TWI827841B - 自動顯微鏡聚焦系統、裝置及方法 - Google Patents

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TWI827841B TW109114589A TW109114589A TWI827841B TW I827841 B TWI827841 B TW I827841B TW 109114589 A TW109114589 A TW 109114589A TW 109114589 A TW109114589 A TW 109114589A TW I827841 B TWI827841 B TW I827841B
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馬修 普特曼
法登 賓斯基
丹尼斯 沙勞可夫
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美商奈米創尼克影像公司
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Abstract

一種用於光學顯微鏡的自動聚焦系統，其藉由使用至少兩個偏移聚焦相機來促使更快地聚焦。每個偏移聚焦相機可以置於影像成形共軛平面的不同側上，使得它們的銳度曲線在影像成形共軛平面相交。樣品的焦點可以藉由使用由偏移聚焦相機所拍攝的影像所確定的銳度值來調整。

Description

自動顯微鏡聚焦系統、裝置及方法
本揭露關於用於自動顯微鏡聚焦的基於影像的機構。
用顯微鏡觀察的大多數樣品具有橫跨其表面小的高度變化。然而這些變化經常對人眼不可見，它們可能導致由顯微鏡捕獲的樣品的一部分的影像失焦。
顯微鏡可以建立可用聚焦影像的範圍稱為景深。顯微鏡必須將樣品的一部分保持在其景深內以產生有用的影像。然而，當從觀察樣品的第一部分過渡到觀察樣品的第二部分時，樣品的高度的小變化可能導致該第二部分在景深之外。
像是影像對比度、解析度、熵及/或空間頻率內容、等等中的不同的銳度測量可以被使用來測量由顯微鏡捕獲的影像的聚焦的品質。通常，當樣品為對焦時，所捕獲的影像將呈現最佳的銳度品質(例如，大對比度，高範圍的強度值以及銳利邊緣)。可能被使用於確定樣品何時為對焦的不同銳度測量通常需要在顯微鏡物鏡鏡片與樣品之間的不同距離(即相對Z位置)捕獲一系列的影像，並且測量所補獲樣品的銳度值直到影像以對焦顯現。因為在相對Z位置 處測量樣品的銳度值通常不會指示需要將樣品帶到對焦的調整方向(即，是否增大或減小距離)，所以，比起如果調整方向為已知，更多數量的影像和調整通常被需要來聚焦影像。這增加了每個樣品的總顯微鏡掃描時間，這在高通量掃描應用中可能是有害的。
而且，因為銳度測量可以在接近聚焦位置的相對Z位置上具有相對恆定的值，所以簡單對於銳度曲線的峰值的尋找也許不能準確地識別聚焦位置。
因此，用於自動顯微鏡聚焦的新機制是需要的。
根據一些實施例，用於自動顯微鏡聚焦的系統、裝置和方法被提供。在一些實施例中，用於自動聚焦顯微鏡的系統被提供，該系統包括：一物鏡；一平台，用於將一樣品置於一第一影像成形共軛平面上；一第一聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於一第一偏移距離的一第二影像成形共軛平面的一第一側；一第二聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於一第二偏移距離的該第二影像成形共軛平面的一第二側；其中該第一偏移距離和該第二偏移距離被確定，使得在該物鏡和該平台之間的一相同距離處，由該第一聚焦相機和該第二聚焦相機的每一個所捕獲的該樣品的影像的銳度測量在該第二影像成形共軛平面相等；一主要照明源；一成像裝置，被置於一第三影像成形共軛平面上；以及一硬體處理器，被耦合到該第一聚焦相機和該第二聚焦相機，其被配置為當使用該第一聚焦相機的該樣品的一銳度值等於使用第二聚焦相機的該樣品的一銳度值時，確定該樣品為對焦。
在一些實施例中，用於自動聚焦顯微鏡的方法被提供，該顯微鏡具有至少一個物鏡、用於將樣品置於一第一影像成形共軛平面上的一平台、一第一聚焦相機，該第一聚焦相機被配置用於聚焦，被置於在一第一偏移距離的一第二影像成形共軛平面的一第一側上、一第二聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於一第二偏移距離的該第二影像成形共軛平面的一第二側、一主要照明源、一成像裝置，被置於一第三影像成形共軛平面上，該方法包括：設定該第一偏移距離和該第二偏移距離，在該物鏡和該平台之間的一相同距離處，使得對於由該第一聚焦相機和該第二聚焦相機的每一個所捕獲的該樣品的影像的銳度測量值與在該第二影像成形共軛平面相等；以及當使用該第一聚焦相機的該樣品的一銳度值等於使用第二聚焦相機的該樣品的一銳度值時，確定該樣品為對焦。
