CN114191385B - 一种重组人尿激酶原注射液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种重组人尿激酶原注射液及其制备方法。所述重组人尿激酶原注射液包括重组人尿激酶原、保护剂和缓冲溶液；所述保护剂包括海藻糖。本发明所提供的重组人尿激酶原注射液稳定性良好，克服了重组人尿激酶原在液体制剂中不稳定的问题。本发明所述的重组人尿激酶原注射液在2～8℃避光储存条件下有良好的稳定性。本发明提供的重组人尿激酶原注射液使用方便快捷，能够改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间。

Description

一种重组人尿激酶原注射液及其制备方法
技术领域
本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种重组人尿激酶原注射液及其制备方法。
背景技术
重组人尿激酶原是一类丝氨酸蛋白酶，可以激活体内的纤溶酶原转变成有活性的纤溶酶，从而溶解血栓中的纤维蛋白，因此在溶血栓的治疗方面有着广泛的应用。
普佑克制剂是一种注射用重组人尿激酶原，用于急性ST段抬高性心肌梗死，其主要成份为重组人尿激酶原(简称rhPro-UK)。普佑克制剂采用冻干粉针剂型5mg/支，在使用过程中，要求医护人员，使用10mL注射器吸取生理盐水后，将液体注入到含有粉针的西林瓶里，轻轻翻倒1～2次混匀，重复以上步骤反复抽取4支西林瓶，混匀后吸取，用注射器吸入进行注射(3分钟内静脉推注完毕)之后，另取6支西林瓶，用90mL生理盐水溶解，摇震混匀，30分钟内静脉滴注完毕。
CN113671081A公开了一种重组人尿激酶原纯度的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：将重组人尿激酶原样品稀释成样品溶液，采用SEC-HPLC进行检测；所述SEC-HPLC采用的流动相A为pH2.5～3.5的酸的水溶液，流动相B为乙腈。所述检测方法可用于尿激酶原成品纯度检测和尿激酶原原液纯度分析，该方法能够精确检测到成品中的尿激酶原聚体。
CN113252590A公开了一种注射用重组人尿激酶原活性及单链比例的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：(1)将待测样品进行一次稀释后，与嗜热菌蛋白酶混合，进行孵育酶切，再进行二次稀释，得到待测总活的样品溶液；根据样品的单链比例，将待测样品稀释后，得到待测UK(重组人尿激酶原)活性的样品溶液；(2)将尿激酶标准品溶液、所述待测总活的样品溶液、所述待测UK活性的样品溶液分别与S-2444底物溶液混合，放入酶标仪中进行检测，记录OD值，通过绘制标准曲线和计算，得到尿激酶原活性及单链比例。
粉针剂的配制过程会极大地占用医护人员的宝贵抢救时间，且工作效率较低，延长了院前溶栓及PCI协同治疗的宝贵时间。因此，开发一种能够改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间的剂型具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种重组人尿激酶原注射液及其制备方法。本发明所提供的重组人尿激酶原注射液稳定性良好，克服了重组人尿激酶原在液体制剂中不稳定的问题。本发明所述的重组人尿激酶原注射液在2～8℃避光储存条件下有良好的稳定性，所述注射液的制剂处方对蛋白具有良好的保护作用。本发明提供的重组人尿激酶原注射液使用方便快捷，能够改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种重组人尿激酶原注射液，所述重组人尿激酶原注射液包括重组人尿激酶原、保护剂和缓冲溶液；所述保护剂包括海藻糖。
在本发明中，重组人尿激酶原不稳定，很容易被多种蛋白酶切割为尿激酶，在注射液制剂中使用海藻糖作为保护剂，能够增加重组人尿激酶原注射液的稳定性，防止蛋白变性。海藻糖是一种稳定的非还原性双糖，由于不具有还原性，对热和酸碱都具有非常好的稳定性，与蛋白质共存时不会发生化学反应，在注射液中使用具有较高的安全性。特别地，本发明提供的重组人尿激酶原注射液相对于粉针剂，能够进一步改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间。
优选地，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括：重组人尿激酶原1.5～2.5份、保护剂0.5～1.5份和缓冲溶液90～100份。
本发明中，所述重组人尿激酶原的重量份数为1.5～2.5份，例如可以是1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份、2.0份、2.1份、2.2份、2.3份、2.4份或2.5份等。
本发明中，所述保护剂的重量份数为0.5～1.5份，例如可以是0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1.0份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份或1.5份等。
本发明中，筛选结果表明保护剂的重量份数为0.5～1.5时，具有更好的保护效果。保护剂的浓度过低，保护效果较弱不利于重组人尿激酶原的稳定保存，保护剂的浓度过高，无法增加保护效果，同时会增加注射液的粘度，不利于使用。
本发明中，所述缓冲溶液的重量份数为90～100份，例如可以是90份、91份、92份、93份、94份、95份、96份、97份、98份、99份或100份等。
优选地，所述保护剂还包括蔗糖、脯氨酸、组氨酸或吐温80中任意一种或至少两种的组合，优选为吐温80。
优选地，所述保护剂为海藻糖和吐温80的组合。
在本发明中，在安全范围内可以添加吐温80作为保护剂，添加吐温80后样品稳定性更好，吐温80的加入可以使注射液中重组人尿激酶原蛋白免受剪切力作用，有利于保证注射液的质量稳定。
