JP2018505209A - プラミノーゲンを含む医薬組成物及びその使用 - Google Patents

Abstract

プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体を含む医薬組成物が開示される。一実施形態では、組成物は張性調整剤、増量剤及び安定化剤を含み、約３．０〜約１０．０のｐＨを有する。別の実施形態では、組成物は、１００ｍｌ当たり６０００粒子未満、好ましくは１００ｍｌ当たり２０００粒子未満の、１０μｍ以上の懸濁液中の粒子数を含有する。これらの組成物を医薬品として使用することが考えられる。これらの医薬組成物の種々の治療用途も考えられる。

Description

発明の分野
本発明は、医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、プラスミノーゲンを含む医薬組成物、及びその治療のための使用に関する。

発明の背景
プラスミノーゲンは、図１Ａに示すプラスミンの酵素前駆体（チモーゲン）である。ヒトプラスミノーゲン前駆体のアミノ酸配列を図１Ｂに示す。ヒトプラスミノーゲンは、約９０ｋＤａの分子量及び約７．０のｐＩを有する７９１個のアミノ酸（前駆体＝８１０個のアミノ酸）を含むが、Ｎ末端活性化ペプチドの異なるグリコシル化及び／または除去は、６．２〜８．０の範囲のｐＩをもたらし得る。それは、２４の鎖内ジスルフィド架橋、５つのクリングル・ドメイン（フィブリンとインヒビターα２−アンチプラスミンとの結合に関与する）、セリンプロテアーゼドメイン（Ｐ）、及び最初の７７個のアミノ酸から構成される活性化ペプチド（ＡＰ）を含む一本鎖タンパク質である。第２のＯ−結合部位が同定されているが（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，２００６）、１つのＮ結合グリコシル化部位及び１つのＯ−結合部位が存在する。循環中のプラスミノーゲンの約７０％はＯ−結合グリコシル化のみを含み、残りはＮ−及びＯ−結合糖の両方を含む。

天然のプラスミノーゲンは、２つの主要な形態のＧｌｕ−プラスミノーゲン（Ｇｌｕ−Ｐｇ）及びＬｙｓ−プラスミノーゲン（Ｌｙｓ−Ｐｇ）で産生され、これらはグルタミン酸またはリシンのＮ末端アミノ酸にちなんで命名された。Ｇｌｕ−Ｐｇは、遺伝子配列（活性化ペプチドを除く）によって指定される全アミノ酸配列から構成され、一方、Ｌｙｓ−Ｐｇは、Ｌｙｓ−７７とＬｙｓ−７８の間（図１Ｂ中の下線部）のＧｌｕ−Ｐｇの切断の結果である。Ｌｙｓ−Ｐｇの循環半減期は、Ｇｌｕ−Ｐｇよりもかなり短い（Ｇｌｕ−Ｐｇについては２−２．５日、Ｌｙｓ−Ｐｇについては０．８日）。Ｇｌｕ−Ｐｇは、血漿中に存在するＰｇの優性型であり、循環中に検出されるＬｙｓ−Ｐｇはごくわずかである（Ｖｉｏｌａｎｄ、Ｂ．Ｎ．，Ｂｙｒｎｅ、Ｒ．，Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｆ．Ｊ （１９７８）Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ α−，ω−Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ヒトプラスミノーゲン構造及び活性化に及ぼすα-、ω-アミノ酸の影響）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２５３（１５）：５３９５−５４０１； Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ，Ｏｎｇ ＥＢ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＡＪ．（１９７５）Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ： Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ＮＨ_２−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（血栓症研究ヒトプラスミノーゲン：ＮＨ_２−末端グルタミン酸プラスミノーゲンの生物学的健全性のインビトロ及びインビボの証拠）．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７（４）：５１５−５２９）。

プラスミノーゲンは肝臓で合成され、血漿に分泌される。プラスミノーゲンは身体全体に分布し、活性化のための条件が存在する時、プラスミノーゲンプロ酵素は組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）によって活性酵素プラスミンに変換される。プラスミンはフィブリンを分解し、潜在性マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性ＭＭＰに変換し、それは組織治癒／リモデリングプロセスの一部として細胞外マトリックス（ＥＣＭ）をさらに分解する。ｔ−ＰＡによるプラスミノーゲン活性化は主としてフィブリン恒常性に関与するが、その受容体ｕ−ＰＡＲと複合体を形成するｕ−ＰＡによるプラスミン生成は組織リモデリングで役割を果たす。

プラスミンは、人工デバイス及び血液透析グラフトにおける血栓性閉塞のクリアランス、及び後部硝子体剥離（ＰＶＤ）の治療のために、その使用可能性について研究されている（ＵＳ６，９６９，５１５；ＵＳ２０１０／０１０４５５１）。

プラスミノーゲンは、創傷治癒、鼓膜穿孔の治癒、歯周創傷の治癒、感染症、口腔健康、糖尿病性潰瘍、血栓溶解徴候（冠動脈血栓症等）、組織への再灌流傷害、虚血、梗塞、脳浮腫、微小循環の改善、及び補体経路の調節等の治療適応症において、その使用が研究されている（ＵＳ８，６３７，０１０； ＵＳ ８，６７９，４８２；ＵＳ８，３１８，６６１；ＷＯ９５／１２４０７；ＥＰ０，６３１，７８６）。現在のところ、プラスミノーゲンは薬として医薬品市場にはない。

歴史的には、Ｌｙｓ−Ｐｇは、血液学的目的のために一定期間薬学的には商品化されたが、２０００年以来科学的または医学的に使用されていない。Ｌｙｓ−Ｐｇの製剤は、Ｓｃｈｏｔｔら，１９９８，Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３３９，Ｎｏ．２３，ｐｐ．１６７９−１６８６）に記載されている。利用可能なＬｙｓ−Ｐｇは臨床的に使用され、基礎疾患のハイポプラスミノゲニミア（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｉｍｉａ）（プラスミノーゲン欠乏症Ｉ型）の臨床症状である、木質性結膜炎の治療について研究された。従って、Ｌｙｓ−Ｐｇ濃縮物の全身投与が試験されている。Ｋｒａｆｔら（Ｋｒａｆｔ Ｊ、Ｌｉｅｂ Ｗ，Ｚｅｉｔｌｅｒ Ｐ，Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｖ．（２０００）Ｌｉｇｎｅｏｕｓ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ ｉｎ ａ ｇｉｒｌ ｗｉｔｈ ｓｅｖｅｒｅ ｔｙｐｅ Ｉ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（重度のＩ型プラスミノーゲン欠乏症の少女の木質結膜炎）．Ｇｒａｅｆｅｓ Ａｒｃｈ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２３８（９）：７９７−８００）は、重度の低倍増分泌原性血症を有する小児におけるＬｙｓ−Ｐｇの毎日の点滴が、結膜偽膜の部分分解をもたらしたことを報告した。Ｓｃｈｏｔｔら（１９９８）は、６ヵ月齢の小児において、Ｌｙｓ−Ｐｇ製剤を連続点滴として用い、その後に毎日ボーラス注射として用いて処置すると、４週間以内に木質結膜炎の完全な退行をもたらし、気道における高粘膜分泌の正常化並びに皮膚の創傷治癒ももたらした。Ｓｃｈｕｓｔｅｒら（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ Ｖ，Ｈｕｇｌｅ Ｂ，Ｔｅｆｓ Ｋ（２００７）Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ５（１２）：２３１５−２３２２）は、ホモ接合体または化合物ヘテロ接合体（特定の遺伝子座での２つの異なる突然変異対立遺伝子の存在、１対の各染色体上の１つ）のハイポプラスミノゲニミア（ｈｙｐｏｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｉｍｉａ）における患者のプラスミノーゲンレベルは、プラスミノーゲン抗原血漿レベルが＜１〜９ｍｇ／ｄＬ、機能性プラスミノーゲン活性が＜１％〜５１％の範囲であった。これらの患者の大部分はいくらかの残留プラスミノーゲン活性レベルを有することに注目することが重要である。従って、プラスミノーゲンの置換は、それが内因性タンパク質であり、免疫原性または線維素溶解活性の懸念を有するとは予想されないので、有効であると期待される。全身性または局所性のプラスミノーゲン濃縮物は、病変の分解及び再形成の停止をもたらす有効な治療として明確に文書化されているが（Ｗａｔｔｓ Ｐ，Ｓｕｒｅｓｈ Ｐ，Ｍｅｚｅｒ Ｅ，Ｅｌｌｓ Ａ，Ａｌｂｉｓｅｔｔｉ Ｍ，Ｂａｊｚａｒ Ｌ，Ｍａｒｚｉｎｏｔｔｏ Ｖ，Ａｎｄｒｅｗ Ｍ，Ｍａｓｓｉｃｏｔｌｅ Ｐ，Ｒｏｏｔｍａｎ Ｄ（２００２）Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｇｎｅｏｕｓ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｔｏｐｉｃａｌ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ（局所プラスミノーゲンによる木質結膜炎の効果的な治療）．Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ １３３（４）：４５１−４５５，Ｈｅｉｄｅｍａｎｎ ＤＧ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＧＡ，Ｈａｒｔｚｅｒ Ｍ，Ｏｈａｎｉａｎ Ａ，Ｃｉｔｒｏｎ ＭＥ（２００３）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｇｎｅｏｕｓ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ ｗｉｔｈ ｔｏｐｉｃａｌ ｐｌａｓｍｉｎ ａｎｄ ｔｏｐｉｃａｌ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ （木質結膜炎の局所プラスミン及び局所プラスミノーゲンによる治療）．Ｃｏｒｎｅａ ２２（８）：７６０−７６２； 及びＳｃｈｏｔｔ，１９９８）、局所用または全身療法用の精製プラスミノーゲンの製品は市販されていない。

ごく最近になって、Ｉ型プラスミノーゲン欠損（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０２３１２１８０）の治療及びＧｌｕ−Ｐｇ（Ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ＧｏｖＩ ｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ０１５５４９５６）の局所的点眼を利用する木質結膜炎の臨床症状の１つの治療にＧｌｕ−Ｐｇを利用する臨床試験がおこなわれた。

タンパク質は、その構造的特徴を変化させること（内部的に）及び／またはそれらと接触する成分を制御する（外部的に）ことによって、安定化され得る。いくつかのタンパク質は、しばしば残念なことに構造的不安定性をもたらすその物理化学的特性のために、医薬製剤における取り扱い及び挙動に関して特定の課題を提起している。それらは実際に例えば次のような：１）加水分解、酸化反応、脱アミノ化、またはイソＡＳＰまたは分子内短縮等の構造再編成を含む、関連する不純物の形成につながる化学プロセス、または２）凝集／重合を生じさせ、従って生物学的活性に影響を及ぼし、潜在的に免疫原性を増強し得る構造的変化を生じる物理的プロセス、等の様々なタイプの分解を受けることがある。