5:成像裝置、成像相機
6:成像裝置影像成形共軛平面/成像共軛平面
8:樣品影像成形共軛平面/樣品共軛平面
10:成像顯微鏡筒透鏡
11:濾鏡
13:照明器
14:視場光闌
15:分色鏡
16、26:分束器
17:截止濾鏡
18:聚焦殼體
20:稜鏡
21:視場光闌(F-stop)影像成形共軛平面/視場光闌共軛平面
22、24、45、47、49:透鏡
23:精聚焦致動器
25:物鏡
28:鏡子
30:平台
32:聚焦機構
33:定位裝置
35:致動器
40:次要照明源
54:照明單元影像成形共軛平面/照明共軛平面
55:聚焦圖案
60:分色鏡(dichroic)
62:虛線、成像光束
63:虛線、聚焦光束
65:主要照明源
70、72:偏移聚焦相機
71、73:傳感器
76、77:導桿
79:負方向
80:聚焦單元影像成形共軛平面/聚焦共軛平面
81:正方向
100:自動聚焦系統
105:輸入裝置
107:控制器介面
108:控制系統
110:控制器
120:通信
130:Z位置
135、140:箭頭
136、137、141、142:線
138:交點
200:照明單元
300:聚焦單元
600、700:過程
f1、f2:偏移距離
MA1、MB1:斜率
S:樣品
SA1、SA2、SB1、SB2:銳度值
Z1、Z2:位置
第1A圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用兩個照明源的自動聚焦系統的示例。
第1B圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用一個照明源的自動聚焦系統的示例。
第2A圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用兩個照明源的照明單元的示例。
第2B圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用一個照明源的照明單元的示例。
第3A圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用兩個照明源的自動聚焦系統的聚焦單元的示例。
第3B圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用一個照明源的自動聚焦系統的聚焦單元的示例。
第4圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的成像裝置的銳度曲線的示例。
第5圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的用於兩個偏移聚焦相機的銳度曲線的示例。
第6圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用自動聚焦系統(例如第1A圖和第1B圖中所示的系統)用於執行自動聚焦的過程的流程圖的示例。
第7圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的使用自動聚焦系統(例如第1A圖和第1B圖中所示的系統)用於尋找影像成形共軛平面和校準兩個偏移聚焦相機的過程的流程圖的示例。
根據所揭露的標的主題的一些實施例，提供了用於樣品的自動顯微鏡聚焦的機構(其可包含系統、方法、裝置，裝置等)。
第1A圖及第1B圖示出了根據所揭露標的主題的一些實施例的自動聚焦系統100的示例。在高水準上，根據一些實施例，自動聚焦系統100的基本組件包含用於提供光的照明單元200、用於尋找樣品的對焦平面的聚焦單元300、照明器13、成像裝置5、物鏡25、平台30以及包括硬體、軟體及/或軔體的控制系統108。
自動聚焦系統100可以被施行為任何合適類型的顯微鏡一部分。例如，在一些實施例中，系統100可以被施行為使用透射光或反射光的光學顯微鏡的部分。更特別地，系統100可以被施行為從俄亥俄州Cuyahoga Falls的Nanotronics Imaging,Inc.可得的nSpec®光學顯微鏡的部分。雖然以下描述涉及反射光照明器13，但是本文描述的機構可以是不使用反射光照明器的顯微鏡的部分。
根據一些實施例，系統100可以包含一個或多個物鏡25。物鏡可以具有不同的放大倍率及/或被配置為以明場/暗場顯微鏡、差分干涉對比(DIC)顯微鏡及/或任何其他合適形式的包含螢光的顯微鏡來操作。在一些實施例中，被使用於檢查樣品的物鏡及/或顯微鏡技術可由軟體、硬體及/或軔體來控制。
在一些實施例中，精聚焦致動器23可被使用於沿Z方向驅動物鏡25而朝向和遠離平台30。精聚焦致動器23可被設計用於物鏡25的高精度和精聚焦調整。精聚焦致動器23可以是步進馬達、伺服馬達、線性致動器、壓電馬達及/或任何其他合適的機構。例如，在一些實施例中，壓電馬達可以被使用並且可以驅動物鏡0至50微米(μm)、0至100μm、或0至200μm及/或任何其他合適範圍的距離。