优选地，所述海藻糖和吐温80的质量比为(1.5～2.5):(0.01～0.03)，例如可以是2:0.02、2:0.03、2:0.01、2:0.02、1.5:0.01或2.5:0.02等。
优选地，所述缓冲溶液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为15～25mM，例如可以是15mM、18mM、20mM、22mM或25mM等，优选为20mM。
本发明中，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，制备得到的重组人尿激酶原注射液在纯度、活性和单链比例等关键检查项中检测结果均较好，缓冲溶液的浓度过高，会降低重组人尿激酶原在注射液中的溶解度，缓冲溶液的浓度过低，重组人尿激酶原蛋白容易分解，蛋白活性减弱，同时影响pH值的稳定。
优选地，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4～5，例如可以是4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5等，优选为4.2～4.8。
本发明中，缓冲溶液的pH值在4.2～4.8范围内，样品稳定性无明显差异，能够保持注射液的长期稳定储存。
优选地，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括：重组人尿激酶原1.5～2.5份、海藻糖0.5～1.5份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液90～100份。
优选地，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括：重组人尿激酶原1.5～2.5份、海藻糖0.5～1.5份、吐温80 0.01～0.03份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液90～100份。
本发明中，所述吐温80的重量份数为0.01～0.03份，例如可以是0.01份、0.015份、0.02份、0.025份或0.03份等。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述重组人尿激酶原注射液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)制剂原料配制：分别配制缓冲溶液、重组人尿激酶原溶液和保护剂母液；
(2)注射液配制：将重组人尿激酶原溶液、保护剂母液与缓冲溶液混合，得到混合液，调节pH，过滤，得到所述重组人尿激酶原注射液。
优选地，步骤(1)中，所述重组人尿激酶原溶液按重量份数计包括：重组人尿激酶原3.3～5份和缓冲溶液95～96.7份。
本发明中，所述重组人尿激酶原的重量份数为3.3～5份，例如可以是3.3份、3.6份、3.9份、4.2份、4.5份、4.8份或5份等。
本发明中，所述缓冲溶液的重量份数为95～96.7份，例如可以是95份、95.2份、95.5份、95.8份、96.1份、96.4份或96.7份等。
优选地，步骤(1)中，所述保护剂母液的pH值为4～5，例如可以是4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0等，所述保护剂母液的溶剂为缓冲溶液。
优选地，所述保护剂母液的质量百分含量为1～12％，例如可以是1％、2％、4％、6％、8％、10％或12％等。
优选地，所述保护剂母液中海藻糖的质量百分含量为5～10％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％或10％等。
优选地，所述保护剂母液中吐温80的质量百分含量为1～2％，例如可以是1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％或2％等。
优选地，步骤(2)中，所述混合的转速≤200rpm，例如可以是150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm或200rpm等，所述混合的时间为0.2～0.7h，例如可以是0.2h、0.3h、0.4h、0.5h、0.6h或0.7h等。
优选地，步骤(2)中，所述混合中重组人尿激酶原溶液、保护剂母液和缓冲溶液的体积比为(40～61):(5～30):(9～55)，例如可以是60.6:30:9.4、60.6:20:19.4、60.6:15:24.4、60.6:10:29.4、60.6:5:34.4、40:30:30、40:20:40、40:15:45、40:10:50或40:5:55等。
优选地，所述保护剂为海藻糖和吐温80，保护剂母液中海藻糖母液和吐温80母液的体积为(5～30):(0.5～3)，例如可以是5:0.5、5:1、5:3、10:0.5、10:1、10:3、15:0.5、15:1、20:0.5、20:1、20:3、30:0.5或30:1等。
优选地，步骤(2)中，所述混合液的pH值为4～5，例如可以是4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0等。
优选地，步骤(2)中，所述过滤采用除菌滤器进行过滤，所述除菌滤器的滤膜为PVDF膜，所述PVDF膜的孔径0.22～0.45μm，例如可以是0.22μm、0.25μm或0.45μm等。
所述制备方法包括以下步骤：
(1)制剂原料配制：配制浓度为15～25mM的缓冲溶液，并调节pH值为4～5，使用所述缓冲溶液将重组人尿激酶原溶解；配制保护剂母液，所述保护剂母液的质量百分含量为1～12％，调节pH值为4～5，所述保护剂母液中海藻糖的质量百分含量为5～10％，吐温80的质量百分含量为1～2％；
