UA112157C2 - МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ДО c-Mеt - Google Patents
МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ДО c-Mеt Download PDFInfo
- Publication number
- UA112157C2 UA112157C2 UAA201211624A UAA201211624A UA112157C2 UA 112157 C2 UA112157 C2 UA 112157C2 UA A201211624 A UAA201211624 A UA A201211624A UA A201211624 A UAA201211624 A UA A201211624A UA 112157 C2 UA112157 C2 UA 112157C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- region
- antibody
- sequence
- mei
- sequences
- Prior art date
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 103
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 179
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 134
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 66
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 63
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 63
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 60
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 52
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 37
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 34
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 33
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 31
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 26
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims description 23
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 21
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 19
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 19
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 101000720907 Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola Ornithine carbamoyltransferase 1, anabolic Proteins 0.000 claims description 16
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 15
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 101000840540 Homo sapiens Iduronate 2-sulfatase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 5
- 101100340271 Caenorhabditis elegans ida-1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 4
- 101000939500 Homo sapiens UBX domain-containing protein 11 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029645 UBX domain-containing protein 11 Human genes 0.000 claims description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 2
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims 3
- 235000003913 Coccoloba uvifera Nutrition 0.000 claims 2
- 240000008976 Pterocarpus marsupium Species 0.000 claims 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims 2
- 101150011812 AADAC gene Proteins 0.000 claims 1
- 244000005894 Albizia lebbeck Species 0.000 claims 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 claims 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 claims 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 claims 1
- 244000025361 Ficus carica Species 0.000 claims 1
- 235000008730 Ficus carica Nutrition 0.000 claims 1
- 241000764773 Inna Species 0.000 claims 1
- 241001417512 Kyphosidae Species 0.000 claims 1
- 206010023509 Kyphosis Diseases 0.000 claims 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 claims 1
- 229940110339 Long-acting muscarinic antagonist Drugs 0.000 claims 1
- 241001291562 Martes pennanti Species 0.000 claims 1
- 241001214257 Mene Species 0.000 claims 1
- 241000408551 Meza Species 0.000 claims 1
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims 1
- 241001482237 Pica Species 0.000 claims 1
- 241001377010 Pila Species 0.000 claims 1
- 241001057981 Puto Species 0.000 claims 1
- 241001233278 Scalopus aquaticus Species 0.000 claims 1
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 claims 1
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 claims 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims 1
- 241000750042 Vini Species 0.000 claims 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims 1
- ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N cortisol 21-acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O ALEXXDVDDISNDU-JZYPGELDSA-N 0.000 claims 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 claims 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 15
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 25
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 25
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 24
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 24
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 20
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 19
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 101150009089 tifa gene Proteins 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- -1 SOCZ Proteins 0.000 description 16
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 16
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 16
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 16
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 12
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 12
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 8
- 241000782624 Zema Species 0.000 description 8
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 7
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 description 7
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- 101150098813 Ido1 gene Proteins 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 6
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 6
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N imatinib Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CC=C(C(=O)NC=2C=C(NC=3N=C(C=CN=3)C=3C=NC=CC=3)C(C)=CC=2)C=C1 KTUFNOKKBVMGRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 5
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 5
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 5
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 5
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 5
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 5
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 5
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 5
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 5
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 description 4
- 241001132374 Asta Species 0.000 description 4
- 102100025634 Caspase recruitment domain-containing protein 16 Human genes 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- 244000182067 Fraxinus ornus Species 0.000 description 4
- 241000283162 Inia geoffrensis Species 0.000 description 4
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 4
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 4
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 239000002136 L01XE07 - Lapatinib Substances 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 101100491259 Oryza sativa subsp. japonica AP2-2 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 3
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000002280 anti-androgenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000051 antiandrogen Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000002725 brachytherapy Methods 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 3
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 3
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 3
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 3
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 3
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 3
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 3
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 229960004891 lapatinib Drugs 0.000 description 3
- BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N lapatinib Chemical compound O1C(CNCCS(=O)(=O)C)=CC=C1C1=CC=C(N=CN=C2NC=3C=C(Cl)C(OCC=4C=C(F)C=CC=4)=CC=3)C2=C1 BCFGMOOMADDAQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 description 3
- KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N mitoxantrone Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC(O)=C2C(=O)C2=C1C(NCCNCCO)=CC=C2NCCNCCO KKZJGLLVHKMTCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001156 mitoxantrone Drugs 0.000 description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 3
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229960001972 panitumumab Drugs 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 3
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 3
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 3
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 3
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 3
- 229950008250 zalutumumab Drugs 0.000 description 3
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 2
- DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N (4r,7s,10s,13r,16s,19r)-10-(4-aminobutyl)-19-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-16-benzyl-n-[(2r,3r)-1,3-dihydroxybutan-2-yl]-7-[(1r)-1-hydroxyethyl]-13-(1h-indol-3-ylmethyl)-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carboxa Chemical compound C([C@@H](N)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC1=O)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 DEQANNDTNATYII-OULOTJBUSA-N 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- BLRBOMBBUUGKFU-SREVYHEPSA-N (z)-4-[[4-(4-chlorophenyl)-5-(2-methoxy-2-oxoethyl)-1,3-thiazol-2-yl]amino]-4-oxobut-2-enoic acid Chemical compound S1C(NC(=O)\C=C/C(O)=O)=NC(C=2C=CC(Cl)=CC=2)=C1CC(=O)OC BLRBOMBBUUGKFU-SREVYHEPSA-N 0.000 description 2
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 1-oxidanylurea Chemical compound N[14C](=O)NO VSNHCAURESNICA-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-3-(octadecanoyloxy)propyl octadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC IZHVBANLECCAGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VPFUWHKTPYPNGT-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-1-(5-hydroxy-2,2-dimethylchromen-6-yl)propan-1-one Chemical compound OC1=C2C=CC(C)(C)OC2=CC=C1C(=O)CCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VPFUWHKTPYPNGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 2
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 2
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 2
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 2
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 2
- COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N Busulfan Chemical compound CS(=O)(=O)OCCCCOS(C)(=O)=O COVZYZSDYWQREU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060001826 COP1 Proteins 0.000 description 2
- 101100492787 Caenorhabditis elegans mai-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N Carmustine Chemical compound ClCCNC(=O)N(N=O)CCCl DLGOEMSEDOSKAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 240000008365 Celosia argentea Species 0.000 description 2
- 235000000722 Celosia argentea Nutrition 0.000 description 2
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N Cladribine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(Cl)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 PTOAARAWEBMLNO-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-CCXZUQQUSA-N 0.000 description 2
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N Ethinyl estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-SLHNCBLASA-N 0.000 description 2
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 208000022072 Gallbladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000685689 Homo sapiens Solute carrier family 17 member 9 Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 2
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 2
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 2
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 2
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010016076 Octreotide Proteins 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 241001246312 Otis Species 0.000 description 2
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N Propyl gallate Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 ZTHYODDOHIVTJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 2
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000008022 Proto-Oncogene Proteins c-met Human genes 0.000 description 2
- 108010089836 Proto-Oncogene Proteins c-met Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100023106 Solute carrier family 17 member 9 Human genes 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001415849 Strigiformes Species 0.000 description 2
- 108700023707 TUG1 Proteins 0.000 description 2
- NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N Tamoxifen Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 NKANXQFJJICGDU-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 2
- 229940123237 Taxane Drugs 0.000 description 2
- BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N Temozolomide Chemical compound O=C1N(C)N=NC2=C(C(N)=O)N=CN21 BPEGJWRSRHCHSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N Thiotepa Chemical compound C1CN1P(N1CC1)(=S)N1CC1 FOCVUCIESVLUNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000838698 Togo Species 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N UNPD55612 Natural products N1C(O)C2CC(C=CC(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical class OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N anthramycin Chemical compound N1[C@@H](O)[C@@H]2CC(\C=C\C(N)=O)=CN2C(=O)C2=CC=C(C)C(O)=C12 VGQOVCHZGQWAOI-HYUHUPJXSA-N 0.000 description 2
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 2
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 2
- 229960003272 asparaginase Drugs 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M asparaginate Chemical compound [O-]C(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 2
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 2
- 229960002092 busulfan Drugs 0.000 description 2
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 2
- 229960005243 carmustine Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960004630 chlorambucil Drugs 0.000 description 2
- JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N chlorambucil Chemical compound OC(=O)CCCC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 JCKYGMPEJWAADB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 229960002436 cladribine Drugs 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical group 0.000 description 2
- 229960000684 cytarabine Drugs 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 2
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 2
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N estramustine Chemical compound ClCCN(CCCl)C(=O)OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 FRPJXPJMRWBBIH-RBRWEJTLSA-N 0.000 description 2
- 229960001842 estramustine Drugs 0.000 description 2
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 description 2
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 229960000390 fludarabine Drugs 0.000 description 2
- GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N fludarabine phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC(F)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUYCYHIANZCFB-FJFJXFQQSA-N 0.000 description 2
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 201000010175 gallbladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 101150077246 gas5 gene Proteins 0.000 description 2
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 2
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 2
- 230000009033 hematopoietic malignancy Effects 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000057422 human IDS Human genes 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229960002247 lomustine Drugs 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 2
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 2
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 229960001428 mercaptopurine Drugs 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 2
- JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N mmai Chemical compound C1=C(C)C(OC)=CC2=C1CC(N)C2 JLESVLCTIOAHPT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 description 2
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 2
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 2
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 201000002120 neuroendocrine carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 229950010203 nimotuzumab Drugs 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 150000003057 platinum Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N propranolol Chemical compound C1=CC=C2C(OCC(O)CNC(C)C)=CC=CC2=C1 AQHHHDLHHXJYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 2
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 2
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 2
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 2
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 2
- 229960004964 temozolomide Drugs 0.000 description 2
- NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N teniposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@@H](OC[C@H]4O3)C=3SC=CC=3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 NRUKOCRGYNPUPR-QBPJDGROSA-N 0.000 description 2
- 229960001278 teniposide Drugs 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 229960001196 thiotepa Drugs 0.000 description 2
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 2
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- 231100000747 viability assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 2
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 2
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 2
- NGGMYCMLYOUNGM-UHFFFAOYSA-N (-)-fumagillin Natural products O1C(CC=C(C)C)C1(C)C1C(OC)C(OC(=O)C=CC=CC=CC=CC(O)=O)CCC21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXTKHLHCVFUPPT-YYFJYKOTSA-N (2s)-2-[[4-[(2-amino-5-formyl-4-oxo-1,6,7,8-tetrahydropteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]pentanedioic acid;(1r,2r)-1,2-dimethanidylcyclohexane;5-fluoro-1h-pyrimidine-2,4-dione;oxalic acid;platinum(2+) Chemical compound [Pt+2].OC(=O)C(O)=O.[CH2-][C@@H]1CCCC[C@H]1[CH2-].FC1=CNC(=O)NC1=O.C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C=O)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 YXTKHLHCVFUPPT-YYFJYKOTSA-N 0.000 description 1
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N (e)-n-[(4r,4as,7ar,12br)-3-(cyclopropylmethyl)-9-hydroxy-7-oxo-2,4,5,6,7a,13-hexahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a-yl]-3-(4-methylphenyl)prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1\C=C\C(=O)N[C@]1(CCC(=O)[C@@H]2O3)[C@H]4CC5=CC=C(O)C3=C5[C@]12CCN4CC1CC1 PJOHVEQSYPOERL-SHEAVXILSA-N 0.000 description 1
- JRMXMUCILWKNNW-UHFFFAOYSA-N 1-butoxy-2-methylbenzene Chemical compound CCCCOC1=CC=CC=C1C JRMXMUCILWKNNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFPYWIDHMRZLRN-UHFFFAOYSA-N 17alpha-ethynyl estradiol Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)(O)C#C)C4C3CCC2=C1 BFPYWIDHMRZLRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBUTXZSKZCQABC-UHFFFAOYSA-N 2-amino-1-methyl-7h-purine-6-thione Chemical compound S=C1N(C)C(N)=NC2=C1NC=N2 FBUTXZSKZCQABC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQOQDQWUFQDJMK-SSTWWWIQSA-N 2-methoxy-17beta-estradiol Chemical compound C([C@@H]12)C[C@]3(C)[C@@H](O)CC[C@H]3[C@@H]1CCC1=C2C=C(OC)C(O)=C1 CQOQDQWUFQDJMK-SSTWWWIQSA-N 0.000 description 1
- NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxy-15-(4-hydroxy-18-methoxycarbonyl-5,18-seco-ibogamin-18-yl)-16-methoxy-1-methyl-6,7-didehydro-aspidospermidine-3-carboxylic acid methyl ester Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 NDMPLJNOPCLANR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 HQFLTUZKIRYQSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 4'-epidoxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-VTZDEGQISA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005541 ACE inhibitor Substances 0.000 description 1
- 101150065898 AVT5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150105875 AZIN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 1
- 240000006054 Agastache cana Species 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 208000037540 Alveolar soft tissue sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 102100034594 Angiopoietin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010048154 Angiopoietin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000644 Angiozyme Proteins 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241001123248 Arma Species 0.000 description 1
- BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N Aromasine Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N 0.000 description 1
- 229940122815 Aromatase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 101000669426 Aspergillus restrictus Ribonuclease mitogillin Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 241000532370 Atla Species 0.000 description 1
- 102100023006 Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010037003 Buserelin Proteins 0.000 description 1
- 108091007914 CDKs Proteins 0.000 description 1
- 101100373139 Caenorhabditis elegans mig-14 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100287724 Caenorhabditis elegans shk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100268056 Caenorhabditis elegans zag-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100124609 Caenorhabditis elegans zyg-12 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 1
- 102400000730 Canstatin Human genes 0.000 description 1
- 101800000626 Canstatin Proteins 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N Capecitabine Chemical compound C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UORFTKCHSA-N 0.000 description 1
- GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N Capecitabine Natural products C1=C(F)C(NC(=O)OCCCCC)=NC(=O)N1C1C(O)C(O)C(C)O1 GAGWJHPBXLXJQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102100032616 Caspase-2 Human genes 0.000 description 1
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 1
- 235000014552 Cassia tora Nutrition 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 102100023126 Cell surface glycoprotein MUC18 Human genes 0.000 description 1
- 101100500421 Chlamydomonas reinhardtii DHC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100500422 Chlamydomonas reinhardtii DHC10 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 206010073140 Clear cell sarcoma of soft tissue Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700032819 Croton tiglium crotin II Proteins 0.000 description 1
- 102000003903 Cyclin-dependent kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000266 Cyclin-dependent kinases Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000283715 Damaliscus lunatus Species 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102100030012 Deoxyribonuclease-1 Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- ZQZFYGIXNQKOAV-OCEACIFDSA-N Droloxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=C(O)C=CC=1)\C1=CC=C(OCCN(C)C)C=C1 ZQZFYGIXNQKOAV-OCEACIFDSA-N 0.000 description 1
- 101100285518 Drosophila melanogaster how gene Proteins 0.000 description 1
- 206010072268 Drug-induced liver injury Diseases 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000078127 Eleusine coracana Species 0.000 description 1
- 235000013499 Eleusine coracana subsp coracana Nutrition 0.000 description 1
- MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N Emetamine Natural products O(C)c1c(OC)cc2c(c(C[C@@H]3[C@H](CC)CN4[C@H](c5c(cc(OC)c(OC)c5)CC4)C3)ncc2)c1 MBYXEBXZARTUSS-QLWBXOBMSA-N 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N Epirubicin Natural products COc1cccc2C(=O)c3c(O)c4CC(O)(CC(OC5CC(N)C(=O)C(C)O5)c4c(O)c3C(=O)c12)C(=O)CO HTIJFSOGRVMCQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- 241000238558 Eucarida Species 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N Fulvestrant Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3[C@H](CCCCCCCCCS(=O)CCCC(F)(F)C(F)(F)F)CC2=C1 VWUXBMIQPBEWFH-WCCTWKNTSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 description 1
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N Goserelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](COC(C)(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NNC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 BLCLNMBMMGCOAS-URPVMXJPSA-N 0.000 description 1
- 108010069236 Goserelin Proteins 0.000 description 1
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150023756 HSPA13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000152447 Hades Species 0.000 description 1
- 241000581652 Hagenia abyssinica Species 0.000 description 1
- 102100021889 Helix-loop-helix protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000200242 Hertia Species 0.000 description 1
- 229910052689 Holmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000903615 Homo sapiens Basic leucine zipper transcriptional factor ATF-like 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000867612 Homo sapiens Caspase-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000623903 Homo sapiens Cell surface glycoprotein MUC18 Proteins 0.000 description 1
- 101000897700 Homo sapiens Helix-loop-helix protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000581803 Homo sapiens Lithostathine-1-beta Proteins 0.000 description 1
- 101000904173 Homo sapiens Progonadoliberin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000661816 Homo sapiens Suppression of tumorigenicity 18 protein Proteins 0.000 description 1
- 101100049052 Homo sapiens VASH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- DOMWKUIIPQCAJU-LJHIYBGHSA-N Hydroxyprogesterone caproate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)CCCCC)[C@@]1(C)CC2 DOMWKUIIPQCAJU-LJHIYBGHSA-N 0.000 description 1
- 108010028501 Hypoxia-Inducible Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016878 Hypoxia-Inducible Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 235000010650 Hyssopus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N Idarubicin Chemical compound C1[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2C[C@@](O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-TZNDIEGXSA-N 0.000 description 1
- XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N Idarubicin Natural products C1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C2=C(O)C(C(=O)C3=CC=CC=C3C3=O)=C3C(O)=C2CC(O)(C(C)=O)C1 XDXDZDZNSLXDNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150042084 Ido2 gene Proteins 0.000 description 1
- JJKOTMDDZAJTGQ-DQSJHHFOSA-N Idoxifene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN2CCCC2)=CC=1)/C1=CC=C(I)C=C1 JJKOTMDDZAJTGQ-DQSJHHFOSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-NUEINMDLSA-N Isotretinoin Chemical compound OC(=O)C=C(C)/C=C/C=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-NUEINMDLSA-N 0.000 description 1
- QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N L-ascorbyl-6-palmitate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O QAQJMLQRFWZOBN-LAUBAEHRSA-N 0.000 description 1
- 239000011786 L-ascorbyl-6-palmitate Substances 0.000 description 1
- 239000005517 L01XE01 - Imatinib Substances 0.000 description 1
- 239000002147 L01XE04 - Sunitinib Substances 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027338 Lithostathine-1-beta Human genes 0.000 description 1
- 101150060239 MOM1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009073 Macrophage Migration-Inhibitory Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010048043 Macrophage Migration-Inhibitory Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000006644 Malignant Fibrous Histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000751119 Mila <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- 101100269376 Mus musculus Agfg2 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 101001098066 Naja melanoleuca Basic phospholipase A2 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000750002 Nestor Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283965 Ochotona princeps Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 229940049937 Pgp inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 240000005546 Piper methysticum Species 0.000 description 1
- 235000016787 Piper methysticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000514450 Podocarpus latifolius Species 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 102100028730 Pre-mRNA-processing factor 17 Human genes 0.000 description 1
- 101710124488 Pre-mRNA-processing factor 17 Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical class C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 1
- 102100024028 Progonadoliberin-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- YJDYDFNKCBANTM-QCWCSKBGSA-N SDZ PSC 833 Chemical compound C\C=C\C[C@@H](C)C(=O)[C@@H]1N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC1=O YJDYDFNKCBANTM-QCWCSKBGSA-N 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N SJ000285215 Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2C1CC1CC2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2CC1CC AUVVAXYIELKVAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100149884 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SOV1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000218998 Salicaceae Species 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 108050003978 Semaphorin Proteins 0.000 description 1
- 102000014105 Semaphorin Human genes 0.000 description 1
- 108010079723 Shiga Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- UIRKNQLZZXALBI-MSVGPLKSSA-N Squalamine Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](NCCCNCCCCN)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CC[C@H](C(C)C)OS(O)(=O)=O)[C@@]2(C)CC1 UIRKNQLZZXALBI-MSVGPLKSSA-N 0.000 description 1
- UIRKNQLZZXALBI-UHFFFAOYSA-N Squalamine Natural products OC1CC2CC(NCCCNCCCCN)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCC(C(C)C)OS(O)(=O)=O)C1(C)CC2 UIRKNQLZZXALBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000996723 Sus scrofa Gonadotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 241001648319 Toronia toru Species 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102100021163 Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase 1 Human genes 0.000 description 1
- 102400000731 Tumstatin Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000015778 Undifferentiated pleomorphic sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000792914 Valeriana Species 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 241000863480 Vinca Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 241001178076 Zaga Species 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 230000008484 agonism Effects 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001818 alpha-sarcin Proteins 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950010817 alvocidib Drugs 0.000 description 1
- BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N alvocidib Chemical compound O[C@@H]1CN(C)CC[C@@H]1C1=C(O)C=C(O)C2=C1OC(C=1C(=CC=CC=1)Cl)=CC2=O BIIVYFLTOXDAOV-YVEFUNNKSA-N 0.000 description 1
- LXQXZNRPTYVCNG-YPZZEJLDSA-N americium-241 Chemical compound [241Am] LXQXZNRPTYVCNG-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960003437 aminoglutethimide Drugs 0.000 description 1
- ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N aminoglutethimide Chemical compound C=1C=C(N)C=CC=1C1(CC)CCC(=O)NC1=O ROBVIMPUHSLWNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- 229960002616 ancestim Drugs 0.000 description 1
- 108700024685 ancestim Proteins 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- 229940044094 angiotensin-converting-enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940046836 anti-estrogen Drugs 0.000 description 1
- 230000001833 anti-estrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003388 anti-hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940030495 antiandrogen sex hormone and modulator of the genital system Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 210000000702 aorta abdominal Anatomy 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034720 apoptotic signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940078010 arimidex Drugs 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010385 ascorbyl palmitate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N boldenone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N buprenorphine Chemical compound C([C@]12[C@H]3OC=4C(O)=CC=C(C2=4)C[C@@H]2[C@]11CC[C@]3([C@H](C1)[C@](C)(O)C(C)(C)C)OC)CN2CC1CC1 RMRJXGBAOAMLHD-IHFGGWKQSA-N 0.000 description 1
- CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N buserelin Chemical compound CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](COC(C)(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 CUWODFFVMXJOKD-UVLQAERKSA-N 0.000 description 1
- 229960002719 buserelin Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLXUFYVBQPIQQH-UHFFFAOYSA-N butoxymethoxybenzene Chemical compound CCCCOCOC1=CC=CC=C1 PLXUFYVBQPIQQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046731 calcineurin inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229960004117 capecitabine Drugs 0.000 description 1
- FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N captopril Chemical compound SC[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O FAKRSMQSSFJEIM-RQJHMYQMSA-N 0.000 description 1
- 229960000830 captopril Drugs 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- WNRZHQBJSXRYJK-UHFFFAOYSA-N carboxyamidotriazole Chemical compound NC1=C(C(=O)N)N=NN1CC(C=C1Cl)=CC(Cl)=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 WNRZHQBJSXRYJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-RNFDNDRNSA-N cesium-137 Chemical compound [137Cs] TVFDJXOCXUVLDH-RNFDNDRNSA-N 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 201000000292 clear cell sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-YPZZEJLDSA-N cobalt-57 Chemical compound [57Co] GUTLYIVDDKVIGB-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000004814 combretastatins Chemical class 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000006552 constitutive activation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-AKLPVKDBSA-N copper-67 Chemical compound [67Cu] RYGMFSIKBFXOCR-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 1
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960003901 dacarbazine Drugs 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 229960004969 dalteparin Drugs 0.000 description 1
- 229960002204 daratumumab Drugs 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N dehydrotestosterone Natural products O=C1C=CC2(C)C3CCC(C)(C(CC4)O)C4C3CCC2=C1 RSIHSRDYCUFFLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N diethylstilbestrol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(\CC)C1=CC=C(O)C=C1 RGLYKWWBQGJZGM-ISLYRVAYSA-N 0.000 description 1
- 229960000452 diethylstilbestrol Drugs 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003534 dna topoisomerase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229950004203 droloxifene Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002694 emetine Drugs 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N emetine Chemical compound N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-CKBKHPSWSA-N 0.000 description 1
- AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N emetine Natural products N1CCC2=CC(OC)=C(OC)C=C2[C@H]1C[C@H]1C[C@H]2C3=CC(OC)=C(OC)C=C3CCN2C[C@H]1CC AUVVAXYIELKVAI-UWBTVBNJSA-N 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 108010028531 enomycin Proteins 0.000 description 1
- 230000029578 entry into host Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960001904 epirubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000328 estrogen antagonist Substances 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 229960002568 ethinylestradiol Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 229960000255 exemestane Drugs 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000002710 external beam radiation therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005242 forging Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229960002258 fulvestrant Drugs 0.000 description 1
- 229960000936 fumagillin Drugs 0.000 description 1
- NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N fumagillin Chemical compound C([C@H]([C@H]([C@@H]1[C@]2(C)[C@H](O2)CC=C(C)C)OC)OC(=O)\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O)C[C@@]21CO2 NGGMYCMLYOUNGM-CSDLUJIJSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 229940074045 glyceryl distearate Drugs 0.000 description 1
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 description 1
- 239000002748 glycoprotein P inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-OUBTZVSYSA-N gold-198 Chemical compound [198Au] PCHJSUWPFVWCPO-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N gonadorelin Chemical compound C1CCC(C(=O)NCC(N)=O)N1C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)C(CC=1NC=NC=1)NC(=O)C1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002913 goserelin Drugs 0.000 description 1
- 229960004905 gramicidin Drugs 0.000 description 1
- ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N gramicidina Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 108010006406 heparinase II Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003652 hormone inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229950000801 hydroxyprogesterone caproate Drugs 0.000 description 1
- 229960000908 idarubicin Drugs 0.000 description 1
- 229950002248 idoxifene Drugs 0.000 description 1
- 229960002411 imatinib Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-AHCXROLUSA-M iodine-123(1-) Chemical compound [123I-] XMBWDFGMSWQBCA-AHCXROLUSA-M 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M iodine-131(1-) Chemical compound [131I-] XMBWDFGMSWQBCA-RNFDNDRNSA-M 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960005386 ipilimumab Drugs 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-IGMARMGPSA-N iridium-192 Chemical compound [192Ir] GKOZUEZYRPOHIO-IGMARMGPSA-N 0.000 description 1
- 229960004768 irinotecan Drugs 0.000 description 1
- UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N irinotecan Chemical compound C1=C2C(CC)=C3CN(C(C4=C([C@@](C(=O)OC4)(O)CC)C=4)=O)C=4C3=NC2=CC=C1OC(=O)N(CC1)CCC1N1CCCCC1 UWKQSNNFCGGAFS-XIFFEERXSA-N 0.000 description 1
- YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N isosorbide mononitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[C@@H]1CO[C@@H]2[C@@H](O)CO[C@@H]21 YWXYYJSYQOXTPL-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002014 ixabepilone Drugs 0.000 description 1
- FABUFPQFXZVHFB-CFWQTKTJSA-N ixabepilone Chemical compound C/C([C@@H]1C[C@@H]2O[C@]2(C)CCC[C@@H]([C@@H]([C@H](C)C(=O)C(C)(C)[C@H](O)CC(=O)N1)O)C)=C\C1=CSC(C)=N1 FABUFPQFXZVHFB-CFWQTKTJSA-N 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N l-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(O)=C(O)C1=O TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001115 mace Substances 0.000 description 1
- 238000009115 maintenance therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229950008959 marimastat Drugs 0.000 description 1
- OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N marimastat Chemical compound CNC(=O)[C@H](C(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)[C@H](O)C(=O)NO OCSMOTCMPXTDND-OUAUKWLOSA-N 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229960004961 mechlorethamine Drugs 0.000 description 1
- HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N mechlorethamine Chemical compound ClCCN(C)CCCl HAWPXGHAZFHHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229960004616 medroxyprogesterone Drugs 0.000 description 1
- 229960001786 megestrol Drugs 0.000 description 1
- RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N megestrol acetate Chemical compound C1=C(C)C2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(C)=O)(OC(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RQZAXGRLVPAYTJ-GQFGMJRRSA-N 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003475 metalloproteinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229960002700 octreotide Drugs 0.000 description 1
- 229960002450 ofatumumab Drugs 0.000 description 1
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 1
- CKNAQFVBEHDJQV-UHFFFAOYSA-N oltipraz Chemical compound S1SC(=S)C(C)=C1C1=CN=CC=N1 CKNAQFVBEHDJQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950008687 oltipraz Drugs 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940043138 pentosan polysulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229960002087 pertuzumab Drugs 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 108010076042 phenomycin Proteins 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229950003608 prinomastat Drugs 0.000 description 1
- 229960004919 procaine Drugs 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 1
- 229960003712 propranolol Drugs 0.000 description 1
- 239000000473 propyl gallate Substances 0.000 description 1
- 235000010388 propyl gallate Nutrition 0.000 description 1
- 229940075579 propyl gallate Drugs 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 229940063222 provera Drugs 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 235000002079 ragi Nutrition 0.000 description 1
- GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N raloxifene Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=C(C(=O)C=2C=CC(OCCN3CCCCC3)=CC=2)C2=CC=C(O)C=C2S1 GZUITABIAKMVPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004622 raloxifene Drugs 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940116176 remicade Drugs 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000012508 resin bead Substances 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 1
- 229950003238 rilotumumab Drugs 0.000 description 1
- 102220125116 rs867314622 Human genes 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940072272 sandostatin Drugs 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N seliciclib Chemical compound C=12N=CN(C(C)C)C2=NC(N[C@@H](CO)CC)=NC=1NCC1=CC=CC=C1 BTIHMVBBUGXLCJ-OAHLLOKOSA-N 0.000 description 1
- LVLLALCJVJNGQQ-ZCPUWASBSA-N seocalcitol Chemical compound C1(/[C@H]2CC[C@@H]([C@@]2(CCC1)C)[C@H](C)/C=C/C=C/C(O)(CC)CC)=C/C=C1/C[C@H](O)C[C@@H](O)C1=C LVLLALCJVJNGQQ-ZCPUWASBSA-N 0.000 description 1
- 229950009921 seocalcitol Drugs 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009958 sewing Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 229940115586 simulect Drugs 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015424 sodium Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940100996 sodium bisulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 229940001482 sodium sulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical class C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 235000003687 soy isoflavones Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 229950001248 squalamine Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 229960001796 sunitinib Drugs 0.000 description 1
- WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N sunitinib Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=C(C)NC(\C=C/2C3=CC(F)=CC=C3NC\2=O)=C1C WINHZLLDWRZWRT-ATVHPVEESA-N 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000007755 survival signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 229960001603 tamoxifen Drugs 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 229960002372 tetracaine Drugs 0.000 description 1
- GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N tetracaine Chemical compound CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 GKCBAIGFKIBETG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXVCSRUYMINUSF-UHFFFAOYSA-N tetrathiomolybdate(2-) Chemical compound [S-][Mo]([S-])(=S)=S CXVCSRUYMINUSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 229940044693 topoisomerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229960000303 topotecan Drugs 0.000 description 1
- UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N topotecan Chemical compound C1=C(O)C(CN(C)C)=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 UCFGDBYHRUNTLO-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- XFCLJVABOIYOMF-QPLCGJKRSA-N toremifene Chemical compound C1=CC(OCCN(C)C)=CC=C1C(\C=1C=CC=CC=1)=C(\CCCl)C1=CC=CC=C1 XFCLJVABOIYOMF-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- 229960005026 toremifene Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 238000013414 tumor xenograft model Methods 0.000 description 1
- 108010012374 type IV collagen alpha3 chain Proteins 0.000 description 1
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013594 undilute cell lysate Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N uranium(0) Chemical compound [U] JFALSRSLKYAFGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 description 1
- 229950010938 valspodar Drugs 0.000 description 1
- 108010082372 valspodar Proteins 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004355 vindesine Drugs 0.000 description 1
- UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N vindesine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(N)=O)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1N=C1[C]2C=CC=C1 UGGWPQSBPIFKDZ-KOTLKJBCSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 229940099073 xolair Drugs 0.000 description 1
- 229950009002 zanolimumab Drugs 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Винахід стосується моноклонального антитіла, яке зв'язує людський c-Met, також розкрита фармацевтична композиція, яка включає антитіло, а також терапевтичний й діагностичний способи застосування антитіла.
Description
Галузь техніки, до якої відноситься винахід
Даний винахід відноситься до моноклональних антитіл проти людського с-Меї, рецептора фактора росту гепатоцитів, і до застосування таких антитіл, конкретно до їх застосування для лікування злоякісних новоутворень.
Попередній рівень техніки
Білок с-Меї є мембраноасоційованим рецептором-тирозинкіназою. Переважно одноланцюговий попередник посттрансляційно розщеплюється з одержанням зрілої форми гетеродимера с-Меї, який складається з позаклітинного а-ланцюга (50 кДа) і більш довгого трансмембранного Д-ланцюга (145 кДа), які зв'язані дисульфідним зв'язком (ВігспІтеїег еї аї. 2003. Маї Кем Мої Сей Віо! 4:915). Позаклітинна частина с-Меї складається із трьох типів доменів. М-кінцевий домен 5ЕМА утворюється із цілої «-субодиниці й частини В-субодиниці й має гомологію з білками семафоринів. Наступним за доменом ЗЕМА йде цистеїн-збагачений домен, а далі 4 імуноглобуліно-(І4)-подібних домени. Цитоплазматична частина містить навколомембранний кіназний домен і С-кінцевий хвіст, який є важливим для передачі сигналу в клітину. Єдиний відомий високо-афінний ліганд для с-Меї, фактор росту гепатоцитів (НОБ), експресується, головним чином, фібробластами за нормальних умов (Гі апа Т5епд 1995. У СеїЇ
Рпузіої! 163:61) і пухлинними клітинами (Регїтасіпі еї аЇ. 1995. Опсодепе 10:739). НОЕ (який також називають розсіюючим фактором: 5Е) синтезується у вигляді попередника, який протеолітично перетворюється на активний а/ВД гетеродимер. Виходячи із кристалічної структури фрагмента, який зв'язує рецептор, вважають, що НОБЕ зв'язується з с-Меї у вигляді димера (Спігдаа?е еї аї. 1999. Маї 5ігисі Віо! 6:72). а-Ланцюг НОБЕ зв'язується в с-Меї з високою афінністю з Ід-подібним доменом, тоді як В-ланцюг НО зв'язується в с-Меї з низькою афінністю з доменом БЕМА (Вавіїйсо еї а). 2008. 9) Віої! Спет 283:21267). Остання взаємодія є відповідальною за димеризацію с-Меї і активацію рецепторної тирозинкінази при зв'язуванні з активним гетеродимером НОР. Автофосфорилювання рецептора призводить у результаті до одержання унікального стикувального сайту для залучення ефекторів, з яких зв'язування барі (1-й зв'язуючий агент, асоційований з 2-м білком, зв'язаним з рецептором фактора росту (Огб21) є суттєвим для наступних етапів основних сигнальних шляхів с-Меї (Сотодіїйо еї а. 2008. Маї Нем
Огид бівсом 7:504):
Зо "Шлях Каз5-ЕККТ/2: проліферація. " Шлях Каз-Кас: інвазія, рухливість, епітеліально-мезенхімальний перехід. «- Шлях РІЗК-АКІ: життєздатність. с-Меї експресується на поверхні епітеліальних і ендотеліальних клітин багатьох органів у процесі ембріогенезу та у дорослому стані, включаючи печінку, підшлункову залозу, передміхурову залозу, нирки, м'язи й кістковий мозок. Активація с-Меї відіграє істотну роль у так званій програмі "інвазивного росту", яка складається з ряду процесів, які включають проліферацію, рухливість, ангіогенез і захист від апоптозу (Воссассіо апа Сотодііо 2006. Маї
Кем Сапсег 6:637). Ці регульовані с-Меї процеси йдуть за нормальних фізіологічних умов у процесі ембріонального розвитку, при репарації уражень печінки й серця, і в патологічних випадках у ході онкогенезу (Еаег єї аї. 2009. Сііп Сапсег Кез 15:2207).
Недоречна передача сигналів від с-Меї відбувається фактично у всіх типах твердих пухлин, таких як рак сечового міхура, рак грудей, рак шийки матки, колоректальний рак, рак шлунка, рак голови й шиї, рак печінки, рак легені, рак яєчників, рак підшлункової залози, рак нирок і рак щитовидної залози, а також у різних саркомах, гемопоетичних злоякісних новоутвореннях і в меланомах (Вігсптеїег еї аЇ. 2003. Маї Кем Мої Сеї Віо! 4:915; Сотодіїйо єї аІ. 2008. Маї ем Огид
Оібвсом 7:504; Реги?7і апа Воцаго 2006. Сіїп Сапсег Кез 12:3657). Основні механізми онкогенності с-Меї, як правило, здійснюються трьома різними шляхами: " аутокринні петлі НОБ/о-Меї, " гіперекспресія с-Меї або НОБЕ, " мутації в послідовності, яка кодує рецептор с-Меї, які активують кінази.
Найбільш суттєвим є те, що мутації, які активують с-Меї, були ідентифіковані в пацієнтів зі спадковим папілярним раком нирок (Зсптіді еї аі. 1997. Маї Сепеї 16:68). Конститутивна активація с-Меї спричиняє одному або кільком з поміж проліферативного, інвазивного, життєтвірного або ангіогенного фенотипів злоякісних новоутворень. Було показано, що сайленсинг гена с-Меї, здатного до ендогенної експресії, у пухлинних клітинах у результаті призводить до припинення проліферації й росту пухлини і до регресії початку метастазування, а також до зменшення утворення нових метастаз (Согзо еї а. 2008. Опсодепе 27:684).
Оскільки с-Меї сприяє багатьом станам розвитку злоякісних новоутворень, від початкового до прогресу до метастазування, с-Меї і його ліганд НОЕ стали лідируючими кандидатами для бо спрямованої протипухлинної терапії (Сотодіїйо еї а). 2008. Маї Кем Огид різсом 7:504; Кпиазеп апа Мапде М/оцде 2008. Си Оріп Сепеї Оєм 18:87). Для досягнення даної мети вивчаються кілька стратегій: " Хибні рецептори: субобласті НОР або с-Меї або молекулярні аналоги можуть діяти антагоністично як стехіометричні конкуренти шляхом блокування зв'язування ліганду або димеризації рецептора. Одним прикладом такої антагоністичної субобласті НОЕ є МКА (КгіпдіІе
Рпапгта). " Низькомолекулярні інгібітори тирозинкіназ (ТКІ): Трьома с-МеЇ-специфічними ТКІ у різних стадіях клінічної оцінки є АКО197 (Агаше), УМО 38877605 (Чоппбзоп 5 доппзоп) і РЕ-04217903 (Ріїгег). " Моноклональні антитіла, які зв'язують НО, такі як АМО102, рилотумумаб (англ. піоїититаб) (Атдеп), Ни! 2557 (Такеаа), і АМ-299 (Зспетіпа). " Моноклональні антитіла, які зв'язують с-Меї, описані в УМО2005016382, ММО2006015371, мО2007090807, МО2007126799 УМО2009007427, УМО2009142738 і в роботі мап аег Ногві еї аї. (мап аег Ногеї еї а). 2009. Меоріазоа 11:355)3. МеїМар (Сепепіесп) є гуманізованими моновалентними (одно-плечовими) ОА-505 антитілами, які зв'язують позаклітинний домен с-
Меї, запобігаючи в такий спосіб зв'язуванню НОБЕ і наступній активації рецептора (іп еї аї. 2008.
Сапсег Ке5 68:4360). У мишачих моделях ксенотрансплантатів було виявлено, що обробка
МеїМар інгібує пухлинний ріст НеЕ-керованої ортотопічної гліобластоми й підшкірних панкреатичних пухлин (Чіп еї аІ. 2008. Сапсег Ке5 68:4360; Мапепз еї аї. 2006. Сііп Сапсег Ке5 12:6144). Антитіло п224011 (Рієїте Рабге) (Согмаїа апа Вошіе 2009. Арзігасі 835 ААСК ТО01п
Аппиаї! Мееїйіпо) є гуманізованим двовалентним дО 1-антитілом проти со-Меї. Протипухлинний ефект даного антитіла спостерігали в мишей (Соеї5сп еї аІ. 2009. Арзігасі 2792 ААСЕК 1001
Аппиаї Мееїіпд). Антитіло СЕ-355621 (Рії7ег) є людським Ідс2, який блокує зв'язування ліганду шляхом зв'язування з позаклітинним доменом с-Меї та інгібує НОЕ-залежний ріст у моделях пухлинних ксенотрансплантатів (Тзепод еї а. 2008. У Мисі Меа 49:129).
У висновку слід зазначити, що деякі продукти проти с-Меї уже вивчалися, але дотепер не існує жодного продукту проти с-Меї, схваленого для терапевтичного застосування. Існує необхідність одержання ефективних і безпечних продуктів для лікування важких, асоційованих з с-Меї захворювань, таких як злоякісні новоутворення.
Зо Сутність винаходу
Метою даного винаходу було запропонувати нові високоспецифічні та ефективні моноклональні антитіла проти с-Меї для медичного застосування. Антитіла запропоновані винаходом демонструють характеристики зв'язування з с-Меї, які відрізняються від характеристик антитіл, описаних у даній галузі. У кращих втіленнях, антитіла запропоновані винаходом мають високу афінність у відношенні до людського с-Меї, є антагоністичними й мають кращий профіль фармакокінетики при застосуванні для пацієнтів-людей.
Короткий опис креслень
Фігура 1. Порівняння послідовностей варіабельних ділянок важких ланцюгів антитіл НиМаб.
Виходячи із цих послідовностей можуть бути визначені консенсусні послідовності СОК. Ці консенсусні послідовності представлені в Таблиці 4.
Фігура 2. Порівняння послідовностей варіабельних ділянок легких ланцюгів антитіл НиМаб.
Виходячи із цих послідовностей можуть бути визначені консенсусні послідовності СОМ. Ці консенсусні послідовності представлені в Таблиці 4.
Фігура 3. Криві зв'язування одновалентних і двовалентних форм антитіл проти с-Меї із клітинами А431, які експресують с-Меї. Представлені дані це МЕ! одного репрезентативного експерименту. Оскільки Ідсе1-024 і Опі-0б68 не демонструють насиченого зв'язування із клітинами А431, то не можливо і розрахувати точне значення ЕСбо.
Фігура 4. Зв'язування антитіл з с-Меї, який експресується на епітеліальних клітинах макаки- резус. Представлені дані - це МЕЇ одного експерименту.
Фігура 5. Інгібування зв'язування НОБЕ з позаклітинним доменом рецептора с-Меї, індуковане антитілом проти с-Меї. Представлені дані - це один репрезентативний експеримент.
Фігура 6. Криві інгібування різними антитілами проти с-Меї зв'язування НОЄ з сМеї5ЕМА 567НІі58, отримані за допомогою ТК-ЕКЕТ. Представлені дані - це середнє МЕЇ ж стандартна похибка трьох незалежних експериментів.
Фігура 7. Процентне інгібування життєздатних клітин КРА після обробки антитілом проти с-
Меї у порівнянні з необробленими клітинами (095). Представлені дані - це процентне інгібування життєздатних клітин двох незалежних експериментів х стандартне відхилення. Ідс1 - 1016-022 є єдиним позитивним результатом в одному експерименті.
Фігура 8. Ефективність антитіл проти с-Меї при інгібуванні росту пухлин в моделі бо ксенотрансплантату КРА у мишах ЗСІЮ. Мишей обробляли за допомогою 400 уд антитіла на 9 день після тижневої підтримуючої дози 200 цд. Представлені середні розміри пухлини на групу обробки.
Фігура 9. Ефективність антитіл, які зв'язують с-Меї, для інгібування росту пухлин в моделі ксенотрансплантата КРА4 у мишах 5СІЮ. Мишей обробляли 400 мкг антитіла на 9 день, з наступною підтримуючою дозою 200 мкг раз на тиждень. Вплив обробки на частоту пухлин, від часу. Представлений відсоток мишей без пухлини (розміри пухлин «500 ммУ). Утворення пухлин уповільнювався в мишей, оброблених антагоністичними антитілами, у порівнянні з мишами, обробленими контрольними антитілами.
Фігура 10. Ефективність антитіл проти с-Меї при інгібуванні росту пухлин в моделі ксенотрансплантата МКМ45 у мишах 5СІЮ. Мишей обробляли 40 мг/кг антитіла на 7 день і 20 мг/кг антитіла в дні 14, 21 і 28. Представлені середні розміри пухлин до досягнення 50 95 мишей граничного значення, що становить 700 мм? на групу обробки.
Фігура 11. Ефективність антитіл проти с-Меї, при інгібуванні росту пухлин в моделі ксенотрансплантата МКМ45 у мишей 5СІОЮ. Мишей обробляли антитілом - 40 мг/кг на 7 день і 20 мг/кг антитілом на 14, 21 і 28 дні. Відсоток мишей з розміром пухлини менше ніж 700 мм3 представлений на діаграмі Каплана-Мейера. Утворення пухлин уповільнювалося в мишей, оброблених анти с-Меї антитілами, у порівнянні з мишами, обробленими ізотиповим контрольним антитілом.
Фігура 12. Аналіз життєздатності КРА4 для визначення впливу гнучкості антитіла (апібоду
Пехіріїйу) на його агоністичну активність. Формат ІДА2ті(1) не індукує проліферацію на відміну від форматів ІДА1 і Ід01 того ж антитіла. У даному експерименті використовували варіанти антитіла проти с-Меї 505 (див. 56468529 і приклад 2).
Фігура 13. Аналіз гнучких мутантів, що невідновлюваному ДСН-ПААГ (069). Не спостерігали аберантних мультимерів або продуктів деградації, тоді як спаровування легкого ланцюга було видно як смугу 50 кДа (-С)2) в С2205, ДО220 у мутантах до 1-шарнір Ід3.
Фігура 14. Антигензв'язуючий тІФА(твердофазний імуноферментний аналіз) для визначення зв'язування з с-Меї антитіл проти с-Меї з мутаціями в шарнірі. За допомогою тіФА було показано, що всі мутанти зв'язують с-Меї з порівнянної афінністю.
Фігура 15. Фосфорилювання с-Меї як визначена величина агоністичної активності антитіл
Зо проти с-Меї. На Фігурі 15 представлені результати вестерн-блотингу лізатів клітин А549; мембрани пофарбовані антитілами проти фосфорильованого с-Меї, загального с-теї або рД- актину.
Фігура 16. Аналіз проліферації з використанням клітин МСІ-Н441. Клітинну масу визначали через 7 днів інкубації в присутності антитіла або контролів, і виражали у вигляді відсотка відносно необроблених зразків (для яких установлювали 100 95).
Фігура 17. Аналіз життєздатності КР4. Тестували вплив антитіл проти с-Меї, на загальну життєздатність клітин КР4. Здатність Ідс1-1016-069 знижувати життєздатність КРА зберігалася й/"або поліпшувалася шляхом уведення мутацій, які знижували гнучкість антитіл.
Фігура 18. Негативна модуляція, визначена за допомогою тіФА у вигляді рівня сумарного с-
Меї у лізатах А549. Усі варіанти антитіла (069) зберігали здатність до негативної модуляції.
Фігура 19. Аналіз АОСС для порівняння антитіл Іде1-1016-069 з високим і з низьким вмістом фукози.
Фігура 20. Відсутність зв'язування антитіл с-Меї із клітинами в цільній крові в аналізі зв'язування ЕАС5. Результати представлені для В-клітин, моноцитів і гранулоцитів.
Докладний опис винаходу
Визначення
Термін "с-Меї", як він використовується в даному документі, позначає рецептор фактора росту гепатоцитів (реєстраційний номер Сепрапк ММ 000245) і включає будь-які варіанти, ізоформи й міжвидові гомологи людського с-Меї, які природно експресуються клітинами або експресуються на клітинах, трансфікованих геном с-Меї.
Термін "імуноглобулін" позначає клас структурно споріднених глікопротеїнів, які складаються із двох пар поліпептидних ланцюгів, однієї пари легких (Г) низькомолекулярних ланцюгів і однієї пари важких (Н) ланцюгів, усі чотири зв'язані між собою дисульфідними зв'язками. Структура імуноглобулінів добре охарактеризована. Див., наприклад, Рипдатепіаї
Ітітипоїоду Сп. 7 (Раш, УМ., ейа., 2па4 ей. Камеп Ргез5, М.У. (1989)). Коротко, кожний важкий ланцюг, як правило, містить варіабельну область важкого ланцюга (скорочено позначену в даному документі як Мн або МН) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить, як правило, три домени, Сні, Сн2, і Сн3. Кожний легкий ланцюг містить, як правило, варіабельну область легкого ланцюга (скорочено позначену в даному 60 документі як Мі або МІ) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга містить, як правило, один домен, Сі. Області Мн і Мі, які можуть бути додатково підрозділені на ділянки гіперваріабельності (або гіперваріабельні ділянки, які можуть бути гіперваріабельними за послідовністю й/або формою структурно зумовлених петель), також їх називають областями, які відповідальні за комплементарність зв'язування (СОК), перемежовуються ділянками, які є більш консервативними і які називаються каркасними областями (ЕК). Кожна УН і МІ, як правило, містить три СОМ і чотири ЕК, розташовані від М- кінця до С-кінця в наступному порядку: ЕК1, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА (див., також
СпоїщШтіа апа ГевзкК у. Мої. Віої. 196, 901-917 (1987)). Як правило, нумерація амінокислотних залишків у даній галузі здійснюється за допомогою методу, описаного в Кабаї єї аЇ., Зедоепсе5 ої Ргоїєїпв ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ед. Рибіїс Неайй 5егуісе, Маїйопаї! Іпвійшев ої Неайцй,
Веїпезаа, МО. (1991) (такі фрази, як нумерація залишку варіабельного домену як в Кабаї або відповідно до Кабаї означають у даному документі систему нумерації для варіабельних доменів важкого ланцюга або варіабельних доменів легкого ланцюга). З використанням даної системи нумерації, фактична лінійна амінокислотна послідовність пептиду може містити меншу кількість амінокислот або додаткові амінокислоти, що відповідає скороченню або вставці в ЕК або СО варіабельного домена. Наприклад, варіабельний домен важкого ланцюга може включати одиничну амінокислотну вставку (залишок 52а відповідно до Кабаї) після залишку 52 Мн СОК2 і вставлені залишки (наприклад, залишки 82а, 826, і 82с тощо відповідно до Кава) після залишку 82 ЕК важкому ланцюга. Нумерація залишків відповідно до Кабраї може визначатися для даного антитіла за допомогою порівняння областей гомології послідовності антитіла з послідовністю з "стандартною" нумерацією за Кабаї.
У контексті даного винаходу термін "антитіло" (АТ) позначає молекулу імуноглобуліну, фрагмент молекули імуноглобуліну або їх похідну, які мають здатність специфічно зв'язуватися з антигеном за звичайних фізіологічних умов, з періодом напівжиття, які складають істотні періоди часу, наприклад, щонайменше, близько 30 хвилин, щонайменше, близько 45 хвилин, щонайменше, близько однієї години, щонайменше, близько двох годин, щонайменше, близько чотирьох годин, щонайменше, близько 8 годин, щонайменше, близько 12 годин, близько 24 годин або більш, близько 48 годин або більше, близько 3, 4, 5, 6, 7 днів або більше тощо, або будь-який інший розмірний функціонально визначений період (такий як період часу, достатній для індукції, стимулювання, посилення й/або модуляції фізіологічної відповіді, асоційованої с антитілом, який зв'язується з антигеном, і/або період часу, достатній для антитіла для виникнення ефекторної активності). Варіабельні області важкого й легкого ланцюгів молекули імуноглобуліну містять домен зв'язування, який взаємодіє з антигеном. Константні області антитіл (АТ) можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну із тканинами або факторами хазяїна, включаючи різні клітини імунної системи (такі як, ефекторні клітини) і компоненти системи комплементу, такі як СТд, перший компонент класичного шляху активації системи комплементу. Антитіло, яке зв'язує с-Меї, також може бути біспецифічним антитілом, діатілом або подібною до них молекулою (опис діатіл див., наприклад, в РМАБ ОБА 90(14), 6444-8 (1993)). Дійсно, біспецифічні антитіла, діатіла і подібні до них, представлені даним винаходом, можуть зв'язуватися з придатною мішенню додатково до ділянки с-Меї. Як зазначено вище, термін антитіло в даному документі, якщо не зазначене інакше або допоки немає очевидного протиріччя за контекстом, включає фрагменти антитіла, яке зберігає здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Було показано, що антигензв'язуюча функція антитіла може бути здійснена за допомогою фрагментів повнорозмірного антитіла. Приклади з'єднуючих фрагментів, які охоплюються терміном "антитіло", включають ()) фрагмент Рар' або фрагмент
Еаб, моновалентний фрагмент, який складається з доменів Мі, Мн, Сі і Сн1, або моновалентне антитіло, описане в УМО2007059782 (Септарб); (ії) фрагменти ЕК(аб)», двовалентні фрагменти, які включають два фрагменти Бар, зв'язані дисульфідним містком у шарнірній області; (її) фрагмент Га, який власне, складається з доменів Мн і Сн1і; (м) фрагмент Ем, який власне, складається з доменів Мі і Мн одиночного плеча антитіла, (м) фрагмент ЯАБ (Умага еї аї., Маштге 341, 544-546 (1989)), який власне складається з домена Мн і називається також доменним антитілом (Ноїї еї аї; Тгепах Віоїесппої. 2003 Мом;21(1):484-90); (м) верблюжі антитіла або нанотіла (Кемеїв5 еї а; Ехрегі Оріп Віо! Тег. 2005 дап;5(І):ПІ-24) і (мії) виділена гіперваріабельна ділянка (СОК). Більше того, хоча два домена Ем-фрагмента, Мі і Мн, кодуються окремими генами, вони можуть бути об'єднані, за допомогою рекомбінантних методів, за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє їм створити окремий білковий ланцюг, у якому області М і
Мн зливаються з утворенням моновалентних молекул (відомих як одноланцюгові антитіла або одноланцюговий фрагмент Ем (зсЕм), див. наприклад, Віга еї аї!., Зсіепсе 242, 423-426 (1988) і
Нивюп еї аі., РМАБ ОБА 85, 5879-5883 (1988)). Такі одноланцюгові антитіла охоплюються 60 терміном антитіло, якщо не зазначено іншого або інше не є очевидно зазначене в контексті.
Хоча такі фрагменти, як правило, включені в позначення антитіла, вони всі разом або окремо є унікальними ознаками даного винаходу, які демонструють різні біологічні властивості і можливість застосування. Ці та інші антитільні фрагменти застосовані в контексті даного винаходу обговорюються далі в даному документі. Також слід розуміти, що термін антитіло, якщо не зазначено інакшого, також включає поліклональні антитіла, моноклональні антитіла (МАТ), антитіло-подібні поліпептиди, такі як химерні антитіла та гуманізовані антитіла, і фрагменти антитіл, які зберігають здатність до специфічного зв'язування з антигеном (антигензв'язуючі фрагменти), отримані за допомогою відомих методів, таких як ферментативне розщеплення, пептидний синтез і рекомбінантні методи. При продукуванні антитіло може мати будь-який ізотип.
Термін "ізотип", як він використовується в даному документі, відноситься до будь-якого класу імуноглобулінів (наприклад, Ідс1, Ідс2, дез, Ідс4, дО, ІдДА, І9ЗЕ, або ІДМ), які кодуються генами константних областей важких ланцюгів.
У контексті даного винаходу, термін "моновалентне антитіло" позначає, що молекула антитіла здатна до зв'язування з однією молекулою антигену, і, таким чином, не здатна до перехресного зв'язування з антигенами. "Антитіло, яке має дефіцит ефекторної функції" або "антитіло з дефіцитом ефекторної функції" означає, що антитіло має значно меншу або зовсім не має здатності активувати один або декілька ефекторних механізмів, таких як активація комплементу або зв'язування з Ес- рецептором. Таким чином, антитіла, які мають дефіцит за ефекторної функції, мають значно меншу або не мають здатності опосередковувати антитілозалежну клітинноопосередковану цитотоксичність (АЮСС) і/або комплементзалежну цитотоксичність (СОС). Прикладом такого антитіла є Ідо4. "Антитіло, що зв'язується о-Меї" є антитілом, яке було описано вище, і яке специфічно зв'язується з антигеном с-Меї.