製剤開発は、一般に、活性医薬成分（ＡＰＩ）が、それが薬学的に許容される薬物物質に変換され得る十分な程度に特徴づけられるプロセスに言及する。正確に折りたたまれ生物学的に活性な構造が存在することを確認するために、薬物物質の生物物理学的特性化を実施しなければならない。溶液中のタンパク質の三次構造を調査し、タンパク質構造に対する異なる製剤条件の安定性及び効果を評価するために、いくつかの分光技術（蛍光、ＣＤ、ＤＳＣ、ＤＬＳ等）を使用することができる。（Ｖｏｌｋｉｎ，ＤＢら、“Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ”（タンパク質医薬品の製剤開発と製造の必須ガイドとしての前製剤研究）. Ｓｔｅｖｅ Ｌ．ＮａｉｌとＭｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ａｋｅｒｓ編，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ ２００２，Ｃｈａｐｔｅｒ １，ｐａｇｅ １−３９； Ｃｈｅｎｇ，Ｗ．ら“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ａ Ｍｏｄｅｌ ＩｇＧ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ： Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ“（モデルＩｇＧ２モノクローナル抗体の安定化用賦形剤を同定するためのハイスループット生物物理学的方法の比較：配座安定性及び凝集速度測定）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．１０１，Ｎｏ．５，ｐａｇｅ １７０１−１７２０，２０１２）。さらに、しばしば製薬業界は、薬剤物質の放出のための生物学的アッセイを実施することによって、ＡＰＩの構造的完全性を確認する。これらをもとに、好ましい製剤が、その処方によって不注意に修飾されていないことを確認される。プラスミノーゲンは、冠動脈血栓症、人工デバイス及び血液透析グラフトにおける血栓閉塞のクリアランスなどの血栓溶解徴候のため、及び組織再灌流損傷のため、虚血、不完全骨折、脳浮腫の治療のため、或いは微小循環を改善するために、プラスミンの調製に主に使用されるタンパク質である（ＷＯ９５／１２４０７；ＵＳ６，９６９，５１５；ＥＰ０，６３１，７８６）。

プラスミノーゲンの投与は、冠動脈血栓症のような血栓症の徴候、組織への再灌流傷害の治療、虚血、梗塞、脳浮腫の治療において、或いは微小循環、創傷治癒、鼓膜穿孔の治癒、歯周創傷の治癒、感染症、口腔健康、糖尿病性潰瘍、プラスミノーゲン欠乏症及び補体経路の調節を改善するため、有用であることも分かっている（ＷＯ９５／１２４０７；ＥＰ０，６３１，７８６；ＵＳ８，６３７，０１０；ＵＳ８，６７９，４８２；ＵＳ８，３１８，６６１）。

プラスミノーゲンを処方する際に遭遇するいくつかの課題がある。いくつかの問題は、プラスミノーゲンを分解するプラスミノーゲン製剤のプラスミン汚染に起因する。アプロチニン、リジン、フッ化フェニルメタンスルホニル、大豆トリプシンインヒビターまたはセリンプロテアーゼインヒビターの添加等のプラスミノーゲンの分解を回避するために、様々なアプローチが使用されている（ＵＳ４，１７７，２６２、ＵＳ４，３６１，６５３、ＵＳ５，３０４，３８３）。

他の困難さは、プラスミノーゲンが水性溶媒中に可溶化された場合の糸状物質の混濁または存在によって代表される。この欠点を克服するために、プラスミノーゲンと、例えば非イオン性界面活性剤またはスクロース、アミノ酸及びアルブミンの混合物との組み合わせが提案されている（ＷＯ９４／１５６３１）。

ヒトの治療的使用のためのＧｌｕ−Ｐｇの製剤商品は知られていない。知られているＧｌｕ−Ｐｇの唯一の製剤は、研究のためのもののみである。

プラスミノーゲンの医薬組成物の開発が必要である。

本明細書は、多くの文献を参照し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、プラスミノーゲンを含む医薬組成物、及びその使用（用途）に関する。

本発明は下記項目１〜６１に関する：
１．
−プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体；
−張性調整剤；及び
−安定化剤；
を含み、且つ
約３．０〜約１０．０のｐＨを有する医薬組成物。

２．ｐＨが５．０〜８．０；または６．０〜８．０；または６．５〜７．５である項目１に記載の医薬組成物。

３．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌである項目１に記載の医薬組成物。

４．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約４０、３０、２０，１０または５ｍｇ／ｍｌである項目３に記載の医薬組成物。

５．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、当該組成物の全タンパク質含量の少なくとも８０％であるか、または当該組成物の総タンパク質含量の９０％を超過する項目１〜４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

６．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、組成物の全タンパク質含量の９５％または９８％を超過する項目５に記載の医薬組成物。

７．安定化剤が、（ｉ）アミノ酸、（ｉｉ）アミノ酸塩、（ｉｉ）アミノ酸類似体、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び／または（ｉｉｉ）の任意の混合物を含む項目１〜６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

８．アミノ酸、アミノ酸塩またはアミノ酸類似体が、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、システイン、リジン、リジン類似体またはイプシロン−アミノカプロン酸である項目７に記載の医薬組成物。

９．前記安定化剤がアルギニンである項目８に記載の医薬組成物。

１０．安定化剤が約２０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度を有する項目１〜９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１．安定化剤が約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を有する項目１０に記載の医薬組成物。

１２．張性調整剤が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、シクロデキストリン、ラフィノース、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、グリシングルタミン酸、アラニン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、またはこれらの任意の組み合わせである項目１〜１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１３．張性調整剤が、塩化ナトリウムである項目１２に記載の医薬組成物。

１４．張性調整剤が、約３０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度で存在する請求項１〜１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１５．張性調整剤が、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭまたは約２５ｍＭ〜約３５ｍＭの間の濃度で存在する項目１４に記載の医薬組成物。

１６．さらに増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含む項目１〜１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１７．増量剤が、グリシン、グルタミン酸、アラニン、マンニトール、ソルビトール、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、マンニトール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、キシリトールまたはこれらの任意の組み合わせである項目１６に記載の医薬組成物。

１８．増量剤が、マンニトールまたはソルビトールである項目１７に記載の医薬組成物。

１９．増量剤が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度にある項目１６〜１８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

２０．増量剤が、約５０ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度にある項目１９に記載の医薬組成物。

２１．さらに還元糖を含む項目１〜２０のいずれか１つに記載の医薬組成物。

２２．還元糖が、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、スクロースまたはこれらの任意の組み合わせである項目２１に記載の医薬組成物。

２３．さらに非還元糖を含む項目１〜２２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

２４．非還元糖が、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、またはこれらの任意の組み合わせである項目２３に記載の医薬組成物。

２５．当該医薬組成物は、約１８０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍの間のオスモル濃度を有する項目１〜２４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

２６．さらに防腐剤を含む項目１〜２５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

２７．防腐剤が、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、フェノール、グリセロール、キシリトール、レゾルシノール、カテコール、２，６−ジメチルシクロヘキサノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、２−クロロフェノール、塩化ベンゼトニウム、メルチオレート（チメロサール）、安息香酸（プロピルパラベン）ＭＷ１８０．２、安息香酸ＭＷ１２２．１２、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化セチルピリジニウム、またはこれらの任意の組合せである項目２６に記載の医薬組成物。

２８．防腐剤の濃度は約０．００５〜約１０％（ｗ／ｖ）であり項目２６または２７に記載の医薬組成物。

２９．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、ヒトプラスミノーゲンである項目１〜２８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３０．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、約８０％を超えるＧｌｕ−プラスミノーゲンから構成されている項目１〜２９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３１．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体がＧｌｕ−プラスミノーゲンである項目１〜２９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３２．当該組成物が、１００ｍｌあたり６０００個未満の１０μｍ以上の粒子数を含む項目１〜３１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３３．粒子数が、１００ｍｌあたり２０００または１０００粒子未満である項目３２に記載の医薬組成物。

３４．静脈内、皮下、局所、皮内、眼科及び／または筋肉内投与に適している項目１〜３３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３５．液体組成物、凍結乾燥に適した液体組成物、凍結に適した液体組成物、凍結乾燥組成物、凍結組成物または再構成組成物である項目１〜３４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３６．液体、ゲル、クリーム、または軟膏である項目１〜３４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３７．薬剤として使用される項目１〜３６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３８．１００ｍｌあたり６０００粒子未満の１０μｍ以上の粒子数を含むプラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体を含む医薬組成物。

３９．粒子数が、１００ｍｌあたり２０００または１０００粒子未満である項目３８に記載の医薬組成物。

４０．さらに安定化剤を含む項目３８または３９に記載の医薬組成物。

４１．安定化剤が、（ｉ）アミノ酸、（ｉｉ）アミノ酸塩、（ｉｉ）アミノ酸類似体、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び／または（ｉｉｉ）の任意の混合物を含む項目４０に記載の医薬組成物。

４２．アミノ酸、アミノ酸塩またはアミノ酸類似体が、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、システイン、リジン、リジン類似体またはイプシロン−アミノカプロン酸である項目４１に記載の医薬組成物。

４３．安定化剤がアルギニンである項目４２に記載の医薬組成物。

４４．安定化剤が約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を有する項目４０〜４３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４５．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌである項目３８〜４４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４６．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約５ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌである項目４５に記載の医薬組成物。

４７．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、当該組成物の全タンパク質含量の約９５％を超過しているか、または当該組成物の総タンパク質含量の約９８％を超過している項目３８〜４６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４８．さらに張性調整剤を含む項目３８〜４７のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４９．張性調整剤が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、ラフィノース、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、グリシングルタミン酸、アラニン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、またはこれらの任意の組み合わせである項目４８に記載の医薬組成物。

５０．張性調整剤が、塩化ナトリウムである項目４９に記載の医薬組成物。

５１．張性調整剤が、約３０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度で存在する項目４８、４９または５０に記載の医薬組成物。

５２．さらに増量剤を含む項目３８〜５１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

５３．増量剤が、グリシン、グルタミン酸、アラニン、マンニトール、ソルビトール、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、マンニトール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、キシリトールまたはこれらの任意の組み合わせである項目５２に記載の医薬組成物。

５４．増量剤が、マンニトールまたはソルビトールである項目５３に記載の医薬組成物。

５５．増量剤が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度にある項目５２、５３または５４に記載の医薬組成物。

５６．医薬組成物は、約１８０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍの間のオスモル濃度を有する項目３８〜５５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

５７．組成物が約６．５〜約８．０のｐＨを有する項目３８〜６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

５８．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、ヒトプラスミノーゲンである項目３８〜５７のいずれか１つに記載の医薬組成物。