在一些實施例中，XY平移平台可被使用於平台30。XY平移平台可由步進馬達、伺服馬達、線性馬達、壓電馬達及/或任何其他合適的機構驅動。在一些實施例中，XY平移平台可以被配置為在任何適當的控置器的控制下在X軸及/或Y軸的方向移動樣品。
在一些實施例中，包括致動器35的聚焦機構32可被使用於在Z方向調整平台30朝向和遠離物鏡25。致動器35可被使用於進行例如0至5mm、0至 10mm、0至30mm及/或任何其他合適範圍的距離的粗聚焦調整。致動器35也可被使用於移動平台30上及下，以允許不同厚度的樣品被放置在平台上。在一些實施例中，致動器35也可被使用於提供例如0至50μm、0至100μm、0至200μm及/或任何其他合適範圍的距離的精聚焦。在一些實施例中，聚焦機構32也可以包括定位裝置33。定位裝置可以被配置為及時在任何適當的點確定平台30的位置。在一些實施例中，任何適當的位置(例如，當樣品為對焦時平台的位置)可以被以任何適當的方式被儲存以及稍後被使用來將平台帶到那個位置，即使在自動聚焦系統100的重置及/或電源重啟時。在一些實施例中，定位裝置可以是線性編碼器、旋轉編碼器或任何其他合適的機構，以追踪平台30相對於物鏡的絕對位置。
在一些實施例中，自動聚焦系統100當被適當地聚焦和對準時，可以使用沿著經由顯微鏡的光學路徑而發生的一組共軛焦平面，例如影像成形共軛組(如第1A圖及第1B圖所示者)。影像成形共軛組內的每一平面與該組中的其他平面共軛，因為當經由顯微鏡觀察樣品時該等平面同時為聚焦並且可以彼此疊加地觀察。自動聚焦系統100中使用的影像成形共軛平面的組可包含聚焦單元影像成形共軛平面80(“聚焦共軛平面80”)、成像裝置影像成形共軛平面6(“成像共軛平面6”)、照明單元影像成形共軛平面54(“照明共軛平面54”)、視場光闌(F-stop)影像成形共軛平面21(“視場光闌共軛平面21”)和樣品影像成形共軛平面8(“樣品共軛平面8”)。這裡將第一偏移聚焦相機70、第二偏移聚焦相機72及/或成像相機5(當成像裝置5是相機時)置於成像共軛平面上或偏移到成像共軛平面的所有談論是指將傳感器置於成像共軛平面上或偏移到成像共軛平面 的相機5、70及/或72之中。在一些實施例中，照明共軛平面54及/或視場光闌共軛平面21可以被省略。
在一些實施例中，成像裝置5可以是包含影像傳感器的相機，該影像傳感器被置於自動聚焦系統100的影像成形共軛平面6上。成像裝置5可被使用於捕獲樣品的影像，例如，一旦控制系統108確定樣品處於焦點。影像傳感器可以是例如CCD，CMOS影像傳感器及/或將光轉換成一或多個電信號的任何其他合適的電子裝置。這種電信號可被使用於形成樣品的影像及/或視訊。在一些實施例中，成像裝置可以用被使用於觀察樣品的接目鏡(ocular)或眼窗(eyepiece)代替。
在一些實施例中，控制系統108，包括控制器110和控制器介面107，可以控制自動聚焦系統100的組件(例如，致動器35和23、主要照明源65、次要照明源40、偏移聚焦相機70和72、平台30、聚焦圖案55、成像裝置5和物鏡25等)、及通信、操作(例如，取得影像，開啟和關閉照明源、移動平台30和物鏡25、儲存與樣品相關聯的不同的值)以及由自動聚焦系統的組件及在自動聚焦系統的組件之間所執行的計算(例如，銳度計算)的任何設定。控制系統108可以包含任何合適的硬體(其可在一些實施例中執行軟體)，像是例如電腦、微處理器、微控制器、特定應用積體電路(ASIC)、場可程式閘陣列(FGPAs)以及數位信號處理器(DSP)(其任一者可以稱為作為硬體處理器)、編碼器、讀取編碼器的電路、記憶體裝置(包含一或多個EPROMS、一或多個EEPROM、動態隨機存取記憶體(“DRAM”)、靜態隨機存取記憶體(“SRAM”)及/或快閃記憶體)及/或任何其他合適的硬體元件。在一些實施例中，自動聚焦系統100內的 個別組件可以包含它們自己的軟體、軔體及/或硬體，以控制個別組件並與自動聚焦系統100中的其他組件通信。
在一些實施例中，控制系統(例如，控制器110和控制器介面107)與自動聚焦系統100的組件之間的通信120可以使用任何合適的通信技術，像是類比技術(例如，中繼邏輯)、數位技術(例如，RS232、以太網路或無線)、網路技術(像是局部區域網路(LAN)、廣域網路(WAN)、網際網路)藍芽技術、近場通信技術、安全RF技術、及/或任何其他合適的通信技術。
在一些實施例中，操作者輸入可使用任何合適的輸入裝置105(例如，鍵盤、滑鼠或操縱桿)被傳達至控制系統。
第2A圖顯示根據所揭露標的主題的一些實施例的自動聚焦系統的照明單元的實施例的一般配置。照明單元200可以包含兩個照明源，例如主要照明源65和次要照明源40。照明源可以提供在波長範圍內彼此不同的光束。在其他實施例中，照明單元200可僅包含主要照明源65，例如，如第2B圖所示。