Передбачається термін "людське антитіло", як він використовується в даному документі, включає антитіла, які містять варіабельні й константні області, виділені з людських зародкових послідовностей імуноглобулінів. Людські антитіла запропоновані винаходом можуть включати амінокислотні залишки, які не кодуються людськими зародковими послідовностями
Зо імуноглобулінів (наприклад, мутації, уведені неспецифічним або сайтспецифічним мутагенезом іп міго або соматичними мутаціями іп мімо) Однак передбачається що, термін "людське антитіло", як він використовуються в даному документі, не включає антитіла, у яких послідовності СОК, отримані із зародкової лінії інших видів ссавців, таких як миші, були пересаджені в людські каркасні послідовності.
При використанні в даному документі, людське антитіло є "виділеним із" зародкової послідовності, якщо антитіло отримане із системи з використанням людських імуноглобулінових послідовностей, наприклад, шляхом імунізації трансгенної миші, яка несе людські імуноглобулінові гени, або шляхом скринінгу бібліотеки людських імуноглобулінових генів, і де обране людське антитіло є ідентичним за амінокислотною послідовністю до амінокислотної послідовності, яка кодується зародковим імуноглобуліновим геном, щонайменше, на 90 95, наприклад, щонайменше, на 95 95, наприклад, щонайменше, на 96 95, наприклад, щонайменше, на 97 95, наприклад, щонайменше, на 98 95, або наприклад щонайменше, на 99 95. Як правило, крім СОКЗ важкого ланцюга, людське антитіло, отримане з конкретної людської зародкової послідовності, буде демонструвати не більше ніж 20 амінокислотних відмінностей, наприклад, не більш ніж 10 амінокислотних відмінностей, як наприклад, не більше ніж 9, 8, 7, 6 або 5, наприклад, не більше ніж 4, 3, 2, або 1 амінокислотна відмінність від амінокислотної послідовності, яка кодується зародковим імуноглобуліновим геном.
У кращому втіленні, антитіло запропоноване винаходом є виділеним. В контексті даного документа, передбачається, що "виділеним антитілом" називають антитіло, яке власне є вільним від інших антитіл, які мають відмінні антигенні специфічності (наприклад, виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з с-Меї, власне є вільним від антитіл, які специфічно зв'язуються з антигенами, відмінними від с-Ме). Виділене антитіло, яке специфічно зв'язується з епітопом, ізофорфою або варіантом людського с-Меї, може, однак, мати перехресну реактивність із іншими спорідненими антигенами, наприклад з інших видів (наприклад, з міжвидовими гомологами с-Мей). Крім того, виділене антитіло може бути фактично вільним від іншого клітинного матеріалу й/або хімічних речовин. В одному втіленні даного винаходу два або декілька "виділених" моноклональних антитіл, які мають різні антигензв'язуючі специфічності, поєднуються в добре охарактеризовану композицію.
Термін "конкурує з" або "перехресно конкурує з", як він використовується в даному документі 60 в контексті двох або декількох антитіл, означає, що два або кілька антитіл конкурують за зв'язування з с-Меї, наприклад, конкурують за зв'язування з с-Меї в аналізі, описаному в прикладах даного документа. Для деяких пар антитіл конкуренція при аналізі в прикладах спостерігається лише тоді, коли антитіло нанесене у вигляді покриття на чашку, а інше антитіло використовується для конкуренції, а не навпаки. Також передбачається, що термін "конкурує з", як він використовується в даному документі, охоплює такі комбінації антитіл.
Терміном "епітоп" позначають білкову детермінанту, яка здатна специфічно зв'язуватися з антитілом. Епітопи, як правило, містять поверхневі угруповання молекул, таких як амінокислоти або цукрові бічні ланцюги й, як правило, мають специфічні тривимірні структурні характеристики, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні й неконформаційні епітопи відрізняються тим, що зв'язування з першими, але не другими, порушується в присутності денатуруючих розчинників. Епітоп може включати амінокислотні залишки, безпосередньо задіяні у процесі зв'язування (які також називаються імунодомінантними компонентами епітопа), та інші амінокислотні залишки, задіяні у процесі зв'язування, такі як амінокислотні залишки, які ефективно блокуються специфічним антигензв'язуючим пептидом (інакше кажучи, амінокислотний залишок перебуває усередині футпринта специфічного антигензв'язуючого пептиду).
Термін "моноклональне антитіло", як він використовується в даному документі, відноситься до препарату молекул антитіла однієї молекулярної композиції. Композиція моноклонального антитіла демонструє унікальну специфічність зв'язування й афінність до конкретного епітопу.
Відповідно, терміном "людське моноклональне антитіло" позначені антитіла, які демонструють унікальну специфічність зв'язування, і які містять варіабельні й константні області, виділені з людських зародкових послідовностей імуноглобулінів. Людські моноклональні антитіла можуть бути отримані за допомогою гібридоми, яка є злитою з іморталізованою клітиною В-клітиною, отриманою із трансгенної або трансхромосомної тварини, відмінної від людини, такої як трансгенна миша, яка має геном, що включає трансген важкого ланцюга людини й трансген легкого ланцюга людини.
Термін "зв'язування", як він використовується в даному документі, у контексті зв'язування антитіла з конкретним антигеном з афінністю зв'язування, яка відповідає КО близько 10-77 М або менше, як наприклад, близько 108 М або менше, як наприклад, близько 107 М або менше,
Ко) близько 1079 М або менше, або близько 107! М або ще менше, відповідно до визначення, за допомогою, наприклад технології поверхневого плазмонного резонансу (5РЕ) у приладі "Віасоге 3000" з використанням як ліганда антигену й антитіла як аналіта, яке зв'язується з конкретним антигеном з афінністю, яка відповідає КО, яка, щонайменше, вдесятеро нижче, наприклад, в 100 раз нижче, наприклад, щонайменше, в 1000 раз нижче, наприклад, щонайменше, в 10000 раз нижче, наприклад, щонайменше, в 100000 раз нижче, ніж афінність зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад, БСА, казеїн), відмінним від конкретного антигену або близькоспорідненого антигену. Значення, на яке знижується афінність, залежить від КО антитіла, так що коли КО антитіла є дуже низьким (тобто, антитіло є високоспецифічним), те значення, на яке афінність до антигену є нижчою, ніж афінність для неспецифічного антигену, може бути, щонайменше, десятикратним.
Термін "Ка" (сек"), як він використовується в даному документі, позначає константу ступеня дисоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло. Вказане значення також позначається у вигляді Кон.
Термін "Ка (М" х сек"), як він використовується в даному документі, позначає константу ступеня асоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло.
Термін "Ко" (М), як він використовується в даному документі, позначає константу рівноважної дисоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло.
Термін "Ка (М"7), як він використовується в даному документі, позначає константу рівноважної асоціації конкретної взаємодії антиген-антитіло, яку одержують ділячи Ка на Ка.
Термін "інгібує ріст", як він використовується в даному документі, передбачає, що (наприклад, у відношенні до таких клітин, як пухлинні клітини) відбувається будь-яке вимірюване зменшення клітинного росту при контакті з антитілом, яке зв'язує с-Меї, у порівнянні з ростом тих же клітин, які не контактували з антитілом, яке зв'язує с-Меї, наприклад, інгібування росту клітинної культури, щонайменше, на величину близько 10 95, 20 95, ЗО Ор, 40 96, 50 95, 60 Зо, 70 95, 80 95, 90 9, 99 95, або 100 95. Таке зменшення клітинного росту може відбуватися за допомогою різних механізмів, наприклад, за допомогою фагоцитозу ефекторних клітин, АОСС, СОС, і/або апоптозу.
Даний винахід також пропонує антитіла, які включають функціональні варіанти області Мі, області Мн, чи одного або декількох СОК антитіл із прикладів. Функціональний варіант Мі, Мн, бо або СОК, які використовується у контексті антитіла проти с-Меї, дає можливість антитілу зберегти, щонайменше, істотну частину (щонайменше, близько 50 95, 60 бо, 70 о, 80 95, 90 Об, 95 95 або більше) афінності/авідності й/або специфічності/селективності батьківського антитіла й у деяких випадках таке антитіло проти с-Меї може бути асоційоване з більшою афінністю, селективністю і/або специфічністю, у порівнянні з батьківським антитілом.
Такі функціональні варіанти, як правило, зберігають істотну ідентичність послідовності щодо батьківського антитіла. Відсоток ідентичності між двома послідовностями є функцією числа ідентичних позицій у послідовностях (тобто 95 гомології - числу ідентичних позицій/загальне число позицій х100), беручи до уваги число пробілів і довжину кожного пробілу, які повинні вноситися для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток ідентичності між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями, може бути визначений, наприклад, за допомогою алгоритму Е. Меуег5 апа У. МіПег, Сотриї. Аррі. Віозсі 4, 11-17 (1988), який включений у програму "АГІСМ" (версія 2.0) з використанням таблиці мас залишків РАМ120, зі штрафом за подовження пробілу, який дорівнює 12, і штрафом за внесення пробілу, який дорівнює 4. Крім того, відсоток ідентичності між двома амінокислотними послідовностями може бути визначений за допомогою алгоритму Нідлмана й Вунша, -). Мої. Віо!. 48, 444-453 (1970).
Послідовність варіантів СОК може відрізнятися від послідовності СОК послідовностей батьківських антитіл консервативними замінами; наприклад, щонайменше, 10, наприклад, щонайменше, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 або 1 із замін у варіанті є консервативними замінами амінокислотних залишків.
У контексті даного винаходу, консервативні заміни можуть визначатися за допомогою замін усередині класів амінокислот, відображених у наступній таблиці:
Класи амінокислотних залишків для консервативних замін
Азр (0) і Сім (Е)
Гуз (К)., Аго (В), і Ні (Н)
Зег (5), Тпг (Т), Авп (М), і Сіп (С)
Су (С), Ага (А), Ма! (У), Сем (3, і Ме ()
Суз (С), Ме! (М), і Рго (Р)
Рпе (Р), Туг (0, і Ттр (М)
Передбачається що, термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або просто "клітина-хазяїн"), як він використовується в даному документі, позначає клітину, до якої вводиться експресуючий вектор, наприклад, експресуючий вектор, який кодує антитіло запропоноване винаходом.
Рекомбінантні клітини-хазяїни включають, наприклад, трансфектоми, такі як клітини СНО, клітини НЕК293, клітини М5/О і лімфоцитарні клітини.
Терміном "трансгенна тварина, відмінна від людини" позначено тварину, відмінну від людини, яка має геном, який включає один або декілька трансгенів важкого й/або легкого ланцюга людини або, що включає трансхромосоми (як інтегровані, так і не інтегровані в природну геномну ДНК тварини), і який здатний експресувати повністю людські антитіла.
Наприклад, трансгенна миша може мати трансген людського легкого ланцюга й або трансген людського важкого ланцюга, або трансхромосому людського важкого ланцюга, таким чином миша продукує людські антитіла проти с-Меї, при імунізації антигеном с-Меї і/або клітинами, які експресують с-Меї. Трансген людського важкого ланцюга може бути інтегрований у хромосомну
ДНК миші, як у випадку трансгенних мишей, наприклад, мишей НимМмаб, наприклад, мишей НСо7 або мишей НСоЇ2, або трансген людського важкого ланцюга може підтримуватися позахромосомно, як у випадку трансхромосомних мишей КМ, як описано в УМО02/43478. Подібні миші, які мають великий набір людських генів АТ, включають НСо?7 і НСо20 (див., наприклад,
МО2009097006). Такі трансгенні й трансхромосомні миші (які разом називаються в даному документі "трансеенними мишами") здатні продукувати багато ізотипів людських моноклональних антитіл до даного антигену (таких як ІдсС, ДА, ІМ, дО і/або ІЗЕ), при рекомбінації М-0-.) і перемиканні ізотипів. Трансгенна тварина, відмінна від людини, також може використовуватися для продукування антитіл проти специфічного антигену шляхом уведення генів, які кодують специфічне антитіло, наприклад, шляхом функціонального зв'язування генів з геном, який експресується в молоці тварини. "Лікування" означає введення ефективної кількості терапевтично активної сполуки запропонованої даним винаходом з метою полегшення, поліпшення, купірування або усунення (лікування) симптомів хворобливих станів. "Ефективна кількість" означає кількість, яка є ефективною при даному дозуванні і протягом таких періодів часу, які є необхідними для досягнення цільового терапевтичного результату.
Терапевтично ефективна кількість антитіла проти с-Меї, може змінюватись відповідно до таких факторів, як перебіг захворювання, вік, стать й маса індивідуума, а також здатність антитіла проти с-Меї, викликати цільову відповідь в індивідуума. Терапевтично ефективна кількість також є такою кількістю, у якій терапевтично корисні ефекти перевищують будь-які токсичні або шкідливі ефекти антитіла або частини антитіла. "Ідіотипове" антитіло є антитілом, яке розпізнає унікальні детермінанти, як правило, асоційовані з антигензв'язуючим сайтом антитіла.
Додаткові аспекти й втілення винаходу
Як описано вище в першому аспекті, винахід відноситься до моноклонального людського антитіла, яке зв'язує людський с-Меї.
Моноклональні антитіла запропоновані даним винаходом можуть бути отримані гібридомним методом, уперше описаним КопПіег еї аї., Маїшге 256, 495 (1975), або можуть бути отримані з використання методів рекомбінантної ДНК. Моноклональні антитіла також можуть бути виділені з фагової бібліотеки антитіл за допомогою методів, описаних наприклад, в Сіаскхоп еї аї, Маїиге 352: 624-628 (1991) і в Магкз5 еї аї, У. Мої. ВіоїІ. 222, 581-597 (1991). Моноклональні антитіла можуть бути отримані з будь-якого придатного джерела. Таким чином, моноклональні антитіла можуть бути отримані з гібридом, приготовлених з мишачих В-клітин селезінки, отриманих з мишей, імунізованих з використанням антигену, який представляє інтерес, наприклад, у формі клітин, які експресують на своїй поверхні антиген, або у формі нуклеїнової кислоти, яка кодує антиген, який представляє інтерес. Моноклональні антитіла також можуть бути отримані з гібридом, виділених з клітин здатних експресувати антитіло, імунізованих людей або ссавців, відмінних від людини, таких як пацюки, собаки, примати тощо.
В одному втіленні, антитіло запропоноване винаходом є людським антитілом. Людські моноклональні антитіла, спрямовані проти с-Меї, можуть бути отримані з використанням трансгенних або трансхромосомних мишей, які мають більшу частку людської імунної системи, а не мишачої. Такі трансгенні й трансхромосомні миші включають мишей, позначених у даному документі як миші НиМаб і миші КМ, відповідно, і разом позначаються в даному документі як "трансгенні миші".
Миша НиМмаБ містить мінілокус людських імуноглобулінових генів, який кодує послідовності важкого ланцюга (н і у) і легкого ланцюга до імуноглобулінів, разом зі спрямованими мутаціями,
Зо які інактивують ендогенні локуси ланцюгів н і к (Гопрегд, М. еї аїЇ., Маїшге 368, 856-859 (1994)).
Відповідно, миші демонструють знижену експресію мишачого ДМ або к і, у відповідь на імунізацію, уведені людські трансгени важкого й легкого ланцюга зазнають перемикання класу й соматичних мутацій з утворенням високоафінних людських моноклональних антитіл ІДС, Кк (Гопрего, М. еї аї. (1994), вище; огляд в І опрегд, М. Напароок ої Ехрегітепіа! Рпаптасо!іоду 113, 49-101 (1994), І опрего, М. апа Низлаг, 0., Іптегп. Нем. Іттипої. Мої. 13 65-93 (1995) і Нагаїпо, Р. апа Гопрега, М. Апп. М.М. Асад. сі 764 536-546 (1995)). Одержання мишей НиМаб докладно описане в Тауїог, Ї. еї аї., Мисієїс Асідбє ВНезєагсп 20, 6287-6295 (1992), Спеп, у. еї аї.,
Іптегпайопа! Іттипоіоду 5, 647-656 (1993), Тоайоп еї аї., 9. Іттипої. 152, 2912-2920 (1994),
Таупог, Ї.. єї а!., Іптетаїйопаї! Іттипоіоду 6, 579-591 (1994), Рівпм/а, 0. еї а!., Маїиге ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996). Див., також 05 5545806, 05 5569825, 5 5625126, 005 5633425, 05 5789650, 55877397, 05 5661016, 5 5814318, 005 5874299, 005 5770429, 05 5545807, МО 98/24884, МО 94/25585, МО 93/1227, МО 92/22645, УМО 92/03918 ії УМО 01/09187.
Миші НСо7 мають порушення УКО у своїх ендогенних генах легкого ланцюга (каппа) (як описано в Спеп еї аїЇ., ЕМВО 4). 12, 821-830 (1993)), ї порушення СМО у своїх ендогенних генах важкого ланцюга (як описано в прикладі 1 МО 01/14424), трансген КСо5 людського легкого ланцюга каппа (як описано в Ріб5пм/їйа еї аї., Маїиге ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996)), і трансген
НСо7 людського важкого ланцюга (як описано в 05 5770429).
Миші НСо12 мають порушення УКО у своїх ендогенних генах легкого ланцюга (каппа) (як описано в Спеп еї аї!., ЕМВО .). 12, 821-830 (1993)), і порушення СМО у своїх ендогенних генах важкого ланцюга (як описано в прикладі 1 МО 01/14424), трансген КСо5 людського легкого ланцюга каппа (як описано в Рі5пм/їйа еї аї., Маїиге ВіоїесппоЇоду 14, 845-851 (1996)), і трансген
НСоО12 людського важкого ланцюга (як описано в прикладі 2 МО 01/14424).
У лінії мишей КМ гомозиготно порушений ендогенний мишачий ген легкого ланцюга каппа, як описано в Спеп еї аі,, ЕМВО 3. 12, 811-820 (1993), а також гомозиготно порушений ендогенний мишачий ген важкого ланцюга, як описано в прикладі 1 УМЛО 01/09187. Дана лінія мишей несе трансген людського легкого ланцюга каппа, КСо5, як описано в Різпм/йа еї аї.,
Маїйге Віоїесппоіоду 14, 845-851 (1996). Дана лінія мишей також несе трансхромосому людського важкого ланцюга, яка складається із фрагмента ПСЕ (5020) хромосоми 14, як описано в УМО 02/43478. бо Спленоцити із цих трансгенних мишей можна використовувати для одержання гібридом, які секретують людські моноклональні антитіла, згідно з відомими методами.
Крім того, людські антитіла запропоновані даним винаходом або антитіла інших видів запропоновані даним винаходом можуть бути ідентифіковані за допомогою методів дисплейного типу, які включають зокрема фаговий дисплей, ретровірусний дисплей, рибосомний дисплей та інші методи, добре відомі у даній галузі, а отримані в результаті молекули можуть бути піддані додатковому дозріванню, такому як дозрівання афінності, як методу, добре відомому в даній галузі (див., наприклад, Ноодепроот еї аї., У. Мої. Віої. 227, 381 (1991) (фаговий дисплей), Мацудпап еї аї., Маїшге Віоїесп 14, 309 (1996) (фаговий дисплей),
Напез апа Рішсітау, РМАБ ОБА 94, 4937-4942 (1997) (рибосомний дисплей), Раптіеу апа Зтій,
Сепе 73, 305-318 (1988) (фаговий дисплей), Зсой ТІВЗ 17, 241-245 (1992), См/іпа єї аі., РМА5
ИБА 87, 6378-6382 (1990), Визз5еї єї аї., Мисі. Асіає Везвагсі 21, 1081-1085 (1993), Нодепроот єї а!І., Іттипої. Вемієм5 130, 43-68 (1992), СпівмеїЇ апа Мссапепу ТІВТЕСН 10, 80-84 (1992), і 5 5733743). Якщо для одержання антитіл, які не є людськими, застосовуються технології дисплея, то такі антитіла можуть бути гуманізовані.
В одному втіленні, антитіло запропоноване винаходом відноситься до ізотипу ІдО1, Ідс2,
ІЧО3, Ідс4, ІдО, ІдА, ІЧЗЕ, або ІдмМ.
У першому основному втіленні антитіла запропонованого винаходом, антитіло конкурує за зв'язування з розчинним СМегєСОНІ» з іммобілізованим антитілом, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:33, і область МІ, яка включає послідовність ЗЕО І МО:37 (024), де антитіло, бажано, конкурує більше ніж за 50 95, наприклад, більше ніж за 75 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного у прикладі 17.
У наступному втіленні, антитіло не конкурує за зв'язування з розчинним сМегЕСОНІів з антитілом, обраним із групи, яка складається з: а) іммобілізованого антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ
МО:1, й яке містить область МІ, яка включає послідовність ХЕО ІЮ МО:5 (005) р) іммобілізованого антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ
МО:17, й яке містить область МІ,, яка включає послідовність зХЕО ІЮ МО:21 (008) с) іммобілізованого антитіла, яке містить область МН і область Мі антитіла 505, і а) іммобілізованого антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО І
Ко) МО:49, й яке містить область МІі.,, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:53 (045), де, бажано, антитіло конкурує менше ніж на 2595, наприклад, менше ніж на 20 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначень, даних в прикладі 17.
У наступному втіленні, антитіло зв'язується з тим же епітопом, що й антитіло, обране із групи, яка складається з: а) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність «ЕО ІЮ МО:33, й яке містить область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:37 (024) р) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність зХЕО ІЮ МО:65, й яке містить область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:69 (061) с) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІО МО:73, й яке містить область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:77 (062) а) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:81, й яке містить область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:85 (064) е) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:89, й яке містить область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:93 (068)
І) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:97, й яке містить область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:101 (069) 9) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:113, й яке містить область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:117 (098)
Р) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:121, й яке містить
БО область МІ, яка включає послідовність 5ЕО 1ІЮ МО: 125 (101) і ї) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:129, й яке містить область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:133 (181).
У наступному втіленні антитіло містить область МН, яка містить послідовність СОКЗ, представлену в а) ЗЕО І МО:З36 (024)
Б) ЗЕО ІО МО:193, як наприклад, область СОКЗ із МН, представлену в 5ЕО ІЮ МО:68, 76, 84 або 92 (061, 062, 064, 068) с) 5ЕО ІЮ МО:196, як наприклад, область СОКЗ із МН, представлену в 5ЕО ІЮ МО:100 або 132 (069, 181) бо а) 5ЕО ІЮ МО:116 (098), або е) 5ЕО ІО МО:201, як наприклад, область СОКЗ із МН, представлену в 5ЕО ІЮ МО:124 (101).У наступному втіленні антитіло містить: а) область УН, яка включає послідовності СОМКТ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:34, 185 і 36, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, 5ЕО ІЮ МО:38, 39 і 206, як наприклад, антитіло, яке містить область МН, яка включає послідовності 5ЕО ІО МО:34, 35 і 36, і область МІ, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, БЕО ІЮ МО:38, 39 і 40, (024) р) область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, БЕО ІЮ МО:191, 192 ії 193, і область
МІ, яка включає послідовності СОКТІ, 2 і 3, 5ЕО ІЮО МО:78, 79 і 208, як наприклад, антитіло, яке включає а) область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:66, 67 і 68, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ1, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:70, 71 і 72, (061) р) область МН, яка включає послідовності СОКТІ, 2 і 3, 5ЕО ІЮО МО:74, 75 і 76, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:78, 79 і 80, (062) с) область МН, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, 5ЕО ІЮО МО:82, 83 і 84, і область МІ, яка включає послідовності СОКІЛ, 2 і 3, БЕО ІЮ МО:86, 87 і 88, (064) а) область МН, яка включає послідовності СОМ, 2 і 3, 5ЕО ІЮ МО:90, 91 і 92, і область МІ, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, БЕО ІО МО:94, 95 і 96, (068) с) область МН, яка включає послідовності СОМ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:194, 195 і 196, і область
МІ, яка включає послідовності СОК'І, 2 ї 3, БЕО ІЮО МО:209, 210 ї 104, як наприклад, антитіло, яке містить а) область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, ЗЕО ІО МО:98, 99 і 100, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:102, 103 і 104, (069), або р) область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:130, 131 і 132, і область
МІ, яка включає послідовності СОКІ1, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:134, 135 і 136, (181) а) область МН, яка включає послідовності СОКІ1, 2 і 3, 5ЕО ІЮ МО:197, 198 і 116, і область
МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 ї 3, БЕО ІЮО МО:118, 119 ї 211, як наприклад, антитіло, яке містить область МН, яка включає послідовності СОБІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮО МО:114, 115 і 116, їі область МІ, яка містить послідовності СОКІЛ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:117, 118 і 120, (098) або е) область МН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3 ЗЕО ІЮ МО: 199, 200 їі 201 і область
Ко) МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3 5ЕО ІЮО МО: 126, 212 ї 128, як наприклад, антитіло, яке містить область УН, яка включає послідовності СОБІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮО МО: 122, 123 і 124 і область МІ, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, БЕО ІО МО:126, 127 і 128 (101).
У наступному втіленні антитіло містить: а) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІО МО:33, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:37 (024) р) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:61, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:69 (061) с) область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:73, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:77 (062) а) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІО МО:81, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність «ЕО ІЮ МО:85 (064) е) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІО МО:89, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:93 (068)
І) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:97, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:101 (069) 9) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:113, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:117 (098)
Р) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:121, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5260 ІЮ МО:125 (101)
БО ї) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:129, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:133 (181)
Ї) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:159 і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:160 (078) кю) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:161, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:162 (084) ї) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:163, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:164 (063) т) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:165, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5260 ІЮ МО:166 (087) 60 п) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:137, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5260 ІЮ МО:138 (066) о) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:139, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5260 ІЮ МО:140 (065) р) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:141, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:142 (082) 4) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:143, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:144 (089), або г) варіант кожного із зазначених антитіл, де зазначений варіант бажано містить щонайбільше 1, 2 або З амінокислотних модифікації, краще, амінокислотні заміни, наприклад, консервативні амінокислотні заміни в зазначених послідовностях.
В одному втіленні антитіло містить область МН, яка включає СОКЗ-послідовність ЗЕО ІЮ
МО:100, і область МІ, яка включає СОКЗ-послідовність зЗЕО ІЮ МО:104 (069).
В одному втіленні антитіло містить область МН, яка включає послідовності СОК'І, 2 і 3, ЗЕО
ІО МО:98, 99 ії 100, і область МІ, яка включає послідовності СОБІ, 2і 3, 5ЕО ІЮ МО:102, 103 і 104, (069).
В одному втіленні антитіло містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:97, і область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:101 (069).
В іншому основному втіленні антитіло запропоноване винаходом: - конкурує за зв'язування з розчинним сМегЕСОНІі5 з іммобілізованим антитілом, де зазначене іммобілізоване антитіло містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮО МО:9, і область МІ, яка включає послідовність 5ЕСО ІЮ МО:13 (006), бажано, де антитіло конкурує більше ніж на 50 95, наприклад, більше ніж на 75 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного у прикладі 17, і - не конкурує за зв'язування з розчинним СМесЕСОНІ5 з іммобілізованим антитілом, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:49, і область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:53 (045), бажано, де антитіло конкурує менше ніж на 50 95, наприклад, менше ніж на 25 95, наприклад, менше ніж на 20 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного у прикладі 17, і - зв'язує домен ЗЕМА із -Меї, бажано, де антитіло здатне інгібувати зв'язування НОЕ з доменом ЗЕМА з ІСзо, що становить менше ніж 10 мкг/мл, наприклад, менше ніж 2 мкг/мл, як описано в прикладі 9.
У наступному втіленні, антитіло не конкурує за зв'язування з розчинним сМегЕСОНІів з іммобілізованим антитілом, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:33, і область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:37 (024), бажано, де антитіло конкурує менше ніж на 25 95, наприклад, менше ніж на 20 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного у прикладі 17.
У наступному втіленні, антитіло зв'язується з тим же епітопом, що й антитіло, обране із групи, яка складається з: а) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО-1, і область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:5 (005) р) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІО МО:9, і область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:13 (006) с) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІО МО:25, і область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:29 (022), і а) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:57, і область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:61 (058).
У наступному втіленні, антитіло містить область МН, яка включає послідовність СОМКЗ, представлену в а) ЗЕО ІЮО МО:181, як наприклад, область СОКЗ із УН, представлену в 5ЕО ІЮ МО:4 або 12 (005, 006)
Б) 5ЕО ІЮ МО:28 (022), або с) ЗЕО ІЮ МО:60 (058).
У наступному втіленні антитіло містить: а) область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, БЕО ІЮО МО:179, 180 і 181, і область
МІ, яка включає послідовності СОКІ1, 2 і 3, ЗЕО ІО МО:6, 7 і 202, як наприклад, антитіло, яке містить а. область УН, яка включає послідовності СОРК1, 2і 3, 5ЕО ІЮО МО:3, 4 і 3, і область МІ, яка 60 включає послідовності СОКІ, 2 і 3, БЕО ІО МО:6, 7 і 8, (005), або р. область УН, яка включає послідовності СОРІ1, 2 і 3, 5ЕО ІЮО МО:10, 11 ії 12, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ1, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:14, 15 і 16, (006) р) область УН, яка включає послідовності СОМ, 2 і 3, БЕО ІЮ МО:26, 184 і 28, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 і 3, ЗЕО ІЮО МО:30, 31 їі 205, як наприклад, антитіло, яке містить область УН, яка включає послідовності СОР1, 2 і 3, ЗЕО ІЮО МО:26, 27 і 28, і область МІ, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:30, 31 і 32 (62), або с) область УН, яка включає послідовності СОКТІ, 2 і 3, БЕО ІЮО МО: 189, 190 і 60, і область МІ, яка включає послідовності СОК'1, 2 і 3, БЕО ІЮ МО: 62, 63 і 207, наприклад, антитіло, яке містить область МН, яка включає послідовності СОМ, 2 і 3, ЗЕО ІО МО:58, 59 і 60, і область МІ, яка включає послідовності СОКТІ, 2 ії 3, БЕО ІЮ МО:62, 63 і 64 (058).
У наступному втіленні, антитіло містить: а) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:1, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність зЕО 1О МО:5 (005) р) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:9, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність хЕО ІЮ МО:13 (006) с) область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:25, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5Е0 ІЮ МО:29 (022) а) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІО МО:57, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:61 (058) е) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮО МО:145, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:146 (031)
І) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:147, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5Е0 ІЮ МО:148 (007) 9) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:149, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:150 (011)
Р) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:151, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5260 ІЮ МО:152 (017) ї) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:153, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:154 (025), або
Ї) варіант кожного із зазначених антитіл, де зазначений варіант містить, щонайбільше, 1, 2 або З амінокислотних модифікації, краще, амінокислотні заміни, наприклад, консервативні амінокислотні заміни в зазначених послідовностях.
В іншому основному втіленні антитіло запропоноване винаходом: - конкурує за зв'язування з розчинним сМегЕСОНІі5 з іммобілізованим антитілом, де зазначене іммобілізоване антитіло містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ
МО:49, і область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:53 (045), бажано, де антитіло конкурує більше ніж на 50 95, наприклад, більше ніж на 75 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного у прикладі 17, і - антитіло не конкурує за зв'язування з розчинним сСМесЕСОНІ» з іммобілізованим антитілом, де зазначене іммобілізоване антитіло містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ
МО:9, і область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:13 (006), бажано, де антитіло конкурує менше ніж на 25 95, як наприклад, менше ніж на 20 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного у прикладі 17.
У наступному втіленні антитіло не конкурує за зв'язування з розчинним сМегЕєСОНІв з антитілом, обраним із групи, яка складається 3: а) іммобілізованого антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ
МО:17, і область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:21 (008), і р) іммобілізованого антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ
БО МО:33, і область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:37 (024), бажано, де антитіло конкурує менше ніж на 2595, наприклад, менше ніж на 20 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, відповідно до визначення, даного в прикладі 17.
У наступному втіленні антитіло зв'язується з тим же епітопом, що і антитіло, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО І МО:49, та містить область МІ, яка включає послідовність «60 ІЮ МО:53 (045).
У наступному втіленні, антитіло містить область МН, яка включає послідовність СОКЗ, представлену в ЗЕО ІЮ МО:188, наприклад, область СОКЗ із МН, представлену в 5ЕО ІЮ МО:52 (045).
У наступному втіленні антитіло містить область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і З, 60 ЗЕО ІЮ МО:186, 187 і 188, і область МІ, яка включає послідовності СОКІ, 2 і З БЕО ІЮО МО:54, 55 і 56, наприклад, антитіло, яке містить область УН, яка включає послідовності СОР, 2 і З БЕО ІЮ
МО:50, 51 і 52, і область МІ, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:54, 55 і 56, (045).
У наступному втіленні антитіло містить: а) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮО МО 49, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність хЕО ІЮ МО:53 (045)
Б) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:155, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:156 (040) с) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:157, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:158 (039), або
Я) варіант кожного із зазначених антитіл, де зазначений варіант, бажано, містить, щонайбільше, 1, 2 або 3 амінокислотних модифікації, краще, амінокислотних заміни, таких як консервативні амінокислотні заміни в зазначених послідовностях.
У наступному втіленні антитіло зв'язується з доменом ЗЕМА із с-Меї, бажано, якщо антитіло здатне інгібувати зв'язування НОЕ з доменом ЗЕМА з ІСхо, що становить менше ніж 10 мкг/мл, наприклад, менше ніж 2 мкг/мл, як описано в прикладі 9.
В іншому основному втіленні антитіла запропонованого винаходом, антитіло зв'язує той же епітоп, що й антитіло, яке містить область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:17, і область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:21 (008) або зв'язує той же епітоп, що й антитіло, яке містить область УН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:41, і область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:45 (035), або зв'язує той же епітоп, що й антитіло, яке містить область УН, яка включає послідовність ЖЕО ІЮ МО:105, і область МІ, яка включає послідовність
ЗЕО ІЮ МО:109 (096).
У наступному втіленні антитіло містить область МН, яка включає послідовність СОКЗ, представлену в 5ЕО ІЮ МО:183, наприклад, область СОКЗ із МН, представлену в 5ЕО ІЮ МО:20, 44 або 108 (008, 035, 096).
У наступному втіленні антитіло містить область УН, яка включає послідовності СОКІ, 2 і З,
ЗЕО ІЮ МО:18, 182 і 183, і область МІ, яка включає послідовності СОР, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:22, 203 і 204, наприклад, антитіло, яке містить а) область УН, яка включає послідовності СОКІ1, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:18, 19 і 20, і область МІ,
Ко) яка включає послідовності СОКТІ, 2 і 3, БЕО ІЮ МО:22, 23 і 24, (008), р) область МН, яка включає послідовності СОКТІ, 2 і 3, 5ЕО ІЮО МО:42, 43 і 44, і область МІ, яка включає послідовності СОКТІ, 2 і 3, БЕО ІЮ МО :46, 47 і 48, (035), с) область МН, яка включає послідовності СОМ, 2 і 3, ЗЕО ІЮ МО:106, 107 і 108, і область
МІ, яка включає послідовності СОКТ, 2 і 3, БЕО ІЮО МО:110, 111 ї 112, (096).
В іншому втіленні антитіло містить: а) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮО МО:17, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:21 (008) р) область МН, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:41, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:45 (035) с) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:105, і, бажано, область Мі, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:109 (096) або
Я) варіант кожного із зазначених антитіл, де зазначений варіант, бажано, містить, щонайбільше, 1, 2 або 3 амінокислотних модифікації, краще, амінокислотних заміни, таких як консервативні амінокислотні заміни в зазначених послідовностях.
У наступному втіленні, антитіло зв'язується із клітинами А431 із ЕСхо, що становить 10 нм або менше, як наприклад, з ЕСзхо рівної 2 нМ або менше, бажано, як визначено відповідно до прикладу 13.
У наступному втіленні, антитіло зв'язується з с-Меї з константою афінності (КО), яка
БО становить 20 нМ або менше, наприклад, 5 нМ або менше, бажано, як визначено відповідно до приклада 14.
У наступному втіленні, антитіло зв'язується з с-Меї макаки-резус, бажано, якщо сигнал зв'язування антитіла з с-Меї макаки-резус, щонайменше, в 5 разів перевищує сигнал для антитіла негативного контролю, як визначено відповідно до приклада 15.
У наступному втіленні, антитіло інгібує зв'язування НОЕ з позаклітинним доменом с-Меї, бажано, якщо антитіло інгібує зв'язування більше ніж на 40 95, наприклад, більше ніж на 50 95, наприклад, більше ніж на 60 95, наприклад, більше ніж на 70 95, наприклад, більше ніж на 80 95, наприклад, більше ніж на 90 95, як визначено відповідно до приклада 16.
Ще в одному втіленні, антитіло здатне інгібувати життєздатність клітин КР4, бажано, якщо 60 антитіло здатне інгібувати життєздатність більше ніж на 10 95, наприклад, більше ніж на 25 95,
наприклад, більше ніж на 40 95, бажано, як описано в прикладі 19.
Формати антитіл
У даному винаході пропонуються антагоністичні й неантагоністичні антитіла, які зв'язують с-
Меї. Оскільки деякі антитіла діють антагоністично на клітини-мішені незалежно від того, є вони моновалентними або бівалентними, для інших антитіл при цьому функціональний ефект залежить від валентності. Як презентовано в прикладі 19 у даному документі, антитіла 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101, 181 (які всі перебувають в одній і тій же групі перехресного блокування, див. приклад 17), наприклад, демонструють антагоністичні властивості в аналізі життєздатності клітин КРА4 незалежно від їхнього формату. Антитіла 022 і 058, з іншого боку, поводяться антагоністично в даному аналізі в моновалентному форматі, але агоністично (або, щонайменше, не антагоністично) у бівалентному форматі. Таким чином, залежно від потрібних функціональних властивостей для конкретного використання, конкретні антитіла можуть бути обрані із набору антитіл, запропонованих у даному винаході й/або їх формат може бути адаптований шляхом зміни валентності.
Більше того, антитіло запропоноване винаходом може бути антитілом будь-якого ізотипу.
При виборі ізотипу, як правило, будуть керуватися потрібними ефекторними функціями, такими як індукція АОСС. Прикладами ізотипів є Їдс1, Ідс2, ІдОЗ і Ідс4. Може бути використаною одна із двох константних областей людського легкого ланцюга, каппа або лямда. За необхідності клас антитіла проти с-Меї даного винаходу може бути змінений відомими способами.
Наприклад, антитіло даного винаходу, яке початково було (ЯМ, може бути змінене на клас антитіла (ДС даного винаходу. Крім того, методи зміни класу можуть бути використані для конвертації одного підкласу дос в іншій, наприклад, з ЇДС1 на ІдсС2. Таким чином, ефекторні функції антитіл даного винаходу можуть бути змінені при зміні ізотипу, наприклад, на антитіло
І9С1, Ідс2, ІдСЗ, Ідс4, ІдО, ІдА, ЧЕ або ІдМ для різних терапевтичних застосувань. В одному втіленні антитіло запропоноване даним винаходом є антитілом Ідс1, наприклад, Ідс1,к.
Негативна модуляція, індукована антагоністичними антитілами, є механізмом «дії терапевтичних антитіл проти с-Меї. Відповідно, в одному аспекті винаходу потрібні антитіла зі зниженими агоністичними властивостями, але зі збереженою здатністю індукувати негативну модуляцію с-Меї.
Зо Було виявлено, що за зниженої конформаційної гнучкості антитіл потенційна залишкова агоністична активність бівалентних Ідс1 антитіл мінімізована.
Відповідно, в одному втіленні, антитіло запропоноване винаходом було модифіковано таким чином, щоб зробити його менш гнучким, наприклад, за допомогою мутацій у шарнірній області.
Найбільші конформаційні зміни є результатом гнучкості шарніра, завдяки якій доступним є широкий діапазон кутів Баб-Ес (ОїІтапп Зарнігє, Е., В.Г. еіапієЇїй, М.О.М. Стівріп, Р.М.НІ.
Раїтеп, Р.М. Вида, В.А. Оумек, О.А. Випоп апа І.А. М/іізоп. 2002. Сопігавіїпуд с вігисіигез геуваї ехігете азуттеїгу апа Пехібіїну. у. Мої. Віої. 319: 9-18). Один зі шляхів зменшення гнучкості Рар- плеча в імуноглобулінах полягає в запобіганні утворенню дисульфідних зв'язків між легким і важким ланцюгом за допомогою генетичної модифікації. У природному антитілі ЇДС1 легкий ланцюг з'єднаний з важким ланцюгом ковалентно через дисульфідний зв'язок, який з'єднує С- кінцевий цистеїн легкого ланцюга із цистеїном у позиції 220 (С220 Б) нумерації) у шарнірі Ес важкого ланцюга. Або шляхом мутації амінокислоти С220 на серин або будь-яку іншу природну амінокислоту, або видаленням С220, або шляхом повного видалення шарніра, або шляхом заміни шарніра ІдДс1 на шарнір Ід3, утворюється молекула, у якій легкі ланцюги з'єднані їх С- кінцевими цистеїнуми, аналогічно до ситуації, виявленої в людському ізотипі І(ДА2Іт(1).. Це призводить до зниження гнучкості Раб відносно Ес і, отже, зменшує здатність до перехресного зв'язування, як показано в прикладах.
Інша стратегія зменшення гнучкості молекули ІдДО1 полягає в заміні шарніра Ідс1 на шарнір
Іц9ос2 або до 2-подібний шарнір (Сапої еї а. ЕМВО .-). 1988;7:1989-94). Дана шарнірна область має дві властивості, відмінні від властивостей шарніра Ідс1, які, як вважається, роблять молекулу менш гнучкою. По-перше, у порівнянні із шарніром ІдС1 шарнір ІдсС2 на З амінокислоти коротший. По-друге, шарнір д02 містить додатковий цистеїн, таким чином, утворюється три, замість двох, дисульфідних містки усередині важкого ланцюга. В іншому випадку, може бути введений варіант шарніра Ідс1, який має подібність із шарніром Ідо2. Цей мутант (ТН7Аб-9) (М/О2010063746) містить мутацію Т223С і дві делеції (К222 і 1225) для утворення більш короткого шарніра з додатковим цистеїном.
У наступному втіленні антитіло запропоноване винаходом є підтипом ІдсС1, у якому область шарніра була модифікована шляхом: () видалення шарнірної області з послідовністю ЕРКЗСОКТНТСРРСР та її заміни на бо шарнірну область ІдС2 з послідовністю: ЕЕКССУЕСРРСР (Ід01 Шарнір-Ідаг);
(і) видалення в положенні 220, так щоб модифікована шарнірна область містила послідовність ЕРК5ОКТНТСРРСР (Ід01 АС220); (ії) заміни цистеїну в положенні 220 на будь-яку іншу природну амінокислоту (Х) так, щоб модифікована шарнірна область містила послідовність ЕРКЗОХОКТНТСРРСР (ІдС1 С220Х); (м) видалення шарнірної області з послідовністю ЕРКЗСОКТНТОСРРСР (Опібоду Ідст1); (м) видалення шарнірної області з послідовністю ЕРКЗСОКТНТСРРСР та її заміни на шарнірну область ІдОЗ з послідовністю
ЕГКТРІФОТТНТОРАСРЕРКЗСОТРРРСОРАСРЕРКЗСОТРРРСОРАСРЕРКЗСОТРРРОРАСР
(901 шарнір-Ідое3); або (м) заміни треоніну в положенні 223 на цистеїн і видалення лізину в положенні 222 і треоніну в положенні 225, так щоб модифікована шарнірна область містила послідовність
ЕРКЗСОСНСРРСР (9051 ТН7Дб-9).
В одному втіленні винаходу антитіло запропоноване винаходом має підтип Їдс1, у якому область шарніра була модифікована видаленням в позиції 220 таким чином, щоб модифікована область шарніра мала послідовність ЕРКЗОКТНТСРРСР (Ідо1 АС220) або заміною цистеїну в позиції 220 на будь-яку іншу природну амінокислоту (Х), так щоб модифікована область шарніра мала послідовність ЕРКЗХОКТНТСРРСР (Ідо1 С220Х);
У наступному втіленні антитіло запропоноване винаходом має підтип Ідс1, у якому область шарніра була модифікована заміною цистеїну в позиції 220 на серин, так щоб модифікована область шарніра мала послідовність ЕРКЗ5ОКТНТСРРСР (1901 С2205).
У наступному втіленні антитіло запропоноване винаходом має підтип Ідс2.
У наступному втіленні в антитілі запропонованому винаходом модифіковані цукри для зменшення кількості фукози й, таким чином, для посилення АЮСС, наприклад, шляхом додавання сполук до культурального середовища в ході вироблення антитіл, як описано в 052009317869 або як описано в мап ВегКе! еї а (2010) Віоїесппої. Віоепуд. 105:350 або за допомогою нокаутних за РШТ8 клітин, наприклад, як описано в Матапе-ОНпикі еї а! (2004)
Віотесппої. Віоепд 87:614. В іншому випадку АОСС може бути оптимізованим за допомогою способу, описаного Штапа еї аї!. (1999) Майшге Віоїтесй 17:176.
В одному втіленні антитіло містить область МН, яка включає СОК З-послідовність, зХЕО ІЮ
МО:100, і область МІ, яка включає СОК З-послідовність, 5»ЕО ІЮ МО: 104 (069), підтипу ІДС1, у якому область шарніра була модифікована заміною цистеїну в позиції 220 на серин, так щоб модифікована шарнірна область мала послідовність ЕРКЗБОКТНТСРРСР (Ідс1 С2205).
В одному втіленні антитіло містить область МН, яка включає послідовності СОР, 2 і З ЗЕО
ІО МО:98, 99 і 100 і область МІ., яка включає послідовності СОР1, 2 і З БЕО І МО:102, 103 і 104 (069) підтипу ЇдДс1, у якому область шарніра була модифікована заміною цистеїну в позиції 220 на серин, так щоб модифікована шарнірна область мала послідовність ЕРКЗОЗБОКТНТСРРСР (ат С2205).
В одному втіленні антитіло містить область УН, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:97 і область МІ, яка включає послідовність ЗЕО ІЮ МО:101 (069) підтипу (ДС1, у якому область шарніра була модифікована заміною цистеїну в позиції 220 на серин, так щоб модифікована шарнірна область мала послідовність ЕРКОЗОКТНТСРРОСР (Ідс1 С2205).
У різних публікаціях продемонстрована кореляція між зниженим фукозилюванням кора й підвищеною активністю АЮСС іп міто (ЗНієЇїде ВІ. 2002 УВС; 277:26733-26740, Зпіпкама Т. 2003
УВС; 278(5):3466-3473, Отапа Р. Маї Віотесппої!. 1999 Реб;17(2):176-80).
У наступному втіленні антитіло запропоноване винаходом було модифіковане для зменшення фукозилювання кора нижче 10 95, наприклад, нижче 595, що визначається за допомогою високоефективної аніонообмінної хроматографії разом 3 імпульсним амперометричним детектуванням (НРАЕС-РАЮБ). Дана перевірка може бути здійснена добре відомими із попереднього рівня техніки способами, наприклад, обробкою кіфунензином або одержанням клітин, негативних за ГОТ8.
В іншому втіленні антитіло запропоноване винаходом було сконструйоване для посилення активації комплементу, наприклад, як описано в Маїзите еї аї. (2009) Сапсег Зсі. 100:2411.
В одному втіленні антитіло запропоноване винаходом є повнорозмірним, бажано антитілом
І9О1, зокрема, антитілом ІдсС1,к. В іншому втіленні антитіло запропоноване винаходом є фрагментом антитіла або одноланцюговим антитілом.
Фрагменти антитіл можуть бути отримані, наприклад, фрагментацією звичайними методами, і фрагменти зазнають скринінгу в такий же спосіб, як описано в даному документі для цілих антитіл. Наприклад, фрагменти Е(ар)»2 можуть бути отримані шляхом обробки антитіла пепсином. Отриманий фрагмент Е(аб)2 може бути оброблений для зменшення дисульфідних бо містків для одержання фрагментів Раб'. Фрагменти Бар можуть бути отримані шляхом обробки антитіла дО папаїном; Фрагменти Рабр' можуть бути отримані розщепленням пепсином антитіла
Ідб. Фрагмент Е(аб) також може бути отриманий зв'язуванням Раб, описаним нижче через тіоефірний зв'язок або дисульфідний зв'язок. Фрагмент Рар' є фрагментом антитіла, отриманим розщепленням дисульфідного зв'язку області шарніра Е(ар)». Фрагмент Раб може бути отриманий обробкою фрагмента К(аб)» таким відновлюючим агентом, як дитіотреїтол. Фрагмент антитіла також може бути отриманий експресією нуклеїнових кислот, які кодують такі фрагменти в рекомбінантних клітинах (див., наприклад, Емапз еї аї.,.). Іттипої. Меїйп. 184, 123-38 (1995)).
Наприклад, химерний ген, який кодує частину фрагмента К(аб)2, може включати послідовності
ДНК, які кодують домен СНІ і область шарніра Н-ланцюга, після яких йде кодон зупинки трансляції з одержанням у такий спосіб молекули фрагмента укороченого антитіла.
Як зазначено вище, в одному втіленні антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї є бівалентним антитілом.
В одному втіленні антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї є моновалентним антитілом.
В одному втіленні антитіло запропоноване винаходом є фрагментом Раб або одноплечовим антитілом, таким, як описано в И520080063641 (Сепепіес!) або іншим моновалентним антитілом, наприклад, таким, як описано в М/О2007048037 (Атодеп).
У кращому втіленні, моновалентне антитіло має структуру, описану в М/О2007059782 (Сепітар) (який включений до даного документа як посилання), що має делецію в області шарніра. Відповідно, до одного втілення антитіло є моновалентним антитілом, де зазначене антитіло проти с-Меї сконструйоване способом, який передбачає: ї забезпечення нуклеотидного конструкта, який кодує легкий ланцюг зазначеного моновалентного антитіла, причому зазначений конструкт містить нуклеотидну послідовність, яка кодує область Мі обраного антигенспецифічного антитіла проти с-Меї, і нуклеотидну послідовність, яка кодує константну область (СІ) Ід, де зазначена нуклеотидна послідовність, яка кодує область МІ обраного антигенспецифічного антитіла, і зазначена нуклеотидна послідовність, яка кодує область СІ Ід, функціонально зв'язані одна з одною, і де у випадку підтипу ЇДС1, нуклеотидна послідовність, яка кодує область СІ, була модифікована так, щоб область Сі не містила амінокислот, здатних утворювати дисульфідні зв'язки або ковалентні зв'язки з іншими пептидами, які містять ідентичну області СІ амінокислотну послідовність у присутності поліклонального людського дос або при введенні тварині або людині; і) забезпечення нуклеотидного конструкта, який кодує важкий ланцюг зазначеного моновалентного антитіла, причому зазначений конструкт містить нуклеотидну послідовність, яка кодує область МН обраного антигенспецифічного антитіла, і нуклеотидну послідовність, яка кодує константну область Сн людського Ід, де нуклеотидна послідовність, яка кодує область СН модифікована таким чином, щоб область, яка відповідає шарнірній області й, як вимагає підтип
Ід, інші області СН, такі як область СНЗ, не містила яких-небудь амінокислотних залишків, які приймають участь в утворенні дисульфідних зв'язків або ковалентних або стійких нековалентних міжланцюгових зв'язків важкого ланцюга з іншими пептидами, які містять амінокислотну послідовність ідентичну до константної області Сн людського Ід, у присутності поліклонального людського ІдсС або при введенні в людський організм, де зазначена нуклеотидна послідовність, яка кодує область МН обраного антигенспецифічного антитіла, і зазначена нуклеотидна послідовність, яка кодує область Сн зазначеного Ід, функціонально зв'язані одні з одними; ії) забезпечення клітинної експресивної системи для одержання зазначеного моновалентного антитіла; ім) одержання зазначеного моновалентного антитіла кокоекспресією нуклеотидних конструкцій (Її) і (ії) у клітинах клітинної експресивної системи (її).
Подібним чином, в одному втіленні антитіло проти с-Меї є моновалентним антитілом, яке містить () варіабельну область антитіла винаходу, як описано в даному документі або антигензв'язуючу частину зазначеної області, і (ії) область Сн імуноглобуліну або її фрагмент, який включає ділянки Сна2 і Сн3, де область
Сн або її фрагмент модифіковані так, щоб область, відповідна до шарнірної ділянки, і, якщо імуноглобулін не відноситься до ізотипу Ідо4, інші ділянки Сн, такі як Сн3, не несли ніяких амінокислотних залишків, які б не були здатними утворювати дисульфідні зв'язки з ідентичною ділянкою Сн або не здатні утворювати інші ковалентні або стабільні нековалентні зв'язки між важкими ланцюгами з ідентичною ділянкою Сн у присутності поліклонального людського до.
У наступному втіленні, важкий ланцюг моновалентного антитіла проти с-Меї була бо модифікована таким чином, щоб цільний шарнір був вилучений.
В іншому додатковому втіленні, зазначене моновалентне антитіло є підтипом Ідс4, але область СНЗ була модифікована таким чином, щоб одна або кілька наступних амінокислотних замін були внесені:
Нумерація мутацій СНЗ
КАВАТУ Ес індекс Мутації. ва
ТВ ЕЗ8АУ ЗЗТ'А або ЕЗОТТ або шу аю ЗБУТ 5487 зЗава вабав або еЗБаІК тва Т3Бб6 тА або ТЗебве аю ТЗБебК абе ТЗБЕМ ь39ї зв пЗОВА айо М3Е8У або ЗБЕ або ПЗВ або
Зб або Паб
Я паза пае5ЗА або ПЗ або різ
Е205А або Кл0О5р; або га0БтТ або БаОБ5О або
КЗО5В дбео Б40П50 кА ка або Ба05К дбо К4ОБУ ха 407 тА або 407 ейо 4070 або х307К або ат
Базо ї 438 Бо05 і 407 ЕаО5Т ії У4075) або градБО її УаОоТЕ (3995 1 3070 або (ЗБ 5 У40УК) або спазчО5 ей і У«38 пП335 3 407 і тов "КАВАТ указує на нумерацію амінокислот відповідно до КаБбаї (Кабаї єї аїІ.,, Зедцепсев5 ої
Ргоївіп5 ої Іттипоіодіса! Іпіегеві, Бій Ей. Рибіїс Неайй Зегмісе, Маййопа! Іпвійшев ої Неайй,
Веїпезаа, МО. (1991). ЄЮ індекс указує на нумерацію амінокислот відповідно до ЄЮ індексу як викладено в КаБбаї єї аІ., Зедиепсез ої Ргоївіп5 ої Іттипоїодіса! Іпіегеві, Бій Еа. Рибіїс Неайн
Бегмісе, Маїйопаї! Іпзійшев ої Неани, Веїпезада, МО. (1991)).
У наступному втіленні послідовність зазначеного моновалентного антитіла була модифікована таким чином, щоб воно не містило яких-небудь акцепторних сайтів для М- зв'язаного глікозилювання.
Антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї також включають одноланцюгові антитіла.
Одноланцюгові антитіла є пептидами, у яких області Ем важкого й легкого ланцюгів з'єднані. В одному втіленні в даному винаході пропонується одноланцюгова Ем (5сЕм) у якій важкий і легкий ланцюги в Ем антитіла проти с-Меї даного винаходу об'єднані із гнучким пептидним лінкером (як правило близько 10, 12, 15 або більшої кількості амінокислотних залишків) в одноланцюговому пептиді. Способи одержання таких антитіл описані, наприклад, в 5 4,946,778, Рінскіпип іп Те
Рпагтасоїоду ої Мопосіопаї! Апііродієв, мої. 113, Козепригуд апа Мооге еавз. Зргіпдег-Мепйад, Мем
МоК, рр. 269-315 (1994), Віга еї аї!., Зсівєпсе 242, 423-426 (1988), Нивюп вї аіІ., РМАБ ОА 5879, 5883-1988 (85) апа Мссапепу еї а!., Маїшге 348, 552-554 (1990). Одноланцюгове антитіло може бути моновалентним, якщо використовують один тип Мн і Мі, бівалентним якщо два типи Мн і Мі. використовують, або полівалентним, якщо використовують більше двох типів Мн і Мі.
В одному втіленні антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї є антитілом з дефіцитом ефекторної функції. В одному втіленні антитіло проти с-Меї з дефіцитом ефекторної функції є стабілізованим антитілом Ідс4, яке було модифіковане для запобігання заміни Рар-плеча (мап дес Меції КоїївзсНпоїєп еї аїЇ. (2007) Зсієпсе 317(5844). 1554-7). Прикладами придатних стабілізованих антитіл Ідс4 є антитіла, у яких аргінін у положенні 409 у константній області важкого ланцюга людського Ід04, вказаного за індексом ЕІ як і в Кабаї еї а!., замінений на лізин, треонін, метіонін або лейцин, бажано лізин (описаний в ММО2006033386 (Кігіп)) і/або де область шарніра була модифікована таким чином, щоб вона містила послідовність Суз-Рго-Рго-
Сув.