５９．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、８０％を超えるＧｌｕ−プラスミノーゲンから構成されている項目３８〜５８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

６０．プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体がＧｌｕ−プラスミノーゲンである項目３８〜５８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

６１．薬剤として使用される項目３８〜６０のいずれか１つに記載の医薬組成物。

本発明のさらなる態様は、本明細書の以下の説明、請求項、及び一般化から当業者に明らかになるであろう。

そのクリングル・ドメイン、プラスミン切断部位及びストレプトキナーゼ結合部位を示すプラスミノーゲンの一次構造の概略図である。 ヒトプラスミノーゲン前駆体のアミノ酸配列を示す。成熟形態の配列はボールド体であり、その間にＬｙｓ−Ｐｇを生成するための切断が存在する２つのリジン残基に下線が引かれている。 凍結乾燥後の製剤１のプラセボ（Ｐｇなし）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤１（表１Ａに記載）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤２のプラセボ（Ｐｇなし）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤２（表１Ａに記載）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤３のプラセボ（Ｐｇなし）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤３（表１Ａに記載）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤４のプラセボ（Ｐｇなし）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤４（表１Ａに記載）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤５のプラセボ（Ｐｇなし）を含有するバイアルの写真である。 凍結乾燥後の製剤５（表１Ａに記載）を含有するバイアルの写真である。 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、及び２８．５ｍＭ（０．５％）のアルギニン中にプラスミノーゲン２０ｍｇ／ｍｌを含有する凍結乾燥組成物ｎｏ．Ｆ０４９８のバイアルの写真である。 １０ｍＭ リン酸Ｎａ、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、２８．５ｍＭ（０．５％）のアルギニン及び５４ｍＭ（１％）マンニトール中にプラスミノーゲン１０ｍｇ／ｍｌを含有する凍結乾燥組成物ｎｏ．Ｆ０４９９のバイアルの写真である。 １０ｍＭ リン酸Ｎａ、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２、２８．５ｍＭ（０．５％）のアルギニン及び５４ｍＭ（１％）マンニトール中にプラスミノーゲン２０ｍｇ／ｍｌを含有する凍結乾燥組成物ｎｏ．Ｆ０４５９のバイアルの写真である。 水（サンプル０）、１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５（サンプル１）、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２（サンプル２）及び１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０（サンプル３）中に、５ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲン（それぞれ、順に０．０２、２０、１００、８００ＮＴＵの濁度標準近くである）を含むバイアルの写真である。 ３５ｍＭ ＮａＣｌ及び２８．５ｍＭ（０．５％）Ａｒｇがサンプル１、２及び３に添加されたことを除いて、図１２に示されたものと同じバイアルの写真である。 クエン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６．５（図１７）、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．２（図１８）、及びトリス緩衝液中ｐＨ８．０（図１９）における、０．５％のグリシン、アルギニン、アラニンを含み、アミノ酸を含まない１０ｍｇのプラスミノーゲン、３５ｍＭのＮａＣｌを含有する組成物について、４時間にわたる濁度を示すグラフである。 クエン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６．５（図１７）、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．２（図１８）、及びトリス緩衝液中ｐＨ８．０（図１９）における、０．５％のグリシン、アルギニン、アラニンを含み、アミノ酸を含まない１０ｍｇのプラスミノーゲン、３５ｍＭのＮａＣｌを含有する組成物について、４時間にわたる濁度を示すグラフである。 クエン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６．５（図１７）、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．２（図１８）、及びトリス緩衝液中ｐＨ８．０（図１９）における、０．５％のグリシン、アルギニン、アラニンを含み、アミノ酸を含まない１０ｍｇのプラスミノーゲン、３５ｍＭのＮａＣｌを含有する組成物について、４時間にわたる濁度を示すグラフである。 クエン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６．５（図２０）、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．２（図２１）、及びトリス緩衝液中ｐＨ８．０（図２２）における、０．５％のグリシン、アルギニン、アラニンを含み、アミノ酸を含まない１０ｍｇのプラスミノーゲン、３５ｍＭのＮａＣｌ及び０．５％マンニトールを含有する組成物について、４時間にわたる濁度を示すグラフである。 クエン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６．５（図２０）、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．２（図２１）、及びトリス緩衝液中ｐＨ８．０（図２２）における、０．５％のグリシン、アルギニン、アラニンを含み、アミノ酸を含まない１０ｍｇのプラスミノーゲン、３５ｍＭのＮａＣｌ及び０．５％マンニトールを含有する組成物について、４時間にわたる濁度を示すグラフである。 クエン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ６．５（図２０）、リン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．２（図２１）、及びトリス緩衝液中ｐＨ８．０（図２２）における、０．５％のグリシン、アルギニン、アラニンを含み、アミノ酸を含まない１０ｍｇのプラスミノーゲン、３５ｍＭのＮａＣｌ及び０．５％マンニトールを含有する組成物について、４時間にわたる濁度を示すグラフである。

［発明の詳細な説明］
本明細書中には、プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体を含む医薬組成物が開示される。

本明細書においてまた、
− プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体；
− 張性調整剤；及び
− 安定化剤；
を含み、且つ
約３．０〜約１０．０、好ましくは約５．０〜約８．０；より好ましくは約６．０〜約８．０；さらに好ましくは約６．５〜約７．５のｐＨを有する医薬組成物が記載される。

本発明は、増大した堅牢性を有するプラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体を含む医薬組成物に関する。本発明は、プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体を含む医薬組成物であって、組成物１００ｍＬ当たり６０００粒子未満または組成物１００ｍＬあたり５０００粒子未満、または組成物１００ｍＬあたり４０００粒子未満、または組成物１００ｍＬ当たり３０００粒子未満、または組成物１００ｍＬ当たり２０００粒子未満または組成物１００ｍＬ当たり１０００粒子未満の１０μｍ以上の粒子数を有する。本発明の一実施形態では、凍結乾燥及び再構成の後、粒子の数は低いままである。本発明の一実施形態では、同じ組成の繰り返し調製は、粒子数の変動をもたらさない。

本明細書で使用される「プラスミノーゲン」という用語は、任意の動物、例えば哺乳動物（例えばヒト）由来の任意の形態の天然プラスミノーゲンポリペプチド（例えば、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲン）を指す。プラスミノーゲンはプロ酵素であり、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕ−ＰＡ）によって活性酵素プラスミンに変換される。プラスミンはフィブリンを分解し、潜在性マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性ＭＭＰに変換し、それは組織治癒／リモデリングプロセスの一部として細胞外マトリックス（ＥＣＭ）をさらに分解する。本明細書で使用される用語「生物学的に活性な変異体」は、天然のプラスミノーゲンの生物学的活性、即ち、フィブリンを分解し、潜在マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性なＭＭＰに変換し得るプラスミンポリペプチドに、（ｔ−ＰＡ及び／またはｕ−ＰＡにより）変換され得る能力、を保持する突然変異プラスミノーゲンポリペプチドを指す。変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失／切断（短縮）（Ｎ末端、Ｃ末端及び／または内部アミノ酸欠失／切断）、付加（Ｎ末端、Ｃ末端及び/または内部アミノ酸付加）を含み得る。生物学的に活性な変異体は、天然のプラスミノーゲンポリペプチドのものより低い、高い、または類似の生物学的活性（例えば、得られるプラスミンの酵素活性）を示し得る。実施形態において、変異体は、天然のプラスミノーゲンポリペプチドと少なくとも６０、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％のアミノ酸配列同一性を有する。生物学的に活性なプラスミノーゲン変異体は、例えば、ＷＯ２０１２／０９３１３２、ＷＯ２０１３／０２４０７４及びＷａｎｇら（１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ４，１７５８−１７６７）に記載されており、１つ以上のクリングル・ドメイン及び／またはその一部を欠く、「ミッドプラスミノーゲン」、「ミニプラスミノゲン」、「マイクロプラスミノゲン」及び「デルタプラスミノーゲン」と一般に呼ばれるプラスミノーゲンの切断（短縮）変異体を含む。一実施形態では、プラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンである。さらなる実施形態では、組成物は天然のヒトプラスミノーゲンを含む。プラスミノーゲンは、いくつかの供給源から得ることができる。それは、組換え合成によって得ることができ、或いは血液、血漿または血液由来の溶液から抽出／精製することができる。プラスミノーゲンは、コーン（Ｃｏｈｎ）分画または沈殿によって血液または血漿から抽出することができる。プラスミノーゲンは、ＷＯ２００６／１２０４２３に記載の方法等の結合アフィニティークロマトグラフィーにより、血漿または血液由来の溶液から精製することができ、或いは組換えによって産生することができる。

一実施形態において、プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し；好ましくは約１ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ；好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌ；好ましくは約５ｍｇ／ｍｌ〜約４０ｍｇ／ｍｌ；好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約３０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約２ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０５または０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。

本発明の一実施形態では、医薬組成物中に含まれるプラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体は、約８０％を超える、または約９０％を超えるか、または約９５％を超えるか、または 約９８％を超える純度を有する。「約」という用語は、おおよそ１０％の値の変動を意味する

本組成物のｐＨは、約３．０〜約１０．０であり得る; 約５．０〜約８．０；.６．０〜約８．０；または約６．５〜約７．５である。実施形態において、本組成物のｐＨは、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、８．０、８．５、９．０または１０．０である。このようなｐＨで組成物を維持するために、本発明の組成物は緩衝剤を含むことが好ましい。所望のｐＨに応じて以下の緩衝液を含む多数の緩衝液を本発明の範囲内で用いることができる：

一実施形態では、緩衝液は、２つの緩衝液の組み合わせを含む；例えばクエン酸塩／リン酸塩、クエン酸塩／ヒスチジン、酢酸塩／ヒスチジンまたはコハク酸塩／ヒスチジンである。本発明の一実施形態では、緩衝液はクエン酸緩衝液を含まない。別の実施形態において、緩衝液はクエン酸塩、リン酸塩（Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨＰＯ_４）、ヒスチジンまたはコハク酸塩である。別の実施形態では、緩衝液はリン酸塩（Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨＰＯ_４）、ヒスチジンまたはコハク酸塩である。

一実施形態では、緩衝液の濃度は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ、例えば約２ｍＭまたは約１０ｍＭである。