在一些實施例中，例如，主要照明源65提供具有在451到750奈米(nm)範圍內的波長的光束，而次要照明源40提供具有高或低於被使用於主要源的波長範圍的波長之光束。例如，主要照明源65的波長範圍可以在550到750nm的範圍內，以及次要照明源的波長範圍可以在400到450nm的範圍內。只要該範圍的值是已知的，任何波長範圍的光都可以用於主要照明源65，並且可以使用已知的濾波技術從其他波長分開。類似地，任何波長範圍的光可以被使用於次要照明源40，只要該光與主要照明源65不在相同的波長範圍內。
在一些實施例中，如第1A圖所示，主要照明源65被置位使得其光在水平方向被傳輸朝向照明器13。主要照明源65可以包含聚焦透鏡49(例如，雙凸透鏡)用於聚焦主要光束。次要照明源40可以被置於位於影像成形共軛平面54上的聚焦圖案55之下的適當距離處。
在一些實施例中，聚焦圖案55可由不透明材料形成，具有從材料中切出的圖案。材料的切口區段允許光穿過樣品共軛平面8，而不透明材料區段阻擋光穿過。在其他實施例中，聚焦圖案55可以由澄澈(clear)材料形成，像是澄澈玻璃或澄澈塑膠，其上具有不透明圖案，這使得影像藉由穿過澄澈玻璃或塑膠的光投射在樣品共軛平面上。在進一步實施例中，聚焦圖案55可以為數位控制的(例如，特殊的光調變器)。
聚焦圖案55的直徑(例如，5mm)可以被調整，使得聚焦圖案55的投射小於偏移聚焦相機70和72的視野(FOV)。聚焦圖案55可以是任何合適的幾何形狀，例如圓形、矩形、三角形或六邊形，並且可以被投射在FOV的任何區域上。聚焦圖案55還可以包括一系列分離的開口，使得當光被透射經過分離的開口時，線和空間被投射跨過視野。在一些實施例中，聚焦圖案55可以被為了樣品而客製化。在一些實施例中，主要照明源65和次要照明源40的位置可以被切換。
在一些實施例中，自動聚焦系統100可以被配置為使得來自次要照明源40的光連續地被透射通過聚焦圖案55，以便將聚焦圖案影像連續投射在可以由偏移聚焦相機70及72所捕獲的樣品上。聚焦圖案影像的連續投射可以促進樣品的銳度聚焦，特別是對於透明(transparent)樣品或缺乏任何視覺可識別特徵的樣品。為了銳度聚焦，聚焦圖案55可以代替視場光闌、或者除了視場光闌之外被使用。例如，除了聚焦圖案55之外，自動聚焦系統100也可以包含可以位於照明器13中的視場光闌(F-stop)14。視場光闌14也可以被置於自動聚焦系統100 的影像成形共軛平面上。在一些實施例中，視場光闌14控制由照明源65和40所發射並且被透射至物鏡25的光的直徑。更具體地，在一些實施例中，藉由減小視場光闌的尺寸，光穿過的直徑減小了。這在由偏移聚焦相機70和72所接收的樣品的影像周圍建立暗輪廓，並且可以被使用於調整樣品的聚焦(例如，藉由移動樣品和物鏡彼此更近或者更相離)。在最大測量銳度的點，樣品被認為是對焦的，並且視場光闌可以被打開至更大的尺寸，以允許由成像裝置5對樣品的成像。然而，減小視場光闌並將其回復到其原始尺寸花費時間(例如，2-5秒)並且會減慢掃描過程和通量。
聚焦圖案55可以被置於自動聚焦系統100的任何合適的影像成形共軛平面上(例如，在次要照明源40(如第1A圖及第2A圖所示)上方，或者在視場光闌14處)，當需要時，只要適當的濾鏡(例如濾鏡11)被使用以確定聚焦圖案55不被投射到成像裝置5上。例如，如果聚焦圖案55被置於視場光闌14影像成形共軛平面上(代替視場光闌14)，那麼濾鏡(filter)會是需要的。在一些實施例中，頻帶濾鏡可以位於視場光闌影像成形共軛平面上(代替視場光闌14)，並且以圖案切口形式的聚焦圖案可以在頻帶濾鏡中建立。更具體地，頻帶濾鏡可以被選擇，其透射在主要照明源65的相同波長範圍(例如，大於450nm)內的光並且阻擋與在次要照明源40的相同波長範圍(例如，小於或等於450nm)內的光，除了在聚焦圖案55區域中。換句話說，除了在聚焦圖案55的區域中之外，與在次要照明源40的相同波長範圍內的光將被阻擋，這將允許來自次要照明源40的光被透射通過至偏移聚焦相機70和72。
在一些實施例中，當使用單個照明源時，聚焦圖案55可以為數位控制的(例如，使用特殊光調變器)並且可以被置於例如自動聚焦系統100的視 場光闌影像成形共軛平面上。更具體地，在一些實施例中，當數位控制時，聚焦圖案55可以被控制為在預定間隔被去能(disabled)，使得成像裝置5可以形成表示樣品的影像及/或視訊的電信號而不受聚焦圖案55的干擾(在完整的視野內)。在一些實施例中，成像裝置5可以被配置成使得當聚焦圖案55被賦能時，它不會形成此種樣品的電信號。
注意的是，在一些實施例中，任何合適的照明源可以與照明單元200一起使用，像是用於次要照明源40的400nm紫外準直發光二極體(LED)以及用於主要照明源65的5500K白光準直LED。在一些實施例中，雷射或螢光燈可被使用於主要照明源65及/或次要照明源40。