В іншому втіленні стабілізоване Ідо4 антитіло проти с-Меї є антитілом, яке містить важкий і легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить константну область людського Ідс4, який має залишок, обраний із групи, яка складається з І уз, АІа, ТНг, Меї і І еи у позиції, яка відповідає 409 і/або залишок обирають із групи, яка складається з: Аа, Маї, Су, Пе ї Геи у позиції, яка відповідає 405, і де зазначене антитіло необов'язково включає одну або кілька додаткових замін, делецій і/або вставок, і де зазначене антитіло містить послідовність Суб5-Рго-Рго-Сув5 в області шарніра. Краще, якщо зазначене антитіло містить залишок Гуз або Аа у позиції, яка відповідає 409 або область СНЗ антитіла замінена на область СНЗ людського ІдДС1, або людського Іде2 або людського ІдД3. Див. також УУО2008145142 (Септарб).
У ще одному втіленні, стабілізоване Ідс4 антитіло проти с-Меї є антитілом, яке містить важкий і легкий ланцюг, де зазначений важкий ланцюг містить константну область людського
І904, який має залишок, обраний із групи, яка складається з Гуз, Аа, ТАг, Меї і І еи у позиції, яка відповідає 409 і/або залишок вибирають із групи, яка складається з: Аа, Маї, Су, Пе і Геи у позиції, яка відповідає 405, і де зазначене антитіло необов'язкове включає одну або кілька додаткових замін, делецій і/або вставок і де зазначене антитіло містить послідовність Субз-Рго-
Рго-Су5 в області шарніра. Краще, якщо зазначене антитіло містить залишок Гуз або Аа у позиції, яка відповідає 409 або область СНЗ антитіла замінена на область СНЗ людського ІдДС1, або людського Іде2 або людського Ідс3.
У наступному втіленні антитіло проти с-Меї з дефіцитом ефекторної функції є антитілом не
І9054 типу, наприклад, Ідс1, Ідс2 або ІдсЗ, які були мутаційно змінені таким чином, щоб здатність опосередковувати ефекторні функції, такі як АОСС, була знижена або навіть усунута.
Такі мутації описані, наприклад, в ЮбаІГасдина МЕ еї аї., У Іттипої. 177(21:1129-1138 (2006) апа
Негагей М, ./ МігоІ.;75(24): 12161-12168 (2001).
Кон'югати
У наступному втіленні в даному винаході пропонується антитіло проти с-Меї, кон'юговане з терапевтичною складовою, такою як цитотоксин, хіміотерапевтичний лікарський засіб, імуносупресант або радіоїзотоп. Такі кон'югати називаються в даному документі "імунокон'югатами". Імунокон'югати, які включають один або більшу кількість цитотоксинів називаються "імунотоксинами".
Цитотоксин або цитотоксичний агент включає будь-який агент, який негативно позначається на клітинах (наприклад, убиває їх). Придатні терапевтичні агенти для формування імунокон'югатів даного винаходу, включають таксол, цитохалазин В, граміцидін ОО, бромистий етидій, еметин, мітоміцин, етопозид, тенопозид, вінкристин, вінбластин, колхіцин, доксорубіцин, даунорубіцин, дигідрокси-антрацин-діон, мітоксантрон, мітраміцин, актиноміцин О, 1-дегідро- тестостерон, глюкокортикоїди, прокаїн, тетракаїн, лідокаїн, пропранолол і пуроміцин, антиметаболіти (наприклад, метотрексат, б-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабин, флударабін,
Б-фторурацил, декарбазин, гідроксисечовина, аспарагіназа, гемцитабін, кладрибін), алкілюючі
Зо агенти (такі, як мехлоретамін, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (ВМ), ломустин (ССМІ), циклофосфамід, бусульфан, дібромоманіт, стрептозотоцин, дакарбазин (ОТІС), прокарбазин, мітоміцин С, цісплатин та інші похідні платини, такі як карбоплатин), антибіотики (наприклад, дактиноміцин (раніше актиноміцин), блеоміцин, даунорубіцин (раніше дауноміцин), доксорубіцин, ідарубіцин, мітраміцин, мітоміцин, мітоксантрон, плікаміцин, антраміцин (АМС)), токсин дифтерії й пов'язані з ними молекули (такі як ланцюг дифтерії А та їх активні фрагменти й гіоридні молекули), токсин рицин (наприклад, рицин або деглікозильований ланцюг А рицина), холерний токсин, шигатоксин-подібний токсин (5І-Т-І, 51 Т-ІЇ, 5І Т-ІМ), ГТ токсин, СЗ токсин, шигатоксин, коклюшний токсин, правцевий токсин, соєвий інгібітор протеази Баумана-Бірка, екзотоксин Рзепдотопах, алорин, сапорин, модецин, геланін, ланцюг абріну А, ланцюг модецину, альфа-сарцин, білки АїПІешгіез гогайїї, білки діантину, білки Рпуюіасса атегісапа (РАРІ,
РАРІЇ, ї РАР-5), інгібітор Мотогаїса Спагапійа, курцин, кротин, інгібітор Зараопагіа ойісіпаїї5, гелонін, мітогелін, рестриктоцин, феноміцин, і еноміцин. Інші придатні кон'юговані молекули включають рибонуклеазу (РНКазу), ДНКазу І, стафілококовий ентеротоксин-А, антивірусний білок лаконоса, дифтерійний токсин і ендотоксин Рзейдотопав. Див., наприклад, Равзіап еї аї.,
Се! 47, 641 (1986) апа Соідепрега, Саїй. А Сапсег Уойгта! ог Сіїпісіапе 44, 43 (1994).
Терапевтичні агенти, які можуть бути введені до комбінації з антитілом запропонованої даним винаходом проти с-Меї, як описано будь-де в даному документі, також можуть бути кандидатами для терапевтичних складових, які можуть бути застосованими при кон'югації антитіла даного винаходу.
В іншому втіленні антитіло проти с-Меї запропоноване винаходом включає кон'юговану нуклеїнову кислоту або молекулу, асоційовану з нуклетїновою кислотою. В одному з таких аспектів даного винаходу, кон'югованою нуклеїновою кислотою є цитотоксична рибонуклеаза, антисмислова нуклеїнова кислота, інгібуюча молекула РНК (наприклад, молекула міРНК) або імуностимулююча нуклеїнова кислота (наприклад, молекула ДНК, яка містить імуностимулюючий Срод-мотив). В іншому втіленні, антитіло проти с-Меї запропоноване винаходом кон'юговане з аптамером або рибозимом.
В одному втіленні пропонуються антитіла проти с-Меї, які містять одну або декілька радіоактивно мічених амінокислот. Радіоактивно мічене антитіло проти с-Меї може бути використане як з діагностичними так і з терапевтичними цілями (кон'югація з радіоактивно бо міченими молекулами є іншою можливою особливістю). Необмежуючі приклади міток для поліпептидів включають ЗН, 14С, 15М, 355, 90, 99Тс і 1251, 1311 і 186Ке.
Антитіла проти с-Меї також можуть бути хімічно модифіковані ковалентною кон'югацією з полімером, наприклад, для збільшення їх періоду напівжиття в кров'яному руслі. Приклади полімерів й способів прикріплення їх до поліпептидів, ілюстровані наприклад, в 5 4,766,106, 5 4,179,337, 05 4,495,285 і 05 4,609,546. Додаткові полімери включають поліоксиетильовані поліоли й поліетиленгліколь (ПЕГ) (наприклад, ПЕГ з молекулярною масою від близько 1000 до близько 40 000, наприклад, від близько 2000 до близько 20 000).
Для кон'югації антитіла проти с-Меї с кон'югованою молекулою(ами), такою як ті, що описані вище, може бути використаний будь-який спосіб, відомий у даній галузі, включаючи способи, описані Нипіег еї а!., Майшге 144, 945 (1962), Обаміа еї а1!., Віоспетівігу 13, 1014 (1974), Раїп еї аї.,
У. Іттипої. Меїй. 40, 219 (1981) апа Муагеп, у). Нівтоспет. апа Суїоспет. 30, 407 (1982). Такі антитіла можуть бути отримані хімічною кон'югацією іншої складової з М-кінцевою стороною або
С-кінцевою стороною антитіла проти с-Меї або його фрагмента (наприклад, Н- або І-ланцюги антитіла проти с-Ме) (див., наприклад, Апіроду Епдіпеегіпа НапароокК, єдієд Бу Озати
Капетіїхи, рибіїпеа ру Спідп ЗпоКап (1994)). Такі похідні кон'югованого антитіла можуть бути отримані кон'югацією внутрішніх залишків або цукрів, де це є необхідним. Агенти можуть бути спарені або прямо, або не прямо з антитілом проти с-Меї даного винаходу. Одним прикладом непрямого спаровування із другим агентом є спаровування за допомогою спейсера. В одному втіленні, антитіло проти с-Меї даного винаходу прикріплюється до хелатора-лінкера, наприклад, тіукситану, який дозволяє антитілу бути кон'югованим з радіоїзотопом.
Біспецифічні антитіла
У додатковому аспекті, винахід відноситься до біспецифічної молекули, яка містить першу антигензв'язуючу ділянку з антитілом запропонованим винаходом проти с-Меї, як описано у даному документі вище, й другу антигензв'язуючу ділянку, з різною зв'язуючою специфічністю, такою як зв'язуюча специфічність до людської ефекторної клітин, людського Ес-рецептора, Т- клітинного рецептора, В-клітинного рецептора або зв'язуючою специфічністю до, до неперекритого епітопу с-Меї, тобто біспецифічного антитіла в якому перша і друга антигензв'язуючі ділянки не конкурують за зв'язування з с-Меї, наприклад, біспецифічне антитіло, у якому перша і друга антигензв'язуючі ділянки не конкурують за зв'язування з с-Меї,
Зо наприклад, при тестуванні, описаному в прикладі 17.
Приклади молекул біспецифічних антитіл винаходу включають (ї) два антитіла, одне зі специфічністю до с-Меї, а друге зі специфічністю до другої мішені, кон'юговані разом, (ії) одиночне антитіло, яке має один ланцюг або плече, специфічне до с-Меї, і другий ланцюг або плече, специфічне до другої молекули, та (ії) одноланцюгове антитіло, яке має специфічність до о-Меї і до другої молекули. В одному втіленні друга молекула є антигеном злоякісного новоутворення /пухлинним антигеном, таким як онкоембріональний антиген (СЕА), простатоспецифічний антиген (РБА), КАСЕ (нирковий антиген), а-фетопротеїн, САМЕЇГ. (СТІ - розпізнаваний антиген меланоми), СТ антигени (такі як МАСЕ-В5, -Вб6, -С2, -С3 і Ю; Маде-12;
СТ10; МУ-Е5О0-1, 55Х-2, САСЕ, ВАСЕ, МАСЕ та 5АСЕ), муцинові антигені (наприклад, МОСТІ, муцин-САТ125 тощо), гангліозидні антигени, тірозинази, др75, С-тус, Магії, МеіапА, МОМ-1,
МИМ-2, МОМ-3, НІ А-В7, Ер-САМ або інтегрін, асоційований зі злоякісним новоутворенням, такий як а5р3 інтегрін. В іншому втіленні, друга молекула є ангіогенним фактором або іншим асоційованим зі злоякісними новоутвореннями фактором росту, таким як фактор росту ендотелію судин, фактор росту фібробластів, епідермальний фактор росту, ангіогенін або рецептор кожного з них, особливо рецептори, асоційовані із прогресією злоякісних новоутворень (наприклад, один з рецепторів НЕК1І-НЕК4). В одному втіленні біспецифічне антитіло даного винаходу є діатілом.
Нуклеотидні послідовності, вектори й клітини-хазяїни
У додатковому аспекті винахід відноситься до нуклеотидних послідовностей, таких як послідовності ДНК, які кодують важкий і легкий ланцюги антитіла запропонованого винаходом.
В одному втіленні послідовність нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність, обрану із групи, яка складається з: ЗЕО ІЮО МО: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176,177 1178.
В іншому конкретному втіленні, послідовність нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність УН, обрану із групи, яка складається з: ЗЕО ІЮ МО: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 1751177. бо В іншому конкретному втіленні, послідовність нуклеїнової кислоти кодує амінокислотну послідовність МІ. обрану із групи, яка складається з: БЕО ІЮ МО: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 1 178.
У наступному аспекті винахід відноситься до експресуючого вектора, або набору експресуючих векторів, які кодують антитіло запропоноване винаходом. Важкий або легкий ланцюг антитіла може бути закодований тим же самим вектором або іншим вектором.
Такі експресуючі вектори можуть бути використані для рекомбінантного продукування антитіл винаходу.
В одному втіленні експресуючий вектор винаходу містить нуклеотидну послідовність, яка кодує одну або кілька амінокислотних послідовностей, обраних із групи, яка складається з: ЗЕ
ІО МО: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49,53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176,177 1178.
В іншому конкретному втіленні експресуючий вектор винаходу містить нуклеотидну послідовність, яка кодує одну або кілька амінокислотних послідовностей МН, обраних із групи, яка складається з: БЕО ІЮО МО: 1, 9, 17, 25, 33, 41, 49, 57, 65, 73, 81, 89, 97, 105, 113, 121, 129, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 1751 177.
В іншому конкретному втіленні експресуючий вектор винаходу містить нуклеотидну послідовність, яка кодує одну або кілька амінокислотних послідовностей МІ, обраних із групи, яка складається з: ЗЕО ІЮ МО: 5, 13, 21, 29, 37, 45, 53, 61, 69, 77, 85, 93, 101, 109, 117, 125, 133, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176 і 178.
У наступному втіленні експресуючий вектор додатково включає нуклеотидну послідовність, яка кодує константну область легкого ланцюга, важкого ланцюга або і легкого і важкого ланцюгів антитіла, наприклад, людського антитіла.
Експресуючий вектор у контексті даного винаходу може бути будь-яким придатним вектором, включаючи хромосомний, нехромосомний і синтетичний нуклеотидний вектори
Зо (нуклеотидна послідовність, яка містить набір елементів контролю експресії). Приклади таких векторів включають похідні 5М40, бактеріальні плазміди, фагову ДНК, бакуловіруси, дріжджові плазміди, вектори, отримані з комбінацій плазмід і фагової ДНК, і вектори на основі вірусних нуклеїнових кислот (РНК або ДНК). В одному втіленні нуклеїновая кислота, яка кодує антитіло проти с-Меї, містить "голий" ДНК або РНК вектор, включаючи, наприклад, лінійний експресуючий елемент (як описано, наприклад, в 5уке5 апа допп5іоп, Маї Віоїесп 17, 355-59 (1997)), упакований нуклеотидний вектор (як описано, наприклад, в 05 6,077, 835 і/або УМО 00/70087), плазмідний вектор, такий як рВК322, рис 19/18, або рис 118/119, нуклеотидний вектор мінімального розміру "тідде" (як описано, наприклад, в зспакомув»зкі єї аї., Мої Тег 3, 793- 800 (2001)), або преципітований нуклеотидний вектор-конструкт, наприклад, конструкт, преципітований СаРо4 (як описано, наприклад, в УМО 00/46147, Вепмепівіу апа Кезпеї, РМА5
ИБА 83, 9551-55 (1986), М/ідієг еї аї., Сеї! 14, 725 (1978), і Согаго апа Реагзоп, 5отаїййс СеїЇ
Сепеїісв5 7, 603 (1981)). Такі нуклеотидні вектори та їх застосування добре відомі в даній галузі (див. наприклад, 05 5,589,466 і 05 5,973,972).
В одному втіленні, вектор придатний для експресії антитіла проти с-Мус у бактеріальній клітині. Приклади таких векторів включають експресуючі вектори, такі як Вісезсгірі (5ігаїадепе), вектори ріМ (мап НееКе 5 Зспизвіег, У ВіоЇ Спет 264, 5503-5509 (1989), вектори рЕТ (Момадеп,
Медісон, Вісконсин) тощо).
Експресуючий вектор також може бути або в іншому випадку є вектором, придатним для експресії в дріжджовій системі. Може бути використаний будь-який вектор, придатний для експресії в дріжджовій системі. Придатні вектори включають, не обмежуючись перерахованим, вектори, які містять конститутивні або індуцибельні промотори, такі як альфа-фактор, алкоголь оксидаза й РОН (розглянуті в: Е. А!,зирбеї еї аї., еа. Ситепі Ргоїосої5 іп МоїІесціаг Віоіоду, Сгеепе
Рибріїзпіпд апа Уміієу Іпіегесіепсе Мем/ ХогК (1987), і Сгапі єї а!., Меїйподвз іп Епгутої! 153, 516-544 (1987)).
Експресуючий вектор також може бути або в іншому випадку є вектором ссавців, придатним для експресії в клітинах, наприклад, вектором, який містить глутамінсинтетазу як селективний маркер, такий, як вектори описані в (Верріпоюп (1992) ВіоїесппоЇоду (МУ) 10:169-175).
Нуклеїнова кислота й/або вектор також може містити нуклеотидну послідовність, яка кодує послідовність секреції/локалізації, яка може спрямовувати поліпептид, такий як зростаючий бо поліпептидний ланцюг, у периплазматичний простір або в клітинне культуральне середовище.
Такі послідовності відомі в даній галузі й включають секреційний лідер або сигнальні пептиди.
В експресуючому векторі запропонованому винаходом нуклеїнові кислоти, які кодують антитіло проти с-Меї, можуть містити або можуть бути асоційованими з будь-яким придатним промотором, енхансером та іншими елементами, які полегшують експресію. Приклади таких елементів включають промотори для сильної експресії (наприклад, людський СММ !/Е промотор/(енхансер а також промотори КМ, 5М40, 513-3, ММТМ і НІМ ІТК), ефективні послідовності термінації з поліА та точки початку реплікації для плазмідного продукту в Е. соїї, ген стійкості до антибіотика як селективного маркера і/або звичайну ділянку для клонування (наприклад, полілінкер). Нуклеїнові кислоти також можуть містити індукований промотор, на відміну від конститутивного промотору, такого як СММ ІЕ.
В одному втіленні експресуючий вектор, який кодує антитіло проти с-Меї, може бути розташований у й/або доставлений до клітини-хазяїна або до тварини-хазяїна за допомогою вірусного вектора.
У додатковому аспекті винахід відноситься до рекомбінантної еукаріотичної або прокаріотичної клітини-хазяїна, такої як трансфектома, яка продукує антитіло запропоноване винаходом, визначене в даному документі. Перелік прикладів клітин-хазяїв включає дріжджові, бактеріальні клітини й клітини ссавців, такі як клітини СНО або НЕК. Наприклад в одному втіленні в даному винаході пропонується клітина, яка містить нуклеїнову кислоту, стабільно інтегровану в клітинний геном, який містить кодуючу послідовність, яка експресує антитіло проти с-Меї запропоноване даним винаходом. В іншому втіленні в даному винаході пропонується клітина, яка містить неінтегровану нуклеїнову кислоту, таку як плазміда, косміда, фагеміда або лінійний експресуючий елемент, який містить кодуючу послідовність, яка експресує антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї.
У додатковому аспекті винахід відноситься до гібридоми, яка продукує антитіло запропоноване винаходом, визначене в даному документі. У ще одному додатковому аспекті, винахід відноситься до трансгенної тварини, яка не є людиною, або рослини, яка містить нуклеїнові кислоти, які кодують людський важкий і легкий ланцюг, де тварина або рослина продукують антитіло запропоноване винаходом.
У додатковому аспекті винахід відноситься до способу одержання антитіла запропонованого винаходом проти с-Меї, який передбачає стадії а) культивування гібридоми або клітини-хазяїна за винаходом, як описано в даному документі вище, і р) очищення антитіла запропонованого винаходом з культурального середовища.
Композиції
У додатковому головному аспекті винахід відноситься до фармацевтичної композиції, яка містить: - антитіло проти с-Меї, визначене в даному документі, і - фармацевтично прийнятний носій.
Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може містити одне антитіло запропоноване даним винаходом або комбінацію різних антитіл запропонованих даним винаходом.
Фармацевтичні композиції можуть бути створені за допомогою звичайних методів, таких як ті, що описані в Кетіпдіоп: Те 5сіепсе апа Ргасіїсе ої Рпаптасу, 19 Еайіоп, Сеппаго, Еа.,
Маск Рибіїзпіпд Со., Еавзіоп, РА, 1995. Фармацевтична композиція запропонована даним винаходом може, наприклад, включати розріджувачі, наповнювачі, солі, буфери, детергенти (наприклад, неіонний детергент, такий як Тжуееп-20 або Тмуееп-80), стабілізатори (наприклад, цукри або безбілкові амінокислоти), консерванти, фіксатори тканин, солюбілізатори, і/або інші матеріали, придатні для включення до фармацевтичної композиції.
Фармацевтично прийнятні носії включають будь-який і всі придатні розчинники, дисперсійні середовища, покриття, антибактеріальні й антигрибкові агенти, ізотонічні агенти, антиоксиданти та агенти, які уповільнюють абсорбцію тощо, які є фізіологічно сумісними із сполуками запропонованими даним винаходом. Приклади придатних водних і неводних носіїв, які можуть бути використані у фармацевтичних композиціях запропонованих даним винаходом, включають воду, сольовий розчин, фосфатно-буферний сольовий розчин, етанол, декстрозу, поліоли (такі як гліцерин, пропіленгліколь, поліетиленгліколь тощо), та їхні придатні суміші, рослинні олії, колоїдальні розчини карбоксиметилцелюлози, трагакантову камедь, і ін'єкційні органічні ефіри, такі як етилолеат, і/або різні буфери. Фармацевтично прийнятні носії включають стерильні водні розчини або дисперсії й стерильні порошки для приготування стерильних розчинів ін'єкцій або дисперсій для негайного прийому. Потрібний ступінь плинності може підтримуватися, 60 наприклад, при застосуванні покривних матеріалів, таких як лецитин, шляхом підтримування необхідного розміру часток у випадку дисперсій, і за допомогою використання ПАР.
Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом також можуть містити фармацевтично прийнятні антиоксиданти, наприклад, (1) водорозчинні антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, гідрохлорид цистеїну, бісульфат натрію, метабісульфіт натрію, сульфіт натрію тощо; (2) олієрозчинні антиоксиданти, такі як аскорбілпальмітат, бутилоксианізол, бутилокситолуол, лецитин, пропілгалат, альфа-токоферол тощо; і (3) агенти, здатні хелатувати метали, такі як лимонна кислота, етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), сорбіт, винна кислота, фосфорна кислота тощо.
Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом також можуть містити ізотонічні агенти, такі як цукри, поліспирти, такі як маніт, сорбіт, гліцерин або хлорид натрію в композиціях.
Фармацевтичні композиції запропоновані даним винаходом також можуть містити один або декілька ад'ювантів, придатних для обраного шляху введення, таких як консерванти, зволожуючі агенти, емульгуючі агенти, диспергуючі агенти, консерванти або буфери, які можуть підсилити строк зберігання або ефективність фармацевтичної композиції. Сполуки можуть бути приготовлені з носіями, які будуть запобігати швидкому вивільненню сполуки, такі як композиція з контрольованим вивільненням, включаючи імпланти, трансдермальні пластирі та мікрокапсульовані системи доставки. Такі носії можуть включати желатин, гліцерилмоностеарат, гліцерилдистеарат, здатні до біологічного розкладання і біосумісні полімери, такі як етиленвінілацетат, поліангідриди, полігліколеву кислоту, колаген, поліортоефіри й полімолочну кислоту окремо або з воском, або іншими матеріалами, добре відомими в даній галузі. Способи приготування таких композицій запатентовані або є добре відомими фахівцям у даній галузі.
Стерильні розчини для ін'єкцій можуть бути приготовлені шляхом включення активної сполуки в необхідній кількості у відповідний розчинник з одним або з комбінацією інгредієнтів, перерахованих вище, якщо необхідно, з наступною стерилізацією мікрофільтрацією. Загалом, дисперсії готують шляхом уведення активної сполуки в стерильний носій, який містить основне дисперсне середовище й інші необхідні інгредієнти з тих, що перераховані вище. У випадку стерильних порошків для приготування стерильних розчинів для ін'єкцій, прикладами способів приготування є вакуумне висушування та сублімаційне висушування (ліофілізація), в результаті яких отримують порошок активного інгредієнта плюс будь-який додатковий необхідний інгредієнт із його попередньо стерильно фільтрованого розчину.
Фактичні рівні доз активних інгредієнтів у фармацевтичних композиціях можуть варіювати для того, щоб кількість активного інгредієнта була ефективною для досягнення необхідної терапевтичної відповіді для конкретних пацієнта, композиції й режиму введення, без токсичного впливу на пацієнта. Обраний рівень дозування буде залежати від цілого ряду фармакокінетичних факторів, включаючи активність певних композицій, які використовуються даним винаходом, або їх аміду, шлях уведення, час уведення, швидкість виведення певної використаної сполуки, тривалість лікування, інші лікарські засоби, сполуки й/або матеріали, які застосовуються в комбінації з конкретними використаними композиціями, вік, стать, масу, стан, загальний рівень здоров'я й попередню історію хвороби пацієнта, який потребує лікування та інші фактори, добре відомі в медицині.
Фармацевтична композиція може бути введена будь-яким придатним шляхом або способом.
В одному втіленні фармацевтична композиція запропонована даним винаходом вводиться парентерально. Словосполучення "уводити парентерально", яке використовується в даному документі, позначає режим введення відмінний від ентерального або місцевого введення, зазвичай ін'єкцією, і включає, не обмежуючись перерахованим, епідермальну, внутрішньовенну, внутрішньом'язову, внутрішньоартеріальну, внутрішньотрахеальну, внутрішньокапсулярну, внутрішнорбітальну, внутрішньокардіальну, внутрішньошкірну, внутрішньоочеревинну, транстрахеальну, трансдермальну, внутрішньосуглобну, субкапсулярну, субарахноїдальну, внутрішньоспінальну, епідуральну й надчеревну ін'єкцію або інфузію.
В одному втіленні фармацевтичну композицію вводять внутрішньовенною або підшкірною ін'єкцією або інфузією.
Застосування
У додатковому головному аспекті винахід відноситься до антитіла запропонованого винаходом проти с-Меї для застосування як лікарського засобу.
Антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї можуть бути використані в декількох цілях.
Конкретно, антитіла запропоновані винаходом можуть бути використані для лікування різних форм злоякісних новоутворень, включаючи метастатичні злоякісні новоутворення й несприйнятливі до лікування злоякісні новоутворення. Такі злоякісні пухлини можуть бути НОБ- бо залежними або НОгЕ-незалежними.
В одному втіленні, антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для лікування однієї з форм злоякісного новоутворення, обраного із групи, яка складається з: рака сечового міхура, рака грудей, рака шийки матки, холангіокарциноми, колоректального рака, рака ендометрію, рака стравоходу, рака шлунка, рака голови й шиї, рака нирки, рака печінки, рака легень (такого як недрібноклітинний рак легень (МЗСІ С)), рака носоглотки, рака яєчників, рака підшлункової залози, рака жовчного міхура, рака передміхурової залози, рака щитовидної залози.
В іншому втіленні, антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для лікування однієї з форм злоякісного новоутворення, обраного із групи, яка складається 3: остеосаркоми, рабдоміосаркоми й синовіальної саркоми.
В іншому втіленні, антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для лікування однієї з форм злоякісного новоутворення, обраного із групи, яка складається з: саркоми Капоші, лейоміосаркоми, злоякісної фіброзної гістіоцитоми й фібросаркоми.
В іншому втіленні, антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для лікування гематопоетичних злоякісних пухлин, наприклад, злоякісних пухлин, обраних із групи, яка складається з: гострого мієлогенного лейкозу, Т-клітинного лейкозу дорослих, хронічного мієлоїдного лейкозу, лімфоми й множинної мієломи.
У додатковому втіленні, антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для лікування неоплазій, обраних із групи, яка складається 3: гліобластоми, астроцитоми, меланоми, мезотеліоми й пухлини Вілмса.
У додатковому втіленні, антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для лікування МіТ-пухлин, які включають світлоклітинну саркому (СС5), альвеолярну саркому м'яких тканин (АР) і асоційовану із транслокацією нирковоклітинну карциному.
В іншому втіленні, агоністичні антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї, використовують для регуляції вироблення цитокінів та індукції мобілізації ендотеліальних клітин-попередників, наприклад, у пацієнтів з ішемічною хворобою серця (Уапо еї аї. (2009) Сіїп
Ехр Ріпаптасої РпНузіої. 36:790).
В іншому втіленні, агоністичні антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї використовують для інгібування або поліпшення стану при хронічній нирковій недостатності
Коо) (Міг2и!ипо еї аї. (2008) Ргопі Віовзсі. 13:7072).
Аналогічно, винахід відноситься до способу інгібування росту й/або проліферації пухлинної клітини, яка експресує с-Меї, причому спосіб передбачає введення індивідуумові, який цього потребує, ефективної кількості антитіла запропонованого винаходом.
В одному втіленні зазначена пухлинна клітина задіяна у вигляді злоякісного новоутворення, обраного із групи, яка складається з: рака сечового міхура, рака грудей, рака шийки матки, холангіокарциноми, колоректального рака, рака ендометрію, рака стравоходу, рака шлунка, рака голови й шиї, рака нирки, рака печінки, рака легені, рака носоглотки, рака яєчників, рака підшлункової залози, рака жовчного міхура, рака передміхурової залози, рака щитовидної залози, остеосаркоми, рабдоміосаркоми, синовіальної саркоми, саркоми Капоші, лейоміосаркоми, злоякісної фіброзної гістіоцитоксантоми, фібросаркоми, гострого мієлогенного лейкозу, Т-клітинного лейкозу дорослих, хронічного мієлоїдного лейкозу, лімфоми, множинної мієломи, гліобластоми, астроцитоми, меланоми, мезотеліоми, пухлини Вілмса.
Також, винахід стосується застосування моноклонального антитіла, яке зв'язує людський с-
Меї, для приготування лікарського засобу для лікування злоякісного новоутворення, такого як одне з конкретних проявів злоякісних новоутворень, згаданих вище.
В одному втіленні, відбір пацієнтів для лікування з використанням антитіла проти с-Меї, заснований на рівні (гіпер)експресії с-Меї (або НОЕ на відповідних пухлинних клітинах зазначених пацієнтів.
У наступному втіленні способів лікування за даним винаходом, ефективність лікування відслідковується в процесі терапії, наприклад, у певні моменти часу шляхом визначення рівня експресії с-Меї на відповідних пухлинних клітинах.
Режими дозування у вищевказаних способах лікування й застосуваннях корегуються для забезпечення оптимальної необхідної відповіді (наприклад, терапевтичної відповіді).
Наприклад, може бути введений одиночний болюс, можуть бути введені кілька доз протягом періоду часу або дози можуть бути пропорційно зменшені або збільшені залежно від потреб терапевтичної ситуації. Парентеральні композиції можуть бути складені у вигляді одиничної лікарської форми для легкого введення й однаковості доз.
Ефективні дози й режими дозування для антитіл проти с-Меї залежать від захворювання або стану, який потрібно лікувати, або можуть бути визначені фахівцем у даній галузі. Типовий бо необмежуючий інтервал для терапевтично ефективної кількості сполуки запропонованої даним винаходом становить близько 0,1-100 мг/кг, наприклад, близько 0,1-50 мг/кг, наприклад, близько 0,1-20 мг/кг, як наприклад, близько 0,1-10 мг/кг, наприклад, близько 0,5, близько 0,3, близько 1, близько 3, близько 5, або близько 8 мг/кг.
Лікар або ветеринар, який є фахівцем у даній галузі, може легко визначити й прописати необхідну ефективну кількість терапевтичної композиції. Наприклад, лікар або ветеринар може почати з дозування антитіла проти с-Меї у фармацевтичній композиції на рівні нижче, ніж потрібно для досягнення необхідного терапевтичного ефекту, з поступовим збільшенням дози до досягнення цільового ефекту. Взагалі придатна добова доза, композиції запропонованої даним винаходом, буде бути такою кількістю сполуки, яка складає найнижчу дозу, яка може бути ефективною для одержання терапевтичного ефекту. Введення може бути парентеральним, таким як внутрішньовенне, внутрішньом'язове або підшкірне введення. В одному втіленні антитіла проти с-Меї можуть вводитися шляхом інфузії із щотижневим дозуванням від 10 до 500 мг/м, як наприклад, від 200 до 400 мг/м7. Таке введення може повторюватися, наприклад, 1-8 разів, наприклад, 3-5 разів. Введення може здійснюватися шляхом безперервної інфузії протягом періоду від 2 до 24 годин, наприклад, від 2 до 12 годин. В одному втіленні, антитіла проти с-Меї можуть бути введені за допомогою повільної безперервної інфузії протягом тривалого періоду, наприклад, більше ніж за 24 години, з метою зменшення токсичних побічних ефектів.
В одному втіленні, антитіла проти с-Меї, можуть бути введені із щотижневим дозуванням від 250 мг до 2000 мг таким, як наприклад, 500 мг, 700 мг, 1000 мг, 1500 мг, 2000 мг або 300 мг, протягом до 8 разів, наприклад, від 4 до 6 разів. Такий режим може повторюватися один або більше разів за необхідності, наприклад, через б або 12 місяців. Дозування може бути визначене або відрегульоване шляхом вимірювання кількості сполуки запропонованої даним винаходом в крові при введенні шляхом, наприклад, відбору біологічного зразка й використання антиідіотипових антитіл, мішенню для яких є антигензв'язуюча область антитіл запропонованих винаходом проти с-Меї.
В одному втіленні антитіла проти с-Меї можуть бути введені підтримуючою терапією, наприклад, один раз на тиждень протягом 6 місяців або більше.
Антитіла проти с-Меї також можуть бути введені профілактично для зменшення ризику
Зо розвитку злоякісного новоутворення, затримання прогресії злоякісного новоутворення, і/або зменшення ризику рецидиву при ремісії злоякісного новоутворення.
Антитіла проти с-Меї також можуть бути введені в комбінаторній терапії, тобто в комбінації з іншими терапевтичними агентами, релевантними щодо захворювання або стану, яке потребує лікування. Відповідно, в одному втіленні антитіло-вмісний лікарський засіб знаходиться в комбінації з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, наприклад, цитотоксичним, хіміотерапевтичним або антіангіогенним агентом.
Таке об'єднане введення може бути одночасним, роздільним або послідовним. Для одночасного введення агенти можуть бути введені у вигляді однієї композиції або у вигляді роздільних композицій, за необхідності. У даному винаході, таким чином, пропонуються способи лікування захворювання, у якому задіяні клітини, які експресують с-Меї, як описано вище, де способи передбачають введення антитіла проти с-Меї за даним винаходом, об'єднаного з одним або декількома додатковими терапевтичними агентами, як описано нижче.
В одному втіленні в даному винаході пропонується спосіб лікування розладу, при якому залучені клітини, які експресують с-Меї, у об'єкта, де спосіб передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти с-Меї запропонованого даним винаходом, і, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента об'єкту, який цього потребує.
В одному втіленні даного винаходу пропонується спосіб лікування або профілактики злоякісного новоутворення, де спосіб передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти с-Меї запропонованого даним винаходом, і, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента об'єкту, який цього потребує.
В одному втіленні, такий додатковий терапевтичний агент може бути обраний з антиметаболіту, такого як метотрексат, б-меркаптопурин, 6-тіогуанін, цитарабін, флударабін, 5- фторурацил, декарбазин, гідроксисечовина, аспарагіназа, гемцитабін або кладрибін.
В іншому втіленні, такий додатковий терапевтичний агент може бути обраний з поміж алкілюючого агента, такого як мехлореамін, тіотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (В5МО), ломустин (ССМІ), циклофосфамід, бусулфан, дібромоманіт, стрептозотоцин, декарбазин (ОТІС), прокарбазин, мітоміцин С, цисплатін та інших платинових похідних, таких як карбоплатин.
В іншому втіленні, такий додатковий терапевтичний агент може бути обраний з поміж 60 антимітотичного агента, такого як таксани, наприклад, доксетацель і паклітаксель та алколоїди барвінку, наприклад, віндезин, вікристин, вінбластин і вінорелбін.
В іншому втіленні такий додатковий терапевтичний агент може бути обраний з інгібіторів топоізомераз, таких як топотекан або іринотекан, або цитостатичного лікарського засобу, такого як етопозид і теніпозид.
В іншому втіленні такий додатковий терапевтичний агент може бути обраний з поміж інгібіторів фактора росту, такого як інгібітор ЕгбВ1 (ЕСЕК) (такий як антитіло проти ЕСЕРК, наприклад, залутумумаб, цетуксимаб, панітумумаб або німотузумаб або інші інгібітори ЕСЕК, такі як гефітиніб або ерлотиніб), інгібітор ЕгЬВ2 (Негг/пей) (такий як антитіло проти НЕКЗ2, наприклад, трастузумаб, трастузумаб ОМІ або пертузумаб) або інгібітор як ЕСЕК, так і НЕН2, такий як лапатиніб).
В іншому втіленні такий додатковий терапевтичний агент може бути обраний з поміж інгібітору тирозинкінази, такого як іматиніб (Сіїмес, СіІеемес 5ТІ571) або лапатиніб,
РТК787/иК222584.
В одному втіленні в даному винаході пропонується спосіб лікування розладу, у якому задіяні клітини, які експресують со-Меї, у об'єкта, де спосіб передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти с-Меї запропонованого даним винаходом, і, щонайменше, одного інгібітору ангіогенезу, неоваскуляризації й/або іншої васкуляризації об'єкту, що цього потребує.
Прикладами таких інгібіторів ангіогенезу є інгібітори урокінази, інгібітори матриксних металопротеаз (такі як маримастат, Неовастат, ВАМ 12-9566, А. Г. 3340, ВМ5-275291 ії т.п.), інгібітори міграції та проліферації ендотеліальних клітин (такі, як ТМР-470, скваламін, 2- метоксиестрадіол, комбретастатини, ендостатин, ангіостатин, пеніциламін, ЗСНбб336 (Зспегіпд-
Ріоцдп Согр, Меедісон, Нью-Джерсі), К1І15777 (Янсен Фармацевтика, Іпс, Титусвіль, Нью-
Джерсі) та подібні агенти), антагоністи ангіогенних факторів росту (наприклад, такі як 206474, 506668, антитіла проти ангіогенних агентів і/або їх рецепторів (такі як МЕСЕ (наприклад, бевацизумаб), БЕСЕ і ангіопоетин-1), талідомід, аналоги талідоміду (наприклад, СС-5013), 5416
Зидеп, 505402, антиангіогенний рибозим (наприклад, ангіозим), інтерферон (наприклад, інтерферон ага), сурамін тощо), інгібітори кінази МЕСР-К та інших антиангіогенних тирозинкіназ (наприклад, 50011248), інгібітори специфічного для ендотелію інтегрину/сигнальних шляхів виживання (такі як вітаксин і подібні агенти), антагоністи/хелатори міді (наприклад, тетратіомолібдат, каптоприл тощо), карбоксиамідотриазол (САЇ), АВТ-627, СМ101, інтерлейкін- 12 (11-12), ІМ862, РМО145156Е, а також нуклеотидні молекули, які інгібують ангіогенез (наприклад, антизначеннєва-МЕСЕ-КДНК, кДНК, яка кодує ангіостатин, кДНК, яка кодує роз і
КДНК, що кодує дефектний рецептор МЕСЕ-2).
Іншими прикладами таких інгібіторів ангіогенезу, неоваскуляризації, і/або іншої васкуляризації є похідні антиангіогенного гепарину (наприклад, гепариназа Ії), темозоломід,
МК.4, фактор інгібування міграції макрофагів, інгібітори циклооксигенази-2, інгібітори індукованого гіпоксією фактора 1, антиангіогенні ізофлавони сої, олтипраз, фумагилін та його аналоги, аналоги соматостатину, пентозанполісульфат, текогалан натрію, дальтепарин, тумстатин, тромбоспондин, ММ-3, комбрестатин, канстатин, авастатин, антитіла проти інших цілей, такі як антитіла проти альфа-М/бета-3 інтегрину й антитіла проти кінітостатину.
В одному втіленні терапевтичний агент для застосування в комбінації з антитілом проти с-
Меї для лікування розладів, описаних вище, може бути імуногеном проти злоякісного новоутворення, таким як антиген злоякісного новоутворення/ пухлинно-асоційований антиген (наприклад, молекули адгезії епітеліальних клітин (ЕРСАМ/ТАС5ТОЇ)3, муцин 1 (МОСТІ), онкоембріональний антиген (ОЕА), асоційований з пухлинами глікопротеїн 72 (ТАС-72), др100,
Меїап-А, МАНТ-1, КОК, КСАБІ, МОА?7, вакцини проти вірусів, асоційованих зі злоякісними новоутвореннями (наприклад, вакцини проти вірусу папіломи людини) або пухлинні білки теплового шоку.
В одному втіленні терапевтичний агент для застосування в комбінації з антитілом проти с-
Меї для лікування розладів, описаних вище, може бути протипухлинним цитокіном, хемокіном, або їх комбінацією. Приклади, придатних цитокінів і факторів росту включають ІЕМУу, 1-2, ІІ -4,
ІС-6, 1-7, 11-10, 1-12, І1С-13, 1-15, 11-18, 1-23, 1-24, 11-27, ІІ -28а, ІІ -2860, 1/-29, КОЕ, ІЄМа (наприклад, ІМЕРагб), ІЕМВ, ЗМ-С5Е, СО401І, ліганд РІЗ, фактор стовбурових клітин, анцестим і
ТМЕРа. Придатні хемокіни можуть включати сіи-І еи-Агу (Е! А)-негативні хемокіни, такі як ІР-10,
МСОСР-3, МІС і Заіа із родини людських хемокінів СХС ії С-С. Придатні цитокіни включають похідні цитокінів, варіанти цитокінів, фрагменти цитокінів і химерні білки на основі цитокінів.
В одному втіленні терапевтичний агент для застосування в комбінації з антитілом проти с-
Меї для лікування розладів, описаних вище, може бути регулятором контролю клітинного бо циклу/апоптозу (або "регулюючим агентом"). Регулятор контролю клітинного циклу/апоптозу може включати молекули, які направляють і модулюють регулятори контролю клітинного циклу/апоптозу такі як (ї) сас-25 (наприклад, МС 663284), (ії) циклін-залежні кінази, які гіперстимулюють клітинний цикл (наприклад, флавопіридол (1868275, НМК1275), 7- гідрокистауроспорин (ШСМ-01, КМУ-2401), і росковітин (К-росковітин, СУС202)), і (ії) модулятори теломерази (наприклад, ВІВК1І532, 501-095, ЗКМ163 і композиції описані, наприклад, в 05 6,440,735 і 005 6,713,055). Необмежуючі приклади молекул, які інтерферують з апоптотичними сигнальними шляхами, включають апоптоз-індукуючий ліганд, споріднений ТМЕ (ТКАЇІУ)/ліганд 2 апоптозу (Аро-2І), антитіла, які активують рецептори ТЕАЇЇ, ІЕМ, і антизначеннєву Всі-2.
В одному втіленні терапевтичний агент для застосування в комбінації з антитілом проти с-
Меї для лікування розладів, описаних вище, може бути гормональним регулюючим агентом, таким як агенти, які застосовуються в антиандрогенній і антиестрогенній терапіях. Прикладами таких гормональних регулюючих агентів є тамоксифен, ідоксифен, фулвестрант, дролоксифен, тореміфен, ралоксифен, диетилстильбестрол, етинілестрадіол/естиніл, антиандроген (такий, як флутамінд/еулексин), прогестин (наприклад, такий, як гідроксипрогестерону капроат, медрокси- прогестерон/провера, мегестрол ацепат/мегейс), адренокортикостероїд (наприклад, гідрокортизон, преднізолон), рилізинг-фактор лютеїнізуючого гормону (і його аналоги та інші агоністи ЛГРГ, такі як бусерелин і гозерелин), інгібітор ароматази (наприклад, анастразола/аримідекс, аміноглютетимід/цитраден, екземестан) або гормональний інгібітор (наприклад, октреотид/сандостатин).
В одному втіленні терапевтичний агент для застосування в комбінації з антитілом проти с-
Меї для лікування розладів, описаних вище, може бути будь-яким антианергічним агентом, наприклад, сполуками, які є молекулами, які блокують активність СТІ А-4, наприклад, може бути іпілімумабом.
В одному втіленні терапевтичний агент для застосування в комбінації з антитілом проти с-
Меї для лікування розладів, описаних вище, може бути протипухлинною нуклеїновою кислотою або протипухлинною інгібуючою молекулою РНК.
Прикладами інших протипухлинних агентів, які можуть бути використані як терапевтичні агенти для застосування в комбінації з антитілом проти с-Меї для лікування розладів, описаних вище, є агенти, які індукують диференціювання, аналоги ретиноєвої кислоти (такі як всі з поміж
Зо транс-ретиноєвої кислоти, цис-ретиноєвої кислоти та подібних агентів), аналоги вітаміну О (такі як сеокальцитол і подібні агенти), інгібітори ЕГЬВ3, ЕгГЬВа4, ІСЕ-ІЕ, рецепторів інсуліну, РОСЕКа,
РОСЕРЬеїа, РІК2, ЕНЯ, ЕСЕ, ЕСЕК2, ЕСЕКЗ, ЕСЕК4, ТЕКА, ТЕКС, КОМ (наприклад, антитіло проти КОМ), Зеа, Тіє, Тів2, Ер, Кеї, Ковз, АК, ГТК, РТК? та подібні агенти.
Прикладами інших протипухлинних агентів, які можна застосовувати як терапевтичні агенти у комбінації з антитілом проти с-Меї для лікування розладів, описаних вище, є естрамустин і епірубіцин.
Прикладами інших протипухлинних агентів, які можна застосовувати як терапевтичні агенти для застосування в комбінації з антитілом проти с-Меї для лікування розладів, описаних вище, є інгібітор Н5РОО, такий як 17-аліламіногельдаміцин, антитіла проти пухлинного антигену, такого як РБЗА, СА125, К5А, інтегрин, наприклад, інтегрин бетаї!, або інгібітори МСАМ.
Прикладами інших протипухлинних агентів, які можна застосовувати як терапевтичні агенти для застосування в комбінації з антитілом проти с-Меї для лікування розладів, описаних вище, є інгібітори кальциневрину (такі як валсподар, РОС 833 та інші інгібітори МОК-1 або р- глікопротеїну), інгібітори ТОК (такі як сиролімус, еверлімус і рапаміцин), і інгібітори механізму "хомінга лімфоцитів" (такі як ЕТУ720), і агенти, що впливають на клітинні сигнальні шляхи, такі як інгібітори молекул адгезії (наприклад, анти-їі ЕА).
В одному втіленні антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї призначене для застосування в комбінації з одним або декількома іншими терапевтичними антитілами, такими як офатумумаб, занолімумаб, даратумумаб, ранібізумаб, зенапакс, Сімулект, Ремікад, Хімура,
Тусабрі, Ксолаїр, Раптива й/або ритуксимаб.
Іншими терапевтичними антитілами, які можуть бути використані в комбінації з антитілом даного винаходу, є антитіла проти с-Меї, які зв'язують інші області с-Меї, такі як антитіла описані в МО2005016382, ММО2006015371, ММО2007090807, УМО2007126799 або ММО2009007427 (усі включені до даного документа як посилання).
В іншому втіленні при лікуванні захворювання використовують комбінацію двох або декількох різних антитіл запропонованих винаходом, описаних у даному документі. Особливо цікаві комбінації включають два або більшу кількість неконкуруючих антитіл. Така комбінаційна терапія може призводити до зв'язування підвищеної кількості молекул антитіл на клітину, що може збільшити ефективність через активацію комплемент-опосередкованого лізису. 60 На додачу до вищевказаного, інші втілення комбінаційних терапій винаходу включають наступні: " При лікуванні недрібноклітинного раку легень застосовують антитіло проти с-Меї у комбінації з інгібіторами ЕСЕК, такими як антитіло проти ЕСЕК, наприклад, залутумумаб, цетуксимаб, панітумумаб або німотузумаб, або іншими інгібіторами ЕСЕК, такими як гефітиніб або ерлотиніб) або в комбінації з інгібітором ЕгЬВ2 (Негг/пеи) (таким як антитіло проти НЕКЗ2, наприклад, трастузумаб, трастузумаб-ОМІ або пертузмумаб) або в комбінації з інгібітором як
ЕСЕБК так і НЕКЗ, таким як лапатиніб, або в комбінації з інгібітором НЕКЗ. " Для лікування гліоми застосовують антитіло проти с-Меї у комбінації з темозоломідом або інгібітором ангіогенезу, таким як бевацизумаб. " Для лікування колоректального раку застосовують антитіло проти с-Меї у комбінації з одним або декількома сполуками, обраними з поміж: гемцитабіну, бевацизумаба, фолфокса, фолфіри, кселокса, ІРЇ,, оксаліплатину, іринотекану, 5-РШО/. М, капецитабіну, ОЕТ, агентів, які націлюють на ЕСЕК, таких як цетуксимаб, панітумумаб, залутумумаб; інгібіторів МЕСЕ або інгібіторів тирозинкіназ, таких як сунітиніб. " При лікуванні раку передміхурової залози застосовують антитіло проти с-Меї у комбінації з одним або декількома сполуками, обраними з поміж: гормональної/антигормональної терапії; наприклад, антиандрогенів, агоністів рилізинг-фактор лютеінізуючого гормону (ІНЕН), і хіміотерапевтичних речовин, таких як таксани, мітоксантрон, естрамустин, 5, вінбластин, іксабепілон.
Променева терапія - хірургія
В одному втіленні в даному винаході пропонується спосіб лікування розладу, у якому залучені клітини, які експресують с-Меї, у об'єкта, де спосіб передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти с-Меї запропонованого даним винаходом, і, щонайменше, одного додаткового терапевтичного агента об'єкту, який цього потребує.
В одному втіленні в даному винаході пропонується спосіб лікування або запобігання злоякісному новоутворенню, причому спосіб передбачає введення терапевтично ефективної кількості антитіла проти с-Меї запропонованого даним винаходом, і застосування променевої терапії для об'єкта, який цього потребує.
В одному втіленні в даному винаході пропонується застосування антитіла проти с-Меї запропонованого даним винаходом для приготування фармацевтичної композиції для лікування злоякісного новоутворення шляхом уведення антитіла в комбінації із променевою терапією.
Променева терапія може включати опромінення або асоційоване введення пацієнтові радіофармацевтичних речовин. Джерело випромінювання може бути як зовнішнім, так і внутрішнім щодо пацієнта, який підлягає обробці (променева обробка може проводитися, наприклад, у формі зовнішньої спрямованої променевої терапії (ЕВКТ) або у формі брахотерапії (ВТ)). Радіоактивні елементи, які можуть використовуватися при практичному здійсненні таких методів, включають, наприклад, цезій-137, іридій-192, америцій-241, золото- 198, кобальт-57, мідь-67, технецій-99, йодид-123, йодид-131 та індій-111.
У наступному втіленні в даному винаході пропонується спосіб лікування або запобігання злоякісному новоутворенню, причому спосіб передбачає введення об'єкту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості антитіла проти с-Меї, такого як антитіло проти с-Меї запропоноване даним винаходом в комбінації з хірургічною операцією.
Діагностичні застосування
Антитіла запропоновані винаходом проти с-Меї також можуть бути використані для діагностичних цілей. Таким чином, у наступному аспекті винахід відноситься до діагностичної композиції, яка містить антитіло проти с-Меї, описане вище.
В одному втіленні, антитіла проти с-Меї запропоновані даним винаходом можуть використовуватися іп мімо або іп міо для діагностики захворювань, при яких активовані клітини, які експресують с-Меї, відіграють активну роль у патогенезі, шляхом визначення рівня с-Меї, або кількості клітин, які містять с-Меї на своїй мембранній поверхні. Цього можна дося!ти, наприклад, шляхом контакту дослідного зразка, необов'язково разом з контрольним зразком, з антитілом проти с-Меї за умов, які дають можливість утворення комплексу між антитілом і с-Меї.
Таким чином, у наступному аспекті, винахід відноситься до способу виявлення наявності антигену с-Меї або клітини, яка експресує с-Меї, у зразку, який передбачає: - контакт зразка з антитілом за умов, які дають можливість утворювати комплекс між антитілом і с-Меї; і - аналіз утвореного комплексу.
В одному втіленні, спосіб здійснюють іп міо.
Більш конкретно, у даному винаході пропонуються способи ідентифікації й діагностики бо інвазивних клітин і тканин та інших клітин, на які спрямовані антитіла проти с-Меї запропоновані даним винаходом, і способи моніторингу прогресу терапевтичного лікування, стану після лікування, ризику розвитку злоякісного новоутворення, прогресування злоякісного новоутворення тощо.
Придатні мітки для антитіла проти с-Меї, і/або для вторинних антитіл, які використовуються в таких методах, добре відомі в даній галузі.
У додатковому аспекті винахід відноситься до набору реактивів для виявлення наявності антигену с-Меї або клітини, яка експресує с-Меї, у зразку, який передбачає: - антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї або біспецифічну молекулу запропоновану винаходом; і - інструкції із застосування набору реактивів.
В одному втіленні в даному винаході пропонується набір для діагностики злоякісного новоутворення, який включає контейнер, у якому перебуває антитіло проти с-Меї і один або декілька реактивів для виявлення зв'язування антитіла проти с-Меї із с-Меї. Реактиви включають, наприклад, флуоресцентні мітки, ферментні мітки або інші мітки, які підлягають детектуванню. Реактиви також можуть включати вторинні або третинні антитіла або реактиви для ферментативних реакцій, де ферментативні реакції дають продукт, який можна візуалізувати.
Антиідіотипові антитіла
У додатковому аспекті винахід відноситься до антиідіотипового антитіла, яке зв'язує антитіло запропоноване винаходом проти с-Меї, описане в даному документі. "Антиідіотипове" (Іа) антитіло є антитілом, яке розпізнає унікальні детермінанти, як правило, асоційовані з антигензв'язуючим сайтом антитіла. Як джерело мАТ проти с-Меї з мАТ, їа- антитіло може бути отримане імунізацією тварини того ж самого виду й генетичного типу, для якої отримані антитіла проти Ід. Імунізована тварина, як правило, розпізнає й відповідає на ідіотипові детермінанти імунізованого антитіла виробленням антитіла до цих ідіотипових детермінант (антитіло проти Ід).
Антитіла проти Ід також можуть бути використані як "їімуноген" для індукції імунної відповіді у іншої тварини, продукуючи так зване антитіло проти антитіла проти Ід. Антитіло проти антитіла проти І може бути епітопно ідентичним вихідному мАТ, яке індукує антитіло проти Ід. Таким чином, при використанні антитіл до ідіотипових детермінантів мАТ, можна ідентифікувати інші клони, які експресують антитіла ідентичної специфічності.
Даний винахід додатково проілюстрований наступними прикладами, які не повинні розглядатись як такі, що покликані обмежити застосування винаходу.
Приклади
Приклад 1. Конструкти, які експресують с-Меї
Одержували конструкти оптимізовані за кодонами для експресії с-Меї, позаклітинного домена (ЕСО) (ак 1-932 і С-кінцева мітка Ніхб) або домен ЗЕМА з с-Меї (ак 1-567 і С-кінцева мітка Нібз9) у клітинах НЕК ії СНО. Білки, які кодуються цими конструктами ідентичні до облікового запису сепрапк ММ 000245 для с-Меї. Конструкти містять придатні сайти рестрикції для клонування й оптимальну послідовність Козак (Когак еї а). (1999) Сепе 234: 187-208).
Конструкти клонували у вектор для експресії в ссавців РЕЕ13.4 (опа Віоіодієх) (Верріпаїоп (1992) Віоїесппоїоду (МУ) 10:169-175), з одержанням рЕЕ13.4сМеї, рЕЕ13.4сМегїЕСОН:5 і рЕЄТ1Т3.4сМе(зЕМА-567НІіз8.