本明細書で使用される場合、「張性調整剤」は、医薬組成物の張性（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）を調節するために使用される化合物を指す。一実施形態では、張性調整剤は、組成物を等張にする量で存在する。別の実施形態では、張性調整剤は、組成物を高張または低張にする量で存在する。一実施形態において、張性調整剤は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＺｎＣｌ_２、ホウ酸塩、薬学的に許容される一価塩、薬学的に許容される二価塩、薬学的に許容される三価塩、薬学的に許容される四価塩、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、シクロデキストリン、ラフィノース、糖アルコール、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、グリシングルタミン酸、アラニン、デキストランＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、またはそれらの任意の組み合わせである。「等張性」は、本発明の組成物が、ヒトの血液の浸透圧と本質的に同じ浸透圧を有することを意味する。張性調整剤は、一般に、約２５０〜約３３０ｍＯｓｍのオスモル濃度（浸透圧）を有する。オスモル濃度は、例えば、蒸気圧または氷凍結型オスモル濃度計（ｏｓｍｏｍｅｔｅｒ）を使用して測定することができる。一実施形態では、医薬組成物は、２つの張性調整剤の混合物を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、３つの張性調整剤の混合物を含む。一実施形態では、張性調整剤は糖であるか、または糖もしくは糖の混合物を含む。一実施形態では、張性調整剤は塩化ナトリウムである。一実施形態では、張性調整剤濃度の濃度は、約３０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約３０ｍＭ〜約１００ｍＭである。一実施形態では、張性調整剤濃度の濃度は、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、または約６８ｍＭ、または約７５ｍＭである。一実施形態では、組成物の得られる重量オスモル濃度が所望の範囲内に入るように張性調整剤の濃度を調節する。

一実施形態では、組成物は増量剤をさらに含む。本明細書で使用される「増量剤」は、組成物のバルク質量を増加させる化合物／薬剤を指す。増量剤の例としては、グリシン、グルタミン酸、アラニン、マンニトール、ヒドロエチルデンプン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、マンニトール、ソルビトール、オリゴ糖由来の糖アルコール、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、キシリトール、ポリエチレングリコール 、スクロース、グルコース、マルトース、キシリトール、ＮａＣｌ、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬剤は、張性調整剤としても役立つ。実施形態において、増量剤の濃度は、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭであり；または約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、または約１０８ｍＭ、または約５４ｍＭである。

一実施形態では、張性調整剤及び増量剤は、張性調整剤／増量剤比が約１．０〜約１５．０（重量／重量）であるような濃度である。約１．０〜約１０．０、約３．０〜約１０．０、約５．０〜約１０．０、例えば、約５．０、約８．０、または約１０．０である。一実施形態では、増量剤の濃度は、張性調整剤／増量剤比が所望の範囲内になるように張性調整剤の濃度に基づいて調節される

実施形態では、組成物は、担体、賦形剤、希釈剤、安定剤、緩衝剤等の１つ以上の追加の薬学的に許容される成分をさらに含む。

一実施形態では、医薬組成物は、さらに糖、例えば還元糖及び／または非還元糖を含む。本明細書で使用される場合、「還元糖」は、金属イオンを還元することができるか、或いはタンパク質中のリシン及び他のアミノ基と共有結合的に反応することができるヘミアセタール基を含有するものであり、「非還元糖」は、還元糖のこれらの性質を有しないものである。一実施形態では、還元糖は、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコースまたはそれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、非還元糖は、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノースまたはこれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、還元糖の存在下で凍結乾燥される。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、非還元糖の存在下で凍結乾燥される。

実施形態において、本発明の医薬組成物は、約１８０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍのオスモル濃度；または約２５０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍ、または約２００ｍＯｓｍ〜約３００ｍＯｓｍのオスモル濃度を有する。特定の実施形態では、例えば、本組成物が凍結乾燥で調製される場合、それは３５０ｍＯｓｍより大きいオスモル濃度を有し得る。このような場合、再構成された溶液は、成分を希釈しオスモル濃度を低下させるために、組成物の容量よりも大きい容量を有し得る。また、組成物を小容量の投与のために設計する場合、組成物の重量オスモル濃度は３５０ｍＯｓｍよりも高くなり得る。

本明細書で使用される場合、「安定化剤」は、溶液中のプラスミノーゲンを安定化させる薬剤を指す。一実施形態では、安定化剤は、アミノ酸、アミノ酸塩、アミノ酸類似体、またはこれらの任意の混合物を含む。さらなる実施形態において、アミノ酸、アミノ酸塩、アミノ酸類似体またはそれらの混合物は、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、システイン、リジン、イプシロン−アミノカプロン酸等のリジン類似体、またはこれらの任意の組み合わせである。好ましい実施形態では、前記アミノ酸は、アルギニン塩酸塩及びリジン塩酸塩等のアミノ酸塩基の形態であり得る。一実施形態では、医薬組成物は、２つのアミノ酸、アミノ酸塩及び／またはアミノ酸類似体を含む。別の実施形態では、医薬組成物は、３つのアミノ酸、アミノ酸塩及び／またはアミノ酸類似体を含む。ある実施形態では、アミノ酸の濃度は、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約５０ｍＭ、または約７５ｍＭ、または約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、または約３００ｍＭである。

別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、酸化防止剤をさらに含む。一実施形態において、酸化防止剤は、メチオニン、酸化型グルタチオン（Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）_２（６１３ｋＤａ）、アスコルビン酸、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン／ホモシステイン、グルタチオン、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ（登録商標））、リポ酸、チオ硫酸ナトリウム、白金、グリシン−グリシン−ヒスチジン（トリペプチド）、ブチル化ヒドロキシルトルエン（ＢＨＴ）、またはこれらの任意の組み合わせである。実施形態において、酸化防止剤の濃度は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、または約２００ｍＭである。

別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、さらに界面活性剤を含む。本明細書で使用される場合、「界面活性剤」は、溶液中に溶解されたときに液体と固体との間の界面張力を低下させる化合物／薬剤を指す。一実施形態では、界面活性剤は、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（登録商標）８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８、またはＢｒｉｊ（登録商標）３５；ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８またはＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８）；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；ラウリル硫酸ナトリウム；オクチルグリコシドナトリウム；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−、またはステアリル−スルホベタイン；ラウリル−、ミリスチル−、リノレイル−またはステアリル−サルコシン；リノレイル−、ミリスチル−、またはセチル−ベタイン；ラウロアミドプロピル−、コカミドプロピル−、リノールアミドプロピル−、ミリスチルアミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアリルアミドプロピル−ベタイン（例えば、ラウロアミドプロピル）；ミリスチルアミドプロピル−、パルミドプロピル−、またはイソステアルアミドプロピル−ジメチルアミン；ナトリウムメチルココイル−、またはメチルオレイル−タウリン酸ジナトリウム；ＭＯＮＡＱＵＡＴ（商標）シリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．，Ｐａｔｅｒｓｏｎ、ＮＪ）、ポリエチルグリコール、ポリプロピルグリコール、またはエチレンとプロピレングリコールのコポリマー、またはこれらの任意の組み合わせである。一実施形態では、界面活性剤の濃度は、プラスミノーゲン、生物学的に活性な変異体またはそのフラグメントの凝集を低減し、及び／または組成物中の微粒子の形成を最小限にし、及び／または吸着を低減するように調節される。一実施形態では、界面活性剤は、約０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、約０．００２〜約０．０２％（ｗ／ｖ）または約０．００２％〜約０．００６％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、ポロキサマーである界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を含む。特定の実施形態では、組成物は約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、例えば約０．１％（ｗ／ｖ）のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８を含む。一実施形態では、組成物は、非イオン性界面活性剤を実質的に含まないか、または含まない。例えば、組成物は、約０．０２％、０．０１％、０．００６％または０．００４％（ｗ／ｖ）未満の非イオン性界面活性剤を含む。

別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、ポリマー安定剤をさらに含む。一実施形態では、ポリマー安定剤は、ヘパリン（６〜３０ｋＤａ）；Ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ）、Ｐｏｌｙ（Ａｓｐ）、及びＰｏｌｙ（Ｇｌｕ，Ｐｈｅ）等のポリアミノ酸（２〜１００ｋＤａ）；カルボキシメチルセルロース（１０−８００ｃｐｓ）；シクロデキストリン；デキストラン硫酸、またはこれらの任意の組み合わせである。実施形態において、ポリマー安定剤の濃度は、約０．００１％〜約０．５０％、または約０．００１％〜約０．２５％である。

他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ポリエチレングリコール、例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。一実施形態では、ポリエチレングリコールの濃度は約０．５％〜約１０％（ｗ／ｗ）である。

一実施形態において、本発明の医薬組成物は、防腐剤をさらに含む。本明細書中で使用される場合、「防腐剤」は、その中の細菌活性を実質的に低下させるために医薬組成物に添加され得る化合物／薬剤を指し、これにより、例えば多剤医薬組成物の製造を容易にする。防腐剤の例としては、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、フェノール、グリセロール、キシリトール、レゾルシノール、カテコール、２，６−ジメチルシクロヘキサノール、２−メチル−２，４−ペンタジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、２−クロロフェノール、塩化ベンゼトニウム、メルチオレート（チメルサール）、安息香酸（プロピルパラベン）ＭＷ１８０．２、安息香酸ＭＷ１２２．１２、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、または塩化セチルピリジニウムが挙げられる。防腐剤は、緩衝液及び医薬組成物の他の成分と適合するように選択される（即ち、溶液は透明である）。例えば、緩衝液が酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムである場合、親和性のある防腐剤としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、レゾルシノール、２−メチル−２，４−ペンタジオール、メルチオレート（チメロサール）、塩化ベンザルコニウム、安息香酸ナトリウム、または塩化セチルピリジニウムが挙げられる。本組成物で使用される防腐剤の濃度は、当業者の判断に従って決定することができる。いくつかの実施形態において、防腐剤の濃度は、約０．００５〜約１０％（ｗ／ｖ）、約０．１〜約１．０％（ｗ／ｖ）または約０．３〜約０．７％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態において、防腐剤の濃度は、約０．００５、０．１、０．３、０．５、０．７または１．０％（ｗ／ｖ）である。

別の実施形態において、本発明の医薬組成物は、防腐剤を含まない

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１９版、Ｇｅｎａｒｒｏ，Ａ．編集（１９９５）に記載されているもの等の１つ以上の追加の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤は、本発明の医薬組成物の所望の特性に著しく悪影響を及ぼさないという条件で、本組成物に含めることができる。本発明の組成物の他の構成要素としては、水（例えば注射用の水）、植物油、メチルセルロース等の増粘剤、抗吸着剤、湿潤剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、ＥＤＴＡ等のキレート剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、ポリエステル等の生分解性ポリマー、及び／またはナトリウム等の塩形成対イオンを挙げることができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、被験体に対して使用される用量及び濃度で無毒であるような量で存在する。

一実施形態では、本発明の医薬組成物は、凍結乾燥されたときに約３．５％〜約８％、好ましくは約３．５％〜約６％、より好ましくは約３．８％〜約５．５％の固形分の総量を有する。本発明の医薬組成物中の成分の濃度を増加させることにより、凍結乾燥組成物中の固形分の総量％が増加し、凍結乾燥組成物の固形物外観が改善される。

