ 155 382 1 95) аргініну, 108 мМ (2 95) маніту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ гО506 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 213 898 аргініну, 54 мМ (1 95) сорбіту

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ

ЕО507 Трис-НСІ, 35 мм масі, рН 8,0, 57 мМ (1 95) 101 431 аргініну, 108 мМ (2 95) сорбіту

І00182| На Фіг. 12, 13 ї 14 наведені зображення флаконів, що містять склади Г0498, г0449 і

ЕО459, відповідно, як характерні приклади зовнішнього вигляду ліофілізованих складів, представлених у Табл. 12-15.

Приклад 10: Оборотна агрегація плазміногену (00183) Агрегація плазміногену є оборотною, як продемонстровано в цьому дослідженні.

Заморожені зразки плазміногену (Ра нерозфасований) 5 мг/мл піддають діалізу в анНгоО та інтенсивно осаджують, розморожують, фільтрують крізь шприц-фільтр з розміром отворів 1,2 мкм та використовують як початковий матеріал для контролю (контроль Ро). Аліквоти контролю

Ра по 2 мл вміщують у скляні флакони, попередньо додаючи запасний буферний розчин 1 М натрій цитрату, рН 6,5 (Зразок 1), 0,5 М Ма фосфату, рН 7,2 (Зразок 2) або 1 М Трис-НСІ, рН 8,0 (Зразок 3) з одержанням кінцевої концентрації 10 мМ буфера при кожному значенні рн, відповідно. Зразки 1, 2 і З проілюстровані на фіг. 15, де контролем без Ра є Зразок 0. Зразки 1, 2 і З були додатково навантажені запасними розчинами 5 М Масі ії 0,8 М аргініну до одержання кінцевої концентрації 35 мМ Масі ї 28,5 мМ (0,5 9о) Агу в кожному зразку і проілюстровані на Фіг. 16. Каламутність стандартів 0,02, 20, 100, 800 НОК, відповідно, були використані на Фіг. 15 і 16 як еталон. На Фіг. 15 можна побачити, що при корекції рН розчиняється значна кількість агрегатів. На Фіг. 16 Зразки 1, 2 і З стають прозорими при додаванні аргініну і масі, тобто при візуальній інспекції агрегати відсутні.

І00184| Каламутність зразків 0, 1, 2 і З на Фіг. 16 вимірювали шляхом зчитування оптичної густини (003) на довжині хвилі 550 нм, застосовуючи стандартне калібрування з референтними стандартами каламутності, проілюстрованими на Фіг. 15 і 16. Каламутність наведена у нефелометричних одиницях каламутності (НОК) у Табл. 16. Аліквоти по 1 мл кожного зразка вимірювали до (Т-0) та після навантаження зразків 1, 2 і З буфером, Масі і аргініном в точках часу 0,1 години, 17 годин, 21 година і 24 години. Дезагрегація відбувається швидко, її можна помітити тільки через 0,1 години після навантаження, причому вона зберігається протягом 24 годин.

Таблиця 16

Номер год. год. год.

Рад нерозфасований (5 мг/мл), конц. 2

Рад нерозфасований (5 мг/мл) у 10 мМ

Е0139 натрій цитрату, 35 мМ Масі, 28,5 мМІ 1008 30 37 39 0,5 9) аргініну, рН 6,5

Коо)

Зо

Номер Каламутність (НОК за даними 00 550) год. год. год.

Рад нерозфасований (5 мг/мл) у 10 мМ

Е0140 натрій фосфату, 35 мМ Масі, 28,5 мМІ 1008 43 100 0,5 9) аргініну, РН 7,2

Рад нерозфасований (5 мг/мл) у 10 мМ

ЕО141 Трис, 35 мМ Масі, 28,5 мМ (0,595) 1008 49 56 92 аргініну, РН 8,0

Приклад 11: Вплив амінокислоти на каламутність композиції в часі 00185) Каламутність виміряна у композиціях, що містять 10 мг плазміногену і 35 мМ Масі з 0,5 95 гліцину, аргініну, аланіну та без амінокислоти, при рН 6,5 у натрій-цитратному буфері (Фіг. 17), у натрій-фосфатному буфері рН 7,2 (Фіг. 18) та у Трис-буфері при рН 8,0 (Фіг. 19). 00186) Досліджувані композиції на Фіг. 17, 18 і 19 були відтворені у присутності 0,5 95 маніту як наповнювача і представлені на Фіг. 20, 21 і 22, відповідно.