Приклад 2. Експресуючі конструкти для 505м1, 505 і (311-Н7
Одержували конструкти оптимізовані за кодонами для експресії важкого (НС) їі легкого ланцюгів (С) антитіл дС1 505мІ, 505 і СІІ-Н2 у клітинах НЕК. Білки, які кодуються цими конструктами, ідентичні до тих, що описані в Пат. США 6468529 (послідовності З і 4) для важкого й легкого ланцюгів 505мі, УМО 2006/015371 А2 (Фігура 13) для важкого й легкого ланцюгів 505, і
УМО 2009/007427 А2 (послідовність була виділена з багатьох фігур) для важкого й легкого ланцюгів 224011. 224011 також називається в даному документі (511-Н7.
Приклад 3. Тимчасова експресія в клітинах НЕК-293Е
Клітини ЕРгеезіуіе мМ 293-Е (субклон НЕК-293 адаптований для суспензійного росту й хімічно заданого середовища "Егеевіуе" (НЕК-293Е)) були отримані з "Іпмігодеп" і трансфековані відповідною плазмідною ДНК, за допомогою "293тесііп" (Іпмігодеп), відповідно до інструкцій виробника. Експресію с-Меї перевіряли за допомогою аналізу ЕАС5, як описано нижче. У випадку експресії антитіла, відповідні експресуючі вектори для важкого й легкого ланцюгів коекспресували.
Приклад 4. Тимчасова експресія в клітинах СНО рЕЕ13.4сМеї тимчасово трансфекували в клітинну лінію Егеезіуетм СНО-5 (Іпмігодеп) за бо допомогою реактиву для трансфекції "Ргеезіуіїе МАХ Іігапвтесіоп геадеп!" (Іпмігодеп). Експресію с-Меї перевіряли аналізом РГАС5, як описано нижче.
Приклад 5. Клонування й експресія моновалентних антитіл (молекул Опіродуф))
Для експресії моновалентних антитіл у клітинах ссавців константну область НС з Ідс4, яка втратила область шарніра (Сі) (амінокислоти Е99-Р110) і які містить 2 мутації Е405Т і М407Е в області СНЗ, синтезували у вигляді оптимізованого за кодонами конструкта в експресуючому у ссавців векторі рсОМАЗ.З (Іпмігодеп) і назвали рОпітТЕ. Шляхом вставки оптимізованої за кодонами константної області в область людського легкого ланцюга каппа в рсрмАЗ.3 сконструювали окремий вектор.
Релевантні області МН і МІ. вставили відповідно в рОпітЕ і рКарра з одержанням векторів для експресії важкого й легкого ланцюгів специфічних антитіл. Котрансфекція векторів з важкого й легкого ланцюгів специфічного антитіла в клітинах НЕК-293Е (Іпмігодеп), приводила до тимчасового вироблення моновалентних антитіл із потрібними специфічностями. Очищення антитіл здійснювали за допомогою афінної колонкової хроматографії із протеїном А (як описано в прикладі 11).
Приклад 6. Очищення Ніз-міченого с-Меї смегЕСОНІ5х і сМме(5ЕМАНВІі5 експресували в клітинах НЕК-293Е. Мітка Ні5 в смМе(ЕСОНІ:» і сМеЗЕМАНіх дозволяє очищати їх за допомогою афінної хроматографії з іммобілізованим металом. У цьому способі, хелатор, зафіксований у хроматографічній смолі, наповнений Сог.
Надосадові рідини, які містять СМеЕТЕСОНІ: і СМеї5ЕМАНІ5, інкубували зі смолою в періодичному режимі (тобто в розчині). Мічений Ні білок сильно зв'язується із гранулами смоли, тоді як інші білки, присутні в культуруральній надосадовій рідині, зв'язуються не сильно. Після інкубації гранули вилучали з надосадової рідини й поміщали в колонку. Колонку промивали для видалення слабо зв'язаних білків. Потім елюювали сильно зв'язані білюи сМегЕСОНІ: і сМеІ5ЕМАНІі5 буфером, які містять імідазол, який конкурує з Ніб5 за зв'язування з Со. Елюент видаляли з білка заміною буфера на знесолювальній колонці.
Приклад 7. Процедура імунізації трансгенних мишей
Антитіла 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 031, 035, 039, 040, 045, 093, 095, 096, 101 ї 104 виділяли з наступних імунізацій: одну мишу НСо20 (1 самка, штам 9б2713), одну мишу НСОоїЇ7 (самка, штам 9052714) і дві миші НСоіІ2-ВаІр/С (2 самки, штам
Зо об2811) (Медагех, Сан-Хосе, Каліфорнія, США; для посилання див. вище параграф про мишей
НиМабр, УУО2009097006 і 052005191293) імунізували кожні два тижні по черзі 5хІ06 пухлинних клітин МСІ-Н441 внутрішньоочеревно (в.о.) і підшкірно (п.к) 20 мкг білка сМесгЕСОНІв, пов'язаного з гаптеном гемоцианіну лімфи слимака (КІН).
Антитіла 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 087, 089, 098 і 181 виділяли з наступних імунізацій: дві миші НСо20 (1 самець і 1 самка, штам 02713), одну мишу
НСо!ї2-раІр/С (1 самець, штам 502811) (Медагех, Сан-Хосе, Каліфорнія, США; для посилання див. вище абзац про мишей НиМаб) імунізували кожні два тижні по черзі 5хіІ05 клітин СНО-
К1І5М, тимчасово трансфікованих СМеЕГЕСО, внутрішньоочеревно (в.о.) і підшкірно (п.к.) 20 мкг білка СМеТЕСОНІ»5, пов'язаного з гаптеном гемоціаніну лімфи слимака (КІН).
Здійснювали максимум вісім імунізацій кожної миші, чотири в.о. і чотири п.к. імунізації в крижі. Першу імунізацію проводили клітинами у повному ад'юванті Фрейнда (СЕА; Осо
І арогафогіе5, Детройт, Мічиган, США). Для всіх інших імунізацій, клітини ін'єктували в.о. в РВ5, а сМегЕСО, з'єднаний з КІН, ін'єктували п.к. з використанням неповного ад'юванта Фрейнда (ІБА; ріїсо Іарогаїйогіех, Детройт, Мічиган, США). Об'єднували мишей, щонайменше, із двома послідовними титрами с-МеїЇ-специфічного антитіла, рівними 200 (розведення сироватки 200/1) або вище, визначених в аналізі антиген-специфічного скринінга ЕМАТ, як описано в прикладі 8.
Приклад 8. Аналіз гомогенним антигенспецифічним скринінгом
Наявність антитіл проти с-Меї у сироватці імунізованих мишей або в гібридомах "НиМар" (людські моноклональні антитіла) або в надосадовій рідині культури трансфектом, визначали в аналізі гомогенним антигенспецифічним скринінгом (четвертий квадрант) за допомогою технології "РІноготеїгіс Місго моїште Аззау ТесппоїІоду" (ЕМАТ; Арріїеа Віозубіетв5, Фостер-Сіті,
Каліфорнія, США). Для цього використовували комбінацію З аналізів на основі клітин і одного аналізу на основі гранул. В аналізах на основі клітин, визначали зв'язування з ТН1016-сМеї (клітини НЕК-293Е, які тимчасово експресують позаклітинний домен рецептора с-Меб отримані як описано вище) і з НТ29 (які експресують с-Меї на клітинній поверхні), а також із клітинами
НЕК293 дикого типу (негативний контроль який не експресує с-Ме). Для аналізу на основі гранул, визначали зв'язування з 581016-сМеї (смМегЕСОНІ»5, отриманий при тимчасовій експресії в клітинах НЕК-293Е, як описано вище, біотинільований і спарений з покритими стрептавідином гранулами). Зразки додавали до клітин/гранул для зв'язування з с-Меї. Потім зв'язування бо "НиМар" детектували за допомогою флуоресцентного кон'югата (козячі антитіла проти людських
Ідс1-суб5; Уаскбоп Іттипогезеагсі). Химерне антитіло специфічне до с-Меї 505мі| (отримане в клітинах НЕК-293Е) використовували як позитивний контроль, а змішану сироватку НимаБб і
НиМабр-КІН використовували як негативний контроль. Зразки сканували за допомогою системи детекції "Арріїєй Віозубхіет5 8200 Сеїїшаг Оесесіоп Зузіет" (8200 СО5) і значення "імпульси х флюоресценція" використовували як дані для виведені. Зразки встановлювали як позитивні, коли імпульси були вищими ніж 50, а "імпульси х флюоресценція" були, щонайменше, у три рази вищими, ніж у випадку негативного контролю НимМар-КІ- Н.
Приклад 9. Одержання гібридоми "НиМар»
Мишей "НиМар" з достатнім розвитком антиген-специфічного титру (визначеного вище) забивали й відбирали селезінку й лімфовузли, які фланкують абдомінальну аорту й порожню вену. Злиття спленоцитів і клітин лімфовузлів із клітинною лінією мишачої мієломи здійснювали елекрозлиттям за допомогою системи "СЕЕР 50 ЕІесігоїизіоп Зузіет" (Суїо РиїЇбе Зсіепсев,
Глен-Бурні, Меріленд, США), бажано відповідно до інструкцій виробника. Планшети для злиття скринінгували за допомогою антиген-специфічних аналізів зв'язування, як описано вище, а клітини, позитивні за цим аналізом, тестували в аналізі ЕКК-фосфорилювання "АІрпазсгеєпо зигейгефФф», і в аналізі оцінки афінності "Осіеї", як описано нижче. Антитіла 031, 035, 087 і 089 нарощували й культивували відповідно до стандартних протоколів (наприклад, як описано в
Соїїдап .Е., Віегег, В.Е., Магашіев, О.Н., ЗНнемасі, Е.М. апа 5ігобретг, МУ., єдв. Ситепі Ргоїосоїв іп
Іттипоіоду, допп Уміеу ве Зопв, Іпс., 2006).
Паралельно клонували антитіла 005, 006, 007, 008, 011, 012, 016, 017, 022, 024, 025, 028, 035, 039, 040, 045, 058, 061, 062, 063, 064, 065, 066, 068, 069, 078, 082, 084, 093, 095, 096, 098, 101, 104 і 181 з використанням системи "Сіоперіх" (Сепеїїх, Гемпшир, Великобританія).
Специфічні первинні коміркові гібридоми висівали на напіврідке середовище, приготовлене з 40 95 "Сіопетеаїйїа" (Сепеїїх, Гемпшир, Великобританія) і 60 95 повного середовища Ну 2х (Нусіопе, Уолтем, США), і виколювали приблизно 100 субклонів кожної первинної комірки.
Субклони тестували в антигенспецифічному аналізі зв'язування, як описано раніше, а рівень дб вимірювали з використанням "Осіеї" з метою відбору найбільш специфічного й продуктивного клону з первинної комірки для наступного вирощування. Наступне нарощування й культивування отриманих у результаті гібридом "НиМар" проводили відповідно до стандартних протоколів (наприклад, як описано в Соїїдап 9.Е., Віегег, В.Е., Магодшііев5, О.Н.,
Зпемаси, Е.М. апа Зтобег, МУ., вав. Сцтепі Ргоїосоїв іп Іттипоіоду, доп УМПеу в 5опв, Іпс., 2006).
Приклад 10. Мас-спектрометрія очищених антитіл
Малу аліквоту 0,8 мл антитіла, що містить надосадову рідину гібридом з 6б-коміркової стадії або стадії "НурешШавк" очищали за допомогою колонок "Рпуїїр", які містять смолу із протеїном б (Рпупехи5 Іпс., Сан-Хосе, США) на робочій станції "Зсісіопе АН 3000" (Саїїрег І Гезсієпсев,
Хопкінтон, США). Колонки "Рпміір" використовували відповідно до інструкцій виробника, але буфери замінили на: буфер для зв'язування РВ5 (В. Вгацп, Медіса! В.М., Осс, Нідерланди) і буфер для елюції 0.1М гліцин-НСІ рН 2,7 (Ріка ВівсдеІ-де Наеєп, Букс, Німеччина). після очищення зразки нейтралізували 2 М 2М Ттгіз-НСЇІ рн 9,0 (Бідта-Айагіс!і, Зейндрехт, Нідерланди).
В іншому випадку в деяких випадках більші об'єми культуральної надосадової рідини очищали за допомогою афінної колонкової хроматографії із протеїном А.
Після очищення зразки помістили в 384-комірковий планшет (Умаїег5, планшет з 100 мкл квадратними комірками, рагі" 186002631). Зразки деглікозилювали протягом ночі при 37 "С за допомогою М-глікозидази ЕР. Додавали ОТТ (15 мг/мл) (1 мкл/комірку) та інкубували протягом 1 години при 37 "С. Зразки (5 або 6 мкл) знесолювали на "Асдийу ОРІ С Му» (Умаїег5, Мілфорд,
США) за допомогою колонки а ВЕНЗОО СТ18, 1,7цт, 2.1х 50 мм при 60 "С. Воду МО і ацетонітрил категорії ГС-М5 (ВіозоЇме, саї по 01204101, Валкенсваард, Нідерланди), обидва з 0,195 мурашиною кислотою (РішйКа, саї по 56302, Букс, Німеччина), використовували як елюенти А і В, відповідно. Мас-спектри із часопролітною іонізацією електророзпиленням записували в режимі реального часу на мас-спектрометрі "тісгОТОгЕт7мМм» (ВгиКег, Бремен, Німеччина), який функціонує в режимі позитивних іонів. До аналізу шкалу 900-3000 т/7 калібрували за допомогою суміші для настроювання "ЕБ" (Адіепі ТесппоЇодіе5, Санта-Клара, США). Мас-спектри піддавали деконволюції за допомогою програмного забезпечення "байгаАпаїйувіз"М боїймаге у. 3.4" (ВгиКег) при використанні алгоритму максимальної ентропії для пошуку молекулярних мас між 5 і 80 кДа.
Після деконволюції отримані маси важкого й легкого ланцюгів для всіх зразків порівнювали для виявлення дублюючих антитіл. У порівнянні важких ланцюгів було прийнято до уваги можлива присутність варіантів із С-кінцевим лізином. Був отриманий список унікальних антитіл, бо у якому унікальність визначена як унікальна комбінація важкого й легкого ланцюгів. У випадку
Зо якщо дубльовані антитіла були знайдені, результати з інших тестів використовували для того, щоб вирішити, яке з антитіл є кращим матеріалом для продовження експериментів.
Приклад 11. Аналіз і клонування в експресуючі вектори послідовностей варіабельних доменів антитіла проти с-Меї
Загальну РНК НиМар проти с-Меї одержували з 5х105 клітин гібридоми, а 5'-ВАСЕ- комплементарну ДНК (кКДНК) одержували з 100 нг загальної РНК, за допомогою набору "ЗМАКТ
ВАСЕ сОМА Атріїйісайоп Кі" (Сіопіесі), відповідно до інструкцій виробника. Області, які кодують
МН (варіабельна область важкого ланцюга) і МІ (варіабельна область легкого ланцюга) апліфікували ПЛР і в рамці зчитування клонували у вектори з константною областю рої (яка містить оптимізовану за кодонами, повністю синтетичну, константну область важкого ланцюга людського ЇдДс1 (алотип Її) в експресивному у ссавців векторі рЕЕб.4 (І опа Віоіодіеє5, Слау,
Великобританія (Верріпоїоп еї аї. (1992) Віоїесппоїоду 10:169-175)) і рКарра (яка містить оптимізовану за кодонами, повністю синтетичну, константну область людського легкого ланцюга каппа (алотип Кіт3) в експресивному у ссавців векторі рЕЕ12.4 (опа Віоіодіе5, Слоу,
Великобританія (Веббіпдіоп еї аї. (1992) Віотесппоіоду 10:169-175)) за допомогою незалежної від лігування стратегії клонування (Азіапіді5 еї аІ. Мисіеїс Асіаз5 Ке5. 18:6069-6074). Для кожного
НиМар 12 клонів МІ і 8 клонів МН секвенували та розраховували їх теоретичні маси й порівнювали з доступними мас-спектрометричними даними антитіл. Послідовності подані в переліку послідовностей і в таблиці 1 у даному документі нижче. Послідовності СОК визначали відповідно до КаБбаї єї аїЇ., Зедиепсез ої Ргоїеїп5 ої Іттипої/одісаї! Іпегеві, Бій Еа. Рибіїс Неайн
Зегмісе, Маїйопа! Іпзійшев ої Неапйн, Веїйезаа, МО. (1991). У таблицях 2 і З поданий огляд інформації про послідовності антитіл і більшість гомологічних зародкових послідовностей.
Таблиця 1. Послідовності варіабельної області важкого ланцюга (УН), варіабельної області легкого ланцюга (МІ) і послідовності СОК з НиМар ш СУСЕУОВСАБУНКРСОЗВУКУВСКАВОСТКЕЕХОВОМ шахух вт ми: сні ояте УВОАЕООСЬВИМОСВІВЗРТОТАМСАОМЕОСВУТІТА шо тІясоЗІМуУТУва | й
БО ІВ Мої ун 005, сові БУС . ши
ЗО 10 МО З ун осо, СОБІ. |ВІБРІССІАМНУВОМКОС ши
ЗО ТО Мо: я Мн обов, брез |бУуЄТрИВОотТКпт Й пІОоМТОоВеелВОЗАВУсоВиТІ сао ЬвИ й ГТІЗБГОБЕОКАТЕУСООУМБЕРРТЕООСТКУВІХ
5ЕО ТО Мо: б У 008, СОБІ ЗАВОСТЯВИТА
ЕС ІБ Мої 7 0 бо, СОКЯ ААБОЦОЄ
БО ІО Мо: 5 у 005, СБЕЗ ООУМЕЕВЕТ МИ
ШИ Ше ОМОБІОЗСАЕУККРОЗОУКУВСКАНОСТЕВЕКЕТОМ
ББО І0 Мої 9 не веб ГуВрАРСОСТЕНМСКТЕРТЬСТАНУЛОМЕОСАУТІТА ни І і ЮКОТатАТМВСТВСВВЕОТАУЗУСАВОУСТОВАВАЕ З ст рІійООСТМУТУВ яко тб оМо: 10 0 ун обо, Срві ЗЕОІЄ - - 5 008, СО ! пн
ЕС ІБ Мої 1 000УНОООБ, С0ОКО ОБІКРІШОТАМТАОМКОЄ
Ше І Мої: їй МН боб, СОБЗ ООУЗТОВАОАКВІ Й ! п СП ТБІОМТОЗРОСЕБАСУСОВУТІТСВАБОСТЕВИСАЙУ
БЕО то бог 13 у» 205 ООКРЕКАРКУЬТУААВВІСЯСсУраВЕВОоЯОоВОТОКт ї :
ЦТІЗВІОРБОРАТУУСОЗУМЕУВРЕЕСОСТКУЄТК !
ШИ | о 1БЕТІЗЗСОРБОБРАТУУСОСУМЕУРРТРСОСТЕУВІК
ІБК 10 Ма: 140000, 005, СОВ1 ОБАКОСТЯИСА ЩІ. дв ел о й Вк пи пив ДА пристінні АП іісті дрів лови пн патент
ЗЕМ Іо лог 1 |Ме ао6, Соня |АдЕВТОЯ
КО ТІВ мах 165 00 ОО, совО дОуМаувей т
Го НННЕ Несе ЕТ
ЗЕО Ір Ще 17 уп бо8 ІУВОМЕОКОосЕИМсІтУворавтвуараКОСОУТІВА бо я що ПЕСІСТАУТОМЕЗІКАЗОТАМУУСАВОСКІТСКЕОВУЙ соотьитуВВ. сон овн енинвноово шення сети нн ніки ши и
ПЕ ТО Ме: 18 УВО 005, СОБІ О5УНІЮ і і дрова вав вва в вач сірі уки піт ори попиті ідо лил вікі лико прі пит піна стрий пісі псів подій олісвав
БЕО тб Ме: ї15 УН 008, СонО тІЄРСОБЕТКУВЕОКОЄ
КО ІВ Мої 29 КлібоБ, есРЯ Еттонтях Шк : ПІЙБТОВРЕВБОАЕУСОНУтІ САВА
БО ІВ Ко: 23 іут, дов кос АВКТІТУПЬК: КАКтркЕН
І ПТІЗЯТОРЕОКАТУХСООЕМОУРАТКООстТКУКІК сво 10 оМо: 25 МЕ 005, СОКІ НАБОбІЗЕАгА , і, Со ІВВАВА
БО рома: 23 УТ бо, Сова З рАаокя
БО ТО Ме: й У Зоя, СОБЗ ООРКЕтТРЕТ й о Нет дя У ою, ОКО ОК
ОУБУНБОООУУСРОКНСНЕЗСААСРІГООХАМНИ
ЗвО то Мо: 35 бноаоо ГУВОАРСКСКЕНУАУТВУОСВМКУТАПЕУКСВЕТІВК.
ОМ (омекмті т оМнЕ ВдЕОТАУУСсАВЕСІМКСВ ібУкопеовотруТУВУ
БО ІБ МО: 58 ОН ОПЕР, СБ 8УАМНО 000
ЗО 10 ЩО: з і ВЖАМЯ шу
КО Ії Ома: 97 ув 055, ОПО МІТОК тАННУКО
Їж то ме: бв ув оп95, РЕЯ Титов свиня
ПОТОМ ТОБЕЗВУВАЕУСОВУТІТСКАНОСІВОИ САТ І
ЗЕО ІВ Мох 25 У об2б ОНКРСОКАРКІТІХААЗВЕОВСУРОВУВОВОВОТОКТ
МлтІВЕЄСОРЕРЕАТУХСОВАВОКТИТЕСОпТЕУВІКО 5БО ірбоМо: 30 УБб 099, сові БАБОБІБЗМНІА
БО ІВ Мо: З Гл 029, сова |ВАБОМОВ ав ІВ Мо: 325 й» 025, СОБУ ОБАШОВТИТ | і
ЕМОСЬВІСССТУВОСВООВЬВОСУАБОКТКВВТАМУМ вно тт хо: 33 фун оба УВОАРОКСТВИУВАІВОБООСЯТУТУВВУКОВЕТІК ! НАМЕКМТІУТОММЯТ МАКЕТА САКОВОВОММО твсумсовтьУтУєв
ЧО 10 Ме: 35 0 1УНОШИЯ, СОБІ 5УАМА Щш ШИ
ЧО 1 МОЇ 5 но й, СОН? АІС ТуХиОВУКЕ т
КО ІБ Мо: 35 УНН 09, СОВЗ роси Моткоу
У КВ Мо: 26 ХП ОСЕЛ, СНО ОрООоКоКМоТЕвє
Я ПІОМТОВРевуУЗАВУСОВУТІТСКАВОСІВННОАИХ
ВЕС ТО Мо: ТЯ. У бйЯ ОНКРОКАРКТЬІТААВІОвсМеЗАТВОВОВСТОТ
Й | ! ТІВ ОРКОГАТУУСОСАМАКетТЕсСОСТВОВІК
ЕО ПЕТ ЯЯ 05, СБ ТиАСОСТЄНЬХ
ВО ТО Ме: З т; В5Я, Сов вав 0 ШИ
ГЕО т Ме: 40 ТУТ 054, Сода ООдМОКеТ !
ЕОГБУОВСАБУККРОКЕБКІЗСКОВСТВЕТОУЙТСМ
І | пиБІБТАУлИОКМЗСиКЕОТАМЕжЖСДВОКОТОВКОМ : ше | ІссстІМТУВ
БО ІБ Меї 42 00 УНН О0П25, Брі |У пи
ЗО Тр оМої: 43 ун 035, СОВО ІІУРССООТВХРЕВОЄ 000 пи
КО ТІ) Ме: 44 0 ун оба, СО ОБЕТОЕЕВХ 0 пи Щі
І АІОСТОБРЕЄТЗАВУЧОВУТІТСВАВОСТВВАЦАН
БкО т оме: 45 ут 035. ООКРОКАРКЬСТТРАЗВСЕБСТРЗБЕОСЯСЯЄТОЕТ
ЕТІЗВІОРЕОКАТУХСООКМОУРМУТЕСОСТКІВІКО
ШЕО ТїбоМо: 465 У 035, СОБІ ОБАЗОБТББАТА во б Мої: 47 00 М 035, СОЯ ВАШ ЦЮЯО00000 ПИ
КО 1 Ме: Я |У, 035, СОБО ООКМОЖУРМИТ.
ПТ ФО оЕВоССЕУОРОСЯ ВІ БСААЯСЕТВООтАМЧИ ее ТВ Мо: 48 00 рН оба ковескотевувут В СоЗІту ОУН
ШИ і ОХЕКМТОЖООММБІВАБОТАУУУСАВОВОИСВОТИ : вострУТУЄЗВ Е
Б ТВ МО; я УНН оба5, сові БтАМУ | І
БЕ ТВ о Ме: З ЩУН йаБ, Срво УТсоБОоСІТУТАрНУКО і жо та мат о9нобяв, Сов ОрВсжо5ОУ 000000 ШИ ШИ
ЕІМУБТОВРАТЬВСОВСКНАТІЗОВАБОВУЮВУВАНЯ
КО ІВ Мо: 83 ут 045 СОКРООЛРВІЬІУСАЗМВАТОТВАВКБОВОВОТОК ! | пТІДЗЕЕРЕПЕДУТуСООВеМИВЕтТЕОорОотТкМеК
ЗО 15 Мої: 55 У 045, СОДО ОСБОМНРЕЇ ши
І" | ЕУОБУЕВОВОСУКРОСВБКОВСААБОКТЕ ОТ УК
ЕВ ІВ Мел 55 сл о5а УВОТРЕКНЬЕКУАТІЗРОСЗУТУТРОВУКОВЕТІВВ " ши ібмакнеоУсОоМаікаЕОтАМуЖсАВЕсОУ тво іжУнопуМсОострУтуУвя нн я . А МОосУумвостоутуяЯ
БЕО ТБ она: 8 ОУН ОбОВ, БОБ: 0УтМ ів ї0оМо: 59 рН ойБе, СВ? ТІООбОУТуЖРОВУКС
ЗЕ 10 Мої: 60 УНН 058, СОБІ РоПУУУСВООчУМОВУ Е ! ПОГ ОЗрРОВОАОУЧОКУ ТІ ВАЛОСЬВВАКАЙТ І
ВЕО ІЗ Мої ВО м 058 ВОКРОКАРКЦЬІХРАВЕСОЗОУРЕВРОСВОВЕТОКТ
ПТІБЕГОРЕОЕАТУУСОДЕТВУРОТТЕСООТВТНТИ
ЇЗвОо їб Мої 28 м 055, СОБІ1 ВАЗОСІЯЗАБА п
БЕО ТО Мат: 83 СЛ. 058, СОоВ2 1 ПАБЗОВО
ЗО ІВ Мо: 65 Я 055, СрКЗ ООКТЕУВОЇЖ Що п спсповБзЗазеарУКВООТІвпТтоАУуВосятавоссНаХ і зктКдргоКошЕНТОЖ ТЕТ яко ув ме: 5 ун ооєї дУОВеКМОСБІ КК тАВОТАТУТСАВаВЕОКЬТО і ОСтТНУТУЗИ, де МІ є будь-якою о івмінокислотою; бажано С, 5, ХХ ваз А
КО І Мо: бб МН Обі, срві зсснВМа Що Й
БО ІВ Мої 67 ун 0БІ, Сов? ГІтУнЕантУюВееЬКУ, де КІ ж будь-якою амінокислевою, бажано б, 5, її ВбО А ндіілювй ві вини зокисленою, бажано мМ, б, ї ОА
ЕС троМо! ев їй бв5і, сова 155УОКЬТО
ПІСМТОБРЕБОУВАЯУСОВУТІТСНАБОВІЗИСАНУ
БО то Ме: 59 У 061 ОНЕРСКАРКЕІТІААВІТОВОоУРІАКеСВОВсТОКТ
ЕТІББІОРКЕОРАТУХСООАМОКРІТКООСТВЬНІК як і шо ТАТІ УМА ТІ ІК, шЕБО І Мо: 70 МБ 061, СОБІ ВАБОСТеЗНА й
БО І0 Мо: 71 |У 001, СОБКО ААБ5ВЬОБ ШІ ШИ
! - нні ; ет шп-х пдтттнічкіттннннтніння
ГИ хе тету - яошоя ех є кт ти т-
ВО ЇЇ М тх У о, Ов (Оодкогет ооо рвечовиУКВВсТоиТСАТУозСсСВІВБОЮНВИ ! зиІВОоОРоОВсЬКиИсхі тво рКЕВКИТІ : З н дя «тТхтне те дроті МОгМтеК ХР ву Кі п
БО ТВ Ме: 73 У ови АЧРВЕКНОВЬКЬВКУТААОТАУТУСАВЕВТОІТТО
Кб; де хі є бедь-яков амінокислотею, сь р о т -к і ражано С, б, їх З0О0 А і че гро Ммеат 7й У пай, сі Бони Ї
МЕ я тек па ЛОВ ОВО НО о о о косо рр у тону уч принт зве то ме: 5 Зуобео. срво хХ1ТТНаОокТОМЕІЖВ, де кі ж будезякоОою
ЗО 0 Ме 5 МІ ОПек, КІОКЕ гів ад щоки я ! ашінокислотою, Свжано С, а, її аа А а ТО Ме: 75 У ошОб2, сова чаБУрІСТо
ВІДМОВ ЕВУуВАНУСКУТІТОВАЗООВНЬКМУ З
ІЕеЕер ЖЕ Ма: ЛІ У Би сонКРОБАРКиІхлЛАВБООБОУрОЕВава т і ТІВ ОРЕОБАТІСОПАМОКРЕККООВІ ІК ни в я СО снкопннд нд нку кнннжкіннпданнжюцини нини юю канннниккнлннжюниннннінкинкнннн ніжинннлинкнлнннжжатаяжжиияі їж тт Моє 7 тп? СИ вдоепсіващів шва м Мет о ча Ма, СОКІ АБО А Ї ши рю ОТО 5. й й їх са ие
ЗВО 10 Ме: ВО Б/Ль 062, СрвВа сООАМарвІї жі ШИ МТ и ШО МН МИ
І ор оБесвОоВУКЕВИТЬсу г слузооо гоооВНоХ ї ко лю як 5 ие рив. "че суку уж жк пил вИЇВОРЕСВОСІЕЙТСХІІХНВСМГТУрМкЕКОовВИТІ збе ов Ь - п «її А СІК АХ. ою ся каже м аж х хи иа ек ТО Мої ві на БА Е УОеБЕМоСиВ КІ ЗВУТААСТАУУЕСАВЕВУ ВІ СТО г с т - с ет -уюжа жит ол тут Н ! що, дв ха є будь-якою ямунокислотою,. ! важано їй, й, Її 800 А руту и ве осно Ше у Мово слоірнии ІМссиен нинипон пк ин и нспно нн !
ОО 10 Мох НО ин ба, СВІ 55555
Ісюе чт ма. да Зоя сне а ОХІТЕНОСМТУОКВБІКО, де Х1 є будьсякою а ІМ Ма: по У Ба, ЦОве , і щоок ощо і амінокислотою, бажане С, 8, ХУ або 5 ниви ПОПОВ ск зн ов ві о а соді Ана В З во овнм в
КО 10 Ма: 84 ув па, СВУ ББЖ В злих тус Зх Є Ки хо що де ятки писк тн хі
І шшМмтОобРОЗУСАВЗУСВАУТІ ТСРАВОВІ ВКА м ту дк Ки а дя ж ков сома оч і и а оо 5
ІЗЖО то Мої 85 У. пай ОНЕРОКАРКТІТУААВБОВСУРЕВЕВОВОВОТІКУ у ба х сх они тж я ен так Кен тони но і
БТІБВСОВЕрКАТУЖОСООАМОКРІТЕЗОСТЕБЕТК нан нн Е запа наст тт вен теп тек тт Ек тт тт ко ТО о Мосг б Ук още4, СОКІ ІВАВОСІВИА Н і рода х дитя ІБ оно: 87 061. СВІ ІААБЕНОВ 220
ЗО ВВ ОМОоЇї 87 У па, СБ АБО ання ванна нн ніна вон и
ЗВБИ КО Мо: 80 ги Об, Ср ОдМСКвІт рт тут іннті т тянисжннтя сх вдання нн ни інки повна опа осло он вні орав повинен срівинни і | ОБО щаезпьУкКрРІОТВБТСАМБсСОСвІВВОЗОЗУ ВИ і . ЗБІВОЕРОКОВЕКТОХОТНВСВ ТНЕУ ТЬ
ЕО 10 Мо: 59 чн дав МОВВКМОКЗСКОЗЗУТААВТАУТУСАВВВВТЬТОМ і своатьттувяа, де хі « будь-якою і аміхнеокислогою, бажане Се 8, Ж шо А. акОо Її ме: 50 У бе, Сп БОС ЕМВ; І сну кож жітті ж тлі ж ження пи и ово орки ооо нини куванні оч жу мк З Ін пав зтХкІ ІХЛІМНЕОВТУ тик, ле ше є будь-якою ака 10 Мої З (ув рев, ср її. їй нов гожшно я гвмінскислотою, бажано Су 8, ї або А педдетудеттт др ТЛО,
БЕ ТІ Меси Ун о пад. сова феБУГУУТИ нини поява нов пожовклі а и А А і. пІОСОМТОВР»ЗИМЗдАЕУСОКНИТІТСКАВСЮ ВИ САМУ яакО 105 МЗ: 53 У об ОНКРОКАРКЬБІТААВЕБОВСУВВВЕОВОВОТОЕТ і ГБТІВВГОРЕОКАТУУСОСАМВЕВІТКОССІВКІК
Гіркллай рив на істо піст и дп стінних Пити ли; рин покотився " пе Ї вкО то Ме: Зб У оБ8, СОВА ОБАБОбІББМА ко ІВ Мо: 95 МІ; ОБ, СОВИ ААББГОВ і прин оду з ооо о и ртуті ніко рі п пи п нки т тини ин 5КО 10 Ме: Зб 0 Ше, СОР ОСАМУКРІТ ре нт нн ТИЛ Ен вот ет ет тттнтттонтетнетеетрентн і Оу уюасзАВУККРОАНУКУВСТІСН ТЕТУ І ї наве ами шву кИиМм му Ам ти він ун і
Е КО То Мел о 57 їшн аа УкудранзоемМо А УМОВ ТМ ОМ кБАЗМ !
КО ! птетатдимнов Ол тАУХуУсАВОЬВОТНУЄКОХ ще нодотрУуТИВВ !
ПЕН ШК дня ЗБ оон В ін ИН а ИН си ож Од рт рт рекет
Ме: 58 Нова, СК ЗО І - панно ово три вк моти еп чи отри мая пом пери кри - сли коропи тов ровом ода ов
ВЕ ТО МО: З ща вЕВ, Соц ЦІ5АХМОТТМТАОКІЄ пет сспареичиме и - чут ; усе у п ми он т кн і о о о п о о ин
БЕ БО Мо: 10Н 5Уя бе, Сов рОВОоТМЕРОох
М С и МН
ОТОМТОВРеВУВАБУСОВУТІТСВАВОСТЯМИСАМК іо Тома: кл з НКР ОКАРИБОХХАДБВОВООсУ Рева
А - тору ву отит ки в я ; затут ти - г. тре І
Е БРІВБББОВЕОКАТУУСОСАМЗЕРІТКСОСТНЬКІК
ІЗКО ІО Мо: 105 МБ 069, СВ ОБАБОСТОМИЬА і око їмо: 13 м ЧаЗ, СОВИ КАВВББОе : кетони тк КЛИН ЕС У ШИНИ "У о У ВВ ком т СИЧ оон нтів ов оно пп нт сто ння
ГБО ІВ Мслоуба Її ЗБ, СОЦ сОСАМЗКВИ й подо і айв Ніро нн сн сім ян мсв вн и НИ ВИ НИ А и ни
ІвУсрУОБалЕУКвРОКИСКІВСКОСпПОУВКУВКУТ ОХ ев ІВ Ко: 105 У ВОЄ УБОоМмеоКкапвиМоІгУвораотАУЗеЕВКоОсОУТІВА шо 0 Ме: З Мп б жк ств ти ект ТО ДК ВОРАН У КД КУ Ин ТУ кю топі поттахуки
І й пЕшІБІАЖІСТеоКаАВИТАМХТСАНОСВІТОСЕУЯ сестиУтивЕ
КО то Ме: 305 УВО ОБ, Сорі ЕКО
ВО І оМе: Щї07 УК опбе, Сова ІТтТРОВБОТВУВРВЕОЄ і
Бердкннсьс она ас ьнні нини тт по ій ИН ин
Пес ие шк флешок ту пу т ек яд да жи тут А ізКОо І Ме: з08 шо 0956, Сова дОоБІТОрешу і ї 7 й й й й й т й Ся с сади мя я ж ка зв докт й у У п х
І АТСБІОЗЕОВБНАБУБОКУТІТОКАЗОЗТЕСАТГАМІ
БО ТО Мої 05 Ух п3Б СОЖРСКАРНОВІХААВЗСЕВОУРОВЕЯСВСООТоЕт
ІЙ , ТІВ БОБЕВКАТЕиЖСОСЕМЕРІТЕОСвОТКУКТИ іде От ота ; пи пл ї корту чення нн іо прин аж і Ме: 110 Б ооЗа, сову БКАВОБІЗЗАМА
ГЕО ІБ оМОої: 111 0. 096, СОВ- ААБЗБЕВ Е й с ні НН опа лась НН і а він осі нс о НН о ОН о о Ов ово се кн, ве ке ях як ок ет Ту ахктІ ви рут х
БЖ ТО Мез 1185 ри, пев, Сів ОО і й іш : КАК дінки пп ік т дат тадянвні ння й ї Й Н ря тих су мости рик т ги гам лит г ес
МУсСОуМОВСАБУККРОАБВУКУВСКАОСТТЕТМЕІВИ зво ту щас 113 ун пз ТвОодросотвИМстІЗАМОНТрувОоКУ КУ ТМ ши лм і моз тні пожежу тв оти по пк жук ТК рун --Щї і іртатетАуМЕСВЗОКВОрТАУКУСАВВНХХСоВО РЕ
І покори ух ж уннкжоет . - ТНСОСТІУ Бе ко т Ме: 112 рун оп, ЄБВІ МЕТ і урану кра й у. ори у х. зом кіт вве Ж. ей
КО Ї0 Мах 315 ЗУБ 095, СОБО ХІЗАЕМОоНТОЖОСКУЮе І ук урн ДІЛІ ЖИ рн та - пд А фнірищня пиши ав ТО Мо: Зб УНН пОоя, сов ЗНУ ОоБсБвКгВх тт тт тт яння теттт тт тт
В Пп є і попе рю ин ит тя піІбмтИЗевІАВИСИВИ ГЕ ТСсКАВЮВЕВМИМАЩ і вка ло Мет 17 Ме 09 (ОКРЕКАРЕЗБІХАВНУЦОВОУЄЕНЕНОВОВОТОВКТ Ї й . ІМТіБОБОБЕБЕАТТУСНОТКОУРИ ТЕО КУКІК
ЗУ ІБ Ма; 1185 бро, пові пАБраТаМИА
ЗО ІІ» Мат 119 МБ 058, Сов? АдЕТБОВ фут р нтиюннннктнннсттннтнннтннн пути ни пдв ше т тво ТО Мет: зо МО ше, Со нок і
ЩЯ покине В муч хо гм к ких аа р к чо гутосьУккКРОАВУКУВСКАЗСЕУТЕТИНОГТИ ско т мої 191 чн 05 ІМАОвРОССЛЕЙМОВ БАОКОКТАТАСКЕОВУТМТТ «Арк и А Я У СИ іга егатітя нано ньи рат хитка в шую тур кре ше ІЗТЗІКЄМЬАЗСАВОСТАУТЕСАКУЄКУРОНЬСЯ
Її. у кре оУ ТМ ост по пп а ПОЧНИ ЗИ ПЕ В В Де яв ПОЛО мо по вп опо во питво ооо пово ре с и и я пера усе
ЗО 10 Мет 122 МН ОТ, Ср ЗКНСІТ
БЕО ТО Мо: 193 мн 101, сСрко МЕБАОМОВТМУДОККОЮ не с ду, шо Ме Є ши т. - щ й им я х
БО Ж Мої: їй 0 о 101, СОБЯ МЕВУЕОКОМОХЕОе кІотОВВотівиБЕОВВАТОВСВАСОВБУВаВЖЬАМ І их ст М Я с т хижих У сужичх спимо гум ки хикитто і
БО КО Ме; їв м 101 УСОКРСОАВВІПІУСУКУВАТСІРОВЕВСВОВСТОК ' тер ки сройежр ду Кия жит ху и ри я ие руди жу кю
Ї ! СТІ ЗВМЕЕрЕАУЖиСОошо ок КІК при ТЗ Мас 126 іч 101 свв сте В ї
ЗЕое 1 Мат ло з 101; СВІ КАБОВИСОЄ МА і 5ЕО Її Маг 157 й 01, СОво 15УуЄБЕАТ | Ше
КД нання от в : :
І5БО ТО Мо: 1585 МБ ото, СО МУСОБЕТ екон ання п попит спаниолавастни п му пов спи о и ол пу ви др рукави притока ! і ОУПЬУОВСЛЕУККРСАВУКУВСКАВСТТРЕТВКСИВН І : Безу пеиия ик ск мли тел сь ринки чко ТО оче: 195 ТУ о ї8з УВрАВоОсКИМОМИсЕТ МОУ ТМеАДШКООСОКУТИКТ км А О Оу, ГК жк Ат току ск же фе З спи ківхЕ пох ук я ст ау і СтЕТЕТАУМЕТ НС ВярИТАУХУСАВО ВСТА КВУ ранки же тич й Й Шк й | КоОшттутува ! нн нини нин нання сплжуня - «ЕЕ зв тя тет лесютють зклклететь ль т сті стю ть поль ж нь зять знать лк всьо одно НИ НК шк З. пе Яке зак пижмо ї (ЗЕО 10 Ме: 130 (ун І81, сСОБі 5ЖСІВ ! п па ви о птшдню о и ня
КО Шо Мо: 131 ж ЕяТ, спра там АСКЦОС і
СИХ надто ; са» : ня нш: сел їх ро КОолкт. ок. зош сети зрос кр и ту ко В Мо: І322 ТУЯ І81, Ср 1СБОБОтТАХЕОУ рент
Ї сет м ВНУТ Еф
ЗУ НИ М пп рт -
ІЕМ То Мот 157 (УБ 181 (ТОМ ТОБРОБУЗАВУСЮМУТІТО типи ши ни ізверсКАРКІ ЗВЕУТІТСВАВОСІЗМИБАМУ ділили і и рак ше АРК ІУАДЯВІ т век зу ДМ АКА
ЕЕ ТЕ мот я 5 ЕТІВУІСВЕрЕДдтХ «еррасуравЕосВовотТовт,
БО ЇО Мої ВЗА У 183 00 ТІВ БОРЕрКАТУУСООАМУЕ КБОЕСЕСТОКТ ут Бий 0 18, СДН пев тичнннй сеюАМОЕРІТЕСОЧТВІ ВІ ; І
ЗВО ТВ Мої та5 Я в) ІБАВОбІЗМИЦА ХОКОДКВЕРІТЕСОСТНВОВІК пт сойох та ЖАХ втлй тях роти Аза ве ета гони ТЕ - Еш сов дАеБІВ сттнпіттнн тк
Е. ї ак Зо си іні ар -- : БЕБи ! Мови, ср СОДИБЕВІТ й - Й
І. СТИ іш ж ЗОБОВ РА о тв Ме: 157 я Би ОБУ АКУ ЕКРОАОУКУВСЕдасУТЕ ее МО: ? й студ пери - - МК в тя
Мет 137 |у 055 УКОДРОНСБЕММСНІЗАУМ КАБОЄТЕТУСІВИ
З ЕМО Вест й ж, сор ут вх БАХМУТ иМАдсКТиВА х . | СТА ШЕ ово, тити кни т, еВ гдУУУпАВН Ки Е -- могти; бІСАБООВОРМУК ач - яті
БО СТО для | зрив рай
КО то оМол 1385 «чл 05 том ТОКЕРеЕУБАЕУЄОВУ ТС - Ї
ІтЬ У 5 ур тих УВА КЕ СКАОСТ МИ ї
ОНКРСКАРКОБІТАВЕВВЬВО АБОСТЗМИЬКИУ ше шу тт з пвх ди САДОВО перкссвицетиет
У ТІ55БОРЕСЕАТУУСОПиМВЕ пот ука МЕ т ше КА осо пАМОК В теодрутт й вхетихт тк виш ий пі ВІТ ЕСОТВІ КТ й ОА рр чен ніші за ІК чкО ТП Мої 1: вУСрУСВОАЕУККРСВЗУКУЄ ли Ост гх 0 ІВ Мо: 139 ЧУ 055 тВОоАрРОНОГЕЩУ ; УенаАЗОТТЕТМиТОМ
Н поши пох ОСЕЙ. ЗАІМСУТМА у ре ій ; над ПІВАУМСІТМдОКІОСВУ Й отатттдуМЕВВІ ви не ТІМЕБОКСОСНУТМТ сотню тині ; пока МВВ пОТАКУХСАВОГ ВО Ах ! : птн о ДЯСОгЬУТУЄВ РТДУТТСАПОСКОТМУКОХ і плн ав поко ше іти ше де Ко І зх З Ї. хоАск цих й пт мМтпехс шт в й 0 то оМо: 190 Іо ПЕВ | пішмтошквБУБДаМУСсОВУТІ ху ун чрикян Н : боки ізнкракАрКТОІХА звЕУтТІРІнаЗостЕМИАЄ З
Бош | шле ПЕдрЕТТУЙАКЯКТН нев ох сени анна пен: зи і; «талу Й чІхдАВБВЬЦІпУВВВГ ОВ шочтуйь ! і ся ОвЕПЕдТУЖУСООВМОКрТГКСОСТВ Ї у й ек мо "ут доле екв Ів Кк , ОМПІАЛНЗСАЕУККРОДНУКИХ геОботТньсІК
Ге ЦУ ТВ ше тйї й й тще мисте у. кридаукускІвсх
Ге но і; гу: Цех їх м щу и сатани МО ї стоки их їжі сУВ ово УКОАРОВСЬеИМОоМІЗАУМОУ ТЯ ЗБЕТЕТВУВКЗИ
Баш ЕЕМОМІВАУМОХЖТОЕАОКІЄ шо
ОТЕТРЕТАЖМЕТВЯТ ЗАУМОоХТМУАОКООСВУуТМИХ
МИ пОЕТиЕТАЖМЕвеЗІКаПИТАМХЗ й МЖК У жк ! парники края ап гаАгУеВеоцвОстТМЕЕ гу. ! постити ЗОАВОВОКСТМХЕ КУ : 55 мк вн ОО що ІБ пе то і щоОТО Мет вай (м ово пе Ек сквер нетя 1 й ше ЕЕ митит те БУусбоКУутІтсвлАЕСС МИ МАМ
Біля | НКВОКАРКИ ТУ; В АЕПСТЯМИСАНУ : а жа я Н с Й я неза зику ака й Й МН ! нини нин ПУгтвято шектвчучру чповсувЕНЕЗОВоВОоТокт
І ! птн тЕшТОРЕОКАТтУУСООАКВКЕТ ОТО КТ п урну кан ТСсОСАМОЕвІТЕООЄ . о і то пов ой ІТЕСБОБТВІ те
Бе її вч кош ВОВКИ РО А ВИ х пен пл, К фе Мосс 143 пи оп тету ККВБАЗУКОВОСВТОХ полу нродини
Н кл Где ти: Ів, место й Є и я ИН Поеа ех
Н : МАО их уВОдЕЗНОвЕИМИ ВУ сани
Е сла дтшкь ному Е моні т ткач . і Мх : ки ки і татарам ПАДАВ ОСВУТМИ пива пошлиннт МмЕБДВІНЯСОТАУУЧСАДО ВСТМУ КО 0000 41МсобтУтуво ТТСАВОІВСТМХ ТУ
З УМ дик ті т поко нння
БВ 1 Мо: 1 я . пІсмтопвазуца вашчаиннниу : мо ЩІ і зо те Ітоаавазуєсви ані нина ях 115 У п Ухркви дк реЗУБлАЕУСОВУТІТеСВАВОСТ ВИ ст
ОНХРОКАВКІ УВАЗІ ВАБОСІЗМИБАМЕК лання нттчнни ким АЗК . М - птІЗЯеТИВ Й й звонка і
ІТВБІЮРБОКАТУСОВАМАИ МЕБСВСВОТОГЕ
Пси кар М У сатути що й ке
ЗЕ е МО УОСАКЕУКЕ ООЛМСЕРІТЕСОСТВІВІК.
ЗЕО ІВ МО: 145 ХОТУСССАБЧУККРОЗВУКУВОКАВО ВБІК
ОБ Ме: 145 у 03 Говадесасів звуку тТгИа во миши /ВОАРОООСТЕИМОКТ ВР Ц ТЕПЗЖОКОК і І | ПКЕЕ ТАХ МАЕ ж х тктдОМЕОаВНИ
КА Кв думи Й . те цем їла і й І ! тАУМмЕіІ Си ЕОТАУХСАВК й жу ! тут кра ц ж их Ой гУт; і п « «Р А ЦО АМООФТМУТУВИ нн дерти й я ню шк нтнстнт й
БЕ ІЙ Мо: 155 : птОомтавваваде тт нні і Молода Мп ОЗ - ОМТОЕ ЕЕ БАНУНОВТ ТС КАОЄТЕНИСКНЯ : Ян сх ту ТС Й ях ААУ тла роги інтен пи ня м пр й нянні нн тутвецОвЕВ тІдАЕСІОоБеУрИВЕВСОшЕОТЛЕ І пуд ПРАХОМ реттсостТКтТвІКО ев твою . СоШМТОВСАКУККРОВБЕ ЗЕРОВ.
ЧЕ Ва -о ою В кокер кА МЕ, ша ВО УВОАРОСПІЕНМОЯ ІІУКУВЄКАОНОТКЯОЖНІНМ ї я у кеВ НА Я зІжЕ НОних 7 ЖАХ А УЛУЄ тд ІКТ аАМУДОомКО АЛЕ ши ОКеТеТАУТЕСТЕСВЗЕОТА амтАомЕооАУтття спнетютннятя З Аа. МИНЕ о лах пи в птиссоти ІЕОВЗЕОТАУТУСАВСУЄСУВЗАБА 0 ДотИсОстТМУуТУВУ ІСАБОУСУОБАрА
НЕ: втмутувв г се ня
КО ТІК Моес 145 зтимезввлше і С ЛІК Мо 148 с. ПУ ПІСМТОБЕБОЬВАУЄ ДЕСтІтсВА : ! : чих ще 7 мм У хх. тек конях уки
ООКРЕКАВКІ Іуда ОВ ТСКАБОСІВЕНЦАНИ пен нн ех ІМ ве Може питейе ще і
СТ зоре пекли се пояттуют од поем НА ШН ке пси ллвод вот нт зУРЕТЕСОаТя грот
Зк ВОМ; тар па ОЗБбАКУуККРоБВУКУСКАВО с ТКУЄТК. І
З ХВ оМе: ТЯ ун о(і овОожВеЗніІ виМмсвк то КУССКАБССТЕОЗУСІСИ пом |та сесеенмавеКеІСО ВО Е жу Ку з НУ ММ І пазів чн і пика КРІСОІТАМУдОМТОСВУТІТА ситі |вкототАЖМЕВТЯВВВЕОТАХУХ ІАюМТОСВУТИ ТА
Ї ---к роту их чгшІ варта рІшссвтМУтив дкрмахинАлАЕ пИитиБ5 ся раку по
Ів ето шен ее ІсМмтТОоВвраЗІнА порно ав о тром: 15 1 1 ІОМТОЯРАЗІБАВУСОВИИТ ТОВ ст
МмочмаЕ хх ал ЦМНИ МШИ СИ З я ет ни ще кла оліраовонн
І сн ООКРЕКАРКУІІУДАЯВЦОВО скАВОМІЕНЬАЙХ тт похо. й ККАЛ ВИ ОВаМкаВЕІЗ ко - тт лозу ЕЛЕ ЕБОЕИ ТО вежу х У шо у вве зали у ц
Кк
Си годи Сири Ї
УМ УувеаУуУ ОВ В ЗОААНОКТЕ ВАМИ сти пом іє кож чУвОоделиськииА Ту щ ІЗ ШКО КтаЕ ко Ір Мр: 15 ї тн одіо УБОАРСКСЬКУ МАКІВ раБМКЕКАОБУКОКЕТІВК р пси Ммтт ет Ви иВ З присеМті жіхствдклтАаймиетА ВТ ТЕКТИ
ЕБАКТОуСОМкВОнАБОТАУУТСАКЕСТИКОВКЯ В І
Щ Й хебЕмМовегтЬУтуВ ! тт ат сю цс НД Ух дво тв пот 159 ПОІОМТОЗРЗЗУВАВУЄОНУТІТСРАБОСІВОИСАНХ ко ІБ омМе: 1595 1 017 стю ри вт тупа ; рак нев ! їз Ма і Ї спкракаАрЕгЬгХААВО БОоБИУвВЕ ЕБОВООСТОКТ : і окшен иа і І і ітеерааі вет АНУ УА КН ВВ В шин ТІЗБІОРБОКАТУУСОБАКВЕТИТЕООСТИУКІК
І чути вас трсратвл сто пукунх
ГОМ ЗгУушадесоММ аракае БОС АЗСЕТЕВЕТАМНИ си жому крах що сит яр спри шов ЗЕ дер
Бе 1 Мо: 1 З У пов Мо яке УАКІВТООЗЗКОТАОВУКаВЕТІКК пок УТ ЕВІ ВДАТТАИСАК ше гя
Яцек Я ЗХ ГОМ І вл ВІТА УСАВКО СМ ЕТВТЯ
Е Зк мере ки мує кіт І
Що ни ши УКВ сВотОУтУюя пеня виник стопи дод зво то нет ти рІОМТОЕРЕБЗУБАБУСОВУТТТСВАВОСТЕЕМЬАЙ У
ЗЕ ТО М о ут пов Ти тентом ие х пад ста і : Не б п ОпКРаКАРКТСТУААЯВБОВОСУРОВЕВСВОоСТОвт » я А З шах виводити ол век МИС ц хтоттувтох Тхтгу тих сте і шин п ПОТТЕЕТОРЕОБАТУЖСООТМЧРТИТКСОЄТКУВІК . т ха ОКА АЮ ЇХ : п пр: У у и и АКА КН
ЕЕТЕВСОСТО ов СААССЕТ ЕТ АМИ і І стінки же ; сушки тя шо іддатр ж кр зо змо ІУВОАРОКСНЕНУЗИ ЗОВ СІТХХДОИЗУКСВКТІ ВЕ
БО Ір мо: 155 лин лав ТВОАРОКСТЬКУУВУТЗОВОСІ ТУ АЙЯУКСИРТІВВ тонгя зятя их й совет тк . с
ОМаХМТОТЬОММВІВАЕСТВУЄХСАВОВСИСяОУМО
МАВКИ вини остіутува
Мк тва» хе | Мч УБтоВРАТИВСБеРОБВАТІВСНдОЗОаУлеЬАИХ вкО І Мет 158 УТ. ба: поквеоодеи тет евсяатоюя 138 Кл. бао ООкРОдАРЕ І ІУОДЛЕМААТОТРАВЕВСяСВОТОКУ с. КАК маю КИ, тт ват шт ик ре Кк. Кн : і І І , штітвБББЕБрвОБАУСТСООпОМиВТкОвОоАУгИХК ї усій ЕвБОСКІ лм три м с цер. ря т
БУСЛІоюоОсиУ Есе РІ АБ ЕММХАМОК І злу оо м не Р воля го КО УМЯ Зсої я ТЕ С
КО Ії Мо: 157 в вза УКоАрЕсКоовЕИУчвІ ВОЗ ТАС ЕКОКЕТІСЕ ! тів секетт тм В АТУТ А А нети ея
ОЗКМТОУТОМИЗБКАБОТАУУУСАКОКОМУЯИСИО дстіУтУве у ня Ух чт моб житя ад ІН В ото сах х ух шепосою сг в ІІ УБЕІШЕвАТІ ОВО ДМ
ВО ТЕ Мої и хі пені жу кут дн вк кт ву : . й й пт 7 м МБО Мото 5 | У п Ка РЗОАРЕИТХОАВМВАТОГВАВЕВОБОВОТОК т за ТК «АЗК А ИМ А сетер гм пк ич ар п КІмр г ден кт зага |.