ある実施形態では、プラスミノーゲンまたはその変異体は、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミノーゲンである。別の実施形態において、プラスミノーゲンまたはその変異体は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンである。一実施形態では、プラスミノーゲンまたはその変異体は、様々なタイプのプラスミノーゲン及び／または変異体からなる。好ましくは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン含量は、プラスミノーゲンまたはその変異体の全含量の５０％超過、または６０％超過、７０％超過、または８０％超過、または９０％超過である。

本発明の一実施形態は、プラスミノーゲンまたはその変異体を含む医薬組成物であって、組成物中のプラスミノーゲンまたはその変異体以外のタンパク質の総量が、組成物の約１０％未満、約５％未満、または約２％未満である。本発明の実施形態は、プラスミノーゲンまたはその変異体を含む医薬組成物であって、組成物が追加のタンパク質（即ち、プラスミノーゲンまたはその変異体に加えて）を含まないかまたは実質的に含まない。本発明の一実施形態では、組成物はアルブミンを含まないか、または実質的に含まない。本発明の一実施形態では、組成物はアプロチニンを含まないか、または実質的にアプロチニンを含まない。本発明の一実施形態では、組成物はトリプシン阻害剤を含まないか、または実質的に含まない。本発明の一実施形態では、組成物は、セリンプロテアーゼ阻害剤を含まないか、または実質的に含まない。本発明の一実施形態では、組成物はプラスミンを含まないか、または実質的にプラスミンを含まない。本発明の一実施形態では、組成物は界面活性剤を実質的に含まないか、または含まない、即ち界面活性剤の濃度は０．０１ｍＭ未満である。

一実施形態では、本発明のプラスミノーゲンを含む医薬組成物は、室温で少なくとも２時間、２４時間、１週間または１ヶ月間安定である。

一実施形態では、本発明のプラスミノーゲンを含む医薬組成物は、０℃未満の温度で少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間または少なくとも２４ヶ月間安定である。０℃未満の前記温度は約−２０℃、約−３０℃、約−６０℃、約−７０℃または約−８０℃である。

実施形態において、プラスミノーゲンを含む医薬組成物は、液体組成物、凍結乾燥に適した液体組成物、凍結に適した液体組成物、凍結乾燥組成物、凍結組成物または再構成組成物である。

用語「医薬組成物」は、医薬的、医学的または治療的目的のための組成物を示す。

本明細書に記載される成分（ｐＨ、緩衝液、張性調整剤、増量剤、安定化剤等）の全ての組み合わせ、及び本発明の医薬組成物のこれらの各濃度が、本開示によって具体的に描かれる。本発明によるプラスミノーゲン（Ｐｇ）の医薬組成物の代表的な例を表１Ａに示す。

本発明による医薬組成物の他の代表的な例は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは５〜６０ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲンまたはその変異体、及び６．５〜８．０のｐＨを有する組成物として、以下の表１Ｂに示される。これらの全ての例において、プラスミノーゲンの含量は、好ましくは主にＧｌｕ−プラスミノーゲンから成り、プラスミノーゲンまたは変異体の総含量は５ｍｇ／ｍＬ〜６０ｍｇ／ｍＬである。

一実施形態では、本発明のプラスミノーゲンを含む医薬組成物は、静脈内、皮下、局所、皮内、眼科及び／または筋肉内投与に適している。

一実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、ヒト被験体に投与するためのものである。好ましくは、本発明の医薬組成物は、静脈内投与、皮下投与、局所投与、筋肉内投与または眼科投与用である。一実施形態では、本発明の組成物は、液体、ゲル、クリームまたは軟膏の形態である。

本発明の組成物中に処方されるプラスミノーゲンは、いくつかの供給源から得ることができる。それは、組換え合成によって得ることができるか、または血液、血漿または血液由来溶液から抽出／精製することができる。プラスミノーゲンは、コーン分画または沈殿によって血液または血漿から抽出することができる。プラスミノーゲンは、血漿または血液由来の溶液から、ＷＯ２００６／１２０４２３に記載された方法のような結合親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。プラスミノーゲンの変異体には、アミノ酸配列の任意の修飾、またはそれへの基の任意の付加、またはそれへのアミノ酸またはアミノ酸配列の任意の付加が含まれるが、これらに限定されない。プラスミノーゲンの断片には、限定されないが、アミノ酸またはアミノ酸配列の欠失が含まれる。

本明細書中で使用される場合、「約」という用語は、対応する値の＋１０％または−１０％をカバーすることを意図する。

用語「被験体」は、プラスミノーゲン、その変異体またはその断片の投与から利益を得ることができる生物を含む。用語「被験体」には、哺乳類または鳥類などの動物が含まれる。好ましくは、対象は哺乳動物である。より好ましくは、被験体はヒトである。より好ましくは、被験体は治療を必要とするヒト患者である。

本明細書中で使用される場合、「予防する」または「予防」とは、疾患または障害を獲得するリスク（または感受性）の可能性の低下（即ち、疾患に曝露されているか、または疾患の素因がある可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、または示していない患者において、疾患の臨床症状の少なくとも１つが発症しないようにすること）を指す。このような患者を同定するための生物学的及び生理学的パラメータは、本明細書で提供され、医師によっても周知である。

被験体の「治療」または「治療する」という用語は、疾患または状態、疾患または状態の症状、或いは疾患または状態のリスク（または感受性）を、遅延、安定化、治療、治癒、緩和、軽減、改変、改善、悪化の軽減、改善、向上、または影響することを目的として、被験体への本発明の組成物の適用または投与（または被験体の組織または器官への本発明の組成物の適用または投与）を含む。「治療する」という用語は、傷害、病理または状態の治療または改善における成功の任意の指標を指し、軽減；寛解；悪化の速度の低下；病気の重症度の軽減；症状の安定化、症状の減少、または傷害、病理または状態を被験者に対してより許容しやすくすること；退化または衰退の速度を遅くすること；変性の終着点を衰弱させないこと；または被験者の身体的または精神的健康を改善すること；等の客観的または主観的パラメータを含む。いくつかの実施形態では、用語「治療する」は、被験者の平均余命及び／または追加の治療が必要とされる前の遅延を増加させることを含み得る。

本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、特定の障害、疾患または状態を治療または予防するために被験体に投与される際、その障害、病気または状態のそのような治療または予防を行うのに十分である化合物の量を意味する。本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、さらに、創傷を治癒する、鼓膜穿孔を治癒する、歯周創傷を治癒する、感染性疾患を治療する、口腔の健康を増強または維持する、後部硝子体剥離（ＰＶＤ）、糖尿病性潰瘍、及び、冠動脈血栓症等のプラスミノーゲン欠損被験体を治療する、組織への再灌流障害の治療、微小循環改善のための虚血、梗塞、脳浮腫の治療、プラスミノーゲン欠乏症の被験者を治療する、及び被験体中の補体経路を調節する、ための有効なプラスミノーゲン、その変異体またはその断片の量を意味する。投薬量（用量）及び治療上有効な量は、例えば、被験体の、年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事のアクティビティ、投与時間、投与経路、排せつ速度、及び薬剤の組み合わせ、適用可能であれば、施術者が化合物が被験体に対して有することを望む効果、及び被験体が罹患している特定の障害（複数可）等の様々なファクターに依存して変わり得る。さらに、治療有効量は、被験体の血液パラメータ（例えば、脂質プロファイル、インスリンレベル、血糖）、疾患状態の重篤度、臓器機能、または基礎疾患または合併症に依存し得る。このような適切な用量は、本明細書に記載されるアッセイ等の任意の利用可能なアッセイを用いて決定され得る。本発明の医薬組成物がヒトに投与される場合、医師は、例えば、最初に比較的低用量を処方し、引き続き適切な反応が得られるまで用量を増加させることができる。投与される用量は、最終的には医師の裁量に委ねられる。

キット
本発明の化合物（複数可）は、キットの一部として容器（例えば、包装、箱、バイアル等）を任意に含んで包装することができる。キットは、本明細書に記載される方法に従って市販のものを使用してもよく、本発明の方法で使用するための説明書を含み得る。

本発明の組成物は、別の有効成分と同時に、前または後に、及び同じ投与経路によって、または別の投与経路によって、患者に投与してもよいし、投与しなくてもよい。従って、本発明は、医師が使用する場合、本組成物の適切な量を、単独で、または別の有効成分と組み合わせて患者に投与するように単純化し得るキットも包含する。

本発明のキットは、凍結乾燥組成物を再構成するための薬学的に許容される液体をさらに含むことができる。例えば、有効成分が、非経口投与のために再構成されなければならない固体形態で提供される場合、キットは、非経口投与に適した微粒子非含有無菌溶液を形成するために活性成分を溶解することができる適切な薬学的に許容される液体のシール容器を含むことができる。

特定の実施形態では、本組成物は、単回または複数回の投与のために、バイアル、ボトル、チューブ、シリンジまたは他の容器に収容される。このような容器は、例えば、ガラス、或いはポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリオレフィン等のポリマー材料で作製することができる。いくつかの実施形態では、容器は、単回用量を抜き取り、次いで、針の除去の際に再シールするために、針によって貫通され得るゴム栓のようなシールまたは他の閉鎖システムを含み得る。当技術分野で知られている、注入可能な液体、凍結乾燥組成物、再構成凍結乾燥組成物、または再構成及び注射用粉末、のためのこのような容器はすべて、本開示の組成物及び方法における使用において意図されている。特定の実施形態では、容器は、単回投与または複数回投与を含むペン型送達装置である。このようなペン型送達装置は、永久的、例えば、単一用量または複数用量を含む使い捨てカートリッジを収容する永久的ペンであってもよく、或いは装置全体が使い捨て、例えば、単回用量または複数回用量を含む使い捨てペンであってもよい。ペン型送達装置が複数の投与量を含む特定の実施形態では、投与量は予め設定することができ、即ち固定することができる。他の実施形態では、投与量は、柔軟な投与量、即ち、ユーザによってダイヤルインされ得る。いくつかの実施形態では、ペン型送達装置は、ルアーロック、ルアーコーン、または使い捨て針の取り付けを容易にする他のニードル嵌合コネクタを備える。他の実施形態では、ペン型送達装置は、結び付け（ステーク）された、即ち永久的な針を含む。別の特定の実施形態では、容器はシリンジである。いくつかの実施形態では、注射器は、ルアーロック、ルアーコーン、または使い捨て針の取り付けを容易にする他の針嵌合コネクタを備える。他の実施形態では、シリンジは、ステークされた、即ち永久的な針を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、単回投与または複数回投与で事前充填される。