(2)制剂半成品配制：将重组人尿激酶原溶液、海藻糖母液、任选的吐温80母液与柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，得到混合液，所述混合中重组人尿激酶原溶液、保护剂母液和缓冲溶液混合的体积比为(40～61):(10～20):(10～35)，所述混合的转速≤200rpm，所述混合的时间为0.2～0.7h，调节混合液pH值为4～5，使用孔径0.22～0.45μm的PVDF膜除菌滤器过滤，得到所述重组人尿激酶原注射液。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的重组人尿激酶原注射液克服了重组人尿激酶原在液体制剂中不稳定的问题，所述重组人尿激酶原注射液在2～8℃避光储存条件下有良好的稳定性，本发明中的制剂处方对蛋白具有良好的保护作用。
(2)本发明提供的重组人尿激酶原注射液稳定性好同时使用方便快捷，能够改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
以下实施例和对比例中所用各组分来源如下所示：
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实施例1
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法包括以下步骤：
(1)制剂原料配制：
配制浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，并调节pH值为4.5；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为3.3％的重组人尿激酶原溶液；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为5％的海藻糖母液，调节海藻糖母液pH值为4.5。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、20份海藻糖母液与19.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例2
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法包括以下步骤：
(1)制剂原料配制：
配制浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，并调节pH值为4.2；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为3.3％的重组人尿激酶原溶液；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为10％的海藻糖母液，调节海藻糖母液pH值为4.2。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、10份海藻糖母液与29.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为150rpm，混合0.5h，调节混合液pH值为4.2，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例3
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法包括以下步骤：
(1)制剂原料配制：
配制浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，并调节pH值为4.8；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为3.3％的重组人尿激酶原溶液；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为5％的海藻糖母液，调节海藻糖母液pH值为4.8。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、20份海藻糖母液与19.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为150rpm，混合0.5h，调节混合液pH值为4.8，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例4
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1份、吐温80 0.02份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液96.98份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法包括以下步骤：
(1)制剂原料配制：
配制浓度为20mM的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，并调节pH值为4.5；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为3.3％的重组人尿激酶原溶液；使用所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液配制质量浓度为5％的海藻糖母液，调节海藻糖母液pH值为4.5；配制质量浓度为1％的吐温80母液，调节吐温80母液pH值为4.5。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、20份海藻糖母液、2份吐温80母液与17.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例5
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1份、吐温80 0.01份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液96.99份。