НИ фетівБІЕРЕСКВУТУСОСВЕМИРЕТЕСрОТКУ ВІК
Ї пут рт сив р кут, те - й 1 пошко зовевУукиЗо Ки ТсАМБсСОСВТІЗООНЕХ о и ІсштверрОоксТЕШТОСІУНеСсЕтУУВроКЕ : ізко та Мет л55 чув 078 з оон кешу ноту мрОКВуУТІ ічОовишМмотет тав й групу у ств ще г вам оКсевУ ААУ САРІ м і рення ооиУтеВ !
ВИНИ ДЕННЕ ИН Кай Лос ИН і
Ї птозмтодресовАатитя лютих зах т Ма: їєВ Бл, б7в ТОМ ТОВЕ ЗЕУБАВУЗОКУ ТІ ТОВАБОВІ ВОК САЛКХ
Ме ки Мох 690 ДУБ 975 НКВОоКАВКСПЕуААВВЦОВОУРЕВЕВІ Сас ТОКЕ ; ие хау сп
І І тт ит дп лити і і . Я ІтВБвОвЕОогА СООМЕТ совок уж п брід ет тут мата я 7 се пл жир хе Хор сто - вини раді
ГОСУвЕеБОЦУКРЕОТІВО СВУ воовІ БОНН дог . Й о ст пере та т ен м рек Ум ще
ІЗЕО з Ма: 141 бно 085 ащМІВОВЕСКСОЕЙі ЗО ИВсНТжмешькКБВАУТе т. сьо й - Й Й і ШИ Ди
І хІбуру реви етТ т сови яких тик гу :
І У певкМмУтеркв-витАаптаУухоАва тир ТОМ
Що собтьУтУва тет тип тич ит и т суток Н ішктотв в я пІсоМтОовеоивАМООиУ т сКАКОСВІ ВВА З
ГО до ІІ ге стро ой жі дич Кути т ри мсек т рлєти ск!
І З їв5 Мі п оБКкЕОКАвВКЬ АВ ОБОсУвВеш ЗО зак зліз ит УК кет Театр цед чек сту у тя ес туї "ку 00000000 1ЕТІЗВООРБОКАТУТСОСАМОРРІТКООСТВОКІК птдтдсдлиит суп до пове Мила. ТИУКЕ пах оЗиТсАМВООІВ каса И 1 ве є дл чоти стер оєстми котки и :
БО то Мо ТБ УА ОБ ря ІвОовБРОКОЛЕНІОСІ НЕСТОР КОВИУ ТВ !
Ісвпраешкмих спі сирі п тт де щ у риВКкнО ву кААИТАУТУСвВВУВІСКИ ! й пали н і й іт ект тут по очко ши вових, и іди т І ПМ ОоМгОоБРЕВУЗАВИУСОВУТІ ТСЦ АЙ І іавОа ТО ме: стей т, без (о - Крук маю мя
ВЕО ІбБ Мо: 164 У 063 ОНКРОКАРКТЬІТУААБЕБОВОУРЕАКУОВВОТОКТ і ц. х Кук КМ кт С (оВКвоКАКтЬтувАВ шо т атлети сн да М Р КНННИ - нн нн ке іт вати іти в сети пеки, о покВсеоІУкКРІСТЬВОТИАУВОБВІВВшСНОМ се ще пл й шк сл ет ютиу ла - з честі ; й
ЗБО І Мо: 165 |УН 087 ЕКІВОРРСКСІЕНІОСТУНЯСНТУОМРВЬКеАМТТЯ
Ко ) тру сект СК КІН КО В ККТКоКТКу кукУ - ривок ОВкОаОиТААТВУУУсАНОВУСТОХ ше о абатьстовЕ г пишу пн зі ше г 0 й ОА ще -
Ге 1: 1
БЕ меле хв по 1 ! ща М й : ш - Ро по А Е шк Ме» Й , Ал 2 - Б М я т Ох Б І - ї ц т 1387 І і ще ди С зе шо 15 пкте 7 І шо У рі М я : ші ке Що 0 : ОО - ще б16 1 т г й пт тет
ВЕ що в шо пт ше У не г ЗАЗ
МЕ м УВ По ОРЕ кХ У - То з. що Та що ту 5 -- ах о16 ! п ДЕ зе -4 : 169 - т ІЗ я то косах ! БО яти а ! ШИ о пдут гЕиМс Соо (яки : ід п х ТІ у й В в ех К гл т ск У щі НЯ щи Ме о се дя
Я Тр х " щи вк УТ но Сея з АК ва ее
Ме й і - . З НО й тек, РО БІ трі ве ВЕ ! шо Ш 28 - т ще я ІКАО по
ІЗ ТУ Че ТЕ сеоКА РЕВ КА 5ре се ТЕС пас ЗА
Ко шо г Е їв р Ве сх еВ стЕоротні Бе
В) я Й і о кове Вк. ш-д педа ТВ: З - СЕ зт У у
Є т я 1: Ок зі , с. де ДВ КУ м І тре
ТУ ія п «т А ще ії ях М ах УТ ней ПЕ Н щі У ІВ Ус ЗБЕ І се З пр ТЕ УЕ УТ і
М Ї В шк 1 неї не т т с о ве ЕТ ШЕ т З
Є по -ш ПО ом деЕоЕВтт Ве УА со т лЕ і що й в 7 і, ТО іо Тео п есте У КОСУ ст ї спліт ж й Іс Ой Є ПЕ Ту 55 т гу на що ще
І КН ісо вс: кої ЕУК ща ще ІТ ГУК я т ту МН БАХ вно дтд ЗИ КЕБо поек Те І сит БІ 2 ! с 1 щ ост ки я їй пе тяд ті ї7 Я Тх х Ме З УК в З В з ши ши Ж ее їх Чі КЗ МЕ ве нен Ер ту ще й НА; вх ВІ її З 5 З що Бей
Мо н то рок ов 755 ІВ. ІХ Б КВОБІВ: Но
І; ШИ Не я о. того :
ІБЕс її». | тт КЕогАеКи - й сота п вЬКЯ
Са шк ! ІБМо БАРКІ ТЕДЕД стани петни Е що р 5; С ОБ ке ДІ ши Ам у га ТК ТЕ ї
В: п і. МВ. пис ТРЕ, ВІ Не а те пен зн і
Кк тет 6 ВО ще Бора У МУ У Е5 ТЗ в в -щ-пн ща | нн скл БА ЕВ ве ши чо ТУ? їк і
НИ З - Ко щі сЕ Яку АТу І Зм хВ об їх Птн і в 173 - рктвтвх ВУККР Усо ТЕ тетЕу роси то ши -- З г сш я кро птЕосияих ке щі - ІВ - ув дося пси п о і ШИ Мас шк в ре що око с ве в п совоя сет Я гі - і: пт її тя АБ ще вк б ок рою,
ІВЕ ще шо і тт ЗА З СА пе о У меня Дт во Шо г - еле МЕеВь ше КОВІ бо о
У Ї - - Шо пе КІ «де АМУ ря шу чи лтг ТУ
ІВ - р ши у вен ТЛ, в ж у се тки ПЕ
Тк шк й ком ве пІЖ е ру в ет ЗЕ вт що Мо т | СО І Ме ІОБЕОЕ ЖОВ ви ї А Ес тах КГ щі т аг. - Зо оке соксте ТАТ АД ВК не клса че - пп п п п Ії пс и «ВЗ ут т ОБ ме Ме ак, - ТЕ С ї5 поча МК ут Ле І ЗЕ мА А Н
І ко т т що о, кан ТА Ей пусоо сет св Ітсх ті ща !
С ІЙ ни Ув по пот - пет 5д І ! Що пом н 2 нш іх пе щ ща китевкос пу і що т 053 я У О5 5 А Ії ее т; Тея щи ПЕ х Н ! г | 93 | скАО тетвет ще се
Іще п Іі сЕ БЕ А Беч ее ее М
Б Тв | ШІ КА стад 5 те ветЕосот КА
Е ко що і КУ жен ще птах оБтАМУ пе ше : ч. ч о кій Е ад е т зх ех гг х
Ж т: хЕ шш - Се НК, ІЇ се М пу нн М те НІ ї
ІТ і У тю и БУХ їх 5 ст Му: укр ї ЕЕ но пог
Ї пох | Б я г вом ріОРЕогя БУ о У т ва п Сх ! З: | ше Бе ОАЕ Ал ПАБ: БЕ АВ ЗО у ч -ї Ед Те т щит ве Се Я 2 у В са Зк сир ду 5 п ге щей НЯ й
ЗЕ 7? кості БАБУ Утооо КІТОЕ кн Ти. що ще х ості. ТАХ оо ЖЕ остео БИК ГО тів ще т ТВ ун вм аг МТ ди. нс СКАВОСЇ ЗЕ Ів ! м ро пої : дон реве - вх з" їі як ооктокАе я чт Увег я СЕНИК і ши й щі ГбКА Б КА ха ЗоКо ТЕО се ВАХ сот
У | КУ Її Ар БТ - ота. не КК
ВМС 5 їй КеВх ГА лих о ОКУ сні й ї
ХА лот тТ,с М А - ТА ее пре ГЕ ня Х у ме ОБУ ОРЕ) ЯН Су А ЗВ ст Ко ГЕЕТ - - її УВО і де тк віх ї І та 5 ЗЕ ніш ЕЕ пи ця Ксвр З5О Вей ХАА: ЇВ са БЕ В ІК
Як т «В кТ ПАК кр здо т й дн же рт Я п І БІ ак дя сис тт ху ЦЕ я . ТІТОВ Я ЗО и
А ТЕ ду (ЕЙ СЕ ОО що СВ нях УгІх мо | пе ММ пет СІСВАК тва І
А л г СОЇ Утув, ЛО У ЕМ то де Вон Кі
Н (0) ІК ЗТ даже ой Зї й 51 че т ак ас Ух і п - т : і
Іл и лита ан де 5. ще ЕВ що БА т т 10 6-0 ачо тих о зов - лися поту еко птувве -- я Кт
Н ; с Й о ; т 1 -0 Ж тх З т . Уще ков соте т п) о гу п Би
Н 16 8 дж УТ сит вгової пе т о но е усоох То ково їх й суРвт оотІ А Ї 16 -0 З р пай ОЕМ в лк сок ак і
Ши! -0 24 З Ми и ЕМеУ ях ОІВ тку ії: ї 1 З 97 ші п ув що тт Є і т 01 5- 33 32 ! ос ІТ вв пЕд к нот 5. толоки т що ; 33 ЗЕ Ш і й с стей вік щ
ЕЕ ї зав
Ей т вес с . в) т - ноз, с що Е сї 2 ; СІ Ї М 9-
З8 В ан 5 4 ; 32 УЗ -51
У 0-3
У З
ІаН 5-5 -
УЗ 1-1 он 2 ен -Н-3
Таблиця 3.
Гомології мишачого першоджерела й послідовностей легких ланцюгів
На Фігурах 1 і 2 представлене вирівнювання послідовностей НиМаре. Виходячи із цих послідовностей може бути визначена консенсусна послідовність для послідовностей СОМ. Ці консенсусні послідовності представлені в таблиці 4.
Табдиця Я. Консенсусєні послідовності
Іко Пуми нин и й де хну або, ХонАабо хін (005-006 ПИ ценУвеой СОВІ ІвхІхІхаха або Ії, Ха - б або, Краще, щоб Хі
ШИ Й | | або Б,Хон сухі Баболі ХО,
ШИ | | деХієабо М, ХІІ вах
БОЛІ МО ВО ем, сна ВХІХОРШОХІХАМУ (або Т, ХаеА або Т, ХК або МС по5-006 пвнх ре се КК ко щоб ХІ-Табо у, хоч аби
ШИ | | Хіерабо ї, ХаеА або ТІ ХМ
БО МО 18 - . -БК- ках Х ла хі вай о Ки г в во. Ха
ЯНВ Ку пенуьвоні сова РУСУВХИХ вхо яе хі Маба У; Хо або й ха
БО МІВ пт сто НУРСОУХИКУЗВУЕ 00 ще пен НУзяІ ОК о ех» р, вавам щш
Б ме 183 лих Й Й 5 2 й й
Внинин пен сова оЕхІТОхонОУ Е ХІеМ або, Х3- Б бар
ЗБОЮ Масі84 пенузозч сою кхазха ем Ми ке мабоз,Аи ті,
ЕО ПО Ме: 185 ізнУузаЗа СТЯО ліЗОЗХсО5іУ Хоіде Хі - Бабобуло відсутнім, хм
Я ав ана е Й си ША 69 А. п
РОЮ Мо: 186 пло пи НИ де Хі З або М, 7 р ЕНУзахі |СОВИХІУАМХ поча пори ши 02 дежінА або у, хаб ху і че щ7 Й ГИ ся ле НІЖ ди о киУ - ех тн зу І
ЗРО Могів пвнуЗ-ззя сода ОКА два Б. Краще, щоб Х1-А або М, ХО - 1) 045 : шеХКО Я нан м | А лоти Пен З совз ооо де ХІ-У або З
СЕ Мо: 159 пи рення тчєичаЄтнннннннннни п ПеНУЗАЯЮІ СОВІ РУУМХІ де ХУ або 5 шо ниоши ПО меш строк суть я ДЕХТО у. Хо або 8 Хо
ЗБОЮ Ме:190 00 роя ств ХИ5ХОХЗХАВУТХУ суд ув ме ми я ІББМаИ-Я СО К тхХБОеУКО або 5, ХА «апа Хе вбю М. Хе ле Р або А що !
КО ТО Мес 191 ча даль трі согсхіехуо сю яко : 062-064-068 гену СК ввахІ5М ве ле ХХІХ або НН шк вер зучузловієтчкнткчия ДЕ ХІІ еєбудьнякою амінокислотою, (З
ЗО ТО Ме: 192 ; і хв хана ХІгУАЯ | ве хо чл оте :
БЕ Ен ін ак СОво Мркі Кк Гуха бажано С, М. Б або А, Ха табо у и пив ХВ або М, ХУ або !
ОІВ Ме ІЯХ рило спе коліт ще Же або 062-064-06К ен жо скат Іде ХхІеЕ або Ш й
ВЕС Меаг194 ця св о хе жуть міш ню обов вмів сок ХТКсїЬ ле Хі-в аа
ЗО 10 Ме: 195 л; чт МІХ УКХ МА іде хізА або ТАМ або Ж, Країне, я Бей -І2- с Моовитоу - - ро» у
ГК іенмі в оКлокгоб Що щоб ХітА або ТЕ хату і
ЗЕО ТО Ма: 15 зв рі ДО М | ок
ТЕО зв а 196 пенУвіВ-ї СОВЗІБІВОТХ УВУ деХі-А або М сіжиіня тт ніс нжкьк ісіннііжюннникниииинимі дині З. ній жкінні сс ніннккким склі режі іжнннннніі нини жити нет яти кі ніижиині і і жиажжетттттт тет жіжжіжжитюьєнчжкть; шу Ми 197 і й п й н Й вну сою хіхобі деХІ- Мабо 5, ХО Р або
КТ ни и й МАТ ЕА ІК узи пе хі-равах Хо - Наомі зра ЦО лук ТО98 Пенміія- сбдо вах ІКОХТХЗУ де х1 1 збо т х я зо М, хі Їх 095 7 ХК або М хахваво й, когУ або і. !
ЗБО ЦО Мо: 109 | - но не ХІ- або, хі Набо у,
ОО пемувмяя сові хіхосіхз деко Каб вки тна ик
ЗО МИЛОЮ ОА ГМІВАХІМОМТМУАОЇде хі з або У, Ха або. Х3 5 зіУ1-18- ОКО дутики пд і і Ї юр ВНУТ ОК кох або паїв? ХІБУГРОМІ І ХОУК де хі - Бабої, х3- Р або було
ЗБОТОМО СЮ енуртяя сов ух ПОТОМУ де Хі я Бабо у ХУ - Р або було ни ше І у відсутим Шо
ЗО пПІМа да пОоКМ1р. стру не ладлкТо гарт де або Ха - Р або М. Краще, діа лий ОВ ОСУМеХІРХ: во дини 005-006 ві СОВЗЮЮУМУХІРХЯТ пцобхінабовіхон мВ Я покмн зчз|СОКо ХТАБВІЕВ деХІ ОМ або А
Че і ГУ |. М рі А г Ек - пу. корек ех ня у 4 7 лі ; ою Мо: 2 юкМмАТУЧчСЄВЕНОСгМУХ ех де КІ Ж аво МУ
ЗБОЮ КО Я05 ее іаеієова бузузузсимат ЗХ Об Б, ХА або ЗМ го. ІБК 14250 СркцОеХ ІЇХаХаЗЕХ АТ або ха Раб Шо
ЕС Мо сов і
ЗОВ юкутловогєв КЗ ОАЕ гт де хін абб було відсутнім
ЗБО НО Мо: Покмрізео Сов ОЮвХхі5уРЮ ве хіт або М.Х О або було 55. І ! відсутнім виш со Мо В покуті Сов3 ООАМХТЕРІ де Хі - або 062-064-068 | м А М М. ЛІ ле з аск Щ
У Ме: 20 ск тури о г. тя кити ви тк ж. дя - є и Оракул сові кАВОСІЮХІМТА ле Хі-5 або м
Просте ото Вип МН вва нава ИНА ОО ПВ ОО ЕН НОВО
ЗЕ Ме: 216 ще ! - з ПОКМІ-оч0ї СОКО ЛАВІ іде Х1-0 або;
ЗБОЮ Ма ПКУ 010. й Й що шо ЩІ
ЗГООМеИ ОКУТО. 0 совЗІХІОУХО5УРМТ 0одехі - Набоб, х2-Кабом сок Ів0 Й ше ко. я | : :
ПОТ юкузоючі сова оХхІХОвКАТ де ХІМ або А, ХО - Б або 5
Приклад 12. Очищення антитіл
Культуральну надосадову рідину фільтрували через 0,2 мкм тупіковий фільтр і наносили на 5 5 мл колонки "Марзеїесї Зиге" (СЕ Неакй Саге) та елюювали 0,1 М цитратом натрію - Маон, рн 3. Елюат негайно нейтралізували 2 М Ттгі5-НСЇІ, рН 9 і диалізували протягом ночі проти 12,6 мМ м
МангРО», 140 мм Масі, рН 7,4 (В.Вгацп). В іншому випадку, після очищення елюат наносили на колонку "Ніргер ЮОезайіпуд соїштп" і заміняли в антитілах буфер на 12,6 мМ МанНгРоОх, 140 мМ
Масі, рН 7,4 (В.Вгацшп). Після діалізу або заміни буфера зразки стерильно фільтрували через 0,2 мкм тупікові фільтри. Чистоту визначали за допомогою ДСН-ПААГ, а концентрацію вимірювали нефелометрією й за поглинанням при 280 нм. Очищені антитіла зберігали при 4 "С. Мас- спектрометрію здійснювали для ідентифікації молекулярної маси важкого й легкого ланцюгів антитіл, експресованих гібридомами, як описано в прикладі 10.
Приклад 13. Зв'язування клонів анти-с--Меї з пухлинними клітинами, які експресують мембранозв'язаний с-Меї, визначене за допомогою аналізу ЕАС5
Зв'язування антитіл с-Меї та їх моновалентних форм (які також називаються у даному документі "молекулами Мпіроду" див. приклад 5) із клітинами А431, які експресують мембранозв'язаний с-Меї (придбаними в АТСС, СКІ -1555), перевіряли за допомогою проточної цитометрії (ЕАС5 Сапіо ІІ, ВО Віозсіеєпсе5). Аналіз "Ой" (Юбако, Глоструп, Данія) виявив, що клітини А431 експресують у середньому 30 000 копій білка с-Меї на клітину. Зв'язування антитіл проти с-Меї і молекул "Опіроду" визначали за допомогою кон'югованих з фікоеритрином антитіл кози, які зв'язують людські ІЇдсї (Часквоп). ІДс1-505 використовували як позитивне контрольне антитіло, а НиМар-КІН використовували як антитіло ізотипного контролю. Значення ЕСво визначали за допомогою нелінійної регресії (сигмоїдальна крива "доза-ефект" з варіабельним нахилом) за допомогою програмного забезпечення "сгарпрай Ргізт М4.03" (сгарпрад 5оїймаге,
Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
На Фігурі З показано, що всі протестовані антитіла й молекули "Опіроду" проти с-Меї зв'язують с-Меї, який експресується на клітинах А431 дозозалежним способом. Значення ЕСвхо для зв'язування коливаються у діапазоні 0,28-1,92 нМ для Ід і 0,52-13,89 нМ для молекул "Опіроду". Цікаво, що антитіло 951-024 продемонструвало високі рівні ненасиченого зв'язування із клітинами А431, яке не спостерігалося при тестуванні зв'язування із клітинами НТ- 29 (придбаних в АТСС, НТВ-38 М) (дані не представлені). Для антитіл 022, 024, 062, 064, 069, 098, 101 ї 181, зниження ЕСво не спостерігалося або спостерігалося менше ніж 2 разове зниження між Ідс1 і молекулами "Опіроду" ідентичних клонів. Також рівні максимального зв'язування не змінювалися в Іде1 і молекул "Опіроау". З іншого боку, для антитіл 005, 006, 008,
Зо 035, 045 і 058, при порівнянні (Д1 з еквівалентним "Опіроду" спостерігали більш ніж 2 разове зменшення значення ЕСво, а також зменшення рівня максимального зв'язування. Це, цілком ймовірно, відбулося внаслідок більш низької швидкості дисоціації (Ка) цих антитіл (див. приклад 14).
Приклад 14. Аналіз "Осіеї" для ранжирування афінності
Зв'язування антитіла з сМесгЕСОНІіх аналізували за допомогою технології "Віо-І ауєг
Іпіепеготеїгу" (ВІЇ) на системі "Осіеї" (Боперіо, Менло-Парк, США). Біосенсори, покриті антитілами до людських ідо (Ес-специфічними) використовували для захоплення антитіл проти с-Меї відповідно до процедури, рекомендованої виробником. сМеїЕєЕСОНІів, отриманий із клітин
НЕК293, наносили зверху на іммобілізовані антитіла проти с-Меї шляхом поміщення завантаженого біосенсора в комірку, яка містить 10 мкл/мл смМегЕСОНІ:» розведеного в 10 разів у буфері для вимірювання кінетики (Рогіеріо). Відмінність у відбитті світла (ДАХ, нм) поверхні біосенсора через зв'язування з СМеєЕеЕСОНІі»х вимірювали в реальному часі протягом приблизно 10 хвилин, а для розрахунків константи асоціації (Ка 1/М х с|) використовували програмне забезпечення "Осівї" (М4.0, Бопебріо). Потім завантажений біосенсор поміщали в комірку, яка містить тільки буфер для вимірювання кінетики (розведений в 10 разів в РВ5) для визначення константи дисоціації (Ка (1/сІ). Аналіз кінетики здійснювали для визначення афінності (Ко |М)|) при використанні моделі 1:11 (ленгмюр). Як позитивний контроль використовували 0,2 мкг/мл
ІЧе1505, який продукується клітинами НЕК293.
У таблиці 5 показано, що всі антитіла проти с-Меї зв'язують СМеїТЕСОНІх з наномолярними афінностями в діапазоні 0,6-13,9 нм.
Таблиця 5.
Кінетичні константи (Ка, Ка і Ко) антитіл при зв'язуванні з СМЕТЕСОНІі5 7006 | 425.05 | 42оБо3 | 9895.09,.4.ЙщБЖФ 77069 7. | 2 лавчО5 | 2675604 | 126Б09 9 7..096 | 196505 | 5О0БО4 | 7 255Б09 щ Ж "
Приклад 15. Зв'язування антитіл проти с-Меї з мембрано-зв'язаним с-Меї на епітеліальних клітинах макак-резусів, визначене аналізом ЕАС5
Для визначення крос-реактивності із с-Меї макак-резусів, зв'язування антитіл проти с-Меї із с-теї-позитивними епітеліальними клітинами макак-резусів (4МВг-5, придбаними в АТСС) тестували за допомогою проточної цитометрії (ЕАС5 Сапіо ІІ, ВО Віозсіепсе5). Кон'юговане з фікоеритрином антитіло кози проти людських дс (Часкбзоп) використовували як вторинний кон'югат. НиМабр-КІ-Н використовували як ізотипне контрольне антитіло.
На Фігурі 4 продемонстровано, що всі протестовані антитіла проти с-Меї є крос-реактивними із с-Меї макаки-резуса. В обох протестованих концентраціях (0,5 мкг/мл і 10 мкг/мл) антитіла проти с-Меї були здатні специфічно зв'язувати с-Меї макаки-резуса. Для всіх антитіл, сигнал був, щонайменше, в 5 раз вищим, ніж для ізотипного контрольного антитіла НимМаб-КІ Н. Цікаво, що Р1016-035 продемонстрував набагато більш високі верхні рівні флуоресценції (МЕ «200 000) у порівнянні з іншими специфічними до с-Меї антитілами. Ця відмінність не спостерігалася на клітинних лініях, які експресують людський рецептор с-Меї.
Приклад 16. Блокування зв'язування НОЕ з позаклітинним доменом с-Меї, визначене за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (тІФА)
Для аналізу можливості блокувати антитілами проти с-Меї зв'язування фактора росту гепатоцитів (НОР) з рецептором с-Меї здійснювали тІФА. Для цього прикріплений позаклітинний домен с-Меї інкубували з неміченим антитілом проти с-Меї і флуоресцентно міченим НОБ.
Неблокуючі антитіла не конкурують із міченим НО за зв'язування із с-Меї що дає максимальний сигнал флуоресценції. Блокуючі антитіла конкурують із міченим НОЕ за зв'язування із с-Меї, що призводить до зниження флуоресцентного сигналу.
НОБЕ (Ргозрес Тапу, Реховот, Ізраїль) флуоресцентно мітили шляхом кон'югації з Європієму» (РегкіпЕЇтег, Турку, Фінляндія). Комірки для тІФА покривали протягом ночі при 4 "С 0,5 мкг/мл рекомбінантним людським позаклітинним доменом с-Меї (К8У0О 5увзіет5, Мінеаполіс, США), розведеним в РВ5. Потім комірки для тІФА відмивали РВ5Т (РВ5, доповнений 0,05 95 Гуееп-20
Ібідта-Аїдгісй, Звейндрехт, Нідерланди)) і блокували протягом однієї години за кімнатної температури (КТ) РВЗТ, доповненим 2 95 (об./06.) курячою сироваткою (бірсо, Пейслі,
Шотландія). Після відмивання РВЗ5Т, комірки для тіФА інкубували протягом однієї години за кімнатної температури в темряві із сумішшю 50 мкл серійно розведеного антитіла проти с-Меї (0,128-10000 нг/мл в 5-разових розведеннях) і НОЕ, кон'югованим з 50 мкл 0,44 мкг/мл
Європію?" в РВ5Т. Потім незв'язаний НОЕ, кон'югований з Європієм", відмивали РВ5Т, а зв'язаний НОЕ, кон'югований з Європієму", інкубували протягом 30 хвилин за КТ у темряві з розчином "Оеша Еппапсетепі ЗоїІшіоп" (РегКкіпеїтег) для посилення флуоресцентного сигналу.
Середню інтенсивність флуоресценції при 615 нм вимірювали за допомогою рідера "Епмівзіоп 2101 Миййареї! геадег" (РеккіпеЇїтег) з наступними встановленими параметрами: парне дзеркало
Іапсе/ОеєеШа, фільтр емісії 615, фільтр збудження 340 нм, час затримки 400 мкс, вікно 400 мкс, 100 спалахів, 2000 мкс на цикл і двоспрямоване порядкове зчитування. Для визначення значень
ІСво, криві зв'язування аналізували за допомогою нелінійної регресії (сигмоїдальна крива "доза- ефект" з варіабельним нахилом, вищі значення обмежені загальним значенням для всіх наборів даних) за допомогою програмного забезпечення "сгарпрай Ргізт М4.03" (сгарпрад Зоймаге,
Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
На Фігурі 5 представлені характерні приклади кривих інгібування зв'язування. НО антитілами проти с-Меї, що зв'язують позаклітинний домен рекомбінантного людського с-Меї. 505 використовували як позитивне контрольне антитіло. Усі антитіла проти с-Меї в експерименті продемонстрували свою здатність конкурувати з НОР, кон'югованим з Європієм3», за зв'язування з рекомбінантним с-Меї. Значення ІСзо коливаються у діапазоні 0,0011-0,0794 мкг/мл. Без додавання НОР, кон'югованого з ЄвропіємеУ", детектували приблизно 600 відносних флуоресцентних одиниць (англ. геЇІайме Пиогезсепі ипії5, КЕ), що вказує на рівень сигналу при досягненні максимального інгібування. Коли зв'язування НОЕ, кон'югованого з Європієме", не інгібувалося, детектували приблизно -66,000 КРИ. Антитіла 005, 006, 058, 101 ї антитіло позитивного контролю 505 були здатні інгібувати на 84,5-92,1 95 зв'язування НОЕ з рецептором с-Меї. Решта антитіл були здатні інгібувати зв'язування НОБЕ із с-Меї, щонайменше, на 55 95.
Оскільки НОЕ може зв'язувати рецептор с-Меї за обома доменами 5ЕМА і в Ід-області, деякі антитіла можуть інгібувати тільки одну із цих взаємодій. Для того, щоб визначити яку із взаємодій інгібовано, здійснювали аналіз інгібування на основі сМе(зЕМАНЙі5 резонансним переносом енергії флуоресценції з тимчасовим розрізненням (англ. (те-гезоїЇмей Пиогезсепсе гезопапсе епегду ігапвіег, ТА-ЕВЕТ).
Приклад 17. Конкуренція антитіл проти с-Меї за зв'язування з розчинним сМесгЕСОНІв, визначена за допомогою сендвіч-тІФА.
По-перше, визначали концентрації оптимального покриття тестованих антитіл проти с-Меї і оптимальну концентрацію смМесЕСОНІ»5. Далі комірки для тІФА покривали протягом ночі при 4 "С
НиМар проти с-Меї, серійно розведеними в РВЗ (8 мкг/мл в 2-разових розведеннях). Потім комірки для тіФА відмивали РВЗТ (РВ5, доповнений 0,0595 Туееп-20 (бЗідта-Аїйагісн,
Звейндрехт, Нідерланди)) і блокували протягом однієї години за кімнатної температури (КТ)
РВЗТС (РВ5Т, доповнений 2 95 (0об./06.) курячою сироваткою |сірсо, Пейслі, Шотландія|). Після цього, комірки для тІФА відмивали РВ5Т та інкубували протягом однієї години за кімнатної температури з біотинільованими СМегЕєСОНІх серійно розведеними в РВ5ОТС (1 мкл/мл в 2- разових розведеннях). Незв'язаний біотинільований СМеЕїЕСОНІ» відмивали з РВ5Т, і зв'язаний біотинільований СМеЕгГЕСОНІ» інкубували протягом однієї години за КТ із 0,1 мкг/мл стрептавідин- полі-НЕР (Запдпіп, Амстердам, Нідерланди) розведеним в РВ5Т. Після відмивання, реакцію візуалізували після 15 хвилинної інкубації з 2,2'-азино-біс(З-етилбензотіазолін-б6-сульфоновою кислотою (АВТ: розвести одну таблетку АВТ5 в 50 мл буфера АВТ5 |Коспе Оіадповіїсв,
Алмер, Нідерланди)) за КТ із захистом від світла. Фарбування зупиняли шляхом додавання рівного об'єму щавлевої кислоти (Зідта-Айагісі, Звейндрехт, Нідерланди). Флуоресценцію при 405 нм вимірювали за допомогою рідера мікротитраційних планшетів (Віоїек Іпбзігитепів,
Винуски, США). Умови, які призводили до субоптимального (прибл. 80 95) зв'язування кожного антитіла, були визначені й використані для наступних експериментів перехресного блокування.
Комірки для тІФА покривали антитілом проти с-Меї у субоптимальній дозі, як описано вище.
Після блокування комірки для тІФА інкубували із заданою концентрацією біотинільованого смегЕСОНІі5х у присутності надлишку антитіла проти с-Меї. Реакція розвивалася, як описано вище. Залишкове зв'язування було виражене як відсоток відносно зв'язування, яке спостерігалося за відсутності антитіла-конкурента.
Таблиця 6. При додаванні їх як конкурентів, усі антитіла проти с-Меї були здатні конкурувати за зв'язування з їхніми іммобілізованими еквівалентами. 022, 058 і 505, при додаванні в як антитіл-конкурентів, конкурували з антитілами 005 і 006. Однак у зворотній реакції виявили тільки часткову конкуренцію антитіл 005 ії 006. Ці відмінності можуть бути пояснені більш низькими афінностями антитіл 005 і 006 до біотинільованого СМеЕгЕСОНІів. Антитіло 505, при додаванні як антитіла-конкурента, також демонструвало часткову конкуренцію з антитілами 008 і 045, тоді як у зворотній реакції не спостерігали або спостерігали мінімальну конкуренцію. Крім того, антитіла 024, 062, 064, 068 і 181 при додаванні як антитіл-конкурентів демонструють часткову конкуренцію з антитілом 101, тоді як зворотна реакція продемонструвала повне інгібування зв'язування СМесЕСОНІ5. Значення вищі ніж 100 95 можуть бути пояснені ефектами бо авідності й утворенням комплексів антитіло-СМе(Е СОНІі5, що містять два неконкуруючі антитіла.
Антитіла 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 ї 181 конкурують одне з одним за зв'язування з сМегЕСОНІбх. Антитіла 005, 006, 022 і 058 розглядалися як такі, що належать до однієї перехресно-блокувальної групи, яка відрізняється повною конкуренцією з 005, 006, 022, 058 і 505. Однак антитіло 505 було єдиним антитілом, яке також було здатне конкурувати за зв'язування з антитілом 045. Інша група антитіл, які конкурують за зв'язування з СсМегЕСОНІ5, складається з 008, 035 і 511-Н7.
Таблиця 6. Конкуренція антитіл проти с-Меї за зв'язування з біотинільованим сМегЕСОНІі5 і Антитіло, яке конкурує ! чїммобілізоване (005 ЩаЗаКЯ їв Недея рея4 |035 па5 В бавтитіло | ; ! І і. Ж3,Є 53,1 11,3 85,0 150,9 7,0 Боуї ! скоба б, ж, 0180, ОО 181,0 1ЖЕЯ,В 003,5 ВО,
КИМ пеня нон чини чини рен ннани ПИ дя ТИ ти
КЕ 53, 147,5 2,8 5,1 ВИНО 503,4 40,8 і : | З, 181,2 050,3 023,0 Кб. БЕ1,О 000 ЖЕ8,8 020,8 ' 13 ж, 053,5 1, 14,5 (0.4 53,5 БО в о ння М и Зо ні и ой ВА о вві пит Дт пу тт ютттні ах Я ІВ Дона 100,2 15, ІОВ, НІ Ок, В іБ10, 4 ПЗ БІ, 159,9 ОО, |, 1
КДД ди ди ди пу м пе на и п и о ЗО о и ав о: 55 зв, 133, ТТ, є 154,6 151,35 10,6 іл, ТВ, !
Е Троя тр сини и ни не зви пек ри; ВИ НН ї у кВ. ТЕТ, жен їй 5, ТЗ, 50,3 в Б, Ей, : ! 1,85 ЖЕ, 5 053,1 ЯНВ що, ж, ва, же, 5 "ут ИН пон чинни тин пи ов иа сер и че н а в у п5В 131,5 43,6 190, 2,8 105,0 50,1 1.7 4, ши ЕБ5,Х |жхо,8 жено 4,0 0, 511,5 жЛД,) 4,3 ої Я Б ов в, 7,5 835550 5 : че: ДЕ ЕЧНИКЯ 0и5 3,6 12,5 1519, за иЗ 0, де. НОНОНн и и чо зон фея зав лин ровнеми - - т нин оверу ними яв 01, 98,5 401,7 095,6 |. |В. 190,4 101,5 ни НН а нн НЕ НЕ Не ж
Їбва Пб2,31100,3 102,8 193,9 6,5 353,7 555 100,5. 08 а, І87,З газ, З, 12, 189,4 тав, аБ,5
Н По шу АТАТТТБ Я ту и шо, 156,7 4, жо, Яни БД, Ж, жи, З ! їх ди ДУ АКНЕ іо ик п о нн о тор в ов ЗИ но п пи син Ду нн
ГБО 191,5 185,7 34,5 по, вб,а 96, 196, 31 :
В 2,5 а8е 90, 12,4 95,2 955,1 183,9 6,56 меди у уки нт нен ОТИТ 14,7 19,4 18,9 ян? 159,7 Іа ок, -- яе пи о о пив пи и р и З І п ДЕ Я І -11-НА 150,5 47; БАЗ 5,3 19, 132,5 пи, |, ! рт, б, 50,23, 155,8 154,9 (55,9 4,3
Конкуренція 75 -» 100 95
Конкуренція 25-74 95 конкуренція 0-24 95
Антитіло, яке конкурує
М Іммобілівзоване 062 64 08 без Іо пд 181 ЗІ тн антитіла і І ШИ Н о 1х7,71118,5 195,7 194,5 0,803, 13,12, З 75,8 і ж8,4 |ж5,З 86,5 1,0 1Жж2,3 15а,Ь 15,1 ЗО 35 ! 152, |бБ,ш 15,1 ІЗ5,Я |Е8,Б же 151,3 0,8 0, пав 58 15 158 10,4 й 05,55, Бу
Що жа, Б в ї8,5 ж0,5 |х4,2 51,9 вил І, З : 035 яю 131,7 175,1 150,5 1126,2 113,05, 125,5 17,8
ПЕ. п, 103,7 1133,1397,0 175,2 1101,5195,2 27,8 |55,3 058 11051 1108,5 11851156 111,5 104,4 181,3 5,8 81,5 ! я, знаний 84,2 54,0 жб,2 80,8 1ж3,1 0,4 ЖН,Б пе 2. 15,2 ТЯ як НИ І З, ЗА Оу пб4 й, 2,9 113,0 195,7 14,7 17,5 ї0,1 їзя, ше 108, : же, 150,9 10,5 ЖО,2 1,2 |БО,й 53,0 жаб 510,8 ев 2,4 2,5 1856 15,4 8,2 5.8 015,2 548 10,3 0,3 |50,З 10,7 0,4 8,3 0,7 0, 1, Ба ШИ
БИ, БО р, Ж, 03,1 ж0,и |х1И0 155,13,
Бе3, З ж, р, 1,5 51,8 ж, ОО, |ЖК4,6 ЕН 81 М, 12,1 ви 12, У, 1 2,4 3,5 54,2 ОБ, 59,9 150,3 11,1 80,3 шиї 0,2 0,2 В БТ
ЗА З, |137,М 157,8 18856 397,6 17,95 ГрОо3, 44, 7, З й сих я 3,8 ра, 510,64, 351,5 3, 0,6 чл, жВ8,й хілив| в, |х5, 5 ге ВА
Представлені дані є відсотком інгібування зв'язування ж- ст. відхил. З незалежних експерименти. Для антитіл 035, 505 і 511-Н7 перехресно-блокувальний тІФА здійснювали тільки двічі. Крім того, кілька конкурентних реакцій ("), які дали значення Оптимальної Щільності вище, ніж 5,0, які були вищими від межі детекції рідера для тіФА. Ці результати були виключені з аналізу в результаті повторних вимірювань.
Приклад 18. Блокування зв'язування НОЕ з сМе(5ЗЕМА-567НІі58, визначене аналізом резонансного переносу енергії флуоресценції з тимчасовим розрізненням (ТК-ЕВЕТ)
НОЕ може зв'язувати рецептор с-Меї як у домені ЗЕМА, так і в Ідо-області. Однак тільки зв'язування НОЕ з доменом 5ЕМА виявилося критичним для активації рецептора. Із цієї причини, за допомогою технології ТК-ЕКЕТ була досліджена взаємодія антитіл проти с-Меї з доменом 5ЕМА рецептора с-Меї Для здійснення даного аналізу на основі однорідного зближення, фактор росту гепатоцитів (НОР, Ргозрес Тапу, Реховот, Ізраїль) кон'югували із флуоресцентним барвником-акцептором АїІехайног-647 (Іпмігодеп, Марення, Нідерланди). смМеї(ЗЕМА-567Ніз8 мітили флуоресцентною донорною молекулою, спрямованою проти гістидинової мітки (Апіі-бхпіз Еигоріит?», РегКкіпеІтег, Турку, Фінляндія). Зв'язування НОБ, кон'югованого з АїЇІехайцог-647, з міченим Європієм'"сМеі(зЗЕМА-567Ніз8 робить можливим перенос енергії з донорної молекули (зрушення 340 нм) на акцепторну молекулу (емісія 665 нм).
Середню інтенсивність флуоресценції при 665 нм вимірювали на рідері "Епмізіоп 2101 Мийіабе! геадег" (РегКіпеітег). Конкуренцію немічених антитіл проти с-Меї з НОР, кон'югованих з
АІехайної-647, вимірювали за зменшенням сигналу ТК-РКЕТ при 665 нм, через те, що в незв'язаному стані дистанція між донорним і акцептгорним флуорофорами є занадто великою для здійснення переносу енергії.
Усі розведення були зроблені в 0,5х буфері для детекції "АМСЕ ОЮеїесіоп Вийег" (РегкіпеІтег), доповненому 2,67 95 стабілізуючим розчином (РегкКіпеїтег) і 0,03 95 «(об./об.)
Тмееп-20 (Кієдеї! де Наеп, Сальтисоні, Німеччина). 25 мкл смМеї(5ЕМА-567НІВВ8 додавали до 25 мкл НОР, кон'югованого з АІехайцйог-647, 35 мкл "Апіі-бхпіз Еигоріит?З"» і 25 мкл неміченого антитіла проти с-Меї в 96-комірковому планшеті "оріі-м/пйе" (РегКіпеІтег). Була отримана кінцева концентрація 2,93 мкл/мл сМе(зЕМА-567Ніз8, 0,96 мкл/мл НОР, кон'югованого з
АІехайног-647 і 0,4 мкл/мл "Апіі-бхпів Еигорійте"». Тестували 4-разове серійне розведення неміченого антитіла проти с-Меї у діапазоні 0,49-8000 нг/мл. Після інкубування за 4 "С у темряві протягом ночі. Середню інтенсивність флюоресценції при 665 нм вимірювали за допомогою рідера "Епмізіоп 2101 Мищшіарбеї геадег" (РегкіпеІтег) з наступними встановленими параметрами: парне дзеркало І апсе/Юєа, фільтр емісії 615-665 нм, фільтр зрушення 320 нм, час затримки 60 мкс, вікно 100 мкс, 100 спалахів, 2000 мкс на цикл і двоспрямоване порядкове зчитування. Для визначення значень ІСво криві зв'язування аналізували за допомогою нелінійної регресії (сигмоїдальна крива "доза-ефект" з варіабельним нахилом) за допомогою програмного забезпечення "сгарпраай Ргізт М4.03" (сгарпрад оїмаге, Сан-Дієго, Каліфорнія, США).
На Фігурі 6 представлені криві інгібування зв'язування різних антитіл, які зв'язують Меї, при зв'язуванні з смМеї5ЕМА 567НІі58, протестовані за допомогою ТК-ЕКЕТ. За винятком антитіл 008, 035 і 096, усі антитіла були здатні конкурувати з НОБЕ, кон'югованим з АїЇІехайЙнцог-647, за зв'язування з сМмеї5ЕМА-567НІів8. Антитіло 022 було здатне інгібувати «80 95 зв'язування НОБ, тоді як антитіла 005, 006, 024, 045, 058, 061, 062, 064, 068, 069, 101, 181 їі антитіло позитивного контролю 505 були здатні інгібувати »90 95 зв'язування НОЕ з смМеі(5ЕМА-567НІів8. Визначили значення ІСзхо, які перебувають у діапазоні 0,082-0,624 мкг/мл.
Таблиця 7. Значення ІСво (мг/мл) і відсоток інгібування антитілами проти с-Меї зв'язування ліганда з СМеї(ЗЕМА-567НІів8, визначені за допомогою ТЕ-ЕВЕТ 006 |016ї щ 92 КР 008 |но/ 4 035 |но/ 19 058 |0151 щ 9 ж 061 10491 щ 9 г 068 Щ|0261 96 г 069 Щ|0541 97 096 | но 16 КРрКбе 098 |0551 Юющю Кг 98 щ ЯЗ(ЖжКЖ 701 |0531.ЙюЮющ 9 Ж ЗШ
Зо Представлені дані є середнім МЕЇ трьох незалежних експериментів.
Приклад 19. Аналіз життєздатності КРА
Антитіла проти с-Меї тестували щодо їхньої здатності інгібувати життєздатність клітин КРА (Кікеп Віогезошигсе Сепіег СеїІ Вапк, КСВ1005). Клітини КРА, які аутокринним чином експресують високі рівні як с-Меї, так і НОЕ, висівали в 96-комірковому культуральному планшеті (Сгеїпег Біо- опе, Фрикенхаузен, Німеччина) (10000 клітин/комірку) у безсироватковому середовищі (1 частина НАМ'5 Е12К (|Сатьгех, Іст-Резерфорд, Нью-Джерсі| і 1 частина ОМЕМ |Сатргехі|).
Одержували 66,7 нм розведення антитіла с-Меї у безсироватковому середовищі й додавали до клітин. Через З дні інкубації, кількість життєздатних клітин підраховували за допомогою "АіІатагбіце" (Віозоигсе Іпіегпайопаї, Сан-Франциско, США) відповідно до інструкції виробника.
Флуоресценцію відслідковували за допомогою рідера "Епмізідп 2101 МийШаре! геадег" (РегКіпеІтег, Турку, Фінляндія) зі стандартними параметрами для "АїЇІатагтфіце". Сигнал
"АіІатагбіце" оброблених антитілом клітин наносили на діаграму у вигляді відсотка сигналу в порівнянні з необробленими клітинами.
На Фігурі 7 зображене процентне інгібування життєздатних клітин КР4 після обробки антитілом, яке зв'язує с-Меї, у порівнянні з необробленими клітинами (0 95). Обведені рамкою клони є антитілами, які перехресно конкурують один з одним як описано в прикладі 17. Цікаво, що антитіла 024, 062, 064, 068, 069, 098, 101 ї 181, які належать до однієї перехресно- блокувальної групи, усі були здатні інгібувати життєздатність КРА (18-46 95), як у вигляді ІДС, так і у вигляді молекул "Опіроду". Також молекули Ідс1 антитіл 008, 061 і 096 були здатні інгібувати життєздатність КР4. Напроти, антитіло 045 не інгібує життєздатність КРА ні у вигляді
ІЧС1, ні у вигляді молекули "Опіроду". Для Опі-1016-045--е це можливо відбувається внаслідок його низької ймовірної афінності до мембранозв'язаного с-Меї, визначеної за допомогою аналізу ЕАС5 (приклад 13). Антитіла ді клонів 005, 006, 022 і 058 суттєво не інгібують життєздатність КР4, тоді як Опі-1016-022-їє6, Опі-1016-058-іе і Іде1-1016-058-мНаь інгібували життєздатність КРА на 57, 38 і 44 95, відповідно. Опі-1016-005 і Опі-1016-006 також перехресно конкурують із клонами 022 і 058, але суттєво не інгібують життєздатність КР4. Це можливо відбувається внаслідок їх низьких ймовірних афінностей, визначених аналізом РАС5 (приклад 13). Цікаво, що Ід04-1016-058 також продемонстрував деяке інгібування життєздатності КРА.
Цього не спостерігалося з Ід54-505).
У цілому дані вказують на те, що в деяких перехресно-блокувальних групах, для інгібування життєздатності КР4 потрібне моновалентне зв'язування, тоді як в інших перехресно- блокувальних групах життєздатність КРА можуть інгібувати як моновалентно, так і бівалентно зв'язуючі антитіла.
Приклад 20. Пухлинна модель на основі ксенотрансплантата КРА на 5СІО-мишах
Пухлинну модель на основі ксенотрансплантата на 5СІЮ-мишах використовували для визначення ефективності НиМар проти с-Меї при інгібуванні росту пухлин іп мімо. Семи- одинадцяти тижневі самки ЗСІЮ-мишей, лінії С.В-17/сгРікас-5сід/СтКІ, придбали в "Спагіеє5
Кімег І арогагогіез Медепапа" (Маастрихт, Нідерланди) і розмістили в стерильних умовах у клітках з верхнім фільтром з кормом і водою, доступними аа Ірйішт. Для ідентифікації мишей використовували мікрочіпи (РГЕЕХХ ВМ, Елст, Нідерланди). Усі експерименти були схвалені
Зо комітетом з етики відношення до тварин університету Утрехта.
У день 0, 10х105 клітин КРА4 інокулювали підшкірно в 200 мкл РВ5 у правий бік. Мишей перевіряли, щонайменше, двічі на тиждень за клінічними ознаками захворювання. Розмір пухлин визначали, щонайменше, раз на тиждень. Об'єми (мм?) розраховували після вимірювання штангенциркулем (РІ ЕХХ) як 0,52 х (довжина) х (ширина)2, починаючи з 16 дня.
На 9 день вимірювали середні розміри пухлин і мишей розділяли на 8 груп по 7 мишей у кожній.
Антитіла проти с-Меї (008, 058, 069 і 098) ін'єктували внутрішньоочеревно. Антитіло 511-Н7 використовували як антитіло позитивного контролю, тоді як антитіла 505 та ізотипного контролю використовували як антитіла негативного контролю. Миші одержували дозу насичення 400 мкг/мишу з подальшою щотижневою дозою підтримування 200 мкг/мишу, протягом 7 тижнів.
Додатково зразки плазми, відбирали до введення 1, З і 5 дози підтримування, а потім мишей забивали і визначали наявність людських ЇдДС за допомогою латексних гранул на нефелометрі "ВМІ!" (Саде Вепйгіпо, Аттербури, Великобританія).
На Фігурах 8 і 9 показано, що ріст пухлинних клітин КРА інгібували НиМаб 008, 069, 098 і позитивний контроль (511-НЯ. Інгібування порівнювали з обробкою антитілом ізотипового контролю. Ріст пухлинних клітин КР4 був уповільнений, але не був повністю інгібований контрольним антитілом (311-Н2. Клони 069 і 098 продемонстрували більш потужне інгібування в порівнянні із клонами 008 і (311-Н7. Антитіла 505 і 058 не інгібували ріст пухлин. Це узгоджувалося з даними іп міїго, описаними в прикладі 19. У сукупності, ці дані вказують на те, що в деяких перехресно-блокувальних групах бівалентно зв'язуючі антитіла можуть інгібувати ріст пухлини КРА.
Приклад 21. Пухлинна модель на основі ксенотрансплантата МКМ45
Пухлинну модель ксенотрансплантата людської аденокарциноми шлунка МКМ45 у голих мишей використовували для визначення ефективності НиМаб проти с-Меї при інгібуванні росту пухлин іп мімо.
Клітини людської аденокарциноми шлунка МКМ45 культивували при 37 "С і 5595 СО» у середовищі КРМІ-1640, яке містить 100 одиниць/мл натрієвої солі пеніциліну с, 100 мкг/мл сульфату стрептоміцину, 25 мкг/мл гентаміцину, 20 96 фетальної бичачої сироватки й 2 мМ глутаміну. Використовували семи-восьми тижневих самок голих мишей (пи/пи, Нагіап) (масою 60 тіла в діапазоні від 17,0 до 26,4 г на початку дослідження). Тварини одержували воду та корм ай
Прйшт. Мишей утримували за умов, які відповідають рекомендаціям посібника з утримання та використання лабораторних тварин. Догляд за тваринами й програма використання були акредитовані АААГАС. В день 0, 1х10е" клітин МКМ45 інокулювали підшкірно в 200 мкл 50 95 матригеля в РВЗ у бік кожної миші. На 7 день, тварин розсортували у п'ять груп (п-10) із середнім об'ємом пухлини від 80 до 120 мм3 і почали обробку. Антитіла проти с-Меї (008, 058, 069) ін'єктували у хвостову вену (в.в.). Антитіло (311-Н2 використовували як антитіло позитивного контролю, а антитіло ізотипового контролю використовували як антитіло негативного контролю. Усі миші одержали 40 мг/кг антитіла на 7 день і 20 мг/кг антитіла на 14, 21 і 28 день.
Пухлини вимірювали двічі на тиждень за допомогою штангенциркуля до кінцевого об'єму пухлини 700 мм3 або до кінця дослідження (62 день). На Фігурах 10 і 11 показано, що ріст пухлинних клітин МКМ45 був значно уповільнений антитілами 008, 058, 069, і контрольним антитілом 11-Н2 у порівнянні з обробкою антитілом ізотипового контролю.
Приклад 22. Зниження залишкової агоністичної активності до 1-антитіл проти с-Меї шляхом ослаблення конформаційної гнучкості
Природний ліганд с-Меї, НОР, є функціональним димером, який індукує димеризацію двох молекул с-Меї. Наступне внутрішньоклітинне фосфорилювання внутрішньоклітинного домена с-
Меї приводить до активації декількох сигнальних шляхів, які задіяні у проліферації, інвазії й виживанні клітин. Більшість бівалентних антитіл, які індукуються проти с-Меї, демонструють співрозмірні з НОР ефекти на напрямок розвитку клітин, що особливо зв'язувані антитілом епітопи розташовані в с-Меї близько або в домені ЗЕМА.
Для мінімізації потенційної залишкової агоністичної активності бівалентних антитіл Ідс1, була використана стратегія зменшення конформаційної гнучкості. В дС1 у плечей Бар є більший ступінь свободи для руху відносно домена Ес. Найбільші конформаційні зміни є результатом гнучкості шарніра, який дозволяє широкий діапазон кутів РГаб-Ес (ОПтапп Зарнігє,
Е., А.Г. еїапіє!д, М.О.М. Стівріп, Р.М.Н.І. Ратеп, Р.М. Вида, В.А. Юмжек, О.А. Випоп апа І.А.
УМіївоп. 2002. Сопігавіїпу ІДС вігисішгев геуваї! ехігете азуттеїгу апа ЛПехіріїйу. у. Мої. Віої. 319: 9- 18). Один шлях зменшення гнучкості Баб-плеча в імуноглобулінах полягає в запобіганні утворенню дисульфідних зв'язків між легким і важким ланцюгом за допомогою генетичної
Зо модифікації. У природному антитілі ДО1 легкий ланцюг з'єднаний ковалентно з важким ланцюгом через дисульфідний зв'язок, який з'єднує С-кінцевий цистеїн легкого ланцюга із цистеїном у позиції 220 (С220 за нумерацією Е)О) у шарнірі Ес важкого ланцюга. Або шляхом мутації амінокислоти С220 на серин або будь-яку іншу природну амінокислоту, або шляхом повного видалення шарніра, або шляхом заміни шарніра ЇдДс1 на шарнір Ідс3З, утворюється молекула, у якій легкі ланцюги з'єднані через їх С-кінцеві цистеїни, аналогічно до ситуації, виявленої в людському ізотипі ІЦА2т(1). Це призводить до зниженої гнучкості Бар відносно Ес і, отже, знижує здатність до перехресного зв'язування, що показано в порівняльних дослідженнях агоністичного антитіла проти с-Меї (505) у форматі ІДА2тії) ії (901 при аналізі життєздатності
КРА (Фігура 12).
Інша стратегія зменшення гнучкості молекули ІдДО1 полягає в заміні шарніра Ідс1 на шарнір
Іц9ос2 або Ід 2-подібний шарнір. (бапої еї ам. ЕМВО 4. 1988;7:1989-94). Дана шарнірна область має дві властивості, відмінні від властивостей шарніра ІДдс1, які, як уважається, роблять молекулу менш гнучкою. По-перше, у порівнянні із шарніром ІдС1 шарнір ІдсС2 на З амінокислоти коротший. По-друге, шарнір д02 містить додатковий цистеїн, таким чином, утворюється три, замість двох, дисульфідних містки усередині важкого ланцюга. В іншому випадку, може бути введений варіант шарніра Ідс1, який має подібність до шарніра Ідс2. Цей мутант (ТН7Аб-9) (М/О2010063746) містить мутацію Т223С і дві делеції (К222 і 1225) для утворення більш короткого шарніра з додатковим цистеїном.
Приклад 23. Одержання молекул Ідс1 зі зниженою гнучкістю (тверді молекули Ідс1)
Клонування й експресія
Мутантні антитіла Ідс1 були розроблені й клоновані за допомогою стандартних молекулярно-біологічних методів. Огляд послідовностей усіх отриманих мутацій шарнірної області представлено в таблиці 8 нижче.