安定性の分析
「安定な」組成物としては、その中のタンパク質（プラスミノーゲンまたはその変異体）が、保存時の、その物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を実質的に保持する組成物が挙げられる。タンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が利用可能であり、例えば、Ｌｅｅ、Ｖ．，１９９１，Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）及びＪｏｎｅｓ，Ａ． １９９３，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １０：２９−９０に記載されている。選択された期間、選択された温度で安定性を測定することができる。一実施形態では、組成物は、室温（約２５℃）または４０℃で、少なくとも１、２、３、４、５または６ヶ月間安定であり、及び／または約２−８℃で少なくとも１、２、３、４、５または６ヶ月安定である。さらに、特定の実施形態では、組成物は凍結（例えば、−３０℃）後に安定である。特定の実施形態において、安定性の基準は、以下の通りである：（１）組成物は、視覚的分析によって透明にとどまっている；（２）組成物の濃度、ｐＨ及び重量オスモル濃度が約±１０％以下の変動しかない；（３）ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定した凝集体形態が約１０％以下、約５％以下、または約１％以下である；（４）当技術分野で公知の方法及び十分に確立された分析方法によって測定される、プラスミノーゲンの分解が１０％以下、約５％以下、または３％以下である。

熱変性：プラスミノーゲンまたはその変異体またはその断片の熱変性実験ＨＴＳ製剤スクリーニングは、ＰａｌｌのＯｐｔｉｍ ２（商標）を用いて実施することができる；或いは、タンパク質のアンフォールディング（標準的なＰＣＲ（加熱ブロック付き）、蛍光計またはＣＤ分光光度計（温度制御あり））をモニターするための他の代替的な生物物理学的技術（複数可）を挙げることができる。例えば、Ｏｐｔｉｍ ２システムは、アンフォールディング転移温度（Ｔｍ）、凝集開始温度（Ｔａｇｇ）及び凝集速度を含むタンパク質安定性指示パラメータの範囲を同時に測定する。

賦形剤の熱安定性に対する影響：狭いｐＨは、より高い融点（Ｔｍ）及び凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を有する最適ｐＨ範囲で決定される。より高いＴｍが６．５−７．５の生理的範囲で得られるならば；次の試験（複数可）は、少なくとも３つの緩衝系（複数可）を用いてスクリーニングすることである。

さらに、ＩＥＦ（等電点電気泳動法）またはｃＩＥＦ（毛細管等電点電気泳動法）を、溶液中のプラスミノーゲンの物理的構造（コンフォメーション）の評価のために試験することができる。

６０℃で１〜８時間のインキュベーション後の、各緩衝液／賦形剤について、及びプラスミノーゲンのみを含有する参照溶液についての、プラスミノーゲン酵素活性測定に基づく安定化のパーセンテージ。別の試験では、安定化を３７℃で１〜８時間評価することができる。安定化のパーセンテージは次のように計算される：
安定化百分率=１００×［Ｓ−Ｔ］／［Ｔ］

上式で、Ｓは、３５℃で１０日間後に試験される賦形剤を含む酵素溶液の残留酵素活性であり；Ｔは同じ条件で保存された賦形剤を含まない対照の活性である。

凝集及び粒子測定数（ＰＭＣ）：ＰＭＣは、光遮蔽粒子数試験（Ｌｉｇｈｔ Ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔ Ｔｅｓｔ）によって計算される。分析者は、遮光の原則に基づいて、粒子サイズと個数を自動的に決定できる適当な機器を使用する必要がある。選択されたセンサは、意図された粒度範囲及び予想される粒子数に適してなければならない。標準粒子サイズの範囲は、一般に２〜１００ｍｍである。分析者は、適当な体積で粒子を含まない水に分散されたＵＳＰ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔ ＲＳを使用して、装置の性能を確認する必要がある。較正プロセスでの分散中に粒子が凝集するのを避けるように注意する必要がある。

方法：製品サンプルは、送達（例えば、排出されたシリンジ内容物）を最も適切に表す方法で試験される。十分な容量（即ち、試験を容易にするのに十分な容量）を有する非経口用の場合、個々のユニットの試験はしばしば診断的である。十分な容量の無い非経口用製品については、注意深く徹底的に各ユニットを混合してから、適当な数のユニットの内容物を合わせて別の容器に入れ、１回の試験に必要な容量（一般に０．２〜５．０ｍＬ）を得る。希釈を行う場合は、空の容器に製品と希釈剤のための十分な容量があることを確認し、もしあればわずかな粒子がプロセスに導入されていることを確認する。慎重に各ユニットを開け、シールクロージャー（ｓｅａｌｉｎｇ ｃｌｏｓｕｒｅ）を取り外し、サンプリング、希釈、または必要に応じてプールする前に内容物の汚染を避ける。製品溶媒が、例えば非経口使用のための凍結乾燥された固体または粉末用に、特定されている場合、再構成または希釈は、適当な量の特定溶媒で行われなければならない。この場合、溶媒自体を試験して、それが重要な粒子源でないことを確認することができる。合計数から溶媒粒子数を減算することはできない。気泡を排除することは、特にガスを容易に巻き込むタンパク質製品の場合、重要なステップである。２つの方法が推奨される：製品流体を環境圧力下に放置するか、または穏やかな（例えば、７５Ｔｏｒｒ）真空を適用する。適当であることが立証された場合、他の方法を使用することができる。超音波処理は避けるべきである。サンプルを脱気したら、サンプルの内容物を、適切な手段、例えば容器を手でゆっくりと旋回させることにより、静かにしかし完全に混合することによって、それらを穏やかに再混合して全ての粒子を懸濁させなければならない。製品の液体の混合を反転することは、いつでも推奨されない。混合直後に、ＮＬＴの４つのアリコート（一定分量）を採取する。各アリコートは、それぞれの器具容量（通常０．２〜５．０ｍＬ）に適した容量である。選択されたサイズ範囲にわたる粒子（１０及び２５ｍｍに等しいか、それを超える粒子を含む）の数を数える。最初のアリコートについて得られた結果を無視し、試験される調製物の残りのアリコートについて各サイズ範囲での平均粒子数を計算する。センサのダイナミックレンジ及び針の体積を表すはずのサンプリングを制御するために、風袋用量も適用することができる。

評価：粒子状物質に関する、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）及びＵＳＰ／ＥＰ／ＪＰ（米国薬局方）章（７８７、７８８及び７８９）、ＥＰヨーロッパ薬局方（２．９．２０粒子状物質汚染）及びＪＰ日本薬局方ＪＰ（１６：６．０６．６．０７外国不溶性物質試験）のような規制当局の規制は、以下のように、ヒトの使用のための液体調製物中の許容されるレベルの粒子を定義する。１００ｍＬ以下の名目上の含量で容器に供給される点滴または注射用の治療用タンパク質注射剤である非経口製品の場合：試験された単位中に存在する平均粒子数は、１０μｍ以上で容器あたり６０００を超えるべきではなく、２５μｍ以上で容器当たり６００を超えるべきではない。１００ｍＬを超える名目上の含量を有する容器に供給される治療用タンパク質注射剤及び１００ｍＬを超える名目上の含量を有する非経口注入剤または注射液：試験される単位中に存在する粒子の平均数は、１０μｍ以上で１ｍＬ当たり２５個を超えるべきではなく、または２５μｍ以上で１ｍＬ当たり３を超えるべきでない。また、総粒子荷重は、１０μｍ以上で容器あたり６０００を超えるべきではなく、２５μｍ以上で容器当たり６００を超えるべきではない。投与中（インライン）に最終フィルタと共に使用される製品は、免除を正当化する科学的データが利用可能であることを条件として、これらの要件から免除される。ただし、ろ液はガイドラインに準拠することが期待される。＜１００ｍＬで供給または最初に再構成した後、＞１００ｍＬの容量で注入するために希釈した製品について、粒子の含量は希釈前と希釈後の両方で評価し、そして最終用量に基づいて評価する必要がある。従って、ＵＳＰ／ＥＰ／ＪＰ法は本明細書中に含まれる。ここで、用語「粒子」は「粒子状物質」を指し、逆もまた同様である；これらの用語は同義語として使用することができる。

Ｏｐｔｉｍ−２（商標）を用いて４７６ｎｍ／６００ｎｍでの光散乱により、または３５０ｎｍのＵＶでの標準ＵＶ分光光度計により測定される動力学的研究：高温（６５℃）及び酸性溶液ｐＨ（４．５）または塩基性溶液ｐＨ（９．５）等の加速条件は、異なる安定化賦形剤を迅速にスクリーニングするために選択される。組成物の成分は、少なくとも１〜４時間、固定温度（５５〜６０℃）で時間の関数としてのＴａｇｇを増加させるために評価される。プラスミノーゲン溶液の凝集動態挙動は、温度制御（開始Ｔｍが決定される）を装備して、５５〜６０℃において４時間以下で測定される。賦形剤は、２６７ｎｍ、４６７ｎｍまたは３５０ｎｍでの光散乱により測定されるプラスミノーゲン凝集の阻害に対するそれらの効果についてスクリーニングされる（Ｃｈｅｎｇ，Ｗ．ら、“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ａ Ｍｏｄｅｌ ＩｇＧ２ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”（モデルＩｇＧ２モノクローナル抗体のための安定化賦形剤を同定するためのハイスループット生物物理学的方法の比較：配座安定性及び動力学的凝集測定）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ． １０１， Ｎｏ ５， ｐａｇｅ １７０１−１７２０， ２０１２）。

熱安定性のタンパク質濃度の影響：Ｏｐｔｉｍ ２（商標）またはＤｕａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ（Ｓｙｐｒｏ Ｄｙｅを有するＤＳＦ）の利点の１つは、高濃度タンパク質溶液中のＴｍ及びＴａｇｇの測定を行う能力にある。 相対安定性の潜在的な候補を調査するか、或いはタンパク質の安定化のための異なる製剤条件をスクリーニングするかにかかわらず、利用可能な特性評価方法の数が限られている高濃度でタンパク質溶液について、その特性を同定することが重要であり得る。

最終のオスモル濃度に対する製剤組成物の影響：最終医薬組成物において、緩衝液、賦形剤及び塩濃度は、親注射を実際に制限するので、非常に高いことは好ましくない。むしろ、２４０〜４００ｍＯｓｍの範囲のオスモル濃度を得るためには、より生理学的等のより中程度の濃度が好ましい。従って、この範囲を最初に決定するためにオスモル濃度が計算されるが；しかしながら、ＩＶ注射の場合、再構成後にプラスミノーゲンまたはその変異体または断片が、再構成のために溶液によって希釈されるのであれば、凍結乾燥プロセスの開発中に、より高いオスモル濃度を使用することもできる。