在一些實施例中，聚焦透鏡45(例如，60mm聚焦長度雙凸透鏡)可以被放置在次要照明源40和聚焦圖案55之間的合適距離處。此外，另一聚焦透鏡47可以被放置在聚焦圖案55的另一側的合適的距離處。在一些實施例中，透鏡45和47與聚焦圖案55的距離可以基於顯微鏡的光學特性，以確保光的聚焦和聚焦圖案55的位置是在共軛影像成形平面中。
在使用兩個照明源的一些實施例中，在光行進至照明器13之前，分色鏡(dichroic)60被放置在主要照明源65和次要照明源40兩者的光學路徑中。如本文所使用的，分色鏡可以指鏡子、分束器、濾鏡或光束組合器，其透射已知的、指定的波長的光並且將被透射的光與另一已知的、指定的波長的光組合。注意的是，前述裝置的組合可以被用於反射和透射所需的照明源和波長。在一些實施例中，具有特定截止波長的分色鏡被選擇，以便反射由次要照明源40發射的光的波長，並且允許來自主要照明源65發射的光的波長穿過。例如，如果次要照明源40發射400-450nm的波長範圍內的光並且主要照明源65發射 550-750nm的波長範圍的光，則450nm截止分色鏡(亦即，反射具有450nm及以下的波長的光的分光鏡並且允許大於450nm的波長的光穿過，從而組合光束)可以被使用於反射來自次要照明源40的光並且允許來自主要照明源65的光穿過。分色鏡60可以被設計用於45°入射角，使得被拒絕的來自次要照明源40的光以90°的角被反射並且平行於來自主要照明源65的光路行進。
在一些實施例中，主要照明源65可以是被使用於成像裝置5的光源，並且次要照明源40可以是被使用於在偏移聚焦相機70和72的聚焦傳感器71和73上成像樣品的光源(如第1A圖及第3A圖所示)。
注意的是，在一些實施例中，任何合適的分色鏡、照明器、照明源、聚焦透鏡、傳感器以及聚焦圖案可以與照明單元200一起使用。在一些實施例中，這些組件的任何合適的安排可以與照明單元200一起使用。在一些實施例中，照明單元200的組件可以以任何合適的方式安裝到照明器13，像是藉由使用導桿(以類似於如何偏移聚焦相機72示出被安裝到第3圖中的聚焦殼體18的方式)(如下面描述)，以允許可變的幾何。
第3A圖及第3B圖顯示根據所揭露標的主題的一些實施例的自動聚焦系統的聚焦單元的實施例的一般配置的示例。聚焦單元300可包含兩個相機：第一偏移聚焦相機70和第二偏移聚焦相機72。這些相機可包含例如電荷耦合元件(CCD)影像傳感器、CMOS影像傳感器、成像傳感器的另一形式、視訊傳感器及/或可以形成表示樣品的影像及/或視訊的電信號之任何其它合適的傳感器。在一些實施例中，此種電信號可以被控制系統108儲存和分析。
聚焦單元300可以被安裝在照明器13和成像顯微鏡筒透鏡10之間的區域中。該區域可以稱為無限空間。在一些實施例中，聚焦單元300可以使用適當的組件安裝在其他定位，以使所選擇的定位適應系統的光學特性。
第一偏移聚焦相機70可包含傳感器71，其被置於對聚焦共軛平面80的偏移距離f1處。偏移距離f1可以是於正方向81中或於負方向79中。第二偏移聚焦相機72可以包含傳感器73，傳感器73可置於對聚焦共軛平面80的偏移距離f2處。偏移距離f2可以是於正方向81中或於負方向79中。
如第3A圖和第3B圖所示，第一偏移聚焦相機70和第二偏移聚焦相機72被置於聚焦共軛平面80的不同側上。例如，在一些實施例中，其中聚焦共軛平面80是垂直的，第一偏移聚焦相機70可以置於聚焦共軛平面80的左邊以及第二偏移聚焦相機72可以被置於共軛平面80的右邊(如第3A圖和第3B圖所示)，且反之亦然。此外，第二偏移聚焦相機72可以位於第一偏移聚焦相機70的之上或之下。在一些實施例(未示出)中，其中聚焦共軛平面80是水平的，偏移聚焦相機70可以被置於聚焦共軛平面80之上以及偏移聚焦相機72可以被置於聚焦共軛平面80之下，且反之亦然。此外，第二偏移聚焦相機72可以位於偏移聚焦相機70的右邊或左邊。如連結第5圖至第7圖所討論者，偏移聚焦相機70和72可以被置放使得由偏移聚焦相機70和72捕獲的樣品的影像及/或視訊的銳度值在聚焦共軛平面80處將是相同的。
第一偏移聚焦相機70可以沿著導桿77或任何其他合適的結構移動，以便調整第一偏移聚焦相機70的偏移距離。第二偏移聚焦相機72可以沿著導桿76或任何其他合適的結構移動，以調整第二偏移聚焦相機72的偏移距離。
聚焦單元300也可以包含兩個聚焦透鏡24和22。聚焦透鏡22可以被放置在與第一偏移聚焦相機70相同的水平光學路徑中，並且聚焦透鏡24可以被放置在與第二偏移聚焦相機72相同的水平光學路徑中。在一些實施例中，聚焦透鏡22和24實現與顯微鏡筒透鏡10相同的焦距，以確保傳感器71和73每一個當它們被置於聚焦共軛平面80上時均為對焦。顯微鏡筒透鏡10可以包含用於將樣品的影像聚焦在成像共軛平面6上的透鏡(未顯示)，使得當成像傳感器或目鏡被置於自動聚焦系統100的影像共軛平面6上時，樣品為對焦。
注意的是，在一些實施例中，透鏡22和24可以是雙凸透鏡或任何其他合適類型的透鏡。在一些實施例中，透鏡的焦距可以為基於顯微鏡的光學特性。