Таблиця 8. Амінокислотна послідовність шарніра мутантних до 1-антитіл. Делеції позначені «-», а мутації підкреслені.
їЧбі Дикий Тип ВРКБСОКТИТСВВоВ тЯ451 Шарнір-їдаси ЕВКССУЕ--СРРСЕ тзб51і ДСО ЕРВКБ-ІІКТНТСРРСР ї4б1 02205 ЕРКВВОКТНТСРРОСР тЧавІ тн7Ав-9 ВРКВСІ-СН-СВРСР тчсі з вилучаним пт тонн ння шарніром (пі-тхачс1) тасі Шарнір-т963 ЕБЕТРІСОТТНТСЕВСРЕРЕЗСОТРЕРСРНСЮ і ЕРКВСОТЕРЕСРЕСРЕВКОСОТЕРЕСРВСР
Для експресії отриманих твердих антитіл Їдс1 у клітинах ссавців, константну область НС з
І9с1, яка містить мутації в області шарніра (див. вище таблицю 8), синтезували у вигляді конструкта з оптимізованими кодонами у векторі для експресії в ссавців РСОМАЗ.З (Іпмігодеп).
Окремий вектор сконструювали шляхом вставки оптимізованої за кодонами константної області в область людського легкого ланцюга каппа в рсОМАЗ.3. Області МН і Мі клону 069 і контрольного антитіла 505 вставляли в плазміду з константною областю НС і плазміду з легким ланцюгом каппа, що дає вектори для експресії (мутованих) важкого й легкого ланцюгів специфічних антитіл. Котрансфекція векторів з важким й легким ланцюгами специфічного антитіла в клітинах НЕК-293Е (Іпмігодеп), призводила до тимчасового вироблення мутантних антитіл. Очищення антитіл здійснювали за допомогою афінної колонкової хроматографії із протеїном А (як описано в прикладі 11).
Визначення біохімічних характеристик
Тимчасова експресія
Усі мутанти експресувались на достатніх рівнях і не демонстрували аберантного утворення мультимерів, що було визначено за допомогою М5 (299 95 чистоти) і ДСН-ПААГ.
Результати ДСН-ПААГ представлені на Фігурі 13. Спостерігали у мутантів С220 (С2205 й
ДОС220) й варіантів І(Я051 з видаленим шарніром (варіанти (3901 з видаленим шарніром також називаються ОпіВоду-Іде1 або Опі-Іде1) спаровування легкого ланцюга, помітне у вигляді білої смуги приблизно 50 кДа при аналізі у невідновлюючому ДСН-ПААГ. Варіант із шарніром доз також продемонстрував спаровування легких ланцюгів, тоді як варіант із шарніром Ідса2 і мутант
Іда1 ТН7Аб-9 продемонстрували нормальне спаровування легкого й важкого ланцюгів.
Приклад 24. Властивості зв'язування мутантів з с-Меї
Властивості зв'язування мутантів із с-Меї тестували за допомогою тіІФА. Комірки планшета для тІФА покривали протягом ночі при 4 "С гТНОЕ Р/Ес Спітега (КО 5у«(етв5; Саї.358МТ/СЕ) в
РВЗ (1 мкг/мл). Потім комірки для тІФА відмивали РВ5Т (РВ5, доповнений 0,05 95 Гувеп-20
Ібідта-Аїдгісй, Звейндрехт, Нідерланди)) і блокували протягом однієї години за кімнатної температури (КТ) РВ5ЗТС (РВ5Т, доповнений 2 95 (об./06.) курячою сироваткою |сСірсо, Пейслі,
Зо Шотландія)|). Після цього, комірки відмивали РВЗТ і інкубували протягом однієї години за кімнатної температури з антитілами проти с-Меї і варіантами, серійно розведеними в РВ5ЗТС (10 мкл/мл в 4-разових розведеннях). Незв'язане антитіло відмивали за допомогою РВ5Т, і антитіло, зв'язане з покриттям визначали при інкубації протягом однієї години за КТ із козячими
Кар)2-НКР проти людських ІДС, розведених в РВ5Т (Часкзоп саї.по. 109-035-097). Після відмивання, реакцію візуалізували 15 хвилинною інкубацією з /2,2'-азино-біс(3- етилбензотіазолін-б-сульфоновою кислотою (АВТ: розвести одну таблетку АВТЗ в 50 мл буферу АВТ5 |Коспе Оіадповіїс5, Алмер, Нідерландиї|) за КТ із захистом від світла. Фарбування зупиняли шляхом додавання рівного об'єму щавлевої кислоти (бідта-Аїагісі, Звейндрехт,
Нідерланди). Флуоресценцію при 405 нм вимірювали за допомогою рідера мікротитраційних планшетів (Віоїек Іпзігитепі5, Винуски, США). Усі мутанти зв'язувалися з с-Меї з співрозмірною наявною афінністю (ЕСво) (Фігура 14). У таблиці 10 представлені значення ЕСбзо мутантів, отриманих у даному експерименті. 5О0
Таблиця 9.
Значення ЕсСобхо, визначені за допомогою тІФА
Іда1- : Іа1- . сті ее 1016 Пюсо-) б | юсі- | ло16- т016- | 10167 | 1016. | ве. 4016-| 70167 ) 1016.) 3016.) ове- | 901- ове 00693. | 069. | Шарнір| 069 | 069 | 069. | ово | шарнір | 10167 до220 | б2205 Іс ТН7дбв-9| ТЕ ІС 069 (нг/мл)
Приклад 25. Знижений агоністичний ефект твердих до 1-антитіл проти с-Меї
Фосфорилювання рецепторів
Для визначення агоністичних властивостей захищених антитіл досліджували вплив антитіл на фосфорилювання с-Меї. Після димеризації двох сусідніх рецепторів с-Меї або природнім лігандом НСБ, або більшістю бівалентних антитіл, три залишки тирозину (позиції 1230, 1234 і 1235) у внутрішньоклітинному домені с-Меї стають перехресно фосфорильованими, після чого відбувається подальше фосфорилювання декількох інших амінокислот внутрішньоклітинного домена й активація декількох сигнальних каскадів. Димеризацію й активацію с-Меї можна, отже, відслідковувати за допомогою антитіл, специфічних до фосфорильованого у цих позиціях рецептору, і в такий спосіб її можна використовувати як дані про потенційний агонізм антитіл проти с-Меї.
Клітини А5Б49, ССІ -185 отримані з АТСС, вирощували в сироватці, яка містить середовище
ОМЕМ, до досягнення 70 95 конфлюентності. Після трипсинізації й відмивання клітини висівали в 6-комірковому культуральному планшеті по 1710е6 клітин/комірку, у культуральну середовищі, яке містить сироватку. Після нічної інкубації клітини обробляли або НОЕ (КО 5у«іетв; саї. 294-
НО) (50 нг/мл), або панеллю антитіл (30 мкг/мл) та інкубували протягом 15 хвилин при 37 "с.
Клітини потім відмивали двічі крижаним РВ5 і лізували буфером для лізування (Сеї! бідпаїїпо; саї. 9803) доповненим коктейлем інгібіторів протеаз (Коспе; саї. 11836170001), зразки зберігали при -80 "С. Активацію рецептора визначали вимірюванням фосфорилювання за допомогою вестерн-блотингу за допомогою антитіл, специфічних до фосфо-с-Меї. Білки в клітинному лізаті розділяли на 4-12 95 гелі ДСН-ПААГ і переносили на нітроцелюлозну мембрану, яку потім фарбували антитілом, специфічним до фосфорильованого с-Меї (1234/1235) (Сеї! Зідпаїїпа, саг 3129). Для контролю завантаження гелю використовували антитіла проти загального с-Меї і бета-актину. Результати вестерн-блотингу представлені на Фігурі 15.
Контролі середовища тканинної культури й клітини, оброблені моновалентним форматом
Опіроду антитіла 505, не продемонстрували фосфорилювання рецептора. Напроти, вестерн- блотинг клітин, оброблених позитивним контролем НОБЕ або антитілом-агоністом Ід1-1016-058,
Зо продемонстрував чітку смугу очікуваної маси. Антитіло І951-1016-069 продемонструвало низьке, але детектоване фосфорилювання рецептора, що вказує на те, що має місце деяке перехресне зв'язування рецептора. Однак варіанти, які були розроблені для зменшення гнучкості молекули антитіла, продемонстрували мінімальну активацію рецептора, аж до рівня, співрозмірного з рівнями детектованими в клітинах, оброблених моновалентним контролем Опі- 505-ТЕ (Фігура 15).
Ефект антитіл с-Меї на проліферацію МС1І-Ніа41 іп міт
Потенційну проліферативну агоністичну активність антитіл проти с-Меї тестували за допомогою клітинної лінії легеневої аденокарциноми МСІ-Н441 (АТС, НТВ-174"М), яка експресує високі рівні с-Меї, але не продукує його ліганд НОР. Клітини МСІ-Н441 висівали в 96- коміркові планшети для тканинних культур (Огеїіпег ріо-опе, Фрикенхаузен, Німеччина) (5000 клітин/комірку) в КРМІ (Гопла) без сироватки. Розведення антитіла проти с-Меї (66,7 нМ) готували в КРМІ без сироватки й додавали до клітин. Через 7 днів інкубації при 37 "С/5 965 СО», кількість життєздатних клітин підраховували за допомогою "АІатагріце" (Віозоцигсе Іпіегпайопаї,
Сан-Франциско, США) відповідно до інструкції виробника. Флуоресценцію відслідковували за допомогою рідера "Епмізіоп 2101 Мийаре! геадег" (РегКіпеІтег, Турку, Фінляндія) зі стандартними параметрами для "Аіатагбіче".
Як видно з Фігури 17 проліферація клітин МСІ-Н441 сильно індукується агоністичними контрольними мАТ /дс1-058 ії Ід01-505. Антитіло Ід01-1016-069 також продемонструвало агоністичний ефект у порівнянні із клітинами, обробленими ізотиповим контролем. Агоністична активність Іде1-1016-069 може бути повністю усунута шляхом введення мутацій в С220, С22051 -деї, ії частково варіантами із шарніром Ідс2 і ТН7Дб-9 або з каркасом Ідс2. Контрольні зразки, оброблені ізотипним контролем і моновалентною версією 505 (Опі-505-ТЕ), не індукували ріст клітин.
Аналіз життєздатності КРА
Здатність інгібувати НОЕ-залежні клітини також була визначена для мутантів антитіла проти с-Меї в аналізі життєздатності КРА (див. приклад 19 для експериментальних процедур).
Результати представлено на Фігурі 17. Ефективність мутантів на основі Ідсе1-1016-069 повністю зберігалася або була незначно кращою в С 220-мутантів. Примітно, що внесення мутації в С220 в агоністичне антитіло 505 призводить до значного зниження життєздатності КР4. Відсутність агоністичного ефекту в антитіл 058 і 505 у форматі Ідс1 спостерігали через високу експресію
НОЄБЕ клітинами КРА (аутокринна петля НОР).
Негативна модуляція
Негативна модуляція, індукована антагоністичними антитілами, представляє механізм дії терапевтичних антитіл проти с-Меї. Відповідно, в одному втіленні потрібні антитіла зі зниженими агоністичними властивостями, але зі збереженою здатністю індукувати негативну модуляцію с-
Меї. Для визначення негативного потенціалу антитіл, клітини А549 (СС -185, отримані з АТСС) висівали в 6б-коміркові планшети для тканинних культур (500 000 клітин/комірку) на клітинному культуральному середовищі із сироваткою й культивували протягом ночі при 37 "С. На наступний ранок антитіла проти с-Меї додавали в кінцевій концентрації 10 мкг/мл і планшет інкубували наступні 2 дня при 37 "С. Після відмивання РВ5, клітини лізували інкубацією протягом 30 хвилин за кімнатної температури з 250 мкл буфера для лізису (Сеї| 5ідпаїїпо,
Данверс, США). Загальний білок підраховували за допомогою реактиву для визначення білка з біцинхоліновою кислотою (англ. Бісіпспопіпіс асії, ВСА) (Ріегсе), дотримуючись протоколу виробника. Рівні білка с-Меї у клітинних лізатах підраховували за допомогою специфічного до с-
Меї сендвіч-тІФА. Із цією метою, комірки планшетів для тІФА покривали протягом ночі при 4 "С козиним антитілом проти людського с-Меї, спрямованого проти позаклітинного домена с-Меї (К8О 5узіетв5), розведеним в РВ5 (1 мкг/мл). Потім комірки для тІФА відмивали РВ5Т (РВ5, доповнений 0,05 95 Гуєеп-20 ІбЗідта-Аїагісй, Звейндрехт, Нідерланди|) і блокували протягом
Зо однієї години за кімнатної температури (КТ) РВЗТС (РВЗТ, доповнений 2 95 (06./06.) курячою сироваткою (Сірсо, Пейсли, Шотландія)|). Додавали нерозведені клітинні лізати (100 мкл) та інкубували одну годину за КТ. Після відмивання РВЗТ комірки інкубували одну годину за кімнатної температури з мишачим антитілом проти внутрішньоклітинного залишку тирозину- 1234 людського с-Меї (Сеї! 5ідпаїйпо), розведеного 1:1000 в РВЗСОС. Комірки знову відмивали
РВ5Т ії інкубували протягом однієї години за КТ із козячим антитілом проти мишачого Ес-НАР (Часкзоп), розведеним 1:5000 в РВС. Після відмивання РВ5Т, реакцію візуалізували після 30 хвилинної інкубації з 2,2'-азино-біс(З-етилбензотіазолін-6-сульфоновою кислотою (АВТ: розвести одну таблетку АВТ5 в 50 мл буфері АВТЗ |Коспе Оіадповіїйс5, Алмер, Нідерланди|) за
КТ захищаючи від світла. Фарбування зупиняли шляхом додавання рівного об'єму щавлевої кислоти (5ідта-Аїдгісп, Звейндрехт, Нідерланди). Флуоресценцію при 405 нм вимірювали за допомогою рідера мікротитраційних планшетів (Віотек Іпбзігитепів5, Вінускі, США). Як видно з
Фігури 18 усі мутанти антитіла 069 були здатні індукувати негативну модуляцію.
Приклад 26. Антитілозалежна клітинноопосередкована цитотоксичність (АЮСС)
Клітини МКМ45 (придбані в КІКЕМ Віогезошигсе Сепіег, Цукуба, Японія, КСВ1001) відбирали (5хІ05 клітин), промивали (двічі в РВ5, 1500 об./хв., 5 хв.) і відбирали в 1 мл середовища ЕРМІ 1640, доповненого 10 95 сироваткою СС5 (со5тіс саїї зегит) (Нусіопе, Логан, Юта, США), до якої додавали 200 мкКи "Сг (Хром-51; Атегепат Віобзсіепсе5 Еигоре Стр, Розендал,
Нідерланди). Суміш інкубували у водяній бані, перемішуючи, протягом 1,5 годин при 37 "с.
Після промивання клітин (двічі в РВ5, 1500 об./хв., 5 хв.), клітини ресуспендували в середовищі
КРМІ 1640, доповненому 1095 СС5, підраховували за включенням трипанового синього й розбавляли до концентрації 1 х109 клітин/мл.
При цьому мононуклеарні клітини периферійної крові виділяли зі свіжих лейкотромбоцитарних шарів (Запдиіп, Амстердам, Нідерланди) за допомогою стандартного центрифугування в градієнті щільності фікола відповідно до інструкцій виробника (середовище для відділення лімфоцитів; І оп7а, Верв'є, Франція). Після ресуспендування в середовищі КРМІ 1640, доповненому 1095 СС5, клітини підраховували за включенням трипанового синього й концентрували до 1х107 клітин/мл.
Для кожного експерименту АЮСС, 50 мкл мічених 5'Стг клітин МКМА45 (5000 клітин) попередньо інкубували з 15 мкг/мл антитіла проти с-Меї у кінцевому об'ємі 100 мкл середовища бо ЕРМІ, доповненого 10 95 СС5, в 96-комірковому мікротитраційному планшеті. Після 15 хвилин за КТ, додавали 50 пкл РВМС (500,000 клітин), з одержанням співвідношення ефектора до мішені 100:1. Максимальну кількість лізису клітин визначали інкубацією 50 мкл мічених 2'Сг клітин МКМ45 (5000 клітин) з 100 мкл 5 95 Тийоп-ХІО0. Кількість спонтанного лізису визначали інкубацією 5000 мічених "Сг клітин МКМ45 в 150 мкл середовища, без антитіла або клітин- ефекторів. Рівень антитіло-незалежного лізису клітин визначали інкубацією 5000 клітин МКМ45 з 500000 РВМС без антитіла. Потім, клітини інкубували 4 години при 37 "С, 5 95 СО». Клітини центрифугували (1200 об./хв., З хв.) і 75 мкл надосадової рідини переносили в мікронні пробірки, після яких підраховували "Сг за допомогою лічильника гамма-випромінювання.
Підраховані імпульси за хвилину (імп./хв.) використовували для розрахунків відсотка опосередкованого антитілами лізису в такий спосіб: (імп./хв. зразка - імп./хв. антитіло-незалежного лізису)/імп./хв. макс. лізис - імп./хв. спонтанного лізису) х 100 Фо
У різних публікаціях продемонстрована кореляція між зниженим фукозилюванням кора й підвищеною активністю АЮСС іп міто (ЗНієЇїде ВІ. 2002 УВС; 277:26733-26740, Зпіпкама Т. 2003
УВС; 278(5):3466-3473). На Фігурі 19 показано, що антитіло 069 не індукує лізис клітин МКМ45 через АОСС. Однак коли фукозилювання кора було знижено через присутність кіфунензину в процесі продукування мАТ у клітинах НЕК, антитіло 069 було здатне індукувати більше 30 95 лізису клітин МКМ45. Більше того, лізис уже спостерігався при концентраціях антитіл нижче 0,01 мкг/мл. Представлені значення є середніми максимальними відсотками вивільнення ?'Сг ж станд. відх. з одного репрезентативного іп мо АОСС експерименту із клітинами МКМ45.
Антитіло 069 з низьким рівнем фукози вироблялося в клітинах НЕК 293 в присутності кіфунензину, що дає «99,5 95 не корове фукозилювання (тобто відсутність фукози). Антитіло 069 з високим рівнем фукози вироблялося в клітинах НЕК 293 без кіфунензину, що дає «2,11 95 не корове фукозилювання, яке визначається високоефективною аніонообмінною хроматографією, у поєднані з імпульсним амперометричним детектуванням (НРАЕС-РАО) (дані не показані).
Приклад 27. Втрата зв'язування антитіл проти с-Меї з людськими клітинами периферійної крові
Для з'ясування зв'язування клону 069 із трьома типами клітин (В-клітини, моноцити й гранулоцити), присутніми в периферійній крові, проводили аналіз зв'язування за допомогою
Зо ЕАС5. Флуоресцентно мічений клон 069 використовували для прямого вимірювання на ЕАС5 без використання вторинних детектуючих антитіл. Клітинні популяції в крові були ідентифіковані в аналізі за допомогою флуоресцентних комерційних антитіл проти специфічних маркерів на клітинах, які представляють інтерес.
Периферійну кров від здорових волонтерів (Медичний центр Університету Утрехта) розбавляли вдесятеро в буфері для ГАС (РВЗшО,4 55 ВБАч0,02 95 Мам») та інкубували з антитілами проти с-Меї, кон'югованими з АїЇеха"88, Її антитілами проти СО19, СО16 і СО14, кон'югованими з РІТС (кінцева концентрація 10 пг/мл), і антитілами проти СО19, СО16 ї СО14, міченими фікоеретрином (ВО Віозсіепсе5, Сан-Хосе, Каліфорнія) для ідентифікації клітинних популяцій (відповід.В-клітин, гранулоцитів і моноцитів) у кінцевому об'ємі 100 мкл. Після 30 хвилин при 4 "С, зразки центрифугували (300 9, З хв.), надосадову рідину видаляли, еритроцити лізували інкубацією (10 хв., 4 "С) з 200 мкл розчину "Егу-Іузіб5 зоЇшіоп" (155 мМ МНеСІ, 10 мМ
КНОСОз, 0,1 мМ ЕОТА рН 7.4Ї), і відмивали зразки двічі в буфері для ЕАС5. Зразки ресуспендували в 100 мкл буфера для ЕАСЗ і аналізували за допомогою "ГАС5 Сапіо І" (ВО
Віозсіепсев).
Фігура 20 представляє діаграму ГАС5, у якій показано, що 069, кон'юговане з АІеха"88, не зв'язувало популяцію В-клітин (СО19-РЕ" клітини в межах вікна лімфоцитів). Зв'язування кон'югованого з АЇІеха"88 ритуксимаба використовували як позитивний контроль. Зв'язування з іншими клітинними популяціями аналізували у той же спосіб і характерні результати для одного з З донорів також поміщені на діаграму на Фігурі 21. Антитіло 069-аІеха"8 не зв'язує В-клітини, моноцити або гранулоцити, тоді як антитіла позитивного контролю демонстрували специфічне зв'язування.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 ГЕНМАБ А/С «Тї20» МОнНОКклЛОнНАЛЬНІ ДЯТИТІЛА ДО сС-Мет «1305 р/58.щО «Т60» 212 «1705 рРагептІв хегзіоп 3.5 «2105 1 «11» 121 «2412» РАХ «2135 Вощо б5арівпе «4005 1 5Ій ма! біп о зген о уа! бій 5ег бу Аа сін Уаї губ груз вро 51у ет і 5 їй 35
Бек Уаї уз ма! бек Суб Гуз Аїа зег о спіу біу тагОРНе 5вг оЗевкстує 29 25 30 сіу вне біу тгРБоУуаі Або б1й АТа вго біу тий бу бен бід Тер оМеє с1у Аго ї1е 5агорго ї1е Се бім 1128 АТа Ази туго АТа бій Мет оейе 59 сій соту дед ма! ївВгої1іе ТВ? АТа дер огує зек о тТвг озег тиг АТа тус 65 70 75 но мес сій беу бег Зег ер аАгу его сти Абр Те АтТа маї тує тує Суб 85 90 95 яїа Агу Ар Уа! б1у тує б5р о Терорго Ар отТК РВЕ Ар ті тер 1У 100 5 і зів сіу тйе мет ха! х1іє ма! бег 5ег 115 1270 «Ай» 2 «11 5 «2123 РТ «213» пото 5арієль «005 ек тук Ту Рпе о1у 1 5 «їх 3 киці» 17 «12» РЕт «й13» Войо зарієпе -8005 3 дгЯ же 5егорго ї1іє цей шї1у 112 А1а дей Тус діа Ів мет Ре бій 1 5 10 15 е1У «2105 4 «1 12 «гі?» РВТ «гії» пото зартієпе «Ох 4 д5р ма! сіу Туг Азр тер РГО дер тв оРВе дзр ї1е 1 5 10 «230» 5 «2І15 107 «й312з рат «Із пото зарівене «а002 5 дер бій Меї тТВг бій его Рго бек озег ей 5ег АТасзак Уа! су і 5 10 15 дБр ага ма! Те їЛе твВгосСує Аго АТа бек обЄ1побіу їв баг об5ег Тгр ес аа тгротує біп йТй бух Рко бій бух Аїа Рго був чего їец її туг АТа АТа заг 5ег о йеу біп бек біу маії Рго 5ег Аго с Рйе с бак б1у 50 о1у аіу бег 51уУ Тк оА5р вне Твг зей тнг о їїв 5его5егоїеу сій рго 55 70 75 80 сій Ар РНе А1а твготуг тугосСух біп бій Туг А5побеє Ре Рго РКО 55 90 55 ти вна с с1у біп біу твйговуб Маї сію Т1е гу о 105 «2105 6 «2115 11 «212» РЕТ «2135 пожщо зарієпь кчищье б
Ага Аїа бег біп бу її2е бБеє его Терогецз Аа і 5 10 «вд» 7 «113 у «ві2х вт х«Ф13» Ното зарієпь «ОО»
Аіа АїТа 5ег зер оіїеу вій бег 1 5 «2105 8 «1» 8 «2125 РЕТ «2135 Вото зарівбе «4005 8 віпосій Тук ази век рйе рРго РКО тн 1 5 «НІ З «21їз 121 «Бій» ВРВТ «З» Мото зартепе «8005 9 зій уаї біп без уа! бій беб обу АТа сій Уа! уз бує РРО сіу Бек 1 х! 10 15 зег ма1ї гу маї бегосСув Ту дід бек б1у біу Тік вне бек бЗег РНе с1у їТе сТу Тгр о уа! Аго б1п Аїд Рго сту сій бі (ев бів тгр мех 30 45. о1у Ага І1е Ре РгО ї1е гец сту те АТа АєЙй туго Аза б1й мес Ре бо сеіп б1у дго уаії тиг Її1е тйг Аїа Аброгуб бек отрг озер о таг АТа тус 65 7 75 80 мек бій ге) тт 5ег сей ау его би дер тис Аа маї бук тук Сух
К5 90 95
А1а Ага азрома! б1у туг АвроБес Аза Авр о Аа вне дар тіє тге е1у 106 105 пла
Зіп біу Тр оМеї ма! Тк ма! чего бег 115 120 «ей105 10 «231» 5 «й12з вит «2335 пото 5зарівпз кОм та
Бек РН сту тів сту 1 5.
-21ї1» 37 «йї2х РТ «ВІЗ» Ното зарівпе «4005 Ії
Адгу їіе Ре Рго 116 Гей біу ТНг о Аїа А5п туго АТа ся Меж Рпе: бів ї 5 10 15 51У «2» 17 «її» 12 «21йх РЕТ «813» Вото зарівп5 «ПО» 12 дер уаї біу тук АБр Бек Аіз А5р АТа тре Аза о їїе
А 5 16 «Ох 13 «2115 107 «2125. рт «13» Мото зарієпе «200» 13
Ар тліє біп Меж ТВ ОТ бег о рго бегб 5ег ген ошвг Аза бег уаї з1у у 5 10 15.
Авр Аг Маї Тйг о ї1е тп сСух Аг А1а зве біп піу тів бек бег тгр кеш АТа тгротут іп бій їу5 РРО бін вуз Аа рРго сух бег Кей те туг Аза Аза бег бек оїеми біп 5ег оту Маї Рго бег Ага вре 5ег Фу 53 Ба загосіу бЗек БУ Тег Ав РНе ТвгобеноТйпг їТе 5еб Баг отец ап рго 65 70 75 80 стШ А5ройе АТа тк туго Тут сув б1п бій Туг дей бег о тТук вро Рго 85 о 95
Як о РНе сіу сп бі тс гу уаї бій їв су 1005 105 «2105 14 каїїз 11 «212» РТ хеї3» Яюще 5арівп» «400» 4 аг АТа бегобіп біу Хе бег о5еаг тгровеб АТ я 5 10 «ей10» 15 «11» 7 «егійУ РЕК : «Ф135 Вот 5зартене «А» 15 діа Аїв Зек бек се біл Бе 1 5 «ох 16 «2112 9 «212» РЕ кд135 Вошо зарієнпе «М» 16 сій сіп туг Ап вет туковрго го тпг ї Е «Рік 17 «211» 118 «210з РТ «213» ото зарівпе «0» 17 сти Уа! бій Гей маі бій бЗеб б1у Аа січ Маї уз уз Бко 51 З 1 ві 10 15
Зег сем Суб І18 5ес сув ру б1у 5ег біу Туг 5ег рйе ТКгобег туг тгр жі біуУу Ткроуа! Аго бій Меє рРгооб1у буз Ф1у Гей Ти тер Меє 49 45 5ІУ ше їТе тує Ра б1у Аврозеро бін таб ОоАго туго бек рРго 5ег вне 50 іп о оіУу біп Уа! Тк оїТе 5ек Аа Ар Гуз бег тів 5ег лНг Аа тує 65 7 75 80 вес сій Тгробет 5ег сер гу Аа б5ег др тпг Аїд Мет туко тує суб в5 зо 95
Ата Ака сіп бів тів тТркоб1у сіб рНе д5роТук тт сіу п1ая б1Ж Те мо 75 по І
Ген Уаї те оУаї бег зер 115 «2 18 «гії» 5
«2125 РЕ «135 ото зарігй «4005 18 зЗатотує тТгротів о1у 1 5 «Рій» 19 «25 17 «Біг ВНТ «ві3» Мойо 5аріеть «43005 15 ті ї1е туго Рго 0іу Ар озЗег біз Тигб оАго тує бег о рго Зего рве 1 1 5 10 15 о1у «гій го «41 З «12 вт Й «2135 ото зартейе «МюЗ 20 сів сів ї1е тб о б1у бів рве А5ротуг 1 5 «й 1 «2115 107 «оз РАТ «РАЗ Номо зарієне «4005 21
Аза тів бів Сем ТБ осів 5еговго 5еб 5егобео Бег діа бвг о ма! О1У 1 5 ї0 15 450 Ага Уа! Тиг їі тб Суз Ага АТа баг Осій бі Тіе бвгобег Аїа
Сех атТа Тгротує бій іа сву5 Рго Ту уз Аа го бу ев без те 26 4 туг Ахр Аа бег бер беи бій беє біу Маї вко б5ег Агд РНе бек аїу 55. Бо зек пі бЗек о с1у твгой5ровНо Тйгоіец ТВе ІТ баг об5ве грец вів рго 655 70 75 о сів двр ве Аза Тпг о тТук тук Си ст Бій РВЕ Аа бе Тук РгГО АгО 855 90 95
ТИе риє піу сій біу тТнгогуяє уаї аби ІТе І у5 ке; 105
«Аз 22 «ії» 31 «212 РАТ «2135 ото 5заріепе5 «00 25
Ага А1їа зег бій біу тіе 5ег бек Аїа ви АЇВ 1 5 10 «20» 73 «21ї5 7 «10» РЕК «13» ото 5арівпе «4005 23
Авр Аїв бак о бег це бо 5ег 3 5 «210» 28 «г11м 9 «012ю РН «213» пото 5арієпе ка0Ой» й сіп сій Рпе АБ озЗег о Тує РгОо дкЯ ТР 1 5 «2Мх 25 «211 123 «РІ ЕТ «135 пото зарівно «ЩО 25 сів уві оп це уаї бій баг 51у б1у б1у Уа1ї маї б1й вго сім Аг і 5 10 15 5вг цей АР ви 5егобує АТа АТа бек обіу Ре тик РЙе звгобег Тут 25 30 діа мес ні« Трр Уа! Ако біп АТа Рро б1у їув бі бе аій теромаї
І 45
Аїа уаії те бер тТуг Азо біу бег Азп Гу тує туг Аїа АЗо б5ег ма а5 БО вух сіу Аго Ре тьготіе Зег АгО АЗроАБИ Зего вує дхп тТИгоОбей Тут 70 25 8
Гец с біп меї А5И 5ег їв Ага Аїа бі Абр о Тбг АїТа маї Тут отуг сСуз 85 що 5
АТа дго сіш вес вес ткроРпе С1у сти рен Теробіу тТук Рве А5р ог ем 100 105 120 бо
Тер Ту Ага о1у Твгобен туа| тпго чаї зве 5ег 115 125 «ЗО» 26 кхеїї» 5 «2Ї122 РТ «2135 Вопо зарігй5 «Ох 26 его тує АТа Мет нія 1 5 «10» 27 «11 У «12» вет «213» пото зартенпе5 «4005 у ма! їїе зЗег туг А5р.об1у Зек Аза Гуз Тук Тут аїа Азр о 5ег ма! їТу5 1 5 10 15 зу «10» 8 «2115 14 «д12» Рв ш?іЗ» пото зарієц5 «А 8 бі сешіво тго Ре сіу сім ву тер оту туг вве Азр о вец ї 5 ї0 «10» 29 «115 07 «12» вит «и135 Ното саріеп5 «40йх 99 дер тіе ота меж тн соІп оБеб РКО Зего5ак уд) 5еб А1їа ес ма бу 1 З 10 ї5
АзроАга ма1! Тиг гів тб осСує Аг АТа бек сіп сту пів его бек тер їеи АТа їгротуг б1п о Ві5 Губ5 Рго Б1у Гуз Аїа ко уз Сен о уез ше тук Аїа Ала зе бег їв бів Зек о біу уаї Рго 5ег Ага Рйе 5ег слу бо вес біу 5ег аїу тег одяр вве тТйгогеш їтве о ї1Їе 5еб бег їв їй РО 655 70 75 дО дере АТ ТВ Туг ТукоСу5 біп ої Аій 5егобес вка ТВготер 85 за 95 таеоРНе сім їй біустиб ву5 Уаї бій 51е зу 100 105 «210» 35 «21 41 «2102 РАХ «Фї3» Мото зартеля «4005 30
Ага діа 5ет сій біу її бЗег 5ег тер кеи Аа 3 5 ІВ «230» Зі «ії и «125 РЕТ «213» Ното зарієпе «005 31 іа дій бЗег 5ег рен сій 5е ї 5 «10 32 «211 З «Ф12ж ЕТ І «ІЗ» Вото зартепзо «4005 32 бів сіб Аїа заг зег пес тТНг тер о тнг 1 «М» 33 «2115 122 «212» РТ , «2135 Ното 5арівпх «400» 33 вій Ууаї біп ген ів бій о вег бі 61У б1у ей ой! бТп о вго 51у 01у 1 5 15 15 заг іби Ага беу Зег о Сує маї Аїа 5ег о біу Рпе тк ББе 5Зег бег отук
Азії мес озер теромаї да зіп Ала Рго о1Уу уз БІУу сен їй Тер ма! зег аїя х1ї2 багату бег бер бу сіу чек Тег Туг Туг ма! дер 5ег б ат Су бі Або Ре ТвгоЇї1е Зег АгЕ Аа АзпобБегб Гуз Аа Твг Беу 55 70 78 5о0 тук без біп меє дкп бег о беу Аго АТа бів Абротак АТа Уа! Туг туг 85 Чо 95 суб А1а ух Аброген АЗр о Аго С1у ттромеє б1у тує вне бу ту ткр 190 105 150
Ф1у бів о біу тато гей маї ТБ уд! 5егобег 120 «2105 4 «11» З ко1й» РВТ й «2135 пото зарієпе «00 34
Заг тує дТа мет 56г 1 З «2402 35 «11». ІВ «10» РЕТ «132 БоМмо чаріей5 «4005: 35 діа те заг біу Зекозег о1у б1у беготвготує тує маї Авроб5еє маї 1 З НВ) 15 їу5 о1уУ «2105 365 «К1їх 1? -212» РЕТ «2135 ото 5артепе: «А00х 36
А5в Кез Ар Ага біу теромеї біу тує вне 61у тус ну 5 10 «210» 37 «211» 306. «Из» вних «13» пото зарієепе «400 37
АБр о І1е піп меє Твг осів ЗегоРго 5егобеє Ма) зегоАТа 5егоуаї сі ї 5 15 15
Азроагу ма! тиге о тіе Тпге о сСуз Аг Аа евгосіп б1у ті 5ебозеє тер цем АТа тер тує 51іп нія бух Рго С1у їу5 Аа РгГО Гу ем ей Ще 450 45 туг Аза Аза 5ег Бег гех сій 5ег в1у Уа! Рго 5ег Аго Рле 5ег Оу за 55 60 зек о б1у звгосіу Тк о АЗровНе те осей Тс оІТе беб бак огец с1п Рго 65 70 7 50 сіро д5р рве Ад1астве тук туго бує б1Іп біл Аа Ай обегт бне рРрОо ОтАє 85 90 35
Ре со1у 5іп СТУ твгодго їей СТО їТе і у5 100 105 «2105 35 «11» 11 «йї2» РТ «235 ото зарігпе5 «800» 36
Ага Аа бБег біп с1у ІЇТе 5ег о б5ег тер се) аа 1 її Кт) «10 39 «І 7 «їй» РТ «213» пошо зарієпь -А0П» 39 діа Аїа б5ег ер Би вів Бак 7 «іх 40 «2112 5 «25 РТ «13» Вото зарієте «400х 40 біл от Аа деп вег вне рго тр 1 ке а «2115 318 «12» ВАТ «213» ото 5арівпе «00 1
Зіни маї сій Меп Уа! бій Зег С1іу Аїа Ід ма? буз Суб Рго 51 оц
КЯ 5 19 15 5ег о ївецп Гуз ті 5ег суб вуз бпіу б5ег бі тус баг оРНе Тр обек тує 23 за
Тер хТе б1у тТероуаї аг сій Меж ро Ту уч БІу Сей ой тТкромех с1у тіє ІТ тує Рго 61у Ар бег Авр о Тв дк туго заг рРго 5ег РАЄ 70 55 бо сіп сту біп маї те тів чає Аіа д5робух бЗег 51 Бех Тиб АТа тут 65 70 7 о
Мец бій тгродбп 5еготец їу5 Аа 5ег Ар о твг Аа меж туго туго суб 85 3) 95
Аіа Агу ія бій те те бі бі ее бр тТуг Тгробіу іп с1їу таг що 105 мо
Сешома)! те оуаї бег баг 115 «210» 49 «г1ї5 5 «125 РЕТ «2135 Ното зарієле «400» 42 зег тук Тер їТе 5іу 1 5 «2105 43 «1» 1 «312 ВНТ «2135 Помо барів -4005 43 те те туго Рго СТУ Азробег Ар таг Аго туго зак вго 5ег Ре біп і 5 То 15 су кгц». 44 «11» З «Ка?» РитТ «в13х Вото зарівпе «400» 44 чів сін тів тнгобіу 51 Ре А5зо туг ! 5 «210» 45 -й11з 10585 «2125 РТ -2135 Войо зарівп5 «400х 45
АТа ї12е біпоген Тс обій бБегорго 5ег Хегогви Баг одїа бБегома! Бу ї 5 10 15 дероаго Ууді Так оїТе тгоСузх Аго АТа бек обів с1у тів 5ег бег АЇа
Ге Аїа Тер оту бій біп гУ5 Рго сіу уз Аза РГО бух ге гео ІЇ1е
ТукоАхр АЇа Баг о 5ег бе біо Зег б1у Уа) Рго бЗег о Агу Ре б5ег я1у 60 бек сіу Зак б1іу пк о дероРйпв ТК оїви тає тів Яег бек сей бій РКО 65 щи 75 80 сів а5р вна Аїа Тйг тує туго суб бій сій Ре Ай 5ег тує Рго меє 85 90 95 тує так овне біу 512 бі ТвгоСує цеч Ту те Су» 100 105 «ОТО» 46 «її» 1ї «12» ЕТ «213» пото 5арієпь «в0дй0» 45
Ага А1а б5ег осів сіу 716 бес бег Аїа сви Да ї КІ и «2105. 47 кіт 7 «й РЕТ «23135 пожо 5зарієпе «002 47 ввр Аа баг овет цес сів 5ег ії 1 «ЦО» 48 «ВА 10 «12» РЕ Й «2135 пото зарігпз «00» 45 отв бій бе дей Зеготук рРто мес тує тТИг 1 З но) «21 49 «2115 117 «Ей ВЕТ «233» Мото зарігп5 «00» 49 сів уві біп іє їец о1й бек обі сіу б01у ген ма1ї сбІпорРРО біу б1у 1 5 30 15
Зего ген Адко їву 5еє Су Аа Аза ес б1у Не ТНг о РНЕ бек об5ег туг
АТа мет чек тгв ма! Аго іп діа Рго 51у Гуз оіу без сім тер уаї зе Ма ІТе 5ег о біу 5ег о оїу СТУ т1іе ТНК о туг туг АТа Ар о5ег ма! 35 50
Ги5 сіу Ага РВе Те ліє 5ег Агд о АЗроАБИ 5егоруз Ап тлЛг о бешй туг 7 25 о із сі Ме Ап чего грец Ага Аа бін Ар тик АТа уаї тТук о туг суб 85 Зо 95 дій Аго Ар Аго бу Тр ооіу ек ар отує тТеробіу бій сіу тв ву тоб 105 що
Ууаі таг о Уаї Зог 5ег 115 «2102 50 «8115 5. «12» РТ «13» Вото 5арієйе5 «400» 50 5ег о туг АТа Мет 5аг
Ії З «2105 51 «2115 17 «ази ВЕК «Р155 Вожо 5арівие «ОО» 5
Маї Те зек сі Зек бі шіУу ТІіе тає тує тує А) АБробев уві гу. 1 5 10 15
Фу «ВМ 5 «1» 8 «12» РТ хй13х Бото 5арієп5 «4005 52 ще дгЯ о1у тер ву Бе АБИ Ту «2105 53
«2115 107 «2125 РАТ «213х пото 5зарівпе «Ю» 53
СТч ІТе Уаї гєц тпгосіп бег Рго АТ тв беу бек їеч век рко біу ї 5 Ка 15 сі ага Аза тис веб хегосує ага АТа 5ег бій беєб ма! зей 58готує за
Мем Аза Тгротує бій сій ру рРго сіу бій Аза РРО Аг Тез бе те тТуг А5р Аїа 5ег ап Аго Аа так об1у 112 Рго Аїа де Ре 5ег оі1у 60 бек бім зег бі Тк оА5роРйє ТПг Бей Тг о Ї1е бег бек огеи оц вго 55 70 73 Во біш А5р РНе аїа ма! туго туго сСуз біп о біп Аго бегоаА5а терорко Ре 85 90 25
Тег оре б1іу вро сіу Те оїу« уаї А5р тів Суб 100 105 «2» 54 «їх 1 «2122 вт «Р13»м бПощо 5аріви5 «Ох Ж
Агя Аа чегобіп зег Уа! 5ег зЗег отут І ви. Аа 1 5 їа «20 55 «25 7 «212» ЕТ «213» ото зарівнь5 «00» 55 вер Аїа зЗег АБ вго Аїа тиг кеібх 36 «211» З «21?» РЕТ «213» ото. зарієйе «005. 55 вв бій Ага его АБИ тТерорго РНе тк і 5 ка10» 57
«211» 125 «212» РЕТ ке15» Вото зарієпе «400» 57 ст) маї бій сер оуа!ї біб бег су сіб сту гец о уаї уз Рго оіїу су 1 5 10 15 заг бен уз бец Зег Суз Аїа АТа баг обі рРМе ТНгоРйе 5ЗегоАбр о туг 20 25 50 туг мех це Тв ма1 Ага біп тТвгоРгОо ОЇ ув АКО беб сій тгроуаї!
З! 40 45
АТа тис тів чає Абр о дер сту 5еготутє Тйготук Туг РРО Ар озве Ма 50 55 би цу Біу го вне ТИпг ої1е заг о Ага АБр Ап діа уз АЗлоАбй Геб о тук 55 79 75 80 йем біп Ммеї бак бак без бу Зегобіш Ар о таг АТа мет Туг тує су» 90 95
Аа дго Ів біу ле тує Тук Тук о бтіу 5ег Фу зЗег тук туг А5посіЙ 100 105 110
Авротуг тгробту сів Ту тигоїен Уа) тик оуаї зег бег 115 120 125 «іх ЗВ «11» й «гій ЕТ й «213» йВото зартепз5 «400» 58 дер туг тТиг Має тус 1 5 «-й10» 59 «вї1» 17 «8122 РАТ «213» Вопо зарієпь «00 53
ТНгох1іе б5егодхр АБр ооіу ЗегоТув Тйготук тує Бго Ар оЗего ува! ух 1 5 10 15 сіу «10» бо «315 16 «рід» РА «33» Бото 5арівло
«800» 60 с1іш е1іу це тук тує туго сту Зеб сіу беготує Тук Ап бів дзротує ї 5 10 15 «30» 51 «гії» 106 «ге РВТ «135 Мово заріаль «Оз бі
Аїа їв біп бе тає бів бек овго бек о 5ег о ве) Зег АТа Зег уві) 1у 1 5 10 15
Авроаго ма! ти Іі твг о Суя АгО АТа 5ег бій о1у цен обег бег АЇа гей АТа тгротує агу ст бух рго сіу бук Аїа РГО вуз сей бе 12
Туг А5р о АТа бек Заг огец 5Ін бегоб1іу маї вкго бек Агу РНе бег о1у 60 зек сі бек біу тк АБО вне тТНг о Бред так їТе 5еб бак Гей оіп рго 65 70 75 80. 5Ш Аб5роРКа АТа ТБготує тук Суб ой с1и РНе Твг о беготує вго бій 85 90 95 тів ті вне біу сій б1у тНгодго рей сої хе ух 100 105 «210йх 62 «211 31 «012» РВТ «213» ото зарівнз «400х 82
Аг Аа бЗег обійп біу сей зег о бек АТа рей АїВ 1 У 10 «30» 63 «2115 7 «12х вит «213» пошо арте «00» 83
Ар АВ бег Зак івн б1ч Зег 1 5 «2 64 «2411» 30 «2125 РВТ «213» Вото харівпь
«400» 64 іп бтя вне так обеє тук рго бів її Те 1 5 10 «210 65 «2115 348 «гї2 РЕТ Й «2135 Мото зарівєпу «20» хо?їм тів о теватугка «йййх С523..(52) ; - Не е?223» Хаа сСап бе апу паїтшта!Ту оссутттйдд зиіле аста «О0м 855 бій гец б1їй гей бів сім 5егобіу 5ег сбіу Ген ма! уз Рро 5ег бій 1 5 10 15
Тег оген о зеб о іви ТК о Суз АТа Уа! 5Звегобіу 5біу 5егб тів 5ег чек біу 70 25 30 зу нів бе тер ояеє того ЇЗе Аг озй РКО Рго 5іу сує сб3у цей 616
А5 теп ї1те сту Хаа ї1іе туго мів 5ег о б1у Аби ТВ ТугоАбр Ази РгГо Берг во теп гук бег дго Уа! тйг ої1іе Аїа ма! дер до бег уз Ап сТй вен 655 7 75 БО 5ек цей іїуз геу с зеє Ре їво тс о Аїа АїТа АЗо ТАРОАТа УЗ! Тут туг 85 аа 95 суз АТа Аг Бек бе тук Ахр овВе рей тег Ар отгр о сіу бій с1у плаг 100 105 130 їву маї ТИг УВії 5ег баг 115 «10» 66 «її Й «2122 РЕТ «2135 Нота: зарієвае «ПО» 5 вес біу с1у Ні 5ег тир 5ег 1 5 «30» 67 «ії» 16 «дій» РЕ. «2135 Вото зарієп5
«221» йізс Теахибе «ай 03.03 , , І «223» Хва сап ре впу патигаїїу оссуєкіпод авіпо аста «Мюх Б
Хаа ІїТе туго ніб5 б5ег Бім дя їйс туго дер А5п РгОо 5ег гей груз 5ег 1 5 1й 15 «2105 68 «115 б коза РТ «213 Ното зарівпхе хА00» 658
Звгобег тук дер не без Ве дер ї Є «210з -59 «2Ііз 7 «125. РТ й «2135 пото 5арієп5 «4005 55
Ар ІТе спів Мей Те бій бак рРго 5вго5еб уді Зег Аа 5ег ма бу 1 5 10 15
Ар. Ага маї твг Ж1е тег оСуб Аго АТа зегобіп біу г1е 5ег 5ег Тер
І 20 25. 30 їй Аїа Тер отуг вів НІ бу Рго біу буз АТа вго бу5 ем Ген 312 49 45 тує Аїа АїЇа 5ег бек іец біп зак бі маї рго 5ег Ак Рпе 5ег. бу 35 Іо) зегобіу бер Біу ТК оАЗр Ре Твг оте Тир оїТе 5ег бак їв б РКО 70 75 о
Зб Ао Ре Аїд тНготук Тут сСух віп а1п АТа АЗИ сТ1у Рлйе вро її8 85 за з5 твговне сію сів бу такоАгу сец сіб те був 100 105 же» 70 «г3ї2 1 «123 ВТ «2135: ВНошо зарівйз «4005 70
Ага Ала ек с1іп сіу І11а 5ег 5ег Тер без дій ї 5 10
«210» 71 х21іїх 7 хоїл» ЕТ що «213» пото зарієп5 «аж ТІ діа АТ 5ег бек цей іп 5ег ії 5 «10» 075 «11 З «212» РТ І «2135 Впошо зарівй» «Ай» 75 біп сій Аїа дей -У Рпе врко тів таг ї «10» 71 «21іхм 118 «912х РЕТ «9135 Вото хзаріепе «920» «ий» тівзс Тезтиуге «70д» С523..4521 с. й , І «23» Хза сап бе аву пахьгаї!РУ оссиртійа ато аста «409» 73 біп ів бій ев обіп сш 5ег б1іу 5екобіу вец маї суб Рго 5вк б1п і і: 10 15
ТАг гецобекоїеу ТпгоСуз АТа маї 5ег біу 01у бег тів зег 5ег у ві міє яв тТгробек стер оТ16є дкУ біп Ргос вго Ту їує сім веф й 25 тктр Я1е сіу Хава І11Ї6е тує нія бек о біу АБИ тб тує АЗродяп рко 5ег
Ба ен мує баг оаАро Ууа! ТвгоЇіе дія маї АЗр Ага его гу АБО бій їв 55 70 5 о 5ег івц уз Сем бБег орРпе Уаії Тіг о АТа Аа дер ОТГ АТЯ ма! тут о тук 85 30 35 суб А1а Аг бег бек тує АБрот1е Бей ТйгоАхротго б1у біл бу тпг що 195 110 без уаї тис маї его 5есг 115
«20» 74 «ії» у «212У РЕТ «213» Ното варієне «00» й
Бек біу 01у Ніє чек Тгр 5акг ї З теж 73 «їм 16 «еїй» РКТ ; «2ї3» Лото зартепе «2 І й «г2їж тес Теватике «фдйю (3.0 | , . «2235 Хав свап бе апу паїигаїіМУ оєсугтітпо ашіяо с асій «ОО 75
Хаа Іе тує ніб5 5ег о б1у Аби Тис о Туг АБО Ази РРО 5егорей був вег 1 5 За 15 «210» в «2115 8 «212». РКТ «13» Бото чарієпе «НЮЗ 76
Бег 5ег Туг Ар Те Сем ТИГ Ар ї Ь; «2105 «гі1з «12 РКТ «2135 Вото зарієено «005077 д5р їі біп меб тн обій 5зегорко бегб озеро ма! 5ек Аїа бег у! Ту ї 5 16 15 дер Ага маії таб оті тапгосСуз де Аза зак обіп зіу тів бог Заг тер 70 25 30 ївисАіЇа тгротує оіп нів Бу Рго б3у їу5 АТа вро їу« ївецч Бей тів туг Аїа Аїа Бегобек їеу зіп бегоб1у уаї вго 5ег о дго Рйе 5ег о1у 35 во зЗег біу 5ег с1у тТпг одер оре тйг ген Тйг ї1е 5ег зек феи біб рго 85 70 75 50 і АБровйе Аа тег тує тукосСух ап сти АТа дзпобіу Ре вго ЇІїе 85 За 95
Твсовйе біу ій сіу ТАгоАгКОо Бей бів Те ув 199 105 «іх 78 «ії її «12» РВТ «213» Мото зарівєпе каО05 78
Агу Аїа бек бій б1у їЛе бег 5егоТгр Бей Аа 1 5 15 «Рій» 79 «211» 7 «2102 РВт «213м ото 5зарієт5 «400х 75 «Іа А1а хек бек їеи сти 5ег ї 5 «КМ 80 «231» З «2125 РЕТ І «2135 пото 5арієпь5 «400 ВО «іп ай АТа Ази Сіу Ра Рго пів тп і 5 «2105 81 «2115 118 «23» вит «213» Мото зартвпе «205 «221» ті5с Тєатиге «ай (5823.,.052У І й й «223» Хва сап Бе зпу патига!1у оссигтінпо атштпо ста «005 81 сіп о бац о біп рез с1іп бін беб б1у бег б1у сви уд! уз Рго Зв бій ї З 10 15
ТБ фей зег рев Тк Суз Аїа ма! 5агобіу сіу зекоїТв о 5еб зек о1у 29 25 30 с1у ні зег тррозег Тр їТе Агу аійп о Рго Рго б1у бух Ту емо би терте Ф1у Хаа ї1е тує нія бек 01у д5п ТНготук дер дя РО заг 60 ія ух Зег аго чаї Зкт хі З Ві АЗв о АуЗ Зак вух аж ів а -5 а т5 Зо
Заг зах у і ЗР о зег охаі Таг о АіМ діа аа ТВК оА)х у! Тек туг 55 во 95
Суз Віа ага щег зго Тег АВИ ЖІ сви ТР ОВО ТТ іх бів СТУ тку я іо з іти чаї Твж УР Хег Зк 315 «Ще ВІ «ії» «Из ВЕ «б3їЇх аю барах «Я» й ак сіу «1Ж міх Беє їкр Бех ря КЗ ек «13» їв «ійУ РАХ «БІЯ5 Возе завів «КК «вав ві Бс Кевін «февйз 3 КВ , Й «ТИ3» Хаз кап Бе апу пакигазіу боссигтіпе яке сій «аОйе 83 хав ї1ж Туг Мі зеє іх дж Тс тТух ер аа ге ВЕ жи що бат «3505 «ВН» й «Ай щХ «2132 поча зщківах хау» й те Бек Тут аБр отв ее ЇйР Акв «о» 55 8еа ЩЕ «Ай» БК й їз Яких) бавієвх «Ой» 85 ах ї16 сія мех Тве 415 Зас реко Бак бек ухі Зак Аїд Хек узі 4їх і З 16 їх зар Ага хаї тт ХЗе ТВг осСух лаку Ав бек Фів Бі її. Фет дет Тгв о ра 30
Ген Аа тер тує Бій 5 Ту Рго о біу Гу АТа Рго ух Сец гец їїе 35 40 5 тут АТ АТд его 5егоїез бій Зек б1у ма! Рго бек АгЯ вне 5ег с1у 50 53 60 бек б5іу Чер СТУ тпг о дб5р о Рвйе Тйг Сен тег о їІТе бег бак рец зів Бго 655 79 75 во еїч Адхр РНе Аїа тиготуг туго суз бій біп АТа й5п о біу вве РгГО ї1а
Ех 90 25 лит оРНе сіу бій сіу ТВе Ага їви бін ї1Те 1у5 300 т05 «210» 85 «гії і «212» ВТ «2135 опо зарієпь «00» 86
Аго Аза беє бій с1у 116 бек 5еє тТгроСей Аа кя 5 10 х?105 87 еВ НК; «12ж РТ «2135 Вото зарівле «ай» 87
Аїа Аа бек бет ен бій 5ег ї У «2305 8 ків 9 «вав РЕХ «213» Вот 5арієйе «400» 88 зів біп діа Ав с1у Ре вго ї1ї6 тпг «210» 89 «11» 1318 коїйх ВЖЕ «213» ото 5аріеп5 «вах «20» пес театиге койх (593..0523 «2иЗ» Хаа сап Ве апу патигаї1У осситтїайв ато асій «3005 89 сіп рев бій сецобіп бій 5ег о сі1у бег бу ге ма! їуб5 Рго 5ег СІЙ 1 5 15 15 тВгогрешозек мец те оСух А1а ма! бек су біу бег Її1е бвг 5ег пу ве 30 біу тук чек тТеробек Тгроїіе до бів Рсо Рго біу Гуз оТу се су
Тгрої1е сіу хаа І1їе туго ніє бег о о1у зекотвгб оТугє тус АБИ Рго 5ег 35 БО їви буз 5ег одго маї таг о ї1Те бег о уаї Ар аго бек огує Азпоаіїв Ре 70 75 їн) -вк цей рух бер озеб 5ек ма! тТИг діа АТа дво тн АТа Маїс тує тує 85 ЗО 95.