(1)制剂原料配制：
所述制剂原料的配制过程参考实施例4。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、20份海藻糖母液、1份吐温80母液与18.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例6
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1份、吐温80 0.03份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液96.97份。
(1)制剂原料配制：
所述制剂原料的配制过程参照实施例4。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、20份海藻糖母液、3份吐温80母液与16.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例7
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖0.5份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97.5份。
(1)制剂原料配制：
所述制剂原料的配制过程参照实施例1。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、10份海藻糖母液与29.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例8
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖1.5份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液96.5份。
(1)制剂原料配制：
所述制剂原料的配制过程参照实施例1。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、30份海藻糖母液与9.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例9
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖0.1份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97.9份。
(1)制剂原料配制：
所述制剂原料的配制过程参照实施例1。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、2份海藻糖母液与37.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例10
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、海藻糖3.8份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液94.2份。
(1)制剂原料配制：
所述制剂原料的配制过程参照实施例2。
(2)注射液配制：
将60.6份重组人尿激酶原溶液、38份海藻糖母液与1.4份柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液混合，转速为200rpm，混合0.2h，调节混合液pH值为4.5，使用孔径0.22μm的PVDF膜除菌滤器过滤，即可制备得到所述重组人尿激酶原注射液。
实施例11
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，在制备所述重组人尿激酶原注射液时，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为3，所述海藻糖母液pH值为3，所述混合液pH值为3。
实施例12
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，在制备所述重组人尿激酶原注射液时，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为6，所述海藻糖母液pH值为6，所述混合液pH值为6。
实施例13
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，在制备所述重组人尿激酶原注射液时，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为10mM。
实施例14
本实施例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，在制备所述重组人尿激酶原注射液时，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为30mM。
对比例1
本对比例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液98份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法参照实施例1。
对比例2
本对比例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、甘露醇1份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法参照实施例1。
对比例3
本对比例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、甘氨酸1份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法参照实施例1。