如第3A圖所示，在包括兩個照明源(由一對較長的虛線62和較短的虛線63表示)的一些實施例中，聚焦單元300也可以包含被置於光從樣品反射離開的光學路徑中的照明器13上方的截止分色鏡15。分色鏡15可以被置位使得從在分色鏡的截止下方的樣品反射的光以90°角朝向第一偏移聚焦相機70反射。具有特定截止波長的分色鏡可以被使用，以便反射由次要照明源40(“聚焦光束”)所發射的光的波長。例如，如果聚焦光束為在400到450nm的範圍內，則450nm截止濾鏡可以與聚焦單元300一起使用，以便將聚焦光束反射到第一偏移聚焦相機70。在一些實施例中，分色鏡15僅被使用於包含次要照明源40的實施例中。
在包含兩個照明源的實施例中，截止濾鏡17可以被置於分色鏡15和分束器26之間，以濾除來自主要照明源65的任何光(“成像光束”)。例如，如果成像光束具有450nm及以上範圍內的波長，則450nm截止濾鏡可以被使用於濾除成像光束並避免成像光束將光透射到聚焦相機70和72。在其他實施例中，兩 個截止濾鏡可以被使用，並且每個濾鏡可以被放置在例如透鏡22及24之前或之後。
在僅包含單個照明源的實施例中，如第3B圖所示(由線62表示)，分束器16可以置於在光從樣品反射離開的光學路徑中的照明器13之上。分束器16可以是例如50/50分束器，其被設計成將50%的光從主要照明源65發送到偏移聚焦相機70和72，並且50%的光從主要照明源65發送到成像裝置5。
在一些實施例中，如第3A圖和第3B圖所示，聚焦單元300可以包含分束器26，其可以被置於分色鏡15/分束器16和第一偏移聚焦相機70之間。分束器26可以是例如50/50分束器，其被設計成將聚焦光束的50%發送至第一偏移聚焦相機70和將聚焦光束的50%發送至第二偏移聚焦相機72。鏡子28可以放在分束器26正上方一距離處，並且可以被設計成引導光的光束從分束器26到第二偏移聚焦相機72。
注意的是，在一些實施例中，任何合適的分色鏡、聚焦相機、聚焦透鏡、鏡子、影像傳感器、分束器和截止濾鏡可以與聚焦單元300一起使用。在一些實施例中，這些組件的任何合適的安排可以與聚焦單元300一起使用。聚焦單元300的組件可以被安裝至導桿或用於連接組件的任何其他合適的結構。
第1A圖及第1B圖顯示根據所揭露標的主題的一些實施例的用於自動聚焦系統100的由單個或一對虛線62及63所表示的示例光學路徑。如第1A圖所示自動聚焦系統100可以被配置成使得從次要照明源40發射的光(“聚焦光束(FB)”，如由較短的虛線63所表示)被投射到樣品S上，並且然後被反射到偏移聚焦相機70和72。自動聚焦系統100也可以被配置成使得從主要照明源65發射 的光(“成像光束(IB)”，如由較長的虛線62所表示)被投射到樣品S上，並且然後被反射到成像裝置5。
更具體地，在使用兩個照明源的實施例中，聚焦光束62可以從照明源40經過聚焦圖案55行進到分色鏡60。分色鏡60可以將聚焦光束62反射向照明器13。成像光束可以從主要照明源65行進，穿過分色鏡60以與聚焦光束組合。
組合光束(如果使用兩個照明源)可以行進經過垂直照明器13到達稜鏡20。稜鏡20可以將來自照明源的光以90°向下反射經過換鏡旋座和物鏡25至樣品S。樣品S可以反射組合或單個光束向上經過物鏡25，其然後被傳輸經過稜鏡20朝向分色鏡15。分色鏡15(如果使用兩個照明源)可以藉由例如將來自次要照明源40的光的波長反射至偏移聚焦相機70和72並且藉由允許來自主要照明源65的光的波長通過朝向相機5，而將透射光束分離回入至成像光束62和聚焦光束63。
在包含兩個照明源的實施例中(如第1A圖、第2A圖及第3A圖所示)，由分色鏡15反射的聚焦光束63可以穿過截止濾鏡17以去除截止波長以上的任何光。聚焦光束63然後可以行進至分束器26。分束器26可以藉由將光導向經過位於聚焦殼體18中的聚焦透鏡22，將例如50%的聚焦光束63發送朝向第一偏移聚焦相機70。從那裡，聚焦光束63可以行進到第一偏移聚焦相機70中的光傳感器71。其餘50%的聚焦光束63可以由分束器26被導向朝向鏡子28。鏡子28可以將聚焦光束63反射朝向位於聚焦殼體19中的聚焦透鏡24。從那裡，聚焦光束63可以被導向至第二偏移聚焦相機72中的傳感器73。
在包含兩個照明源的實施例中(如第1A圖、第2A圖及第3A圖所示)，穿過分色鏡15的成像光束62可以穿過光學濾鏡11(例如，僅透射來自成像光束的波長的濾鏡)，向上經過顯微鏡筒透鏡10，並且至成像裝置5。
在包含單個照明源的實施例中，如第1B圖所示，自動聚焦系統100可以配置成使得從主要照明源65發射的光投射到樣品S上然後被反射到偏移聚焦相機70和72以及成像裝置5。更具體地，分束器16可以置於在光從樣品S反射離開的光學路徑中的照明器13之上。分束器可以將例如從樣品S反射離開的光的50%的引導到偏移聚焦相機70和72，並且50%引導到成像裝置5。