Суб А1В Аг б5ег обех туго Абр тів вен тп Азротеро обі біп бу тт о 105 110 їец уа| птпг охаї Бег век 115 «з ВО «211 7 «ета» РАТ : «гі3» пото 52рієпе «4905 90 зег оіу сіу туго 5вг о тРробег 1 5 «30 91 «її» 16 «Той» РАТ . «2135 пото хартеля «Іо Й «й2ї» тізс їзахиге я«оаййж 3.3 хойі» Хав сап Бе апу паїшка!їу рссоггіпа ашіло аста «00
Ххаа жіе тТук Ні5 Звг осі бег ТВготТує туб Ап оРго бег грец був бег 1 5 то 15 «2105. 92 «2115 8 «22» СРНТ «віз» пото завів «АдОю С92 заг бек тТуг Абр Ї16 Гей Те Ар
1 З «й» 93 «31 «12» вит «2135. пото варієпь «400» 93
Ар ї1е бій мес Те бій 5ек о рго Бег бек уд! 5ек діа 5ег маї о1у 1 З 10 15 дер Ага Уаї тб отте тий осСу5 Ага діа его бів оту 118 5егобек тор 2 30
Се Аїа тер тує біп нів бух Рго Сіу уз АТ го їу5 бен обем ті
Туг АТа діа бек зег о рео бій зеб б1у Маї Бго 5ес Аго РНе баг О1у 60 б5ег біу бек сту тпг Ар о РНе тТБг о беу тагожЇ1в Зего5ег без біп РКО 65 75 73 о бі Ахр Бе АТа ТйготТуг Тук Суб сій 5іп АТа А5п Заг о вре рго її 853 во 5 твйкоРйе б1у бій біу тнеодгоа рео біс ї1е руб що 105 «2ійх 94 «ї3ї» 11 кеї?х ЕТ «013» ото 5арієпв5 «Ох 94
Агу А1Та Зог о біп оту Ті 5еб о бвг тро гео Аа 1 5 10 «20 95 «ек «125 РТ «21Ї13» Вомо 5авівгп:е «300» 95 діа АТа бБег 5ег бен обіп оЗег ї 5 «10» 9б «вл З «и?» рРАТ «2135 Ното зарієпе «4005: 96 біп бій А1а дей его рлйе вго т1е Те
1 5 «210 97 «11» ІЗ 12». ват «132 Вото 5арієпе «4005 57 сій маї їй сем ма? бів бек іх АТа 10 уаї вує Гу Бго біу дій і 5 10 15
Зак оуаї! суб уаі чего бу сі тс о5Зек сі тує Тс ве та Зерготує 20 а 30 «іу т112 5ег тер омаї Аг сій АТа Рго с1у нів сіу сво о1и тТКромех 35 40 45 сі трротіе 5егб оАТа туго деп бу туго ТК оАзИ туго АТа бів Гуз цей 50 55 БО біп оїу йго уаї таг Меє тйг тн одер тис бек отиг ес так оАія туг 65 70 75 ОО
Мет бі цен Аго 5ег еп Аг 5ег оАбр Ар отак о АТа уаі Тук Туг Суб 85 90 35 18 Ага АЗрогео Ага с1у Те оазп Туг Ре А5ротуг Терооіу бів. о1у 100 105 110
ТИ ген омаї твгомаії чек бек 115 «2405 че «ЙВіх 5 «ій КТ «213» пошо зартіейп5 «8005 98 зег туг Є1у Ів 5вг 1 5 «2105» 99 «її» 17 «й12з РЕТ «213» ото «дрієпе «-4005 99 1 ї112 5ег Аїа Тут АБ бі туг ТАК А5п Тук Ата 51й Гу ему бій с1уУ
«21і0х 00 «2115. Ю «2122 РЕ «213» Боню: заріян5 «4005 100
Авроівец дгд біу тйг Аби тує РК АБО туг 1 5 10 -2105 101 «2115 «12» ВЕ «-2135 Вошо заріво5 «005 10 дер тів бота меє тигобів чего рго бегобего ма)! зег АТа зекоуа1 о1У 1 5 10 15 дероАка уаі! тТпгої1е ТвгосСу5 Ага діа с б5ег сій сіу їТ6 его аба тгр каз; 25 за
Се АТа тер вне бТп Ні фу Рго сту уз АТа вро губ се бву ї1е
Зх 40 45 туг 8іа АтТа бах 5егоїеу рей бек сіу Ма! вро его Ага Ре 5его су 65 «его бу Зек о піу тйг Ав вла тТнК о гецу тТвгоТ1е бек о хег сечу вій его 655 70 75 во січ Азр Ре АТа ТК о Туг туб Суб бій 51іп АТа Азпозеб Ре рго т1е 85 90 535
Тв оРНе сту бій соту тт о Агу бе сти їі гу» що 1055 хім 102 «231» 11 «305 ВЕЖ «2135 Вощо зарігн5 «400: 302
Аг аа его біп біу І18 5ег Ап Тгрогей АТа 1 5 19
РО» 103 «211 7 «й12х РЕТ «21315 пошо 5арієп: «А0О» 103
Аїа АТа бБег бБег ге бен Бег ї 5
«2Шх 04 «5 9 «2125 РЕ «13» ото яартець «а005 104
Ф1й бій АТа Ай Зег о РНе вго їТе таг 1 5 «20» 105 -2315 118 козйих РЕЖ «й13» пото 5арієп5 «400» 105 сів Уувт сій бен оуаї зіп баб ТУ АТа бі ма! сухо руб Бгосоту зів і 5 10 15 его сей їув Іїе 5егоСух Суб б1іУу бек біу Туб бег о вйе тТпрозег Туг ?0 25 30
Чер їтТе зіу тб Уа? Аго сп Мей рРгОо 51у бує Ту гей сій тер мес о1у 1Те ї1е тус Рго б1у Ахр о 5ег АброТвг дир туго За рго 5егоРве зо 55 60 стп сіу бів Уа! тпК о жїТе бак АТ АВ уз Бек Іїв чек тАгОАТа туг пі та 75 50
Гей сбіп тгроЗакК бегогеч їу5 Аа 5ег о Авротиг Аза мех туго тук бух
ВІ 95
Аза Ага бій біб гів тб о а1у дероРве дер тус тероаїу біп 51у тис 10й 105 110 іїву Уаф тт оУаі 5ес о 5вг 115 «2105 6 «211ж 5 «бій» рРЕтТ «2135 пото 5арівив «МО Сб бек тує тер ї15 о1у 1 5 «105 307 «її 17 «їй КТ «215» Вошо зарієйв «400 107
Ів жїЇє туго вро біу Ар Баг дер о твг Аг туй ес рРго 5ег Рпе бів ї 5 ях) 15 су «М» 308 «1» «125 РЕ «213» опо зарігаб «4002 105 сій бії їТе ТНК сі а5ровне авротуг 1 5 «210» 09 «2115 107 «їй» РЕ «213ж Мото зарієнь «АФОх 105; діа те бій Сеу твг обі ето овго 5ег чек гец 5ег о АТа 5егоуа! с1у 1 5 10 15
АБр ага ма! тнг о ї1е таб Суз Аг Аїа беєс сбіп біу їте Баг обег АВ 275 зо цей АТа тер тує бій бій їу5 рРго бі їу5 АТ рго дб Бе: рей те
Тут Ала Аїя бек 5ег о іеи бін херобіу ма! Рго б5егобга РНе бег су ао вег бі бек сіу тТйР одер вйа тк осей тег тів бБего5ек гей б1й РгОо 55 73 75 80
Оіч А5р РНе Аїа твпготук туго Суз біл бій о Рйе Ап б5еготуг Рго Гей 85. 90 35 ле овйае сіу б1у б1іу ТОК огбує маї бій жів ув 100 105 «оо» о «Рі» 31 «2122 РЕ «Тіз. Вобю зарівля «400» 1
Ага Аа вт бій 1у 118 5еК Заг АТа меч АЇВ ї 5 10 «2 11 «21ї» 7 «2125 ВЕТ
«гі3ю пото 5арієйв «щОйх І
Аа Аїа о бег Зек іє) січ 5Ег 1 5 «2105 2 «Ех 5 «212» РТ «2135 пото 5арівнх «400» 112 сій обіп рпе Акпоб5ег Ту Бго ей ТВе ї 5 «еіб» 113 «ії» 121 «9125 РЕТ І «2ї3» Вото заріейь «а00х 113 зіп ма! бів іви уз! сій бек о біу АТа Сі Уві уз суз рРго ці Аа 1 5 19 15 хек ма! цуз ма! Заг осСуз Був АТа Заг ос31у туго тик РВе лтиг дяп Рве га 25 30 с1у те бек тероуаі! йго бів АТа вко ау бій біу се бій тТгро мех сіу тРротїїє 5акоАТа ве деп зіу ніз Твг о АЗр о Тує бег сій бух ма!
І ві сів о1їу Ага ма? Тве меє тк отвг Авротйг о зеко тв бе т діа тує 65 7О 7З 80 мет б Бен ага бег Сей Аго 5его Ар Ар ТАК оАТа Уа! вве тує сСух 85 90 35 іа Ага чзегоніх тТук Тук бу бек біу 5ег вго вне АЗзр о Тув Тгр у зо00 105 що ей о1іу тйг їву Уа! таб оуа1ї 5есб бек 115 120 «2405 14 «231» 5 «2125 РЕ «Р135 Вото зарієп5 «поз 114 деп РКе сту тів тег
А м
«230» 115 «2її» 17 «їз РАТ «213» Пошо 5авієйе «00» 135
Тер їв Яег АТа Ре дей біу Ні таб Або о Тує бег бій бу Уа Топ 1 5 10 15 е1у «210». 116 «Її» 12 «Те РТ й кеї3» пот зартіеве «щюЮех 116
Бек нів Туг туго соїу 5ег боту Зег рго рве Ар тТук ї 5 10 «105 317 «ії» 7 «1025 РАХ «2135 ото «арівих «00» 117 азроІ1е сбіп Мет Тнг бій 5еб обро Бек о5ег сей бе АТа бег Уа! сту 1 5 10 15 дероаАгоа Уаї тик жІіе тйг Сух Агро АЇа бас бів біу ї1е Зве деп тр 20 25 30 12ец АЗфа теротуг бій Зп огсує Рто бій уз АТа РРО Сує сег дви Її 35 48 45
Туг АТа Аїа Берг чес це сів бе 51у Маї Рко 5ег Аг ей зегобіу
ЗО 55 І зеє біу баг осту тр А5р вне тик осей тТвгожхіє баг об5ег гей бій Рго 55 Мк. 75 80 сін А5р Ре АТа Тк тує туго Суз Ні бій Тук буз Звготук рко Тер 85 за 95
Те вве б1у 10 б1у тв губ ма! бір 3е ув 05 «2102 118 «211» 31 «2125 РТ «2135 Ното зарієйх «00» 118
Ага Аїа 5ек бій оту 116 Зв Аза тб ге А 1 5 нев; «лох 18 кі» й «Там РЕТ «218» Вопю зарівих «Ох 15 діа Аа Баг заг ореноссотп 5ерг 1 5 «105 323 «11» З коїй» ВВ «ії» пото 5зарієп» «4005 120 ні бій тук губ Зак Ту РКО тр тАг 1 5 «ЗО» 21. «2115 173 «2122 РЕ «2135 Вошо 5арівпе «00 121 оп Маї біп гец Уа! сій о 5ег о сі1у 01 біб Уа! бу губ Рго біу Аїа ї 5 КТЗ ї5 б5ег ма! Іу5 маї 5ег Су Бу А1а Заг 51 тТуг твВе вве твг о Агу Ні за е1У Ії ТйР отгроуз! дго бій АТа Рго бу вій сС1у ге с) тгромет сіу тер ї16 Бек Аїа др деп аїу Аза тТнгодей тугб АТа бій зув Риг 50 зів Ар ага маї те омМек те о тве Аввотвнгобзек тай За тпгодія туг 65 та 78 Бо
Меї БІ бероаго 5ег гей Аго 5егоА5р одер тйг АТа уві туго ре осує 85 90 95
Аа дго уаЇї вва Аго туг Ре дер тв Сен ей РгОо тує РН Ар оту 100 105 о тер ту бтя 51у тиговрец о уаії твсоуаї бек тс 115 120 ке» 35 «а1ї» 5
«212ж ВЕ й «213» пото зарієп5 «А 122
Ага нів віу ще тпг 1 З «2105 153 «рії» 17 «е10т РТ Й «213» ВБото зартейе «З00х 1253
Тер оті чек Аа дяр АЗИ біу Аби ТВ оАп тує діа зів Бу5 РНе біп 1 5 10 15 ар «10ю 124 «211 4 «2125 РЕТ . «2135 Ното 5аріапх «ДН 24 маї Бре дго Тук Ре А5р о Тгробен Се рго Туг Рне дБротуг 1 5 КК) «230» 195 жеїіз 08 «гій» РЕТ «2135. Ното «арієйе «00» 125 сії жів уаї Ге Тигбобій бег Рго СІу ТИР огбен Зегб гео беєорго о1у 1 5 10 хх оТш Агу АТа Твг ово сек осув Аго Аїд его бів бекоуа! бег о 5ег бег тує Сей яла тер отут бій 51іп губ рсо с1у ай Афа Рго дк їец те ті тук 6Є1Уу Уді Рпе зву АК Аіа оте оіу їт1е Рго Ар Агу Рйе чек 50 «1у чек бу 5ег б1у тТаг Ар РИ Тийг осей тНг о т1е 5ет Або бе бі 53 7о 75 80
Рго сі) Азо Ре АТа Ма! Ту тує Су сів біт Туг с1у 5ег 5ег рго 85 90 95 туго тис вне сіу бій сту Тпговух ренробів ІЛЕ губ 300 305
-2105 126 «21ї» 12 «217 РВТ й «213» пото зарієп5 «а005 126
Агу АТ Заг сій Зеє маї Бег бек Заг тТуг ген Аїа
КЕ 5 10 «0» 127 «іх 7 «212» РТ «2135 Вото зарівпя «00» 127
СТУ мМаї Рв Бек АгО Аза ОТАг 1 5 «2105 126 ії» 9 чхеї1?й» РТ , «213» пото зарівп5 «щЮх 125 ба й тує о1у бек беговго туго те 1 5 «0305 129 «231» 119 «гій РЕК «2135 ото 5арієп5 «А00» 129 сів уві біп бен уді сій баг о біу Аза сій Уа) руб (у5 вго 61у Аа 1 5 10 15 дек оуаї сує маії б5ег суб гу АЇа бек бІУ Туг ТИг о РВе Тк зес туг о 25 30 о1у т1є Бег тгр маї Ага біп Аза всо бо)іу бій Фіу сей біб Тгро меж
Ї ай 45 с1у тгрожхТе его тйг тує Ап о біу Ту Тк А5п оту Аза бій уз ев
І 18) опо о1у Аго ма! тт Мет твг тає дер тве бек Твг Яес так АТХ тТуг 65 70 75 во
Мет сів Се) аг зек оСе)р Ага 5ек Ар Ар. тн АТ Ууді туго тує Су 85 90 95
Аа Аго дероїенодто біу ТгоАїа Туг Ре Азротуг Тер біу біп Ш1У 100 195 150
ТК оівц ма! Ти Уві его баг 115 «2135 130 «М» 5 «2125 рРВТ «2135 бото 5арієпе «А005 130
Бег тує біу ІЇ18 5вг 1 5 «й10х 131 «її» 17 «2125 РЕ «2135 Вото харіель «005 151 тТгроІТе бак таб отук дп оТу Тук ТИР Одяй Туг Аїд сій губ сви біп 1 5 10 15 іх «210ю 132 «21ї» 7 «42» РЕТ «135 Ношо зартепь5 ка00» 132
АБО Сем дка сіу Тс АТа тує Рпе др туг 1 5 10 «2105 133 «21ї5 197 «212» РЕТ «2131» пото 5арієвь «005 133 дзр іє Фів мет тб Осій беж бро 5вгобеє ма! бвг Аїда бек о уУуді Фу ї К! 10 15 дер Ага уа! тик ої1їє так оСуб Агу АЇа 5ек бій о біу Іо 5ег о А5й тер 20 25 зо іви АТа Ттгротуг вія нів Бу рого СіУу Гуз АТа го су ев тео тів 5. 40 І 45 туг А1а АТа бег 5ег їез бен Зег бІу мМаї го баг Ага вне бегоо1у 50 55 бо зег соту бег біу тп дев Ре ТНК ге тиг ї1е бе бек бе) бій йго 70 75 БО
510 Ар овве Аа те о туг Туго су со1п бій АТа Ай беб вйе о РгО ГіЄ 85 за 35 тТНе вне бу сів со1у тйгоАго мем бій тТе бує що 105 «210» 134 «гії» 11 «2122 ВАТ й х213»5 пото зарієпе «ВО 3
Ага Аа хек бій б1у ІТ 586 Аяй тТкрозец АТа 1 5 о «210» 135 «і» У «ої РЕ «213» пото 5артіепз «00 335
Аіа Аїа бег 5ек еп їги Баг ї З «2105 138 «11 9 хгї2» РВТ «2135 Ношто 5арівєпз «Аж 36 біп сій Аа дяп ес Ре го т1є тпг 1 - «РІО 137 «211 319 «2122 РТ «2135 пото зарієпе «4005. 137 са маї Бій їв маї сіп о беб бу А1в оц ма1ї уз бух Рго ТУ Аа ї 5 10 15 заг оуаї бух маї 5ег Суб сі Аа 5егобіу туго тк овве твгобек тук 2 В 30
О1У Тіе багоїгр ха! Аго бій дія Рго б1іу Ні сту їви бій Трр мес со1у тер ї185 5Зегодіа туго дп а1у Тут ТК АБ Ту АТа сій вух і ву 50
Зп біу дго Уа? Тс о Меж тпг Аза Азротпг бак Те 5еб оте Аа тує 55 70 75 80
Меї ср гей Ага Явб рен дво бЗеє дер двр Тк Аза Уа! ТС тує сСув 85 90 95 діа ага Ар ви Аго соТу Тв дей Тут Ра А5ротуг тер сіу вія у 150 105 ЦО тс без уаї тв Ма! Зег 5ег 115 «2105 138 «2115 107 «21225 РЕ «8гі3У Вото харівн» «400» 135
А5р о тІїе бів мет Тік обіп ек Вго 5ек зек Уа! 5екАТа 5ек уаї бу і р; 10 15 др Ага маії ТАг ої1е Твгб оСуз Ага АТа Бай сій біу Х15 Зег Абп отр 20 25 30 їецш А1а тгротує бів Нія Гуз Рго б1у уз АТа вБго уз сен вер Те 35 до 45 тТуг АТа діа 5ег бег о вец се б5ебосту уаї го бег Агу вне бЗегобіу 59 55 бо
Зего сіу 5вгобіу твВе дер рве ТВгобез о тйб т1е бек обего оре) біпорго 655 70 78 ГеТВ) сіш АБровле АїТа таготТуєб Тубосуб о1п ба АТа АВ 5ег о впе бго ї1е "55 90 95
ТИг Рв о1у сій с1у ТК Ага Сер сім те бує 100 105 хи». 339 «еїїхм 319 «ІТ» РТ «213» йойо вартепь5 «400» 135 ой уаї бія Кеш маї бій бег с1іу АТ о ма1ї бух бує Рго с1у аа 1 5 10 15
Зег оуаії Гу ді бек су5 іш Аза бегосоТу Туг Тбтг о Рйе Те Азпотуг 20 25 30 щіу тіе 5зег тер маї вт ссіп АТа Рго оту Ні БТу Сей бін тер мех з1у тер їТе 5ег АТа Туг Ап о біу тТук тТВгоАвап туго АТа сій Су5 рен 50 55 50 о1п о п1у Ак омаї так Мет ті тс одхротв 5ег тйр о тве тпгоАза тус 65 70 їв о мес ій гей дО Зег о цви Аг 5его Ар Ар Те АТа Уві тТук Тук суб 85 90 5
Аа ага а45р оце аго с1у Твг аа тувк РВе Ар о Тук тер біу бр обу 100 105 110
ТНК бе ма! Твг Ома)! 5ековев 115 «2105 140 «8115 307 «102 РКЕТ «233». БоМмо 5арієпе «400» 440
АЗзр ж1є вій Мет таигобІл бег Рро зег б5ег уді бег Ада Зег ма! СТУ ї 5 10 15
А5роАго уаї таКотіе тиг Сух аг АТа чего бій б)у ЇТе 5ег одяй тер 85 30 ей дів теротук бій нія Суб Рго 5іу Бу5 Аа Рг Су сем без пе
А туг АТа Аїзх 5акобег грец гео 5Звее о сіу уві Рго 5ег о дгяа вав бек бі1у
БО
Зекобіу 5ег біу твг о А5ро вне Твгоїеи тт Ті бек бек сен біт рРго 55 їй 7 БО
Фо дБрорРйе АТа тлг тує тук Су сій бій аа Ар оЗекорне. во т1є 855 що 95 лис Ре біу стй Біу Тпгоака Сен біц їТе су 109 195 «210: 141 «2115 З19 «12» РТ «еі3»5 пото зарівйе оп Уа! бій бец ма! бій б5егобіу Аза бім маї був бує РгО СТУ Аїа 1 5 10 І 15
Зегомаї цуз Уа! бег Суз бім тТвіз бег сіу туго Те вйе Твгоб5еготуг 20 25 35 с1у ті заб тер Уа! Аг біб АТа Рго с1у нНі5 бу цеб бід Тер Мет 35 40 45 сім терте 5егоАТа тує дяпобіу тує так дей Тут Аїда біт бух сен 50 55 І29) сіп сіу ако маї ТВтоМебс Твготпгодеротвг 5еб Твгобес ТР АТа тує 65 79 5 80 меж б1ш гей Аг беє цен Аго 5ег дер АБО о тйг о АТа ма? туго тує осув 85 50 95 діа Адко АБробец Аго сіу ТВг одБп туго Ре Ар отук трробіу ія Ту 100 105 110
Те зви уаї тТпгоМаї бек 5ег 115 «210» 142 «211» 107 «125 ВТ «815» Вото 5артейв «8005 349
Азр о тїе бій меж тпгобіп бег ого баг бек оуді 5ег діа бек хаї с1у 1 їх 10 15 дер Аг Уа) такот)е о тиг Суб дку діа 5аг сій о1у тів 5ег А5й ткр сен Аа тео туго бів Ні Гу Рго 5іу Гуз АЇа РгОо Суб їв Сем тів 0 45
Тут А1а АТа 5ек сег вей сей бег зіу маї РКО 5еК Ага Ре 5ег бі1М
БО
Бек біу зек біу Те дза РНе тре зей ТЯг о ІТе бак чек Сез дів реко 55 70 75 ва сін Ар овне Аза тле тує тує бух бій сій Аза АЗИ Зег Ре рго Іїе 855 95 9 тнЕ вра 1у бій СТУ ТР о АКа цей бів Ті суб 100 105 «910» 143 «її» 119 «Іа РТ. «213» Ното варів «400» 143 сій Уа! сій се маї сій зег б1іуУ АТа бій Уа! уз фу Рго сі1у А18 ї 5 10 15 чес ув! уз маї бек суб біц тк ояег о сіу Тує ТЯК о РБе Тк об5вго тує 20 25 30 сту тіє 5аг о тгроуа! Алго оіп АТа вго сіу нії Ру ге сі Тер мех 35 0 45 оіу тер тів 5ЗегоАїа тує аа сіу туго тінб Би тує Аа біп гу гец 50 55 БО віп Оу Аго Уді тб меї таб твер отиК бек тс 5еготвг АТа тує 55 І й 75 80 мес бі їец Ага Зегоїеч дго баг дер Авротвг діа маї тТуг ни сУ5 85 з0 9
Аїа аго АЗрогеноАго біу ТБгоазп тує овБе Аб5ротує тгробіу їй біу 100 105 зо
ТНе бер омаї ТК маї бек бег «Р10» 144 «га» 107 кгі1?» РАХ «й132 Ното зарівля «4005 344 дер отієє бій мес тигобіп 5ег о Рго ес 5вк маї бег дія 5Зегомаї сій 1 5 10 15
А5роАго маї ТВг о їІ1е Твк осСу5 Аг АТа Зек бів б1у Т12е бек дак Тер о 25 30 кеноА1а тир опе сій Ні бу вро біу бу АТа РГО Бу рем бец ІЇе ай 45 тут Аа Ай Зег о бег сеу бен бек о сіу Уа РРО 5ег Ага РИ 5еє су 0 55 БО 5Зег Ф1у зве бу Тйгодер о вбле УБгогец о Твг оте б5еб бегобем ся Ро 65 70 75 во сій Ар вва Аза тво о тук тує бує Тай ой Аїа дей его Ре рко тів 85 90 95
ТВе рве сту сій Ту ТИР о аАго сей біб їТе уз 90 105 «іх 145
«2115. 151 «21955 РВТ «213» пото зарієпь «ас» 145 сій Ма? бій івец хаї с1п бек б1іу А1їаобіу Маї уз бух го ТУ 58г 1 5 10 15 зег Маї! сує ма! 5вг См5 вуз АТа Бегобіу б3у ТК РБе 5ек 58г Туг
Фіу Ре бі Тгр ма! ага біп Аїа Рго біу біл с1у сем обід тро мех
І 40 45
СОТу Ака їі бек оРго Т1е бацосіу ї1Те ТК одЕЙ Туг АТа сій меє вБе
БО соіп о о3у де Уві ТАК оТТе тТВгоАТа АБрогух беготвг зек оте АЇа тує 55 то 75 50 мет с!Їц бер обег бек іей Аг бек біш Ар тс Аїа ха! тує тує Сув 85 Зо 25
АТ Ак АБр Ма! б1у тує Авр тТгрорго Абр оте Ре Азр о Тіє тгроб1у вт 105 цо спо с1у тТВе меж уді І11в маї бег 5ег 115 120 «?Р10ю 146 «211х 97 «212 ЕТ «132» ото б5артепе «апоз 146
АВ Тіе біп Меї ТВгобій 5ег о Рго бак б5ег Тен бег Аїд 5ек Уа! су 1 5 10 15
Авр дк маї Тпт їТе твг оСу5 дей діа его б1п б1у же бегбобег тер 20 25 Б) їец АТа тгр тує бій бій ух Ро біб їу5 А1а Рго їу5 бег тен їЛ1е 35 40 А5
Тут АТа Аїа зег бек сей сіп о 5екобіу Ма! Рго бек олдго Ре чЯек обі 50 55 50 сіу б1у 5екобіу таб АБроРйєЄ ТВГобец таб о тіе бек бе? грец сій Рго 55 70 Та що сін АвроРйе А1а тс отТуг тує бух сій біп тує д5п 5ег о РНе рго РКО
Що 90 95
ТВ оРБе 51у сій біу тб ору5 ма! сіро т1е Суб 100 105 «2105 147 «й11ї 121 «2125. РВТ хйіїдЗ» Вото зарзеля «4005 147
Сіп маї бій Се Уа! іп 5ег сіу АТа гу чаї (уз муз вго 51У бег 1 Б ня ї сегоуа! уз уаї ЗегоСує су Аїд бек обіу С1у Не Ре чего 5ег тут сіу лів сіу тгто маї Ак сій Аїа Рго с1у бій біу сец би тер мех сіу ага їТе рРБа Рго тів іей Біу те Аза Аза тТуг Аа сій Мет Рпе 50 сіпосіу Агод маї тиг ІТе ТбгоАїа ар огувє бего тк За так АТа тує 65 70 75 ГО) тів с сви тик обеє ів Аго Зв бій Ар ТЕ АТа ма) туго тук Суб 855 90. 5
А18 Ага а5ромаї біу туго Ар обег діа дер АТа Ре йбю Те Тер оБіу 109 105 110 сів біу тс омет Уа! так ома! 5ег зек 115 120 кг105 348 «Тіз 0? «бій» РЕТ й «2132 Вошо зарієпв «4005 148 дер тів с1іп меж тас білобБек РРО беб бек рей бе Аа беб ма1ї с1У ії 5 їо0 15
Ар ойга ма! тик отІ18 ТНгоСу5 Ага АТа 5ег сій бу І18 Звгб обес тгро 20 25 за мем Аа тгротуг ій сій фу5 Рго бі губ Аза Ро мух 5егоіей їїе 35 40 45 тує АтТа діа Бег 5ек сСеу оп озек о с1у уат вго баг Аго бле баг о біу 50 55 50
Бек сіу сег біу Тр оАБЮ Ре твгоїєю тає ті Зеко5ек бе) бій Рго
65 70 75 що
Фів А5ровйе Аїа тНготук тує Суб бій ЄТа туг Ав Зеготук РГО рРгГО 85 ЗО 95
Те вне б1усоів біу тнг обу Уа! біч же г у5 100 195 «ТО» 149 «2115 121 «2125 РЕТ «213х Вото зарієей5 «300» 149 5іп маії біп о зеиу ув! біпя бек б1у Аза сі) Уві ув уз рРго Фу бе 1 5 10 15 зак уаї гує ма! бек сСув груз АТа бек б1іу сіу Таб о РБе 5егобег туг
БІ сіу їТе б1іу тгроМаї дго сій АТа кго сіу біп с1іу Гей ін Тер Мет су ака Ма! вне во їїе сей б1іу тб АТЛа да туг АТа стіп меж віте 59 55 ба сіп сіу алко шаї тре о хї1в твг Аза Авробух Зак ТіК обего тк Аа тТук 70 75 що мех оІй їен тпх 5аго ге дга 5ег іш Або ТВгоАїа Маї Турко Туг суб 85 Зо 35 І
АТа ага Ар ма! біу тук Азр о Яаг АЇза Ар Аа РНе Ар ожшТе тер ау 100 195 110 сТй сту тк оМеж ув) Тег оУуві 5егобег 115 120 «2105 150 «гії 307 «2125 РЕТ хеаА3» Вото варівле «400х 150
Азр ше біп мех таб обІпобЗес го чес 5ег сви 5ес АТасствг ма! Су 1 ік 10 15 де роАго Уві тк о їТе тпг суб аго Аа заг обій оту Т1іє Зег'обег Тгр 7о из 30 їеч Аа о теротук сій біп Гу Рго бів Гуз Аїа го вуз ек Геь тів 35 40 45
Туг АїЗ Аа бЗегоб5еє бен бій 5ег о біу Уа! Ргебозек Ака Ре бес бу 50 55 50 бек 01у бег біу ТАК ОАБО РМ ТНР ем ТР отТе его овек сей оп го 65 70 75 зо сі азрвоРВе АТа ТАК отує тує Суб сій сій Тук Авпобевг Туг РКО РгОо 85 чо 95 тиг Овна віу сій Ту те обу мя! сії їіе суб 100 105 І «віх 151 «й1ї» 123 «гій РЕт й «2135 ото 5арівпе «0Юх 151
Зіпй уаї сій бен уві бій бак бу бі сі Уві Маї 1 Рго бу АКо ї 5 10 15 заг Ге) Ага іеу бек суз АЗа АТа его біу РНе тигоРве Заг очег туг з0
АТВ Меї ніє Тер уд)! ду сій діа Рго е1у гу Ту їей бій Ткромаї
К30) 45
А1Та Ре ті бек Туг др сіу 5ег дз цу тує Ре АТа дер бег Уді
І 55 Бо уз Б1у до Ре тТпг їі 5ев дга Аб5роАзпозек Був Аза те еф тує 655 70 75 8о мви б1п о Меб дзповеє ге дгу АЛа бій др так Ала ма! туго тує су щ5 до 55
АТа дк Сі) іїец без ТгроРйе С1Уу біч Ген Тго 61У туг РБа Ар ву 100 5 о тгвобіу дга сіу тйгоі ви маї ТР уді бег о 5ег
ІВ 120 «йо 152 1» 107 «310 ВНТ Й «ії» пото заріви5 каО0х 152 дев те біп мес Те обіп ек РКО Бек бек Уа) 5ег Аа 5ег Уа! о1у ї 5 10 15 двроАко ма! тйгоїів тб оСух Ага АТя бего біло б)іу хе 5егочес тер із АТа тгротуг сіп Ні туз Рго зі цу Аа рго уз ем овеу Те
ТуК Аїа АЇїа бер бек іви 01й 5ег с1у Уа! Рго зеб Ак Рне бег 51Уу 50 зекобіу бек б1у ТВт одер о вБе тп бе) тйг 13 5ек о зеє беш 01 РгО 65 70 75 50 сій дер овйе Аїа тс туго ту Суя бій ом Аїда дев 5еб о впе ТВе тер й5 90 95 тиговРве біу бів оіу тйг цу маї їм тів гу 100 105 «210» 153 «211» 193 «2122 РЕ. «2135 Вот завіспь «800х 153 сій ха) свй беш ха! Бій 5ег су оіу б1іу уаї маї біп рко сТу Аго
Ії К! 10 15 5ег (ви йго Гец Зек Суб АТа АТа 5ег о біу ре тАг о РНе 5ег бек туг 20 75 30
АТасмет Ні Тгроуаї Ага сій АТа вго біу губ бу реч 516 тро: ма 35 Іо 45
АТїа Рне ІТе заг оТує Азр о аіїу 5ег бек Гу5 Азоотуг Аїд дяр бег Уа 50 35 Бо уз бі Ага РБе ТЕгб тів На Ага Аз» дви 5аговув АВ ТК огей тТув 55 70 75 80 їеп бій Мет бег зег іеу АгО АЇаа АТа Азр Таг о Аїа Маї Тугс тує сСує 85 90 95.
Атїа дк Бі Бецобеу тер вне бі бій бер тер 51У тує рпа дер о вей зо 105 110 тетроо1уУ Агу сіу таб бе Уа! тТйкома? баг бак 175 І 120 «2» 154 крії» ЦКУ «Рід» РТ «213» ВНощо зарівгп5 «Ох 354 дев ІТе сій меб тс обіп чек рус б5егобзеу ма) 5егоАїя 5ег о маї бу ї 5 15 15
Ар Аг Уа! тик оїт1естаг Суз агу АТа бе біп сіу т11е 5ег бек тгр
Р 30
Сеч АЗа теротут ба снів гу5 Рго сту уз аЗа го бух Ге ей Те 49 45 туг-А1а АМТа бек бог сво бій зако бтТу уд РО бег Агу Ре заб о1у 60 дес о біу его біу ТВг о А5роРВе Тигоїеу ТВг ої1е бек о5ес Сен бій Рго 65 70 73 о оч А5О вве АТа Твготукотує су бів біб тНгодБи Бек вне стає тер 55 90 95
Тк орав с1у бій б1у Тгеобує Уа! біц тів Гуз 100 195 «210» 155 «їх 117 «0125 ЕТ І «фі13х Воте зарієпв5 «800» 155 зі маї ста бен без біц 5ег сту біу біу бе Уа! бїв Рго сб1у сту ї З 10 15 зем цем Ага це бег осСуї АТ АЇа 5вг о біу Ре Тпг вве 5ег зер. туг 20 25 30
Аїа меж Тк отгроув! Аг сій АТа Рго бу цуя біу ву бій Терома! 35 0 45
Зегоуаії дів бек сФіу 5ег шіу 61 їв Тіготує туго АТа Ар бек ма 50 55 50 їув З1уУ йго Рйе тнгОоЇ1е его Аго дер Ап бек рБуз АЗИ ОТАК Гей отуг 65 75 75 80 ви бій мес дви 5ег осей Аго Аїасо Її др оте АТа Уа тує Ту бух 85 50 3
А1іа Аго азродго б1у Тгр о сіу 5ег о Аяр тує тгров1іу сій біу Тк огец 100 105 о уаії тк маї ве зег 115
«2105 156 «1їх 7 «й1ах РАТ «2135 Вото чзарієле «4005 1565 віч тів маї іем тк сій Бер РРО АТа ТК оцей 5ег гер бек Рго С1у 1 5 10 15
Сі Аг Аа таг цер 5ег Су Аг Аза его бій бЗег о уа! 5ег Бег туг 75 30 еп АТяа тТгротуг ств біяй сузв вго б1у 14 АТа вго Агд зем Сен т1Є
Туг ар АїЗ Бек деп Ага діа тб с1у ІТ Рго Аа Аг Ра бег оТу 50 чег біу бек сіу тр дер вБе тТиг о Се) тс її Зеко зве се СТИ РгО 05 70 75 во а ар РМесАТа уд! Ту туг Су сій бій Адго 5ег АБп о Тгрорго Ре 55 90. 95
Тео впе біу Рго с1у Те оїуз ма! дер ЇТе їу5 100 105 «2» 157 «Лі» 117 «й12х РТ «24135» Ното зарієйе «хаВО» 157 оіш о маї бій без їеу бій 5ег с1у сіу біу ен уаї біп рго біу ФУ 1 5 о 15 5Зег Бен Або сви 5егоСує А1а АТа бегозіу вве тв РАВ дл деп Туг 20 25 за
Аїа мес бек тгр Уа! дгу біпоАзїа Ргсо сіу бух оіу Сеш бІц Тероуд 35 40 45 бек Аза тів чего біу зек бтіу Б1у ї1е твг тує тук о АТа азробеєк сів 59 55 БО ув а1у Аг Ре те отіє 5ег одгб Ар Ап Бек бух АБИ тТИг ота тур 65 79 75 Во є сб1п Меж дзп бек бви Аку діа бій А5ротЬК АТа Уаї Тут тує сСу5 85 90 95
А1їа уз Азр Ага сту тгросіу бвег др су твор Ту п вх Тг ген 100 105 л1с чаї твеома) бегобег «2105 158 «Тіз 07 «йЩї2» РТ І ей13» йото «арівпе «4005 158 бій їів УуЩаї Гецз тк бій бек о рго Ав таг огви бебі бу 5ег ро сіу ії 5 10 15
Бій дга Аза таб обев 5ег Суз Ага діа бек бій б5ег Уа! Бек обер тут
Сей діа ткротує бів бій су го а1у бій Аза вго Ага цем ген Т1Є 5 туго АброАТа 5ег АБИ Аг АТа таб о біу Ще Рг дів Аг Рпе его ої 35 50 й чего боту зек о чіу Трг одер РВе Тигоіе) тВгоїів 5еб о бег свц бід Рго 65 70 75 во ой АвровМе Ала ма! туго тує Суб біп біп Аг бег дей тирорко. Ре 85 за У тс оРве б1іу рго б1іу тн Гуз маї Ар те уз що 105 «ах 150 «їх 118 «их РЕТ «213» Вото зартівипз «4005 159 біпієец біп рен піп б5ім бег б1у 5зек біу їец ма! уз рКко бек бій 1 2 о 15
Все бак ген пк сСу5 АТа ма1! его оіу зіу баг 316 5егб зве б1у 20 25 30 сіу нії бег теробзеє тер о ї16 лго бій вго го о1у гу ту веп са 35 40 ДУ тов оїТе сіу Суз цем Тут Ні Зег біу А5поТИг Туг туг Ал. РКО 5ег 50 55 6о сем су 5ег дра уаї Ти ї1їє бек уаї А5родго чес рух Аби бій Рце вх 70 75 во аг Сей Суб5 сеу бег бек ма! Таб одів АТа Ар тс АТа маї тут тут 85 Кв 95
Суз Аа Ага заг о Зеє туго Ар от1є бе) твг Аза тгробіу бій оту Те 105 105 шо ії»и Уві тб оуаї 5вг о 5аг 115 «2105 160 «11 07 «212 РАТ «13» ото 5авієп5 «4005 150
А5в ліве Фів Мет їпгобіп 5егорро бег обег уаї 5ег Аїа Бек ув! ФУ 1 5 о 15
Азр о Аго ма1ї тигоїіе твкосуб Аго Аїа хеб бій біу тів бет 5ек Ттр 75 30
Сен Аїд Ткротує іп Ні бу вго біу уз АТ РГО ув Сем бер Ше о) 4
Тук Ата АТа бак ак ей бій ваг біб Уаї рго 5ег Агу РМе еф о1у бо черг бту бЗегоа1у їв Ар о РБе Тит оїем тТвге ї16 зекозеє грец сій РО 65 70 75 о сів АБроРпе Аіа Тйг о тук тує суб ій бій АТд Ай зве оре ркго Ге 85 90. 95 тяг овве оіу сів сіу Тік Або пен сої) Те о фуб 100 105 кі» 1851 хеїї1х 138 «1йх РТ «435 опо зарівпе5 «4005 15 сів Сеп бій кез оій оіц бек бі бек сСіу еп ма! Гуз рРго бек от 1 5 19 15
ТВговео зеагоівен о твпгб Суб б1іу Ма! 5егобіу біу бек Іі баг 5вг о о1у 20 25 з0 сіу ні дес тгро5ак тор отіє Аг біп о вбо вко б1у суз С1уУ ви ОТ 35 40 45
Тео їїе б1у См5 гей тує нія 5егобіу Ап Тк тує туго Аб5лорРГО Бего 50 З Бо їеч мух бек дго маї Ті" х1е 5его ма! АБродго 5егоїує дп вій рае 78 75 Що 5ег цу ву5 сем Бек 5ег ма)! тик АТ АТа Ахротик Аа Уві тує Тусє 85 Зо 95 суя діа Аг бег обеготуг АБО тіє се) тпг о аАбр о тер о сіу біп оту тТНг 100 105 110 ке уаї того Уаї бек Бес 115 х210» 1689 «2112 107 «д1а» РТ , «3» Лото зарівпз «4005 1652 аз тів сій Мех Тпбобій Яег о вго Зегобегоуд) б5егодіа зекома! о1у 1 5 Ю 15
А5родгу маї таг о І1а тк Су де Аа чего оій б1у іє 5ег хег тер 75 30 ів АТа тгротує біпо нія їуя рго о1у 15 Аа Рго ув тен іви ІЇЄ 0 45
Тук АТя АТа Зеє бек ем ій бек о1у маї рго бек Ага Ре чего оїу 535 50 ет біу Бек біу тТвгоАдзроРіе тб оцен тн оте Загоб5ек бе) бій го 79 73 ЖИ біш азр орла АТа твВготуг Тук обу біпобіл АТа Ай бек вне рео ї1о 85 90 95
ТвгоРне с1у сів біу ТАК о Алко бец Я1у Те груз 100 105 «2105: 163 «дії» 118 «їй» РАТ «еТ3» БоОто зарівп5 «Нюх 163 аїп без бій сем бій с1» Зебобіу зер б1у вен ма! Суб Рго 5ер сій 1 5 о 15
ТВгокецобегобеу ТвгоСуз Аа ма! бей Бу біу зег ІТе 5Зек 5ер обу 20 725 10)
Фу ні5 бог ткробег Тгр тів дк біп рео Бго сіу вує ом Сех 610 35 40 45 тер оІжте б1іу Су ї1ї2 Туг ні б5ег біу Ап Тигоїук А5р одн орго бат 55 50 їв муз 5ег Адгу Уа1 Тв" ї1е АТа ма! Ар Аго Зег Був АБИ 1 Сей 55 70 75 80 5егогено гу Сем беє Ре уа! Тиг Аді АТЗ А5ротк Аїа уві ту тує 85 ЗО 25 су АЇЖ АГО бек б5ег Тут АБИ ОТІ фер тТНе ахрогеробіу бій сту тНе 100 195 110 сен Уа! Тк ув! 5екобег 115 «2105 154 х1ї» 307 «1?» ВЕ «213» Мото зарієнпь5 «00» 164 др те бій Меє тик обіп бБегорго 5ег бак оуді бек АТа заг омзі щу 1 У 10 5
АхроАдго маї тйб т1е тнгосСує Аг АТа б5егооіп б1іу ХТе. 5ег Бек тер 29 25 30 ей АТа ткротує бТп Ні Бу рго б1у у5 АТа рго Гу5 івц гео їТе р) 45 тук Аїз АЇїа Зег 5ег о беу бїпо5ак біу Уа! Рго бек око РЕ бакооіу 5 55 Бо тег с1у зе о біу тйгоАЗр о РНа ТВгоїєей ТАК оті зако обеб о вбец біп ро 655 79 75 во 5Іч о А5р Ре Аїа твготує тук Суб сп біп Аіа Ап о біу Ре Рго і1е 85 Б) 35 тивне біу сій б1у тк Абу сец бій ї1е їу5 190 105 жкеїй»х 155 «її» 318 «21йх РК «гіЗ3У Вощмо харієпе «400» 165
Фів осяав бій тен оіп біц Бег зіу бек біу зем маї Гуз Рго зак сій
Х 5 10 ї5
ТВгогец бек грец тс Су АТа УМаї бек біу пу Бег тів бек бек о1у за с1у ніб5 зек о ТгробБеє Ткротів Агу бій Рго Рго сту су5 біу сен бі терії фу Суб хів туго ні 5ег СІу АБИ ТНг тує А5родей Рго Бег бо реш бух бек Ага маї Те оті баг ма! Або ака Бек огУу5 АЙ 61. Ре 55 70 73 що заг цер ув їец зег о б5егоуаії ТНгоАїа Аїа Ар ТНК АТа маї Тут туг 85 90 55 суз Аза Аго 5ек бек туго дяр Тіе 1еу Тпг о Авротгросіу бів оту тр 105 195 їіто їеш уа! тик оУаї б5ег 5ег 115 «205» 1665 «2115 107 «212 РТ шо -2135 Вото 5аріяпе «а» 106 дер ї12 біл мек твг Осій обегобго зег баг ма! 5ег Аїа 5ек уаї бу 1 5 Но 15
АзроАга Уді Твгої1в Те Суб Адка діз бег біп б1у їТ1е 5Зег 5ег о тер 20 25 39
Гей Аза тгротук сій нія бує Рро 51у вує АЇїа Рго гу сен о бей тів 35 40 5 тут АЇВ Аїа 5ег о бег оїеу бій 5еє біу маї рго бек аго Ре бек обіу 50 55 бо
Зех а1у заг слу Тс до Рйе так обец ТНгс ІїТе 5еб бек рем біб вго 55 7 75 о зі Ар Рне Аза тпг туго тус пу іп бір Аїа аз Біу ве орга тів во 90 35
ТНе Ре сіу біл озіу тТБг оте се біц 118 Гуз 100 105 «М 157 кгії» 118 «вїйж ЕТ
«д13ж ото чарівне «МЮ» 157 сіш уаї бій реп ма! сій б5ег бі дів су ма? ух уз ко бі и 1 5 10 15 чеків рух Ї1е заг оСух цу сіу 5ег біу туг тів Ре тТнгозег Туг
Зо тТгрожх1т1в біу трРромаї го сів меж Рго 51у бух сіу їецш 510 Ткро мех оіу ї1іе її Туг реко зіу др 5ег Ар Тйгодго тус зЗековго его Рпе
БО зіп у сій уаї тпг о ТТІе бег АТа Ар ру» бБег їТе 5ег ТпгоАТА туг бо 75 75 о
Бец сіп Терозеє бек ге) бує АЗіа бек оа5ротпг АТа Меб тує тук о сСув 85 90 5 дів Ак бій бій маї тб обу аБроРКе дев отук теробіу бій сіу та 190 105 110 виш уд! ТБг оМаї Бек сег 115 «2105 3158 «М М «2125 РЕ «213» НПотюо зарієве5 -8005 358
АТа їїа біп іец твгобів Зако бео Заг обеє сен баг Аїд бег маї Є1У 1 5 юю 5
АБрРОАгЯ Уа1 тре їТе тТиб Сує Аго Аа 5егобіп 51уУ їТе ває о5ег АЛла 20 25 30
Сен Аза тгротуг ай бій Гуз Рг біу їуБ АЇз Бго Гуз сен Кей Тв 35 4о 45 тут Абр АТа бек баг ей бій бек біу Уаї Рго бЗег Аго Ре баг Оу 50 55 5а 5ег «у его б1у Те Ар оРйЄ ТйгРобенотиг тів ек бас веу бій вро 65 20 75 Кв ій Абр Ре АТа тийг тує Тег оСуз сів аа Рйе дей бер тує ргОо ву 852 Зо 5
Те Ре біу сіу 51у Тс цу маї біш ї118 1у5
100 3105 «рій» 169 «її 118 хе12ж РЕТ й «еї3з пото 5зарівеп5 «00 169 віч уа! сіп бен маї Біп зве оіу б1у сіб ді бу5 вує Ро ТУ 10 ї 5 10 15 5ег сей вух тів бет суб уз сіу 5ег біу туго бег РНе ТНе Зего тує 36 тгр о ї1е с1Уу Тгромаії Ага бій меж рРго біу бух с1іу во бів теромеє 1 Ів їїе тук сорго піу А5р бег Азротпг Агу Туб о беєорго беє вра 50 сів а1у іп Ма! Тк ої1е зер А1іа А5роБує б5ег її бек тпкоАТа тТуг 65 70 75 Б) цеш біп тер обег чего гей губ АТа бек дзротвг Аза Мет Туг туго суб 85 90 95
Аа аго сій бін Уаї Тег осіу дБроблв АяротТук тре осіу бів сіу тк 100 305 що івен уаї Тк Маї 5ег зег 115 «ВМ» 170 кФ2іїх 407 «де ВНТ «2135 пойо 5аріви «002 170
Аїа її сій фец тт обій 5ег о рго Бер 5ег бец бек АЇа 5егоуаї су 1. 5 я 15 дер Аго уаї ТНгожТіе Тиг Суз АгО Аїа бек обІй б1у тів 5ве бек Аа 20 25 за їем АїТа тгр тує бід бій бух Ро Ту Був дів Рго су сер грец т1Є 35 аб 45 тук дер Аїа бег о 5ег ге сію 5ег о сіу УатТ о Рго 5егодго Ре зЗег О1у 0 55 бо зег с1у бег о сіу таб одер Рпе тк овес тс о ІТе зак бег гвц в рРго 65 70 7З БО
ФІ дер вне АТа тик Ту тує бух сів сій Рйе Ап озЕК туго Рго Сей 85 80 95
Тек овне біу біу ш1у Тбгоруз маї б? Пе цу5
Кв) 105 «ме 17 «115 318 «195 РЕТ. «155 ГПото зарігп5 «400» 171 зів уаї біп7івз маї біпобег біу Аїв су ві сух5 сухо рго Б1у бї1и 1 З 10 15
Зегоіен був Те 5ег Суз Гуз сіу Бек СТУ туг 5ек РНе ТВ обер о туг тТгрох1е б1у ТтТгромаї Ага о1й мех Рго бу уз о1у сви 510 тТкр мет су ше ті туго Рго біу А5робег АБО ОТГ Аг ра бегорго ес вда б ста б1у біп ма) Те тів бек да Ар Гу бе ї1е Зак тк АЇд тут 655 70 75 во
Мен вія Теробег бегогец ГСух а1їа бек Ар о тНг АТа меж тТуй тук сСуз 85 за а5
АТа Ага бій біо 31е тв сту 18 Ре дзр туго тге о1у піп оту ТВ 100 05 115 їеу уаї Тр Ома! бек о бевг 115 кам 172 «М» 07 «012. РВТ й «иї3з Вошо зартепе «400» 172
Аіа хе оїпй іец та бій бек ого бег бек мен зег о аїа зегомаї у
Кк кЯ і 5 щ5р.Ага маї Три ІТе тва оСуз Або АТа его СТЙй б1у т1Те сег Бек АТЗ 20 25 30
Кеш Аїа Тер тує бів сзіп о су5 Рго Ту ух Аїа вго бух Сем їен Те 35 -О 45 туг а5р АЇа 5ег бек іен сін бек оту ма! го 5Ег Аго Ре 56г Оу
50 55 бо чек Є1у бек бТу тТйг дер РЕ ТР оїау ТВг ої1е 5вгочег оте біп Рго 55 70 75 50 ой дер Ре АїВ тис тТук туго Суб бів бій Ре Аза бек тує го Аг 85 30 35 те вве сі віп зіу тВг був уаї сії ЇТ6 вуз 109 105 «105 173 «2115 118 «їй» РАТ «2135 Мото 5арівна «З00х 173 бій ма! бій ев уа1ї біпобеб бу Аїа 02) уві Буб цу Рто Зі би 1 5 10 13 ек їеу буз їі бек Суз вує 01у 56госту туг бек реє тпг о 5ек о туг
Тер їі біу Тер ма! Аго бій мес рко біу бух 51уУ беу біз тТгроМмех 41 45 сТіу 112 ІТв туго вгго сту дер бек ав Тег Арго туго бег РО бер РЕВЕ 50. 55 60 сіп сіу сТя маї те 1Те зего Аа Аброух Бек у1е 5еготйг АЛа тут 655 70 75 80 цеч б Терохегоб5ег се вух Аа бек др тлг АТа Мет о Туг тук Суб 855 за 95
АТ Аго Я13 б1и те Тк обіу а5роРНе АБротує тер об1у бій б1у тве о 105 ії
Без Уа! ТНК Уа! бег бек 115 «2І1йх 175 «211». 307 «ФЩ1й» РТ «213» попою зарієйе «005 174 дів те біп сви Тк обіп о бБегоРго бер 5егорец бек Аіа век оуаї ЗУ 1 5 10 15 дер Ага уаї тик оїтТе тб оСуз Аг Аїа 5ек Біл оіу ї1є бек 5вг Аа 20 25 30 гей Аза Тгрозугобіп 51 Куб рго біу Су5 Аїва РКО був во тен Те 35 40 45 тТуг Авр Аїда 5ег бег цей с1й бег о бТу ма! Рго его аго Ре чего ту 50 55 І) чек біу бег бі Тйг о АброРВе ТіК бер тТАг оІ16 5вгобер гей б1п рго 55 70 75 80 ст А5р вне АЇїа тб отуг Туг Суб бій біп Ре Ал Зег луг Рг ев 85 90 935
Таг Ра іу сі Сіу твк о су уа?ї бін ІТе уз 105 105 «5. 175 «115 МВ -82195 ВЕЖ «213» Нощо зарівпе «005 175 сі Уві бій без ма1 бів о5зег 01у АТа сія Уа! бу5 ру5 вго біу ї 5 10 15 зег їецш о ру5 тіе заг сСуз був біу бек с1у Тук бек о РВЄ Тіт обег Туг тер їїе сбіу тв уаї дго сій мет его 61у цуз Біу ве сі тер маї «0 45 о1у 116 Хе тує Рго біу Ар 5ег Ахр тб одго тує берорко 5ег РБе 50 віп бі» зів уаї так тів бе Аїд А5рогу5 5ег ІТ бек твг о аТа тує 55 70 75 во вБец біл Тгр о б5ег 5ег гей і у85 АЇТа 5егодБй ТНР о АТа мет туго тук су» 85 90 95
АХМа дго вій бі) ї1е Тк об1у Ар оРНе АБрОТугє Терому тп обу ть 100 105 ло
Гей чаї твгоУаії бер зе 115 «205 175 «91їх 107 «912 вт «2135 ото зарівпе «щі 176
Аїа тів оїй вейстик 01 Зег о рго бек бвгоїбви 5ег АТа 5еє уві Ту і 5 10 15
Ар Аго Уа тб о тТе те осСуя Агд Аза бек віп оТу Те бег бек лід
Ро) 25 30 іеЧ Аїа тТгротує віп бій суб Рро О1у Буз АТа Рго дви Цеу Се я 35 40 45
Туг йіа АТа его чагогїец зі) бек біу Уаї Рго бебоАго РНе Бе Оу 50 55 50 зе" с1у чек б1іу тк о АБЮ РИ ТК фев Твг оті 5ег о баб гей бій Рго 55 то 5 о сія Ах вне сдїа твготує тує Суб сій бій Ре дей баб отує РРО рей 85 90 95 твгоРНе бі» віу Ту тйг о буб маї би ї1а цуз 100 105 «йі05 177 «215 В «8125 РТ «йі3з Пошо зарівн5 «80050177 сін Уа! сів сей Уді сій бЗеб оту а1в сти маі зує уз рРго З1У бій 1 5 10 15 баг вец бух т1е бер Суз Гуз біу баг біу Туг бек Рйе тТЄ 5еготуг тер оїе с1у тгроуаї Аге біп Меї рго б1іу губ біу еу бін Тиромех 4й 45 сім 118 ї11е туго Рго Оу Ах бег о Азр ТИКОАго туго обер го Бе ера 50 сія бі біп уаї твгодів беє Афіа дер руб вегоїтТа бек Те Аіфа Тує 65 79 75 85
Мей обіп тгр заг зак Сец су Аа Бег Аброїнг од) Мет тує Тук суб 85 Зо 95
Аїа Ако сій бім їТе тВекобіу дер о еКе а5ротук ткробіу СТВ Ту тне що 105 115
Сец Уаї ТНк о Уаі 5ег бек 115 «ом ЗВ «їз 7
«2122 РЕТ «213» йото зартепь «8005 178 діа те біп мем тб бій Зег Бго бек б5ег оїец бег АтТа с 5ег уд бу ї 5 10 ї5 дер дго Ма! ТНг о Іт1е тбгоСуз АКку Аа зег сів с1у І1е бег чер АТа ей Аїа тго тує біпобій і 5 о рРГО сту 1у5 АТа ВРО Ту ер ей їїе тує ма! АТа бБег бет рей бій 5егобіу уаї Рго бег Ага Ре бег о піу
Бо ек бІх Баг оїу Тег одер РВе тб орай твпгої18 ТВ Зак остео оп РКО 95 70 75 о сін АБ Ре АТа так туго тук Суз бій сіп Ме дя о бег отук РРО Хе 85 90 95
Те рве біу біпооту таг о Аго цем сін ІТе гу» що 105 «М 379 «211» 5 «2125. РТ «215 пом зарієпе «2205 «221» МАНІАКТ хайом (23,.(2) «23» ХІМ ог ЕЕ «220 «о» МАКІАМТ хревю (33..583 «СТ35 ХеА Ого ках «29ї2 МАВІАМТ «ой» (43,3 «223» Хі ог «Ах «вії» МАВІАМТ «Тир» (53.57 «3» хан5 ог «4005 179 зег хза хХая Хаа Хай 1 5 «210» 180 «віх 17 кезвх ВЕ хоїі» пото зарівпх «2212 УАВІАКТ «й025 СУ, (23 «223» Хіт ОгоОМ «йо» й «2215 МАКІАНТ «ййй 313 «Ра3ж Хо К, ОГО ВЕ: «бод «ої» УАВІАМІ «й 83.83 «Ка» Ха ов «2205 «бі» УАВІАМНТ «йод» (83,.093 «и?3» ХахА ОГО т «20» «1» УАКІАКТ й «222» (143... 143 «23» хБекК ОК М «005 380
Ага Хаа Хаа Рго ї1є Гез сту хаа Хаз Ази туг Аа біп Хва РКе бій ї 5 й 10 15 с1у «210» 181 егфім. 12 «ріг» РЕ «13» ото зарівих «ой» «22їз МАКІАМ «ги С6)..ї5 «аа» хі М ог 5 «280» «2215 УАВІАМТ «рад» У3..73 «3» Хор ог А «ох -22ї5 МАВТАКТ «дййж (83..19) «223» Х3«т ог й «4005 ї8ї ар ма! зіу Туг дер Хваа Ха Ар охаа Рпе дяр Те ї 5 10 «210 182 «й» 17 «12» РТ
«Рі» пото 5арівле
«021» УАВІАМТ «йй (81.58) «2232 хі«0, БОГОМ «4005. 182 тЛе хе Тут РгОо 5ІУ Ар Зак Хаа пвгодгу тує бак вро 5еє вне бій ну 5 ї9 15 у «МІ» 183 «їх З еб1й» ВК «2135 Вото заріепе «йо кокіх ЧАБІТАМТ котам 33:53) квк3з хім ог Її «дО «2715 УАВІАКТ «ййа СВ), «д2д3» ХЕ ог ВО «Ой» 183 сів сін Хад тпг У Хаз РНе д5р.Отуг 1 -210». 184 «її» 15 «125 РЕТ «2135. Ното зарівне «вед» «вії» МАВІАНТ «Райз КМ... «гАЗ» хіх ог «ех кегї» МАКІАМТ «дж» СВ). «223У Хзем ог 5 «дерх «2215 МАВІАКТ «002 (103... 003 «ра3» Хх3- ог У «ах «фах МАВІАМТ «вай ЛО. «вла» хау ор «40О0х 184
Хап че 5ег лук Ар су 5ег ха губ Хваа ха Аа дер обег ма су 1 5 10 15 б1у «2105 185 «і» 16 «К1дз ВЕ «лї13» пото зартіепь «ги» «2215. МАВТАЩТ «ой» (53..63 «г» Хі«5 ого по да «Ро «221» УАКТАМТ кддгу (1335.,0133 хе Яж ХМ ог А «400: 185
Аїа тТе 5ег обі бег Хай о3у б1іу бег тик о Тук туго хай Абр баг Уві 1 5 що 15
Гу5 бу «2105. 185 «11 5 «019 РЕТ «Рі135 Вото зартепе «дейх к22ї» МАВІАМТ «вх 3.05 «да» хів ок Кк «ВО» Й «212: МАКІАМТ хай 53.05) «га35 Ха ог т «Або» Ве
Хаг туг Аїа Меж Хай 1 5 «ще 187 «21» 17 «2ї125 РТ , «713» Номо зарівпь5 «га «Ф21» УАВІАМТ «байж (3..03 «вйЗ» хі«А ог у «»де твеі» УАКІАМТ хабй» (835.58 шій» хіх ог «ее: «їх МАВІАМТ «22» (153..0153 «023» ХМ ог Е «4005 187 хва їі 5ег сіу 5вгосіу с1у ха ТВк туго ту Аа Азрозег хаа уз ї 5 10 15 ау «10» 188 «й1ї» 8 -212» РЕТ й «0135 пото 5артене «й» «геї» МАВІАМТ «еййм (83.83 «Фа» Х1іш ог с «00» 188 де Ага у тгр ву зег Азр хХда «2105 189 «1» 5 «12» РЕК й «2135 Ното зарієне «вед» «21» МАКІАКТ «агй» (53.53 «23 сХінх ог 5 «ап» 189
АБр ту Тут мет Хаа ї 5 «2105 190 15. 17 «ій РКТ «РІЗУ Пойо 5аріенпь5 хро «2215 УАКТАМТ «аа 3. СХ кхадої» ХІТ ого «205 «д2їх МАКТАМТ «ди» (4)5..183 каз» хоанпоаг 5
«дії» МАВІАМТ хдагйж (53.05) ка» хін бог 5 «Фо «21» МАКІАНТ. хогй» (5)..(8) «ви» Ханс ог 5 «ух «ргїх МАКІТАНТ «2223 С103. 03 «ай3 Хе ог ОМ «ВО» «21» МАКТАКТ «вйж (ТУ. .С12) «023» ХРО А «00» 190
Хай тї11е Зег Хаз Хаа Хаа 56г о Туг Тс оХаз туго хав дар озег Уві Ку 1 я 10 15 с1у «М 1 «вх 7 «2172. КТ -2135 пото 5дрівпе «2205 «21» УАВІАКТ «ою (4). 043 «2235 Хізт аг Н «4005 191 зве сіу біу хваа еко отр озег . З ках 92 хРіїзх 16 «812» РВТ й «РІ13ж Мов зарієпе кай0» «22і». УАВІДЩТ «гро» 13.03, кд23» Хізапу апіло асзта «Дах «Фа12: МАВІАМТ «вав» (21..(8) «е3» дат ог «вх «тії» УАЕТІАМТ «ай 73. «7235 Хан ог
«ої» МАВІАМТ «вай (103.10 «23» хі ок б «400» 192
Хай Хаа Туг Ні5 5ег сіу Хаа Тйг Туг Хав 45п Рго Зегобец руб 5ег 1 5 10 15 «2105 193 «231 В «Від» РЕТ . «2135 Пото вартепе хогйх «із МАКІАМТ «о (5.05 «2235 Хіт ак т хай» 193 5ак зег Туг дзр Хаа Сем ТК о АБД 1 5 «2102: 194 «2115 5 «212» РЕ «2132 пото зарієпі «й» «ейі» УАКТАНТ «вд 33. С «223 Хі ого -8005 194
Хай туг сі1у щіе 5ег 1 5 «2105. 195 шо. 17, с«в1й» ВК «2335 ото. 5аріснте «бд» «рйї»м МАКІАМТ «гай (8у..43 «вйїх хіхА Огот «Тех» «даї» УАКІАКТ «аг» С8)..(8) «023» Хом оОгОоу «Ю» 195
Тер хів 5егохаа тут Ази сіу Ха Ти" дей туго АТа біп Бу цей сій ї 5 Кв) 15
О1у «2105. 1965 «2315 30 «12 ВАТ «2135 ото зартівпе «ай» «2723» УАКІАМТ «22» (61... «23» ХізА ог М кар 195
Азр сви ага в5іУу Тнеохаа туго Ре А5ротук 1 5 я) ка» 137 «Ії 5 «212» ВЕТ «2і3з Ното зартепе «го» «021» МАВІАМТ «джу 13.0) «д23У хі-М ог «02 «21. МАВІАНТ «аййх 21. .12) «Ее3 Хав ат Ху «4005 197 хва хай сіу тів заг 1 5 «2105 195 «З ТУ «2122 РЕТ «2135 ото зарівп5 «РО» «21» МАВТАМТ «кв. К53:.(5 «де3» хів ог ХУ «йо «Рі» МАВІАМТ «рай В). .8) хаййж ХЯенНоОог ОМ «220» «із УАКІАМТ «вх СИ, «йй3» Хі ог М «ог «2ї» МАЖІАМТ адам С123..0193 «223» Хаіх5 ог А
«в «и2їх УАЯТАКТ «вдо (153..5153 «23» ХбиМ ог «005 198 тер 116 5ег Аїа Ха А5п сім Хав тйг о хадоТук Хав біп гу5 Хда оп ії 5 40 15 -1у «2105 199 «из 5 «Ро» РЕТ «2132 Ното зарієйз «ех «рії» МАКІАНТ «Той 513.0 «ег3» хі-Вог «бо» кегї» МАВІАМТ «йду (2У..123 «2235 Хе ог у «гай «221» УАВІАМТ «й 83.05) «ії» хат аг. 5 «НКЮ» 199 хва хва бі 1128 Хай 1 5 «210» 290 «Кім 47 хе12ю РЕТ «2135 Ното 5арівей: «дод» «021» МАВІТАКТ «ри (53505 «2832 хі ог у «од «ді» МАКІАКТ «фай К153..015) «вка» Хо ог «ваОх «22ї» МАКТАМТ. кий 171.67) «беі» х3-0 ого «40025 290
Тк ІТе 5ег АїасХад дп сім Ай ТИР Аби туго Аза сіл був хва 1
Ж 5 10 15 хай «ех 201 «її» 14 хаї2» РЕТ кгїЗж пото 5арівпа ках «281» УАКІдМт. «бах (2у.523 «23 хів ог «беж ей МАВТАМТ. «вай СЦУ.. о хай3ж Хожв ог опо) да «4005 201.