ІЇ00187| У всіх випадках присутність амінокислоти забезпечує стабілізуючий ефект і підтримує або знижує каламутність. Якщо порівнювати види амінокислот, аргінін показує найкращий стабілізуючий ефект і нижчу каламутність при всіх досліджених значеннях рн та в присутності і за відсутності наповнювача, тобто 0,5 95 маніту.

Приклад 12: Композиція з підвищеною концентрацією плазміногену (00188) Досліджені композиції з високою концентрацією плазміногену. Значення ПЧ для частинок розміром 10 мкм або більше та 25 мкм або більше були наведені у Табл. 17 для композицій із вмістом 20 мг/мл плазміногену у 10 мМ або 100 мм розчині натрію цитрату, 35 мМ масі, рн 6,5, з 1 95 аргініну і без нього, і композицій із вмістом 37 і 56 мг/мл плазміногену у 100

ММ розчині натрій цитрату, 35 мМ Масі, рН 6,5, що містить 1 95 аргініну.

В Табл. 17 проілюстровано, що склади за цим винаходом забезпечують одержання композицій, які містять підвищені концентрації плазміногену (37 і 56 мг/мл) та не містять неприйнятного рівня частинок.

Таблиця 17

Номер ПЧ/флакон

Род138 го 2о мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 мМ Ма вв в

ЕО483 Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 35 мМ масі, БОБ рН 6,5, 57мМ (1 95) аргініну

Ра (20 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 100 мМ

Гоб14 масі, рн 6,5, 57ММ (1 95) аргініну 667 33

Ра (37 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 100 мМ

РОб15 масі, рнб,5, 57мММ (1 95) аргінін 325 33

Ра (56 мг/мл) нерозфасований у 10 мМ Ма цитрату, 100 мМ

Го616 масі, рн 6,5, 57ММ (1 90) аргініну 292 17

Приклад 13: Активність плазміногену

Ї00189| Активність плазміногену у кожному складі, наведеному в цьому документі для прикладу, випробовували і порівнювали з активністю плазміногену в початковому складі препарату або нерозфасованому складі (Ро). Необхідно відзначити, що жоден із вказаних складів не впливає на активність

Коо)

Claims (21)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Рідка фармацевтична композиція, що містить: - Сіи-плазміноген у концентрації від близько 1 мг/мл до близько 60 мг/мл; - модифікатор тонічності, присутній у концентрації, скорегованій таким чином, щоб досягти осмоляльності композиції від близько 180 мОсм до близько 350 мОсм; причому модифікатор тонічності являє собою натрію хлорид та присутній у концентрації від близько 30 мМ до близько 100 мМ; і

- стабілізатор, що являє собою аргінін або гліцин, у концентрації від близько 10 мМ до близько 100 мм; і при цьому значення рН композиції становить від близько 5,0 до близько 8,0.

2. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що рН становить від близько 6,0 до близько 8,0 або від близько 6,5 до близько 7,5.

3. Фармацевтична композиція за п. 1 або п. 2, яка відрізняється тим, що концентрація С1и- плазміногену становить від близько 5 мг/мл до близько 60 мг/мл.

4. Фармацевтична композиція за п. 3, яка відрізняється тим, що концентрація Сіи-плазміногену становить близько 40, 30, 20, 10 або 5 мг/мл.

5. Фармацевтична композиція за п. 1 або п. 2, яка відрізняється тим, що концентрація С1и- плазміногену становить від близько 2 мг/мл до близько 20 мг/мл.

6. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-5, яка відрізняється тим, що (С1и- плазміноген складає щонайменше 80 95 від загального вмісту білка в композиції.

7. Фармацевтична композиція за п. 6, яка відрізняється тим, що Сіи-плазміноген складає більш ніж 95 95 від загального вмісту білка у композиції.

8. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-7, яка відрізняється тим, що стабілізатор є аргініном.

9. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-7, яка відрізняється тим, що стабілізатор є гліцином.

10. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-9, яка відрізняється тим, що стабілізатор присутній у концентрації від близько 25 мМ до близько 75 мМ.

11. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-10, яка відрізняється тим, що модифікатор тонічності присутній в концентрації від близько 25 мМ до близько 50 мМ.

12. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-11, яка відрізняється тим, що додатково містить невідновлюючий цукор, що являє собою сахарозу.

13. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-12, яка відрізняється тим, що композиція є істотною мірою вільною від апротиніну.

14. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-13, яка відрізняється тим, що вказаний Сіи-плазміноген являє собою Сіи-плазміноген людини. Зо

15. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-14, яка відрізняється тим, що кількість частинок розміром 10 мкм або більше в композиції є меншою за 6000 частинок на ємність, де номінальний вміст ємності становить 100 мл або менше.

16. Фармацевтична композиція за п. 15, яка відрізняється тим, що кількість частинок є меншою за 2000 частинок на ємність.

17. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-16, яка придатна для внутрішньовенного, підшкірного, місцевого, внутрішньошкірного, офтальмологічного та/або внутрішньом'язового введення.

18. Фармацевтична композиція за будь-яким із пп. 1-17, що являє собою придатну для ліофілізації рідку композицію, придатну для заморожування рідку композицію або розведену композицію.

19. Фармацевтична композиція за п. 1, причому значення рН вказаної композиції становить від 6,0 до 8,0, і вказана композиція містить: - від 2 до 20 мг/мл Сіи-плазміногену; - від ЗО до 100 мМ натрію хлориду; - від 10 до 100 мМ гліцину; - сахарозу; і - від 2 до 30 мМ цитратного буферу.

20. Фармацевтична композиція за п. 19, причому значення рН вказаної композиції становить від 6,0 до 7,0, і вказана композиція містить: - від 2 до 20 мг/мл Сіи-плазміногену; - від 35 до 75 мМ натрію хлориду; - від 25 до 75 мМ гліцину; - сахарозу; і - 10 мМ цитратного буферу.

21. Застосування фармацевтичної композиції за будь-яким із пп. 1-20 як лікарського засобу.

КІ Кк КЗ ка ке зла ут ж Вас ять реа ЧИ РАВ т ях ко р а уй як т ра их ких Ме : Р ПМ АННИ ям гу Ай НН, | и |! У І (. | ТЕ оон г ше мн чи ГЕ ша НН ШЕ) ПІН БД и ' Х КА г й / у К їх й КК К / М) і ціІС- и хр тя у МНа ни ке б ню КК рел вч М й пиацмін зв'язувнння із стрептокіняханю

ФК. А Прекурсор плазміногену людини (іІ/піРгої обліковий номер ль РОПТЯ ТІ і евкеуті ПО Каре війт евіце аз ккКа І слохігеса аксвейеей 5І стаїцувеке достініаевті КзЗіігтгЯ уУнНеккухі зесківнека уевітЗкка 1721 внсакаєззї зріт рт ра гБрхедігев усгавава ра врсуєоре Кгуйусйе 191 сгеестівсяв ев КІЗКІ пазоіссцтєй зазрнаназі вокірвЕнНК Кпустараге 41 пресів вт ек руспррреза ріуцсікрів енутанпхуачі узеВісоа ін З жирів ревірс ЕН вєпуст прє гарзсні вх дугуехтсківр зсоххвузіє з6і п аріарре ірутасува йвохукоїх ННекксох жінка КЕрепуриняя З21 Нізвустврй адкертясні йрзутмезсв ІККсхвігах хтаррохун рохегрхевй З5І1 стіювоКезг октави ої редтавдер ВгеВвзінреї пргасієкиу ствріассуєо Зі реститщн кіт уро апр асокр дхеріксрог утавставрй зр акігі Я гів Нзрелу на айсіеКерг р ззуктісав цех пієрнто ейетхтійе сві розчнНанк іззри км расірзра ттувдгТесі то веїдні Така ТА ірявактусн и тейвогто яіеісаєійз зрійесцюіх воріусівка Біде ТЯ відсагрикр сууУктчЕиту ПпУГВУТЕВВ ФІ оо г ПО и 0: 5555 с. с Фо ФІГ. 4 ФІГ.