在一些實施例中，藉由將物鏡和平台沿Z軸(如第1A圖和第1B圖所示)移動更靠近或更遠地而到不同的相對Z位置，可以使用成像裝置5使樣品對焦。在一些實施例中，聚焦可以使用粗聚焦調整(所述粗聚焦調整跨越寬範圍的Z位置(諸如500μm至2500μm，或任何其他合適的範圍))，及/或使用精聚焦調整而被調整，精聚焦調整跨越更窄範圍的Z位置(例如1400μm至1600μm，或任何其他合適的範圍)。在一些實施例中，粗聚焦調整可以藉由致動器35進行。在一些實施例中，精聚焦調整可以藉由精細聚焦致動器23進行。
在一些實施例中，來自衝擊影像傳感器的光所形成的影像的相對銳度值可以被使用作為樣品聚焦品質的指示符。在一些實施例中，相對銳度值愈高，對焦的影像愈多。在一些實施例中，如第4圖所示，相對銳度值在不同相對Z位置上的曲線圖可以在焦點處具有明顯的峰值(這可以是單個點或多個點)並且在聚焦平面的任一側上減小。相對銳度值可以由任何合適的度量形成，例如影像對比度、解析度、熵、變異及/或空間頻率內容，等等的其他測量，以測量由顯微鏡捕獲的影像的聚焦的品質。可以被自動聚焦系統100使用來計算相對 銳度值的一個示例方程式是影像變異V的量度，其由平均數μ所歸一化以解釋強度波動：
Figure 109114589-A0305-02-0021-1
 其中平均值μ為全部畫素的灰階畫素值的平均值，s(i,j)是坐標(i,j)處的灰階畫素值，以及N和M分別表示i和j方向中的像素數。用於計算可由自動聚焦系統100使用的聚焦品質的其他示例方法是由Sivash Yazdanfar等人，“Simple and Robust Image-Based Autofocusing for Digital Microscopy,”Optics Express Vol.16,No.12,8670(2008)所描述，其以它的全部內容藉由參引而在本文併入。以上揭露的方法僅是示例，而非旨在限制。
第4圖顯示包括X軸及Y軸的圖表，該X軸表示平台30的頂部在Z方向中的相對於物鏡25的相對位置(“相對Z位置”)，以及Y軸表示相對銳度值。相對Z位置可以藉由調整平台30朝向或遠離物鏡25及/或藉由調整物鏡25朝向或遠離平台30而被改變。第4圖中的銳度曲線顯示在每一個相對Z位置、被成像裝置5所捕獲/觀察的影像之相對銳度值。如第4圖所示，銳度曲線在給定的相對Z位置(例如Z位置130)(其可被稱為對焦位置)可以具有最大的測量銳度(例如第4圖中70的相對銳度值)並且可以在對焦位置的每一側(例如，Z位置130)對稱地減小。在某些例子中，第4圖中在對焦位置的曲線的斜率可以為零或接近零。應當理解，如本文所使用的術語“對焦”旨在表示當物鏡和平台的相對置位是使得銳度測量處於銳度曲線之頂部或其附近的點。術語“對焦”並非旨在限於完美或最佳聚焦。對焦可以由操作者及/或其他合適的方法來數學地定義。如第4圖中所示的資料可以經由連續的測量(例如銳度曲線)或可以由改變相對Z位置所收集的分離的點來編輯。
粗Z移動的範圍由第4圖及第5圖中的線137(例如，在500μm處)和142(例如，在2500μm)來表示。精聚焦Z移動的範圍由這些圖中的線136(例如，在1400μm)和141(例如，在1600μm)來表示。注意的是，Z移動的範圍是指在物鏡25和平台30之間實現不同Z位置的實際移動範圍。Z移動的範圍也是指Z移動的範圍，其中銳度計算可以被使用於聚焦樣品。當平台30和物鏡25移動更遠離，箭頭135顯示銳度得分增加到在Z位置130處的最大點(指示影像被認為是如上所述的對焦)，以及當平台30和物鏡25繼續移動更遠離，箭頭140顯示銳度得分從在Z位置130處的最大點減小。
應該清楚的是，第4圖和第5圖中所示的相對銳度值和Z位置可以僅是示例，並且在任何給定的應用中其他值組合可以被測量。
如上所述，在某些情況下，第4圖中在對焦位置處的曲線的斜率可以是零或接近零。這可能使尋找單個最佳聚焦位置變得困難。
如下面詳細描述的，相機70和71能被使用於幫助尋找樣品的對焦位置，甚至當在第4圖中在對焦位置的曲線的斜率為零或接近零時。
第5圖顯示由偏移聚焦相機70和72分別拍攝的對於樣品的影像的銳度曲線A和B。類似於第4圖，曲線圖的X軸表示相對Z位置，Y軸表示相對銳度值，以及線130表示聚焦共軛平面80並且指示對於樣品的最大測量銳度值使用成像裝置而可以被尋找所在的Z位置。銳度曲線A顯示在每個相對Z位置的由第一偏移聚焦相機70所捕獲的影像的相對銳度值。銳度曲線B顯示在每個相對Z位置的由第二偏移聚焦相機72所捕獲的影像的相對銳度值。第5圖顯示曲線A的負斜 率以及曲線B的正斜率在聚焦共軛平面80在138相交。在138，在相同Z位置(亦即1500μm)的樣品的由偏移聚焦相機70及72之每一個所捕獲的影像的銳度值為相同。在一些實施例中，第5圖中所示的資料可以經由連續的測量(例如銳度曲線)或可以藉由改變相對Z位置所收集的分離的點來編輯。在一些實施例中，第5圖中的曲線為非已知。