对比例4
本对比例提供一种重组人尿激酶原注射液，本实施例与实施1的区别在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计包括如下所示组分：
重组人尿激酶原2份、吐温80 0.02份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液97.98份。
本实施例所述重组人尿激酶原注射液的制备方法参照实施例4。
对比例5
本对比例提供一种重组人尿激酶原注射用冻干粉，所述重组人尿激酶原注射用冻干粉按重量份数计包括：重组人尿激酶原0.005份、甘露醇0.004份、蔗糖0.001份和吐温800.00002份，用缓冲液溶解至100份，然后冷冻干燥，即得。
试验例1
本试验例对实施例1～18和对比例1～4的重组人尿激酶原注射液进行40℃、15d的高温试验。分别检测所得的样品的浓度、纯度和单链比例。
浓度检测方法：采用《中国药典》2015版三部-通则-0401紫外-可见分光光度法。
纯度检测方法：采用《中国药典》2010版三部(附录III B)中面积归一化法。色谱柱为TSKgelG3000SWXL7.8×300mm，流动相为0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8含0.4mol/L氯化钠)，柱温25℃，样品池温度4℃，流速0.8mL/min，上样量20μg，于波长280nm处检测。
单链比例检测方法：采用S-2444显色试剂法检测，实验方法参考专利CN113252590A。
高温试验的检测结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003426115140000151
Figure BDA0003426115140000161
实施例1～8所提供的缓冲溶液、保护剂有利于重组人尿激酶原注射液稳定，无明显降解、降解杂质更少、双链杂质更少、重组人尿激酶原蛋白的纯度高，在高温条件下，浓度和纯度以及单链比例都能达到质量标准。
通过实施例4～6与实施例1的对比可知，吐温80的加入可以使注射液中重组人尿激酶原蛋白免受剪切力作用，有利于保证注射液的质量稳定，吐温80作为稳定剂，在安全范围内可以添加。
通过实施例1与实施例9～10的对比可知，减少海藻糖的浓度，不利于重组人尿激酶原的稳定，在高温条件下，重组人尿激酶原蛋白会降解，制剂的纯度和含量以及单链比例都降低；增加海藻糖的浓度会增加注射液的粘度，不利于注射使用。
通过实施例1～3与实施例11～12的对比可知，注射液的pH过高或过低会影响蛋白的稳定性，pH在4.2-4.8范围内可选，样品稳定性无明显差异。
通过实施例1与实施例13～14的对比可知，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度影响制剂中蛋白的单链比例，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度过高会降低蛋白的溶解度，会导致蛋白析出，单链比例下降，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度过低，其稳定性降低，重组人尿激酶原蛋白容易降解。
通过实施例4～6、和对比例1～4的对比可知，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、海藻糖以及吐温80的组合对注射液的长期稳定具有促进作用，两种保护剂与缓冲体系相互配合，各自发挥不同的保护作用，有利于注射液的长期稳定，对生产运输和保存具有重要意义。
试验例2
本试验例对实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液进行影响因素试验。考察4℃剪切力、4℃光照、4℃避光、高温40℃和反复冻融对重组人尿激酶原注射液的影响，检测时间包括0d、5d、10d和15d。
4℃剪切力试验包括如下步骤：
将实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液置在水平摇床内，设置转速为200rpm，于4℃条件下放置15d，在0d、5d、10d和15d取样检测。
4℃光照试验包括如下步骤：
将实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液置在光照箱或其它适宜的光照容器内，于照度4500±500Lx条件下放置15d，在0d、5d、10d和15d取样检测。
4℃避光试验包括如下步骤：
将实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液在4℃的条件下避光放置15d，在0d、5d、10d和15d取样检测。
高温40℃试验包括如下步骤：
将实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液置于恒温恒湿箱中，设置40℃，放置15d，于0d、5d、10d和15d取样检测，检测有关指标。
反复冻融试验包括如下步骤：
将实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液先于-20～-10℃放置12h，再在25℃放置12h，反复5次后取样检测。
不溶性微粒检测方法：采用《中国药典》2015版0903不溶性微粒检查法。
浓度检测方法、纯度检测方法和单链比例检测方法参考测试例1。
实施例4所述的重组人尿激酶原注射液进行影响因素试验的检测结果如表2所示：
表2
Figure BDA0003426115140000181
实施例6所述的重组人尿激酶原注射液进行影响因素试验的检测结果如表3所示：
表3
Figure BDA0003426115140000182
/>
Figure BDA0003426115140000191