жвнНні.в ФГ. 7 с ос ет. 19 ФІГ.1ї чжНО12

ФІГ. 14 от ки ї скххккккккке ДЕК З сюююююююююю МИТ : В ня ско «их, Я пеме хо зх Мщу чи В В ЩЕ рен вк В ЖУК линии оф р, фронтит З ЗИ і; ге У Ка І: В й КЕ хх Я ї МЕ А В я плє ие З ї лготет ЗУ х Ї: В хжххоз ХЕ х й ї З г: З ще й З деж | - й ; 5 що БО зевоовк ох СВ Я дх ШОЇ сом ою даю В Ох : в ї х сно с: ЕОМ У Я і: дали «о сх К Я зх Ки Я сі м кою еВ В ос ж пали т и тт вивих Пили 8 г ЖІ фен ди ву М НК Мінні Ї: ж Ух хе ом ма ШИ : ще І: ЕК ж де КВ ак Я ж і ОКО й І: КО ФЕж кан ютеви "ШК Кос й зехкузанххатутякк Ї: КОХ де Я дин 1 ВОК дк осьг вне х В ж пр я І: В З ГЕ Ї: 5 Х Н ї:: Е х 8 і І: с хх ї в З х КЗ Е шо с: ро В : В зок буд Я зо без ах В В Захіяі З Зал ітоді В З17 ВНУ.

З суль ДЦКК В З сосхххююю о х І: ; пк зх ек З ода уж ше ; Є ди УМО УМ Тех Ку з Хо ГЕ Є луки жк ке у г че МЖК.

ЕК В ї з'аває хх я 5 ме ме ВИМИ 5 В - : Оле Ден З 7 І: В -ї Й Щи Я дрдвкеюю. : В с ВЕ нн нн ен Х с й Зв ЗМИВ В Е І : дао де н СН ххх Зб Айх, НЕ В : щх Н Ше в о З я жхккххх ККУ ще дае я І: є сю по А о Й х Е В СМ МІ се хх.

КУ У ОС сук Я дю Сх В Е тА Її М ке цкк им пу "ж ЩО НКУ І: Е Щі : Козе дах пажьих нак ФО СМ пок а ок ЖК І: В м : кВ мовах З ЖК мк В В хе їх зжажних оз: СИ КО г: - ж ек оди ЯК о НЕБУ хО деки І: 5 УК на о мн а альна нн З ов г: ОМ Ку я АХ С хюкажке В В Не "Ше ДО ояжених І: - НЕнй З РУ «я В Е ї : У І: В М 5 х г: В ЩО Мети З ЩО акту ую : - д 5 ш З 5 я тд, 5 і: че КУ Я г: В У гхЯ х М М щу КО ; 8 З КУ чЕ її КУ хе : : Зккс годі З Мвке ПРОЖІ : В й шому В соку сема хКУХ й й х В ер в и г: чі й ХК ж й Я, о; ВМ В і пит ке ЕНН З В : я М ХХХ В г жо же ЖМНЦЕ З З ех м Я В : жежжа УЩІЕ ІЗ В хан ККД Ка Х 5 вич т В УМО сс ДИ тити Я КОСІ ЯК жу тю дет Кк роза» зи ше Х во Н КБ Ше о НИК Я ВО і ХУ Ех МІ ж ЕОКНВ во сива ОО КЕ ОКО ЦКУ ЗХ ВО ші са ЕІ і скккквНни Ж Я й Х вом с й ж х ВЗ г щей БУ Я Е Н ХМК сухе Ж ме ух КЕ очи і ОН й жахи я 5 ож Н о ЗИ беж нехай Кк М фо у руд ккию вки вкл. х есе : кан я г У ЕХ |! ох даже х й веде НН и п ОО ОО КЗ Н Ж жк З ОЖОі з НИМИ Ї В ! В НЕ ї В Й Мухи В - і Х В їх 5 З ї В - с « кл хе зх п Х - м о З йо В КУ БУ ХЕ М МЕ КУ М Х Е Среух рик Е твоя течії І : Зах ПК В зве ЗО І НО2і1 ФІГ.22 '