用語「製剤」及び「組成物」は、本明細書中では交換可能に使用され得、そして同じ意味を示すことが意図されている。

見出しは、参照のため、及び特定のセクションを位置づけるのを助けるために本明細書に含まれる。これらの見出しは、明細書に記載の概念の範囲限定することを意図するものではなく、これらの概念は、全明細書にわたる他のセクションにも適用できる。従って、本発明は、本明細書に示される実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理及び新規な特徴と一致する最も広い範囲が与えられるべきである。

単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、対応する複数の意味を含む。

特段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件、濃度、特性等を表す全ての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。少なくとも、各数値パラメータは、報告された有効数字の数と、通常の四捨五入法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。従って、それとは反対に示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、得ようとする特性に応じて変化し得る近似値である。実施形態の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、どの数値も、本質的に、実験の変動、試験測定、統計分析等から生じる特定の誤差を含む。

本明細書に記載されている実施例及び実施形態は、説明のみを目的するものであり、その観点から様々な修正または変更は当業者に示唆され、本発明及び添付の請求の範囲に含まれることが理解される。

以下の実施例は、本発明の実施をさらに説明するものであるが、本発明を限定するものではない。

実施例１：凍結製剤中のプラスミノーゲンの安定性
以下の医薬組成物の安定性試験結果を、ＷＯ２００６／１２０４２３に記載の結合親和性技術に従って、血漿から抽出した５ｍｇ／ｍｌのヒトプラスミノーゲン、１０ｍＭクエン酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５（Ｌｏｔ：２００２．ｐｃ０２_Ｐｇ１４０２１０．０１）を含む医薬組成物を−２０℃、−３０℃、−８０℃で６ヶ月間保存して、得た。安定性データは、これらの凍結条件下でプラスミノーゲンが安定であることを示した。プラスミノーゲンｌｏｔ：２００２．ｐｃ０２＿Ｐｇ１４０２１０．０１は、−２０℃、−３０℃及び−８０℃で試験した。凝集レベルをＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、純度レベルを還元条件下及び非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、活性レベルをＢＣＳ活性により、そしてタンパク質濃度を２８０ｎｍにおける吸光度（ＡＢＳ_２８０）により、調査した。６ヶ月後の安定性データの結果は、全ての安定性指示アッセイが、所望の仕様を達成したことを示した。

実施例２：オスモル濃度分析及び固体の全パーセンテージ分析
製剤１〜６のオスモル濃度及び製剤１〜９についての凍結乾燥後の固体の全パーセンテージを表２に報告する。製剤１〜９の含量を表１Ａに定義する。

表2

オスモル濃度は２４０〜４００ｍＯｓｍの生理学的範囲にある。 試験された組成物の得られたオスモル濃度は、オスモル濃度の生理学的範囲内にあるかまたは非常に近いところにあり、有利である。固体ケーキ（凍結乾燥前の液体組成物１００ｍｌ当たりの凍結乾燥後の固体組成物のｇ）の全％は、全ての組成物及びプラシーボに対して約４％であり、これは３．５〜８％の好ましい範囲内にある。

実施例３：プラスミノーゲンの分子量
本発明の医薬組成物中で精製され製剤化されたプラスミノーゲンの分子量は、プラスミノーゲンのアミノ酸の一次配列の計算によって決定され、質量分析によって確認された分子量８７，０００（ＭＷ）である。

実施例４：凍結乾燥後のケーキの外観の研究
製剤１〜５は、表５に詳述されたサイクルプロセスの後に凍結乾燥された。製剤１〜５の含量は表１Ａに規定されている。

表5

図２〜図１１は、各々１２．５ｍｌの製剤１〜５またはそれらの対応するプラセボ（プラスミノーゲンを含まない）を含有するバイアルの写真である。従って、組成物の安定性に対するプラスミノーゲンの存在の影響が調査されている。凍結乾燥プロセスによって形成されたケーキの外観の物理的検査。すべてのケーキは変色することなく均一な密度を維持した。製剤２、３及び５のプラセボについて試験したバイアルの１０％未満がメルトバックを示した。製剤１のプラセボの試験されたバイアルの１０％未満は崩壊した。 製剤１〜５及び製剤４のプラセボの、試験したバイアルの１０％未満が、基礎退縮を示した。全体的にケーキの外観は満足される。

組成物の含量は崩壊温度を決定する。純粋な無定形賦形剤は、それぞれ特徴的なＴｇ’及び崩壊温度を有する；製剤の崩壊温度は、アモルファス相中における全ての組成物の質量平均温度である。乾燥速度は凍結乾燥中のサンプル温度に正比例するため、最大崩壊温度を有する製剤を設計することが重要である。

最後に、塩（ＮａＣｌ）及び賦形剤が最大限に結晶化されなければ、崩壊温度は低下する。例えば、グリシンは−４５℃のＴｇ’を有し、アモルファス相へのその寄与は崩壊温度を非現実的に低い値に低下させることができる。

実施例５：溶液中のプラスミノーゲン凝集に対するアミノ酸の効果
プラスミノーゲン単独では水中では、ＦＤＡによって許容されない、即ち１００ｍＬの組成物当たり１０μｍ以上の粒子６０００個超の、多数のプラスミノーゲン凝集体が生成する（表６のサンプルＦ０４０６参照）。プラスミノーゲンを製剤化するために、種々のスクロースに基づく製剤が開発されている。これらの製剤の大部分は、１００ｍＬ当たり１０μｍ以上の６０００粒子の閾値を満たすことに成功したが、より低い粒子含量を含む製剤が開発され、本明細書ではプラスミノーゲンを安定化するアミノ酸の効果が研究されている。これらのさらなる製剤は、１０ｍｇのプラスミノーゲン及び３５ｍＭのＮａＣｌを含有しており、３つの緩衝液／ｐＨ、即ち１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）及び１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）が試験された。アルギニン、アラニン及びグリシンから選択されるアミノ酸の存在及び非存在を０．５％の濃度で比較した。試験された製剤は新鮮なもの、即ち凍結乾燥の前である。表6は、１０μｍ以上及び２５μｍ以上の粒子のＰＭＣ数を報告している。アミノ酸の存在は、安定化効果が凝集レベルの低下に寄与していることを示している。

表6

実施例６：プラスミノーゲン凝集に対するアミノ酸と組み合わせたマンニトールの効果
１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）または１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）のいずれかを含む１０ｍｇのプラスミノーゲン及び３５ｍＭのＮａＣｌを含有し、且つアミノ酸（０．５％アルギニン塩酸塩、アラニンまたはグリシン）を含有または含有しない製剤に対して、増量剤の０．５％マンニトールの存在（の効果）について試験し、表７に報告した。この研究では新鮮な製剤（ｌｙｏ前）を試験した。一般に、マンニトールの存在は、粒子数を低下させた。一般に、マンニトールとアミノ酸の組み合わせは、粒子数を減少させ、特にアルギニンとマンニトールとの組み合わせにおいてそうである。

表7

実施例７：プラスミノーゲン凝集に対する防腐剤の効果
０．１％フェノール等の防腐剤の存在は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）または１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）のいずれかを含み、且つ０．５％アルギニン塩酸塩または０．５％アルギニン塩酸塩と０．５％マンニトールとの組み合わせを含む、９または１０ｍｇのプラスミノーゲン及び３５ｍＭのＮａＣｌを含有する製剤において試験した。この研究では、新鮮な製剤（ｌｙｏ前）を試験した。粒子数（ＰＭＣ）は表８に報告されている。有利なことに、フェノールの存在は粒子数に有意に影響しなかった。

表8

いくつかの防腐剤を比較した。表９は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）または１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）のいずれか、及び０．５％アルギニン塩酸塩を含む、１０ｍｇのプラスミノーゲン及び３５ｍＭのＮａＣｌを含む製剤中における、０．５％ＣＭＣと０．１％フェノールと０．５％デキストランとの比較を報告している。この研究では、新鮮な製剤（ｌｙｏ前）を試験した。デキストランまたはフェノールの存在は、凝集に有意な影響はしなかった。しかしながら、ＣＭＣは凝集を有意に増加させた。これは驚くべきことではない。なぜなら、ＣＭＣは溶液の粘度を増加させることが知られており、しばしば点眼剤の調製に使用されるからである。

表9

実施例８：プラスミノーゲン凝集に対するアミノ酸及びその濃度の影響
凍結乾燥及び再構成の後、プラスミノーゲン１０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ７．２の製剤で、０．５％及び１％のアルギニンを試験した。粒子数（ＰＭＣ）を表１０に報告されており、アルギニンの両方の濃度が低いＰＭＣ値を維持するのに非常に良好であることを示している。

表10

凍結乾燥及び再構成の後、プラスミノーゲン１０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ＮａＰｉ）、ｐＨ７．２の製剤において、１％のアルギニン、グリシン及びアラニンを比較した。粒子数（ＰＭＣ）は表１１に報告されており、試験された条件においてアルギニンがアラニン及びグリシンよりも良好であることを示しているが、これらの３つのアミノ酸はすべて許容できるＰＭＣ値である、即ち１００ｍＬあたり１０μｍ以上粒子６０００未満である。

表11

実施例９：固体の全パーセンテージ及びオスモル濃度
１０ｍｇ／ｍＬのプラスミノーゲンのいくつかの製剤のオスモル濃度、及びこの製剤を調製するために使用される固形分のパーセンテージが、表１２に報告されている。２０ｍｇ／ｍＬのプラスミノーゲンのいくつかの製剤のオスモル濃度、及びこの製剤を調製するために使用される固形分のパーセンテージが、表１３に報告されている。試験された製剤の結果として得られるオスモル濃度は、有利にも、オスモル濃度の生理学的範囲内にあるか、または非常に近い。固形分の全（合計）パーセンテージは、その中のプラスミノーゲン、張性調整剤及び増量剤の含量から計算され、凍結乾燥した後、得られたケーキの大きさの良好な指標である。

表12

表13

実施例１０：粒子数（ＰＭＣ）
表１２に記載の製剤の１０μｍ以上の粒子についての粒子数（ＰＭＣ）を表１４に報告する；及び表１３に記載の製剤の１０μｍ以上の粒子についての粒子数（ＰＭＣ）を表１５に報告する。