实施例4和实施例6所提供的重组人尿激酶原注射液的在影响因素试验中，其不溶性微粒的结果均符合药典要求，其中，药典要求为：标示装量为100mL以下的静脉用注射液、静脉注射用无菌粉末、注射用浓溶液及供注射用无菌原料药除另有规定外，每个供试品容器(份)中含10μm及10μm以上的微粒数不得过6000粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过600粒。其中，在4℃剪切力试验中，0d条件下的不溶性微粒的结果为2；1，是指样品中含10μm及10μm以上的微粒数为2；含25μm及25μm以上的微粒数为1。
对实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液进行包含4℃剪切力、4℃光照、4℃避光、高温40℃和反复冻融条件的影响因素试验，通过0d、5d、10d和15d四个时间点的试验结果表明，实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液的影响因素实验结果符合质量标准，能够满足注射液的相关要求。
试验例3
本试验例对实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液进行制剂6个月的稳定性试验。
稳定性试验的步骤包括：
(1)包材为预充针注射器。
(2)样品置于医用冷藏柜中4℃存储。
(3)分别于0、1、3、6个月取样检测。
以下项目的检测方法参考试验例1和试验例2中。实施例4和实施例6所述的重组人尿激酶原注射液的6个月的稳定性试验的检测结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003426115140000201
在制剂稳定性试验中，使用实施例6中制剂处方pH4.5、20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系、1％海藻糖和0.03％吐温80或者以实施例4中制剂处方pH4.5、20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系、1％海藻糖和0.02％吐温80，两种处方中注射液中蛋白浓度均为20mg/mL，进行包含6个月的稳定性试验，结果表明所筛选的两组处方对重组人尿激酶原在2～8℃避光储存条件下有良好的保护作用。
试验例4
使用实施例4所述的重组人尿激酶原注射液和对比例5所述的重组人尿激酶原注射用冻干粉分别进行对比试验。各选取5组样品进行配制实验，比较配制时间、配制后溶液的浓度以及配制过程中的损耗。
通过配制冻干粉溶液和注射液溶液，比较两种剂型的临床使用情况。两种类型的制剂的使用情况如表5所示(N/A表示Not applicable，不适用)。
表5
种类 配制时间 溶解速度 配制浓度 规定浓度 损耗率
实施例4-1 20s N/A 20mg/mL 20mg/mL 5％
实施例4-2 20s N/A 20mg/mL 20mg/mL 5％
实施例4-3 20s N/A 20mg/mL 20mg/mL 5％
实施例4-4 19s N/A 20mg/mL 20mg/mL 5％
实施例4-5 19s N/A 20mg/mL 20mg/mL 5％
对比例5-1 92s 48s 20mg/mL 20mg/mL 12％
对比例5-2 104s 53s 20mg/mL 20mg/mL 12％
对比例5-3 95s 40s 20mg/mL 20mg/mL 14％
对比例5-4 100s 50s 20mg/mL 20mg/mL 14％
对比例5-5 101s 45s 20mg/mL 20mg/mL 15％
配制时间范围包含：拆除外包装、铝塑盖、加入复溶液、混匀和吸取药液排空的时间，通过表5可知，由于为液体剂型，拆除包装后直接用注射器吸取药液排空注射，省去冻干剂型中间复溶液吸取，混匀步骤所需时间，使注射液能够显著缩短配制时间，同时其浓度稳定，多次配制浓度与规定浓度差别不大，损耗率低。表明本发明所述的重组人尿激酶原注射液能进一步改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间。
综上，本发明所提供的重组人尿激酶原注射液稳定性良好，克服了重组人尿激酶原在液体制剂中不稳定的问题。在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液体系中重组人尿激酶原更为稳定，海藻糖与吐温80的联合使用，减少重组人尿激酶原的降解，能够对蛋白起到良好的保护作用。本发明提供的重组人尿激酶原注射液使用方便快捷，能够改善医护人员的使用效率、提高顺应性、节约抢救时间。
申请人声明，以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种重组人尿激酶原注射液，其特征在于，所述重组人尿激酶原注射液按重量份数计由重组人尿激酶原1.5~2.5份、海藻糖0.5~1.5份、吐温80 0.01~0.03份和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液90~100份组成；
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的浓度为15~25 mM，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液的pH值为4.2~4.8；
所述重组人尿激酶原注射液的pH值为4.2~4.8。
2.一种根据权利要求1所述重组人尿激酶原注射液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
（1）制剂原料配制：分别配制缓冲溶液、重组人尿激酶原溶液、海藻糖溶液和吐温80溶液；
（2）注射液配制：将重组人尿激酶原溶液、海藻糖溶液、吐温80溶液与缓冲溶液混合，得到混合液，调节pH，过滤，得到所述重组人尿激酶原注射液。
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