Уві хаа Аго Туг о вБе Аби тТгроцеви гей ква тук впе дер. туг і 5 0 -гій» 292 «ї1їМ 9 жхеїйх РК «213» ото 5арієйе кад» «ої» УАВТАМТ «айв (5)..553 «вай Хі ог Е «220 «рої» УАКІАНТ. «йо» 83..С8) «23з Хар ог У «Ох 202
Фе сій Тут АБИ Ве Хаа Рго хаа Тпг «2105 203
Тіт «212 РВТ «213» Кото харівп5 «ех «игі» МАДІДМТ «бро» (13,.513 «223» хівО, УМ ОК А «8005 203
Хза Аїа 5ег ек мен он бер 1 5 «210» 204
«М 1 «За» РК «13» Лощо зарієпь «гйх «ееіж МАКІАМТ «фай 593...) «в23» Хі, Т, |, Ж ої" Му «400» 204 сів ій Ре АБИ ЗегоТує го їей хХаз Тит 1 В їй «Вій» 205 «е1їз а «0» РЕЖ й «213» Попю зарієп5 «220 «221» МАВІАМТ жайа» (2). «гад» хі ОГО Е «ЩЬь «из УАВІАНТ каойз С33..3 «Ей ХА ВТ «гук І «2213 УАВТАМТ «са» (43,.(4) «23» ХМ ог 5 «дк І «21» МАВІТАМТ. жовйж (73...) «дея хан аг т «00» 205 біп Хаа хах хва зег Впе хХаа тер отпг і о. «РІ1йх 206 -Їх 9 «ФІійз рРЕТ «Рі3» Дощ зарівпе «гОх «рої» МАКІАМІ «га» С85..С8) «вй3х хішї ог опо ва «йО0» 205 вв ап АїТа Ази вет РВЕ Рга Хай ТНг «210» 207 «іі» 10 «е422 РАТ
«205 1 «2311х З «212» ряТ ! «2ї3» Нойо 5аріенвь «220» «221» МАКТАМТ «доз (13.0 «вй3ж ХІ-Ног о «ий» «2215 УАКІДНТ «й22» (43,.(43 «8235 ХК ог М -8005 211
Хва біп Туг Хаа Ваг туго вко тер отр 1 ; «210» 212 «231 7 «а» ВТ «233» Вопюо зартієн» «ай І «гії» МАКТАНТ. «ев (23.42) «гаї» Хі ог А кг І І «221» МАВІАМТ. «боб (3)..033 «223» Х3еК ог 5 «4005 2172 ву хва Хаа Зег дга іа те
Claims (31)
1. Моноклональне антитіло, яке зв'язує людський с-Меї, де антитіло конкурує за зв'язування з розчинним СсСМеїЕєСОНІв з іммобілізованим антитілом, де зазначене іммобілізоване антитіло містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО І МО:33, і область МІ, яка включає послідовність 5ЕО 10 МО:37 (024), краще, якщо антитіло конкурує більше ніж на 50 95, як, наприклад, більше ніж на 7595 із зазначеним іммобілізованим антитілом, при визначенні, методом, наведеним в прикладі 17.
2. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що не конкурує за зв'язування з розчинним сМегЕСОНІ» з антитілом, вибраним із групи, яка складається з: а) іммобілізованого антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО І МО-1, й яке містить область МІ, яка включає послідовність ФЕО ІЮ МО:5 (005), р) іммобілізованого антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність ФЕО 10 МО:17, й яке містить область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:21 (008); та с) іммобілізованого антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІО МО:49, й яке містить область МІ, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:53 (045), бажано, щоб антитіло конкурувало менше ніж на 25 95, наприклад, менше ніж на 20 95 із зазначеним іммобілізованим антитілом, при визначенні, методом, наведеним в прикладі 17.
3. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що зв'язується з тим же епітопом, що й антитіло, вибране із групи, яка складається з: а) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:33, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:37 (024), р) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:65, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО: :69 (061), с) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:73, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:77 (062), а) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:81, й яке містить Ко) область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО :85 (064), е) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО І МО:89, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:93 (068),
І) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:97, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зБЕО ІЮ МО:101 (069), 9) антитіла, яке містить область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:113, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЗЕО 1ІЮ МО:117 (098), І) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність БЕО ІЮО МО:121, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЗЕО 1ІЮ МО: 125 (101); і ї) антитіла, яке містить область МН, яка включає послідовність 5ЕО 10 МО:129, й яке містить область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:133 (181).
4. Антитіло за кожним з пп. 1 або 3, яке відрізняється тим, що включає область МН СОКЗ, що має послідовність, представлену в: а) ЗЕО ІЮ МО:36 (024); Б) 5ЕО ІО МО:193, як, наприклад, область МН СОКЗ, представлена в 5ЕО ІЮ МО:68, 76, 84 або 92 (061, 062, 064, 068); с) ЗЕО ІЮ МО:196, як, наприклад, область МН СОКЗ, представлена в 5ЕО ІЮ МО:100 або 132 (069, 181); а) 5ЕО ІЮ МО:116 (098); е) ЗЕО ІЮ МО:201, як, наприклад, область МН СОКЗ, представлена в ЗЕО ІЮ МО:124 (101).
5. Антитіло за будь-яким з пп. 1 або 3, яке включає: а) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зЗЕО ІО МО:33, 185 і 36, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності 5ЕО ІЮО МО:37, 39 і 206, як, наприклад, антитіло, яке містить область УН, яка включає СОБІ, 2 та 3, послідовності зЕО ІЮО МО:34, 35 і 36, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 та 3, послідовності 560 10 МО:38, 39 і 40, (024); р) область МН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ЗЕО ІЮ МО:191, 192 і 193, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зЕО ІЮО МО:78, 79 і 208, як, наприклад, антитіло, яке містить: а) область МН, яка включає СОН, 2 і 3, послідовності «ФЕО ІЮ МО:66, 67 і 68, і область МІ, яка включає СОКІ, 2 і З, послідовності хЕО ІО МО:70, 71 і 72, (061); р) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ЗЕО ІЮО МО: 74, 75 і 76, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності 560 ІЮ МО:78, 79 і 80 (062); Ко) с) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ФЕО ІЮ МО:82, 83 і 84; і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ФБЕО ІЮ МО:86, 87 і 88 (064); або а) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ЗЕО ІЮ МО:90, 91 і 92, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності 56 ІЮ МО:94, 95 і 96 (068); е) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зФЕО ІЮО МО:194, 195 і 196, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зБЕО ІЮ МО:209, 210 ї 104, як, наприклад, антитіло, яке містить: а) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зЗЕО ІО МО:98, 99 і 100, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності БЕО ІЮ МО:102, 103 і 104, (069); або р) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ХЕО ІЮ МО:130, 131 ії 132, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності 5ЕО ІЮ МО:134, 135 і 136, (181); а) область МН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зФЕО ІЮ МО:197, 198 і 116, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зБЕО ІЮ МО:118, 119 ї 211, як, наприклад, антитіло, яке містить область УН, яка включає СОРТ, 2 і З послідовності ЗЕО ІЮ МО: 114, 115 і 116, і область МІ, яка включає і СОРТ, 2 і 3, послідовності ЗЕО ІЮ МО:118, 119 ї 120, (098); або е) область УН, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ХЕО ІЮ МО:199, 200 їі 201, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності зЗЕО ІЮ МО:126, 212 ї 128, як, наприклад, антитіло, яке містить область УН, яка включає СОРТ, 2 і З послідовності 5ЕО ІЮ МО:122, 123 і 124, і область МІ, яка включає СОКТ, 2 і 3, послідовності ЗЕО ІЮ МО:126, 127 і 128 (101).
6. Антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що містить: а) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:33, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:37 (024), Юр) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:65, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО: :69 (061), с) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:73, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:77 (062), а) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:81, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:85(064); е) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:89, і, бажано, область МІ, яка включає 60 послідовність зЕО ІЮ МО:93 (068);
Ї) область УН, яка включає послідовність 5ЕО ІО МО:97, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зХЕО ІЮ МО:101 (069); 9) область МН, яка включає послідовність ФЕО ІО МО:113, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЗЕО 1ІЮ МО:117 (098); І) область УН, яка включає послідовність БЕО ІЮО МО':121, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЗЕО 1ІЮ МО:125 (101); ї) область МН, яка включає послідовність ФЕО ІЮО МО:129, і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:133 (181); Ї) область МН, яка включає послідовність ФЕО ІЮО МО:159 і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:160 (078); К) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮО МО:161 і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:162 (084); І) область МН, яка включає послідовність 5ЕО) 10 МО:163 і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:164 (063); т) область МН, яка включає послідовність ФБЕО ІЮ МО':165 і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:166 (087); п) область МН, яка включає послідовність 560 ІЮ МО:137 і, бажано, область Мі, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:138 (066); о) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:139 і, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:140 (065); р) область МН, яка включає послідовність 5ЕО ІЮ МО:141 і, бажано, область Мі, яка включає послідовність зЕО ІЮ МО:142 (082); а) область МН, яка включає послідовність ФЕО ІЮ МО:143 їі, бажано, область МІ, яка включає послідовність зЗЕО ІЮ МО:144 (089); або /) варіант кожного із зазначених антитіл, де зазначений варіант, бажано, містить, щонайбільше, 1, 2 або З амінокислотних модифікації, краще, амінокислотні заміни, такі як консервативні амінокислотні заміни в зазначених послідовностях.
7. Антитіло за будь-яким з попередніх пп. 1-6, яке зв'язує домен 5ЕМА з со-Меї, бажано, щоб антитіло було здатним інгібувати зв'язування НОЕ з доменом 5ЕМА з ІСво, що становить менше ніж 10 мкг/мл, як наприклад, менше ніж 2 мкг/мл, як описано в прикладі 9.
8. Антитіло за кожним з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зв'язує клітини А431 з ЕСвхо, що становлять 10 нМ або менше, як наприклад, з ЕСз5о, яке дорівнює 2 нМ або менше, бажано, при визначенні, методом, наведеним в прикладі 13.
9. Антитіло за п. 8, яке відрізняється тим, що є бівалентним антитілом.
10. Антитіло за кожним з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що зв'язує клітини с-Меї з константою афінності (КО), яка становить 20 нМ або менше, наприклад, 5 нМ або менше, бажано, при визначенні, методом, наведеним в прикладі 14.
11. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке інгібує зв'язування НО з позаклітинним доменом с-Меї, бажано, яке інгібує зв'язування більше ніж на 40 95, як, наприклад, більше ніж на 50 95, наприклад, більше ніж на 60 95, наприклад, більше ніж на 70 95, наприклад, більше ніж на 80 95, наприклад, більше ніж на 90 95, як визначено відповідно до прикладу 16.
12. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке здатне інгібувати життєздатність клітин КР4А, бажано, яке здатне інгібувати життєздатність більше ніж на 10 95, наприклад, більше ніж на 25 95, наприклад, більше ніж на 40 95, бажано, як описано в прикладі 19.
13. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке є повнорозмірним антитілом, бажано, Іда1- антитілом, зокрема, антитілом ІДС, к.
14. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке є кон'югованим з іншим компонентом, таким як цитотоксичний компонент, радіоактивний ізотоп або лікарський засіб.
15. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке є антитілом з дефіцитною єфекторною функцією, наприклад, стабілізованим людським антитілом ІдДС24, як наприклад, антитілом, де аргінін у положенні 409 у константній ділянці важкого ланцюга людського Ід(34 замінюють на лізин, треонін, метіонін або лейцин, бажано, лізин, і/або де шарнірна область включає послідовність Суз-Рго-Рго-Сув.
16. Антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке є моновалентним антитілом.
17. Антитіло за п. 16 яке відрізняється тим, що моновалентне антитіло містить: () варіабельну область антитіла за кожним з пп. 1-7 або антигензв'язуючу частину зазначеної області, і (ї) область СН імуноглобуліну або її фрагмент, який включає ділянки СН? і СНЗ, де область СН або її фрагмент модифіковані таким чином, що область, яка відповідає шарнірній області, і, бо якщо імуноглобулін не належить до ізотипу Ідся4, то й інші області СН, такі як СНЗ, не містять ніяких амінокислотних залишків, які були б здатні до утворення дисульфідних зв'язків з ідентичною областю СН або здатні до утворення інших ковалентних або стабільних нековалентних зв'язків між важкими ланцюгами з ідентичною ділянкою СН у присутності поліклонального людського Іда.
18. Антитіло за кожним з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що воно модифіковане таким чином, що стає менш гнучким, наприклад, шляхом мутації шарнірної ділянки.
19. Антитіло за п. 18, яке відрізняється тим, що належить до підтипу ІДС, і в якому шарнірна область модифікована шляхом: () видалення шарнірної області з послідовністю ЕРК5СОКТНТСРРОР і її заміни на шарнірну область ІдС2 з послідовністю: ЕВКССМЕСРРСР (ІщИ1 шарнір-Ідаг); (і) делеції в положенні 220 так, що модифікована шарнірна область містить послідовність ЕРКЗОКТНТСРРСР (Іда1 АС229); (ії) заміни цистеїну в положенні 220 на будь-яку іншу природну амінокислоту (Х) так, що модифікована шарнірна область містить послідовність ЕРКОХОКТНТСРРОР (Іда1 С220Х); (м) видалення шарнірної області з послідовністю ЕРКЗСОКТНТСРРСР (піроду Ідат); (у) видалення шарнірної області з послідовністю ЕРКЗСОКТНТСРРОР і її заміни на шарнірну область із ЇД23 з послідовністю ЕГКТРІФОТТНТОРАСРЕРКЗСОТРРРСОРАСРЕРКЗСОТРРРСОРАСРЕРКОЗСОТРРРОРАСР (Ід Шарнір-Іда3); або (мі) заміни треоніну в положенні 223 на цистеїн і видалення лізину в положенні 222 і треоніну в положенні 225, так що модифікована шарнірна область містить послідовність ЕРКЗСОСНОСРРОСР (Ід ТН7Авб-9).
20. Антитіло за п. 19, в якому шарнірна область модифікована шляхом заміни цистеїну в положенні 220 на серин так, що модифікована шарнірна область містить послідовність ЕРКЗБОКТНТСРРОСР (Іа Сб2205).
21. Антитіло за кожним з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що воно модифіковане зі зменшенням корового фукозилювання до менше 10 95, як наприклад, менше 5 95, визначеного за допомогою аніонообмінної хроматографії разом з імпульсним амперометричним детектуванням (НРАЕС-РАВБ). Зо
22. Антитіло за кожним з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що воно є біспецифічним антитілом, яке включає сайт зв'язування з с-Меї, визначений за кожним з попередніх пп., та інший антигензв'язуючий сайт, який має іншу специфічність, таку як специфічність зв'язування з людською ефекторною клітиною, людським рецептором Ес, В-клітинним рецептором або з неперекриваючим епітопом с-Меї.
23. Нуклеотидна послідовність, яка кодує одну або кілька амінокислотних послідовностей, вибраних із групи, яка складається з 5ЕО ІЮО МО:33, 37, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166.
24. Експресуючий вектор, який включає нуклеотидну послідовність за п. 23, який додатково кодує функціонально зв'язану константну область легкого ланцюга, константну область важкого ланцюга або обидва ланцюги антитіла, легкий й важкий.
25. Рекомбінантна еукаріотична або прокаріотична клітина-хазяїн, яка продукує антитіло, визначене за кожним з пп. 1-22.
26. Фармацевтична композиція, яка включає антитіло, визначене за кожним з пп. 1-22, і фармацевтично прийнятний носій.
27. Антитіло за кожним з пп. 1-22, яке відрізняється тим, що воно застосовується як лікарський засіб.
28. Антитіло за кожним з пп. 1-22, яке відрізняється тим, що воно застосовується при лікуванні раку, такого як НаЕ-залежний рак або НаЕ-незалежний рак.
29. Спосіб одержання антитіла за кожним з пп. 1-22, який включає стадії: а) культивування клітини-хазяїна за п. 25, і р) очищення антитіла з культурального середовища.
30. Спосіб виявлення наявності с-Меї у зразку, який передбачає: - контакт зразка з антитілом за кожним з пп. 1-22 за умов, які дають можливість утворення комплексу між антитілом і с-Меї; і - аналіз того, чи утворювався комплекс.
31. Набір для виявлення наявності с-Меї у зразку, який включає: - антитіло за кожним з пп. 1-22; і - інструкції із застосування набору реактивів. 60 32. Антиідіотипове антитіло, проти антитіла за кожним з пп. 1-22.
і лоремання У: Й І нич ТЕН УНК ПОЛК кове колл ни Вт ДО т вл Ак КК, 1 я ло «нівіянівх КОВКИ ВВЕ ТЕТ ов вовна Он й Мк й й М Уміст оНникму ОНИ МАКМНИ КОВКИ К АН вна НМЛ чизозе-ова ЖУКІВ ККУ КЕ КВ ТЕЦ УМ ока За ЗО ! Б ій - УНДО, АВ КАСКВЕ ВК КВАНТ т ТОВ ОАВОВЮН влюміянх я їх ій гло жі Ше ЕУВМРрОА ЕК В ІБК жу А «ВК що ВХ кі Бо МОЖ КУ консенсуєня Су ЕАИХ ТЕТУ ВОЗ ЕД Ам пропіщевниь ти ГомюінійеІ КЕОСЕКТМОВОТИ МАМ ЛЬНЕ КОВКА Т Осн етинитт ху ти ляти се сну мли: шк му ків ОККО У Унізоз-їі Моне шк на 5 Ох о.
ЧЕ ТІн КМІВАУЄИ АКТАМИ КЕ ПКЖУМІВУХ ОК о.
УМалзешних КідКУВЕТМ КИ КІ ЖАННИ и о.
Унів БІДІ Мі ОКР лем, МНЕ АУУ ТВ . о.
НІШІ ШЕ п о ПАЛЮМУТТУТУАН Х . І о З ТКаплпеитУ Кн іджтотАТВ Б НОВЕ БОМСВМСуСНЯ СКМ Уа АТМЕМН ВЕГО АМЖТ СВІТИ МТ ЕС К поснідевмите - т Є порівняння ХНИ: що дао.
ТДПУ СК а МАВ КУККе лаки Е В ЙОНИ Іа ну МКК У УЦАЩУ МИТ МТУ КУМ МУХИ КЕ ХХ пл нео й ! я ЗНИЩ ЕІ ІІІ УМО ИЕ АВК КУ ВИК Ду ки КИЙ ВК З и т пика нн окт вимити МК т МИ ДУ чні евВОоВ ОМ МКК УТ УТ ЕОАВУ МИТИ ее ПКУ ї див п АДСУК ТІ М Кіри мит кино Мод Вих ЕЕ п МАТИ ЛАМИ МКК ЛИ КИТА М ОХ УМ Ми А МВ ща -х ще : шо ї ї В шо Но сх шоу МІНДИИУ КОН ВИТКАМИ, МЕНЕ З ДК а й 1 Щити коноенсуднія СУПУ ОШІКЕБТКМИЧНИСМСЕИВ ВИХ тик УС о кино в посласвмить : : гос АКТ У В МТУ ДМ дні днлялика коні ит пану Щек Я ТІНИ ЕК ПМИПКЕТ М ТТН онов: УКІЦ ОВ ДК ІТИ а пах Тр Б Ві ЯК ї З и м в и ЕК . Мвібзйийеай Бутівка тЕт Ме БТ м о. о . УМІіІйІЕННСЗ КО ЕУТІТАМКИХЕТ АВІА АКТ, їх х ОО АНІ Шисвя ТАКТУ АУД ІЛ в Ух У У х ОО ЗЕ воЯ КИМСОНСУСНя МЕТ АНКЕТ ТАКЕ ЕВИТВУХ ПОДІЮ ЕКО яв поослишевніштю тот З порівниямнаун: с чи ВИБИТИ МИ ЕМ КІ СААЕОКТК НБУ КН АРОК УК МВ Кия Б п УНіишЯнНКУ ФМ І ЕТ ВЕН ЕК АВІВ Б щу чл її УТ ооо нини нн они зн а НН ще пору о М й : пихи дви ММ юки ММ ши МК.
Уніої6-42Х ЖІ КЕІИКІУ ОККО ААЛЧКУК КІТ АН УМОЛАНОМОЗМИНО КМ пт Б - копуенутоня ЗИ КВ НЕ КЕКВ УМОВАМ вті КУТКАХ пестианиюте я ДКистаил ми М с МТ НОВ и ли хід или ли ко пу то опр ло Адсдти тя тіи м тем лаві ЕУЕЕЖЕТУ ВИНИ МИХ МУК 2 МТК ния на ен ше Зно ж ВАМ ОБОКОК: щ Ммидлу и.
ШЕ рих ТІВ ПЕКУХХ С ї о чні Е ПУПОВИНИ У МТВ их ї не: ОККО КЮУ ооо ЖК х копсюкеуєич ЗУМОКиІІЕМИКМу УП УМУК ВАЕОтТАМХ СЕБЕ ЖЕ СЩІММІ КИТИ МВТ Я ТИН ПУМУНДОВМІТХ а поріваакия ХМ: о чн ТЕНТ ЕНТ КУМ КХ мн мороки ЖИ КВ АВ а КІНКСИ ЛИХ УК і, тек УВІ ШІ МУК МЕШТКАМО У ДК ТЕМУ | Бо Би ТВО ІК її Б Все Іво о и о и НН ВН й УМО ЕАТ АХІЛЛА ВВА ЕВ ОВ ЕВ ВК ВХ КУ п комнсенсуємая ОпУСЛІШЛИШКИАНИМ У ПВЛ ЗМІГ ЕКЕТАМЕМУ М МЕДАЛІ ТИ пухолідоеМить хм Я Фіг 1 хх ТІВ ТИВИ ВУ АВЕ пах ще поко Ж НМТ Е ТІЛУ пед : тіше ипні ЯЖКОВЕТІ іч У АНЯ гу З . БИ пат пшинпКр а ЕМІхІ ЕВ КО о ливе ватову МЕС замін БЕН ЖЕМУЦТМИЕНЛУ срекрлачли НО я укл про : ІННУ ІІМКМЯЗУВАБОЇМУТТ і Сонет ПУЕ ми ЯОДЕКИСВІТІЕИИ Сх пекан ХЕІУВК У АК я дмстсма пл : теку Му Ов ВК консемсуєня укОКЕЧІ пеидоямхк й Що УБІК Не ЯКУ пшави вв винна Ба швНв я я полювання еВ Не З сенси ЕКО вв пет як й здНУ дну а ру: : шеМУНА вана й ; МЕ. тн писк вно, о х даті м ЕВ МКрисУх ВВ Ме пек АФК ИОВКМН я й КУ МНН АХ Пплюн млетих ПУНКТІ ЖУ ВИХ М пре РЕцІи КН З с ПОМИТИ КИ ПІК ВЕ КН еВ: ІВ ен а м и фе огроеи КІ КИ кя ЕК х й ПІДНІЖКИ ПАК І ВОК ННІ МУКЕ ше ше мере: Ма свв КЕКВ Ми п к я: ЛК ПНЯ й ден уВ иа ня УЕИОдІЕЛоВу п Іх З нн НН пилу МИТИ КЕ М иТІ піч "кун ІМ, й ний че Мововавоє ННІ пеЕении МИХ УТІК «Ще шум пруданннини шт Мак ЕУО МО УТ дити ран м он ПулимувІ алею ИМ у ковсенкувня ОДЕСИ МИ НПК щі пк - те : КЕ СКОВКТОАІТ АХ КУ я танення не В а нан ХЕТМ ех МВВ . схпаясв М пн а І пукеови о Ммеденопеху МиСУМННИ ее ТСН ОО Ми мте межі еку ТІЩерЕ МКМ сля КЕКВ ОХ о.
Мпа ше ВН тт Мои хино ОСТ И ЖК ЕЕ НЯ на 5. БНХ ЦІ ІБІКЕКУТІВУЮСИКНОМ не АН: . о. піз ЕЕтови печу рнечя т.
Зам ЗКРИДЕИ ІК що нй ій шику ЕЕ найк -вкЗ.
МЕЗИВЕ пу дено Занине щі ї о Уваоле-бАЕ МРЕУКУВУТИ МОВЕКМУ ше Би ОО Укзюло-Вна МЕБІЖЕВУТІ УП КВ ще: НК о. . о о с ще кВ шо. тнзвзиновя пикешй вет ід ЛИ ТлКУ кити ЗРІЛІСТЬ си ией МЕиМЕпЕМтІ х ОКО кити тх, ІЛ УЕМЦ ЕК, Р коктенсусна МеЖРЖНИттТІ ВП ВЕК КХ поплідсенмиум . МАЕ ПД ЖЦя І ТЕО З нн совет: я Вин нен ЕЕ риМухнзАнА КОГО У маси І ВГаОЕІ Ко пе РПЗ ден ттьгн ян нт Е ях ши ме дичні КОКСУ поній ші БМК Х В плів вх ВКПАКІКНУХ пИЗКУ діоди ЕК УМ КІМЕ і пі «ГЕ АТТІВ ові фено си ВЕНИ КИЕОКІВ ве ТМ У КОВІ Кх пп ги нти во іл В ки ук КИ ФІТАТИТЮМЕ В КК ІІ УР й ІП ШеПуХ ШеФІОКОВЕУМ жмім мУмя ЕОР УКВ У ББІММИНО сіло па мішеиху Нео НК З ІК ВИМИ ДИКІ ой по чніван-аак хо ми еано ІЛЄКОВИХ ще; гЯТя чис рт пюиНВ . ШО ВЛА ОК ММК ун МИ ОННИ зи, МНнІЄфанОМ ВАМ МНН п ІДНИІШІУ МЕЖ мс в ї. она шеих КУЄ МЕ УКК ком не с НН дтКсьемьея ПО п яНку БУС ЕВОВи ЦЕ ВИН У ІДИ ЕМ іван ме сотвтовю я хх Іл пет» УЗИ МІКІДУВТИНІ Зк їй що мавки ел ХК пніпінчіса ли ки те ЗІКІНСКОВ У ТІ ТАК Ко КОБееМЕуЄНЯ ОСТУУ В ЦИ УК УХ могу ПТМ енимикинк ит ковани ішМУ на ТВУЖТЕ КУ їм снкх ІЗТВТЮВУ КАЗКА . о ступі ББОТЕТяВУОКо У ту щи ІАЕ МАЖУТРМЕХ п ЕВ ОХ х Ох МИ шет В песни ВА ще лення З ї пити Дт Енея ТІИАВВКТ ВТ ЖАН АТ . . . . ціп Хто зуп мтІчАЦННІКІХ Б ни шк о. с чвавій- 008 ТХВКЙКОс паронини пух пкт зх ї тт Ся З х с о. пса хи КЕ ВУ КИТ КАМКХ ПО АВ ВАМ ТВ З 55 х висилати ТЕТТЕКОЯ ТІШАНКНІШЖТАТХ ВКА тих КО х МУ ун з З щі ях ТРУБНИХ ТАТ їй й мі Б.
МО ТЕМИ ко с оте пе ФЖоДУ их ВАХ о плен Фів тах МЕЖЕУХ ПАКЕТУ про зр ГРМ ТМ ОК У УтіІої5-035 т виш с Бе НіпІВеІтА ТЕМИ ТКу о пече е ПТМ ЕВ КАІКУ АВВІ РО Вомовнортня ТЕУЗЕЯ их Кт Ктт х мчоеноустнях пастндовить й щк ф ІГ. 1 іпродовження) х
ТЕКТИ ЛЕ й Н ІАЕ КМ: КИ ТИМИ ВИМИ ГНЕ ВИКО пут МЕ ек КК оп кни КИ ин А ВОВНИ КЕ пух Ки ЛКК КІВ пк ви Мини Ки КК я КА о а М М В чим МІ ДЕК КВК МКК А УКХ ЖЕ кутя ШІ ту де ок вику и КК ПК ин ІВ ТАЛИХ ТУШКУ КАЖЕ МИ СИМ ИН ЖИМУ МІК МК КТ ТК МУ я ДНК МІРИ МОЖУ КАМ КИ ВИТ ХК НЕК НКАУ КИ КОВІ МАВ АКУКЩ МИША НИ АК ПИТ ЕК ВЕ ВИМ ЕТ ВИК КК СУМ ни ко пок шт УНК МШП НИМ КН щи кН ММК оо Мини НКТ МІТКИ КЕ ТЕМ Ж БЕК ТИН КИ педиЦДНте Е с З пити или ККУ КОН ди МИЛИ ШК ІМЛ ти МІ МКК НМТ т ДИ МЕЖІ КЕКВ ТИ МВВ КК КМ ІТ МКМ ПИ ЖЕ КЕ ЖИМУ ХІД ТЕ ТИМИ КН КИМ КК ИН КІ ИККИМ и Ш КАМ МІДІ К ЕІ КУТИКИ КК ІК КВ КЕ М ВКА ТЕ КІ ТИМ КОЛУ У, УБІШЕ ЧЕМ СМІТ ТИША В КН В І ШМК КОМ Е КІ МІ ВИТ В Он М НН В в Ки НЯ УМ ДИТИ ТИ ДІМ МИ АКА КОЛО ДОПИТ МКАС МТК ДОКИ КОМИ ЖЕК КПДЮ ТО п и КН ОН ИН Хо Ко в В в в ОН нин СОУ НЕЮМА МКК МИТИ КЕ ОД ЕЕ ЛК Ж КИШКИ Х Я - я ІЛИК й ПДК ПИ МІК, осені в м у В ННЯ а Кк в НВ о НН МЕТКИ КАМИ ЕЕ РЕВИКК В МЕ ВШ ВИК МИ ПУЛ Ю Ки ЕПІДИДИМІТ Е ВПЛИ КЕ ТАЖ трлн МЕ ОК ВІВ ІМ КИ ВИК В УДК МИТИХИИ о МКМ МИТИ КАШ ВИПИТИ ВИК КІМ КО КОТ КИТИ УМ ІДИ ІМ у КІН КК КАВИ КЕ КМККШИ ЛЕ ДОМИ КУКИФМОКУТИ МІДИММІШИ УК КК НІККОЛО МЕМ ІМК
ПДВ. у в о В Ви я ПММ ТЕ ОККО КО КК ПДК КЕ КК КВ КУ ХК ЕК ОП ВДВ УТ Е КИ ВХ ВЕЖ ПЕОМ ВИДИ КЕ МКК КВІТ ПІ ЛЕТИТЬ ОВ ди КЗ ке пиши Кк ВК пуп Вид ШИ МОУ С КАШЛЕМ МЕД КТ КМ ЕМ Еш ІК МКК КЛ р ДЖ КН пеня КК М им КК М ди пк КЕНЕ КВК ШК МЕ КИМ КК КК В ЕТИКЕТ ВІНОШИ УМХ ПИТИ КЛЕН КАТЕ МИ КИМ ТК ІМК ТВ МІ КІВ МЖК МЕ МОН ОМЕККУКМ КК ЕИИЕ КИКИ ТЕ ЯК оо НЕ Зо КК ИН ООН АН КН ЗВ ОК В До о УВО ВК о дк зерно ПА У Ко В В Кия и в КУ имЯ Я ОА У ов о З КЕ КОН Я ВИ В КОВО НВ о о я НооВ ДО оо о о ов о У НК и и о КК ОК Ко КУМ ПИЖМА ИАНяК ОЇ МКМ АВК КК ЕВ КОМИ ВИК КВ ІДД КИ КІМ ЕЦК ПИШИ ДОВУИТИ ЗШКИ пе ник ки им ВК шк А КК КК п пт ЛИ КТК ПИ МЕ КК КК КК ДИВА ПКЕЕ ВИД ЖИ УДК ЖЕ БЖ ЕИЕ ТИ пу, оо Я нн и Коен и и в В нн о ЕК ТКЕМИИИх Ко В МЕ НН В хутір Кене КАМ вик Види пак Ки Ж ин Му ти УМХ ПАК КИ КК ТИ ЕЕ ВИК ВКМ У ЕК ВОК ВИКЛИК ВВЕ КИТИ ПЕЖО ПДМ КУ ИЮТХ а и Вк ХОМ КУ ЄМ. КО у и ие ОНИ и и В ВВ КУ Я поли ените ЕКОН КК МЕТОЮ К ТУ КК ВОАС ОВК КИНЕ ЕЕ пок ВХ Кирик пиво пив ПК ПВИІ КЕ ШИПИ І ППО ШК ПИ ХЕ ТИМИ ІД КИ КИМ ИН МИ КМТ ЕТ ЛИ КА МІВ МЖК МУКИ ПІКУ ТИКИ лю УМ ЛИВИХ ДЕ КК ПИТИ КИ ЕК ГУК ШИК ТИ КУН З З Доки оо ЯКО и У В КО о В о ОН НН они КОВКИ ВОУММО Ви а в и КК у и ОК ПИЛА НХМе К ДЕМО КИШ КК КД ВИТКИ КК ЕМВ ЕЕ МЕ ХЛ ОЛИВКИ БЕ ВЕ ТІ МИ КК ТКТ КД Ки Кури ЗІ ПМЖ ТА МК КК КМ ЕЕ В ХЕ ПІК НК КТК ВК ТТЛ, РАЛІ СИМ КИ КЕН т Ви и НКИ КЕ, МЕЖА уТНВ ДЖЕМИ ВМІТИ К МКУ ПК ШНЕК ММК ЛОКТКДОВНКИХ їЕ | 2 І г,
МОЖ ітІ те ПЕШМЕОИ КЕКВ ДЕК дн о ВВ МОНА еНЕО МОНО НЛО ЕК ВЕ КА МО ЕН КЕ оЗуихаеви: МОМ НЕ В о ВВ ДК КЕ Кт НН и НО и В Н ВІЖОС ННЯ «рувінеВка МИММув и КЕШ Е ОА КТК ПУ КЕ ее НН и ОН нев ПЕД ВМ ОА ДВК КЕ КИ Я ВОК КЕНЕ НН в и Я ня Зал ВиКтМ : Н й ее в в ви ЗО ПЕКИ ВА АВ В КЕК ВКЕ КК КК Е ВЕМ КК К ТК ТАКЕ ШМК фКЕОКВУ ВК АК КВ ВВЕ ТЕ КЕН АЯ МИЛЕ З НАШ КВК ЕМ ККУ КК ВЕ В ВМТ ЕК КИ, ЖК ННЯ БАБИНЕ ВЕК ЕК НЕ МК ОАЕ СКИТ СО НН КК В ТУ в ШИХ тТКОМІх Но в ан ЩЕ КЕТІПЕИТИМІШИ КОМИ КуФУМ ОЇ ПЕКІН КАК КВи КТЕЕЕКЕКЕАМИИ МІ ТЕМ ВІ ЖК МУ ИДОСИК, й
ОБУ КІЕОЕ КІФОЗ АКУЕ ВеИНЕК ЕФЕ УОЗ МЕМ КПК ДК ПМК КПК ИНЕ ПМК КД ПНІ КО М
ЗП НТИ ВИМ КК КВ ВК КВК В КАК ВОК УК КНЯ Ер ММК К ЕК МЕ МКМ ІК ТОНИИКИІ МЕЛЕ КЕТОИ МНЕ МОВА ОВ Ве КО ВВЕ ККД АМНЕКМВ НК ЕН ІМ ДО МК НИВИ КИ КК ЕК ТЕНТ КІ КЕ шій МИНЕ ВЕ КВ АВК МКК Ву ЗЕ ОНУКИ КВК КМ КД ДИ ПИ КИ ТЕ УНУБІКУВД ЕМ МІН ШИМОН КН КО ВК КВ Ве КК КАНОН МОЗ Нв в Ко й кожну ших МІДЯЕЄКИ. шо - ПОЛК ВЖИ КНя нен СЕ Ен ХА Бод КЯ що ІМК ИХК, зи МЕ
АН кмеНН оо он М не КОШИК.
КД я ХК ШМК АВ Ки ПІШОВ КЕ З ПУЕТАИКИ ВЕ їх ен НН М НН: ТЮДПМНУЮ о ПЕК АКТУ КЕКВ КА ВА АВК КК КАХ ще КОРІВ АКТУ ІК и я вини си сс к МЛК ен Х Би з ТЕ ЗЛИМИ КВ МЕТ ІКОНКИ ПЕКТИ ДКУЮМИХ ТК ДСИМИЇ, ЖЕ. я МЕДІЯ ОКР ВЕМІ МАВ МКУ КЕ МЕ МКК КЕ КВК ВИ ЕК КАК ПЕАКВМНК КВК КУКА КЕ КЕ АД КН КТ КОХ ее НН ок НЯ БІВ МЕККА ЕЕ ЕТ КЕ ЕК КВЕ КЕ КЕ Тя о В в НН КН я МИНЕ ВНИТх ТЕ т т.
С ПО ї й ч. - : Сг. є іпробоюженняй
. Меаза пряну кс кн -е- по ЗУ тег Н -9- 05-х 5.2 й і де зе мквОчЕ баша о» КН г ке пИЩООХ хх Е Я р працює хо її | я й -я-- ІВ ЯО ех КЕ Н Х Ж І Йо чен 1 ОХ сю дея Я Кг ій ї БЕ жк -е Вр ЯІНЯ ї5а : Кт я дика ее риюдекікОо ЗО ї Тл спа маклими ан и ння иа живи Кая іл оЄ х ож Ку їні Маова клону бо тя чн ШврИЗХ НУ еВ 1.55 --- пед ІБ» зо гу Й нан сне ДОВ іл но й -ее Шо пОК ї ваг «ето «меми ще Хо зацик рин як СО ОЮ ра ; овечя -к- МеВ 1555 сову ее й же ріс -жо дрЕеІ 1297 ще емо Е г їх З з ТУ д й й Ко Ж її ахашелому жу, с: чек Ну ке замі о ся- і кдА. х ЗУувь ! й яке царазютиму ЗІ Е зх р зе що озецоЮ таз га й Ка я -к- цаоЯх Ки Х ЗЖКИК й Шк ся фі цех зе зани я Так й ЯН вотжоватвютя ле вот ох Бе ее зх не НИ мой Кк й : й чле дрхствя п.ясх ки и М ВИС вн 7 їн) Й тізава клсеу Баг їхове те шаиаюати ня -к- рів сх Й а ке тв рем щу МФО р Ки: те ві юх дат - мок т ен МУКА, Ген Е о ня ко Вр ове сих хазяї до ре тн З КУ Ба я. МА НІ ; ах й с році їх з ААдА ля вузах ря а з Р шою фі ХВ зт де У т (З х ее фазі їх зя я. У о КЗ їхмі -
Фіг. З ан Її впО00оЗ я ; ШО 10 мкплал СТ О.5 мкгуюл Зо00 ща о і Ї. ж йО00б | Б. і К Но: ЖІ КЗ і з ї На КЕ їЯ І топос | К НН В НЕ! дай ї і ; ! Кі: с бу ща у ок у, т -х її Е х ка мою ооо со ово у ку Коко вльдрМ МА юю МАЮ я ОА ОК СИ у да К кидка Ку ОЙ ьо нан г х З Я Щи 2 хм фунт 4 ке че оо - Фіг 4 ж вою Ес ЕЄСке | ехо знавенх як -1005 рев рвЯ я КУЩ ев 0 ЕВ.
І щ. -Б05 оо ЗОВ; Як і хх ; вах НИ пс ПТН ролю я -к 045 501545 12563 У їх м ке х ж гру В, дк дер Я їі на НЕ. керолін ев амтитло проти семехімколалі без ковкуруючого внтитиа еВ Ех --р в 1 аа ія й ; а -1883 003258 14575 ве | й -об по о28 17543, Коронки чо | дк п.05671 115025 ші Кс нн Никон е ож ХК лек а ера 01345 12699 | : -ерійї 5.055850 8350 о ре мом ів пр че у ЖО00Мення а В 001530 155555 щи ж и - У ТУ З е й сваз НО света 00 ачтимле прати сек імегімні без конкуруючето внтитйя ее вини ме нн - ЕНН 2 Я -| 5 р
В. В ск и НОСІ х Зх " Ка "ох |Г0ОВ хо я й - | ОБ? я Ши З черга 0010580 п х макримальне ща а.1 055 чо ши нс Ве НН з ; 5 0.1584 я зе ж че о 5 й а ей м М й антутійо проти є-Меківкгмл) запо» ши ШИ добове - Б Я ВЕ: в Ж век и Ж - 052 105768 Що Ех зоенев а се ак 3 реушнни ме жо ах ; й БОС А ІННИ Коня ее їх - 0568 поле г ск. КІ КА 5 в максимальне ще «роб МО ОК. бинймНй 71058 105526 ша ер101 00105976 5 и ТУ ж 3 З ФУ «ЇУ гу з «е Ки я г вититіво проти се мкг/л х К00 риття каяття й У І за ЯН і ОХ , 1 й щожо во , ЕЕ » ! Ї щей Я хх є Я ща з : сЩ у З еВ : НІ : ! - 5 ЩО : - й | |: в Так ні Ї І ! , КО пані Пе, мії -з6 М ; Ки Я со ку ей ту ки ки ск ОА У Оу о ОК до Кн и м о АК ди и, бу ке о обои й, МО Вени Жити А Хе и и Б и АК пев Б ша Як жави Фа М В о з Ко в С СК о С У "Б, ХА в ях Зорю хі ! ЕОВ04 х ЕЕ; МОЖ для о ех КеТ3: у їх й С ШНани Ш ; ж шик : ; ОЗ Е - 1 | ! ниж вон ; Ї ! ї | І ! І В КК Лео але ку Лк и З ї х ся и Км и и ем шими а и МА СК и я Ко ее, ОКО Од Да САС их ому у и м нн ко нм о кни АН КУ : МУ ик У ик й и кА м В А З
Фіг. 7 Модель ксенозрансопознтату КР з. ь шик Ме ЗМ Ме НК З Я Фр тити тили нчихчтчехнчичеххихиния Е- ЗО-СМЕНОСВ М» ня: іщЩОЗ-1916-088 ва ї500 ПІ «же КОМ ЦУНІНОВЕ ха ГУШ; - ЕР 1О18О58 вх Не ЕТО у Н яке ЩО ОЦИВЗТННЕ її й - ЕЕ / /й ж ік ПюТЕВІчНИЙ кантроль є ЩО ГИ; Ж аю ОЛУНИОВОВ Е й і Ї вас Вій Канн жа, 00000 СІблобка о мигумнох г; 23 іб во ва «ча Поробка 00 мигмич Днів поля інокуляції пухлини
Фіг. 8
Мюдель коенетознедивнтату КЕЯ Гозмів пухлина при виживанні «500 мМ ! і | : - ЛУ НЬООВ ЧЕ ва ЕШі че білою УМ 22 124 щи нд Ве Ше БМ ж зх: 1. ТО18-06 хх : ВОЮ ВО дойе «ж» сл 1015-08 Й ті ее ат Ба ух - А ее БНО НЕ хх от 4 лу сум я ОО. св. іо БОВ р В зо І ; «а. ЗО ЛНИЧНИЙ контроль Му : --
Н р. г в хо 0 0 во Ще! Динепепв інокунеції пухлини
Фіг. З Модель ксенотранолантату МЕ - Медізнве значення - за зі дон «а : «кує ІЗОТНТИчНИЙ КОНЮ» х В ц в ча зд-1018-003 з пе ни - я рн ж в -1015-088 ш БМ Ба -к що Я зу ня ; чн 1 ТОВ ОБ у Н Са паро аа в ан лей як а ОН -НЕ г і й до вове й що І ке! т де ДЬ я З носилки виска рахункових 74836 42 4555 Дніа пря інокупиції пухлини
Фіг. 10 Місделе кехнитрянопавнуату МК: - хамие пухлини при виживзнні «у виз ДУ фоннннннннтянннтттння : хо. іВоткІчний кокіропь 5 яо- Й | та ЗТ. НОТ ВОД Же 5 й заке ВСУ ОТ В-ОБ8 БК ва. 5 Бін і яке р 10184099 пе м Й Ат ха я ня -х ' га е- тах ІОВ УНН ве шани Ши Я її Н я 5 Й І
ТО. ЖОЯ шк я о ! сон З бно б о7 ж 2 9 35 45 ЯЗ 55 83 Дявлюнпн моКуляції пухлими
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA201000191 | 2010-03-10 | ||
| PCT/EP2011/053646 WO2011110642A2 (en) | 2010-03-10 | 2011-03-10 | Monoclonal antibodies against c-met |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA112157C2 true UA112157C2 (uk) | 2016-08-10 |
Family
ID=56707087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201211624A UA112157C2 (uk) | 2010-03-10 | 2011-10-03 | МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ДО c-Mеt |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA112157C2 (uk) |
-
2011
- 2011-10-03 UA UAA201211624A patent/UA112157C2/uk unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7034204B2 (ja) | Ｃ－ｍｅｔに対するモノクローナル抗体 | |
| EP3159358B1 (en) | Human antibodies against human tissue factor | |
| UA122395C2 (uk) | Антитіло проти tigit | |
| UA120753C2 (uk) | Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20 | |
| BR112020007725A2 (pt) | anticorpo anti-pd-l1 e usos do mesmo | |
| UA125611C2 (uk) | Біспецифічні молекули, що мають імунореактивність відносно pd-1 і ctla-4, і способи їх застосування | |
| UA119319C2 (uk) | Гуманізоване антитіло до cd134 (ox40) і його застосування | |
| UA118013C2 (uk) | Комбінована терапія з використанням антитіла до клаудину 18.2 для лікування раку | |
| UA121914C2 (uk) | Молекула, що зв'язує pd1 і lag3 | |
| UA126964C2 (uk) | Конструкція біспецифічного антитіла, що зв'язується з дпб3 (dll3) і кд3 (cd3) | |
| US9127061B2 (en) | Anti-human P-cadherin (CDH3) recombinant antibody | |
| UA114883C2 (uk) | Антитіло до рецептора епідермального фактора росту-3 (her3) | |
| UA119571C2 (uk) | Антитіло проти lag3 і його антигензв'язувальний фрагмент | |
| UA123428C2 (uk) | Спосіб лікування раку, що характеризується раковими клітинами, які експреcують cldn6 | |
| EA017086B1 (ru) | Человеческие моноклональные антитела против о8е и их применение | |
| UA128182C2 (uk) | Агенти для лікування експресуючих клаудин ракових захворювань | |
| UA128302C2 (uk) | Антитіла, специфічні до клаудину 6 (cldn6) | |
| UA115969C2 (uk) | Антитіло для лікування ракових захворювань, при яких експресується клаудин 6 | |
| CN113825771A (zh) | 针对密蛋白18a2的抗体及其应用 | |
| UA128575C2 (uk) | Способи та композиції для прогнозування терапевтичної ефективності лікування онкологічних захворювань та прогнозу онкологічних захворювань | |
| WO2011004837A1 (ja) | 抗癌活性を有する抗体 | |
| WO2007114550A1 (en) | A novel monoclonal antibody specific to the l1cam, a hybridoma producing the same and a method producing the same | |
| EP2990418B1 (en) | Functional monoclonal antibody against heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor | |
| UA112157C2 (uk) | МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО ДО c-Mеt | |
| JP2021046362A (ja) | 細胞外のＰＫＣδを標的とする肝癌細胞増殖抑制剤及びそれを含む新規肝癌治療薬 |