表14

表15

表１２〜１５に報告される凍結乾燥製剤の外観の代表例として、製剤Ｆ０４９８、Ｆ０４４９及びＦ０４５９をそれぞれ含むバイアルの写真を図１２、図１３及び図１４に示す。

実施例１０：可逆的プラスミノーゲン凝集
この研究によって示されるように、プラスミノーゲン凝集は可逆的である。ｄＨ２Ｏ中で透析され、大量に沈殿した凍結プラスミノーゲンサンプル（Ｐｇバルク）５ｍｇ／ｍｌを融解し、１．２μｍシリンジフィルタで濾過し、対照（Ｐｇ対照）のための出発物質として使用した。２ｍｌのＰｇ対照のアリコートを、１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ６．５（サンプル１）、０．５Ｍリン酸ＮａｐＨ ７．２（サンプル２）または１Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０（サンプル３）の緩衝液ストックを予めスパイク（混合）したガラスバイアルに加え、各ｐＨの最終１０ｍＭ緩衝液濃度をそれぞれ得る。サンプル１、２及び３を図１５に示す、ここで非スパイクＰｇ対照はサンプル０である。サンプル１、２及び３をさらに５Ｍ ＮａＣｌ及び０．８Ｍアルギニンのストック溶液でスパイクして、各サンプルにおいて３５ｍＭ ＮａＣｌ及び２８．５ｍＭ（０．５％）のＡｒｇの最終濃度を得、そして図１６に示されている。各々０．０２、２０、１００、８００ＮＴＵの濁度標準が、参照として図１５及び１６で使用された。図１５から、ｐＨ調節がかなりの量の凝集物を溶解したことが分かる。図１６において、サンプル１、２及び３は、アルギニン及びＮａＣｌの添加によって透明にされ、凝集物は視覚的に検出され得ない。

図１６のサンプル０、１、２及び３の濁度は、図１５及び１６に示す濁度参照標準を用いた標準較正を用いて５５０ｎｍでの光学濃度（ＯＤ）を読み取ることによって測定した。濁度は、表１６のＮｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ Ｕｎｉｔｓ（ＮＴＵ）に報告されている。０．１時間、１７時間、２１時間及び２４時間で、緩衝液、ＮａＣｌ及びアルギニンを有するサンプル１、２及び３をスパイクする前に（Ｔ＝０）、各サンプル１ｍｌのアリコートを測定した。脱凝集は、スパイク後わずか０．１時間で現れ、迅速であり、２４時間超維持される。

表16

実施例１１：組成物の濁度に対する経時的なアミノ酸の影響
濁度は、０．５％グリシン、アルギニン、アラニンを含み、及びアミノ酸を含まない１０ｍｇプラスミノーゲン及び３５ｍＭ ＮａＣｌを含有する組成物において、クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５（図１７）で、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２（図１８）で、及びトリス緩衝液ｐＨ８．０（図１９）で測定した。

図１７、１８及び１９において試験した組成物を、増量剤としての０．５％マンニトールの存在下で再現し、それぞれ図２０、２１及び２２に報告した。

全ての場合において、アミノ酸の存在は安定化効果をもたらし、濁度を維持または低下させる。アミノ酸のタイプを比較すると、アルギニンは、最高の安定化効果を示し、試験されたすべてのｐＨで、及び増量剤、即ち０．５％マンニトール、の存在及び非存在下において、濁度を低下させる。

実施例１２：上昇した濃度のプラスミノーゲン組成物
高濃度のプラスミノーゲンを含有する組成物を研究した。１０ｍＭまたは１００ｍＭのクエン酸ナトリウム、３５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５（アルギニン１％を含む及び含まない）中の２０ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲンの組成物、及びアルギニン１％を含む１００ｍＭクエン酸ナトリウム、３５ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５中の３７及び５６ｍｇ／ｍｌのプラスミノーゲンの組成物について、１０μｍ以上、及び２５μｍ以上の粒子のＰＭＣ数が表１７に報告されている。
表１７は、本発明の製剤が、許容できない粒子レベルを引き起こさずにプラスミノーゲンを高濃度（３７及び５６ｍｇ／ｍｌ）で含む組成物の調製を有利に行うことができることを示している。

表17

実施例１３：プラスミノーゲン活性
本明細書に例示した各製剤のプラスミノーゲン活性を試験し、初期製剤またはバルク製剤のプラスミノーゲン活性（Ｐｇバルク）と比較した。 プラスミノーゲン活性は、これらのいずれの製剤によっても影響されないことが示された。

Claims (61)

1. − プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体；
   − 張性調整剤；及び
   − 安定化剤；
   を含み、且つ
   約３．０〜約１０．０のｐＨを有する医薬組成物。
2. 前記ｐＨが５．０〜８．０；または６．０〜８．０；または６．５〜７．５である請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌである請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約４０、３０、２０、１０または５ｍｇ／ｍｌである請求項３に記載の医薬組成物。
5. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、当該組成物の全タンパク質含量の少なくとも８０％であるか、または当該組成物の全タンパク質含量の９０％を超過する請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、組成物の全タンパク質含量の９５％または９８％を超過する請求項５に記載の医薬組成物。
7. 前記安定化剤が、（ｉ）アミノ酸、（ｉｉ）アミノ酸塩、（ｉｉ）アミノ酸類似体、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び／または（ｉｉｉ）の任意の混合物を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記アミノ酸、アミノ酸塩またはアミノ酸類似体が、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、システイン、リジン、リジン類似体またはイプシロン−アミノカプロン酸である請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記安定化剤がアルギニンである請求項８に記載の医薬組成物。
10. 前記安定化剤が約２０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度を有する請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
11. 前記安定化剤が約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を有する請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 前記張性調整剤が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、シクロデキストリン、ラフィノース、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、グリシングルタミン酸、アラニン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、またはこれらの任意の組み合わせである請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
13. 前記張性調整剤が、塩化ナトリウムである請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 前記張性調整剤が、約３０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度で存在する請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 前記張性調整剤が、約２５ｍＭ〜約５０ｍＭまたは約２５ｍＭ〜約３５ｍＭの間の濃度で存在する請求項１４に記載の医薬組成物。
16. さらに増量剤を含む請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
17. 前記増量剤が、グリシン、グルタミン酸、アラニン、マンニトール、ソルビトール、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、マンニトール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、キシリトールまたはこれらの任意の組み合わせである請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記増量剤が、マンニトールまたはソルビトールである請求項１７に記載の医薬組成物。
19. 前記増量剤が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度にある請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 前記増量剤が、約５０ｍＭ〜約１２５ｍＭの濃度にある請求項１９に記載の医薬組成物。
21. さらに還元糖を含む請求項１〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
22. 前記還元糖が、フルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース、グルコース、スクロースまたはこれらの任意の組み合わせである請求項２１に記載の医薬組成物。
23. さらに非還元糖を含む請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
24. 前記非還元糖が、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース、ラフィノース、またはこれらの任意の組み合わせである請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 当該医薬組成物は、約１８０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍの間のオスモル濃度を有する請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
26. さらに防腐剤を含む請求項１〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
27. 前記防腐剤が、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、フェノール、グリセロール、キシリトール、レゾルシノール、カテコール、２、６−ジメチルシクロヘキサノール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、２−クロロフェノール、塩化ベンゼトニウム、メルチオレート（チメロサール）、安息香酸（プロピルパラベン）ＭＷ１８０．２、安息香酸ＭＷ１２２．１２、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化セチルピリジニウム、またはこれらの任意の組合せである請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 防腐剤の濃度は約０．００５〜約１０％（ｗ／ｖ）であり請求項２６または２７に記載の医薬組成物。
29. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、ヒトプラスミノーゲンである請求項１〜２８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
30. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、約８０％を超えるＧｌｕ−プラスミノーゲンから構成されている請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
31. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体がＧｌｕ−プラスミノーゲンである請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
32. 当該組成物が、１００ｍｌあたり６０００個未満の１０μｍ以上の粒子数を含む請求項１〜３１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
33. 前記粒子数が、１００ｍｌあたり２０００または１０００粒子未満である請求項３２に記載の医薬組成物。
34. 静脈内、皮下、局所、皮内、眼科及び／または筋肉内投与に適している請求項１〜３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
35. 液体組成物、凍結乾燥に適した液体組成物、凍結に適した液体組成物、凍結乾燥組成物、凍結組成物または再構成組成物である請求項１〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
36. 液体、ゲル、クリーム、または軟膏である請求項１〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
37. 薬剤として使用される請求項１〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
38. １００ｍｌあたり６０００粒子未満の１０μｍ以上の粒子数を含むプラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体を含む医薬組成物。
39. 前記粒子数が、１００ｍｌあたり２０００または１０００粒子未満である請求項３８に記載の医薬組成物。
40. さらに安定化剤を含む請求項３８または３９に記載の医薬組成物。
41. 前記安定化剤が、（ｉ）アミノ酸、（ｉｉ）アミノ酸塩、（ｉｉ）アミノ酸類似体、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）及び／または（ｉｉｉ）の任意の混合物を含む請求項４０に記載の医薬組成物。
42. 前記アミノ酸、アミノ酸塩またはアミノ酸類似体が、アルギニン、プロリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、アラニン、システイン、リジン、リジン類似体またはイプシロン−アミノカプロン酸である請求項４１に記載の医薬組成物。
43. 前記安定化剤がアルギニンである請求項４２に記載の医薬組成物。
44. 前記安定化剤が約２５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度を有する請求項４０〜４３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
45. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約８０ｍｇ／ｍｌである請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
46. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体の濃度が、約５ｍｇ／ｍｌ〜約６０ｍｇ／ｍｌである請求項４５に記載の医薬組成物。
47. プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、当該組成物の全タンパク質含量の約９５％を超過しているか、または当該組成物の全タンパク質含量の約９８％を超過している請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
48. さらに張性調整剤を含む請求項３８〜４７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
49. 前記張性調整剤が、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、スクロース、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ラクトース、ソルビトール、デキストロース、ラフィノース、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、グリシングルタミン酸、アラニン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、またはこれらの任意の組み合わせである請求項４８に記載の医薬組成物。
50. 前記張性調整剤が、塩化ナトリウムである請求項４９に記載の医薬組成物。
51. 前記張性調整剤が、約３０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度で存在する請求項４８、４９または５０に記載の医薬組成物。
52. さらに増量剤を含む請求項３８〜５１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
53. 前記増量剤が、グリシン、グルタミン酸、アラニン、マンニトール、ソルビトール、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、マンニトール、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、キシリトールまたはこれらの任意の組み合わせである請求項５２に記載の医薬組成物。
54. 前記増量剤が、マンニトールまたはソルビトールである請求項５３に記載の医薬組成物。
55. 前記増量剤が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度にある請求項５２、５３または５４に記載の医薬組成物。
56. 当該医薬組成物は、約１８０ｍＯｓｍ〜約３５０ｍＯｓｍの間のオスモル濃度を有する請求項３８〜５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
57. 当該組成物が約６．５〜約８．０のｐＨを有する請求項３８〜６１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
58. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、ヒトプラスミノーゲンである請求項３８〜５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
59. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体が、８０％を超えるＧｌｕ−プラスミノーゲンから構成されている請求項３８〜５８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
60. 前記プラスミノーゲンまたはその生物学的に活性な変異体がＧｌｕ−プラスミノーゲンである請求項３８〜５８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
61. 薬剤として使用される請求項３８〜６０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

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