使用第5圖中所示的對於相機70和72的曲線A和B的特性，系統100可以被配置為對於相機70和72之每一個在兩個相對Z位置處來取樣相對銳度值，並且使用所得到的銳度值和相對Z位置來確定平台和物鏡的所需相對運動的方向(亦即，是否要增加或減少相對Z位置)以便使樣品為對焦。此外，在一些實施例中，系統100可以額外地被配置為使用所得到的銳度值和相對Z位置來確定平台和物鏡的所需的相對移動量(即，在相對Z位置中的變化量)以便使樣品為對焦。
更特別地例如，在一些實施例中，藉由確定沿著曲線A的兩個相對Z位置之間的線的斜率並且藉由確定沿著曲線B的相同兩個相對Z位置之間的線的斜率，吾人能確定是否當前相對Z位置為：曲線A的峰值左側、曲線A的峰值與焦點之間、焦點與曲線B的峰值之間、或曲線B的峰值的右側。在知道該資訊時，所需的移動方向為已知。也就是說，如果當前相對Z位置是在曲線A的峰值的左側，或者在曲線A的峰值和焦點之間，則相對位置需要增加。如果當前相對Z位置在焦點和曲線B的峰值之間，或者在曲線B的峰值的右側，則相對位置需要減小。
第6圖還參考第1圖至第5圖，顯示根據所揭露標的主題的一些實施例的用於在自動聚焦系統100中使樣品對焦的示例過程600。
在610處，樣品被放在平台30上。平台30及/或物鏡25可以被移動，直到平台30的頂部表面被置於由Z位置137和142所定義的操作範圍內的位置Z1。
在620處，在相對Z位置Z1處的樣品的銳度值可以使用偏移聚焦相機70和72之每一個來測量。隨著Z1位置由聚焦相機70捕獲的對於樣品S的影像的銳度值SA1可以被記錄。隨著Z1位置由聚焦相機72捕獲的對於樣品S的影像的銳度值SB1可以被記錄。
在630處，平台30及/或物鏡25可能被移動，直到樣品S處於Z位置137和142之內的不同相對Z位置Z2。在一些實施例中，位置Z2可被選擇，使得Z2與Z1之間的距離為物鏡25的景深(DOF)的距離的兩倍或者小於2(例如，1.5乘以DOF，1乘以DOF或.5乘以DOF)的另一倍數。所揭露的用於選擇位置Z2的方法僅是示例而非旨在限制。
接下來，在640處，類似於620處，在相對Z位置Z2處的樣品的銳度值可以使用偏移聚焦相機70和72之每一個來測量。由聚焦相機70捕獲的對於樣品S的影像的銳度值SA2隨著Z2位置可以被記錄。由聚焦相機72捕獲的對於樣品S的影像的銳度值SB2隨著Z2位置可以被記錄。
在650處，在(Z1,SA1)和(Z2,SA2)之間形成的線的斜率MA1可以被計算並記錄。例如，MA1可以等於(SA2-SA1)/(Z2-Z1)。類似地，在(Z1,SB1)和(Z2,SB2)之間形成的線的斜率MB1可以被計算並記錄。例如，MB1可以等於(SB2-SB1)/(Z2-Z1)。
在660處，相對Z位置可以被調整以使樣品S對焦。在一些實施例中，相對Z位置可以被調整以使樣品S以任何合適的方式對焦。例如，在一些實施例 中，相對Z位置可以藉由執行對於如下表中詳述的MA1、MB1、SA2和SB2的值的不同組合列出的Z調整而被調整以使樣品S對焦。
Figure 109114589-A0202-12-0022-2
Figure 109114589-A0202-12-0023-3
 當由聚焦相機70和72捕獲的影像在相同的相對Z位置處具有相同的銳度值(或是在彼此的任何合適的容許值內)時(如第5圖中的138所示)，交點可以發生。
所揭露的表格僅是使用偏移聚焦相機70和72用於聚焦樣品的示例方法，並不旨在限制。使用偏移聚焦相機70和72用於聚焦樣品的其他方法可以被使用。
在執行上述表中所描述的內容時，當調整(亦即，增加或減小)相對Z位置直到由偏移聚焦相機70和72捕獲的對於樣品的影像的銳度值相同(或是在彼此的任何合適的容許值內)時，系統100可以執行任何合適的動作。例如，在一些實施例中，系統100可以將在指示方向中的相對Z位置調整一給定量，重複620，確定由偏移聚焦相機70和72捕獲的對於樣品的影像的銳度值是否相同(或是在彼此之任何合適的容許值內)，並且，如果值不相同(或在容許值內)，則重複630、640和650，直到由偏移聚焦相機70和72捕獲的對於樣品的影像的銳 度值是相同的(或是在任何合適的容許值內)(例如，如第5圖中的交點138所指示)並且在交點處的斜率MA2和MB2的方向(如下所述)是彼此相反的。
在650處可以使用任何合適的給定量的移動，並且可以以任何合適的方式確定給定量。例如，在一些實施例中，給定量可以總是為固定量。此固定量可以基於系統100的配置來確定，並且可以是使用者指定的。作為另一個示例，在一些實施例中，給定量可以基於在640處確定的斜率而改變。更特別地，當斜率指示相對Z位置在第5圖中的曲線A的峰值的左側、或在第5圖中的曲線B的峰值的右側時，給定量可以為更大，以及當斜率指示相對Z位置在第5圖中的曲線A的峰值和第5圖中的曲線B的峰值之間時，給定量可以為更小。作為又一示例，給定量可以是基於在640處確定的斜率以及在620處確定的SA1和SB1的值的函數。更特別地，當斜率指示相對Z位置在第5圖中的曲線A的峰值的左側、或在第5圖中的曲線B的峰值的右側時，給定量可以與SA1和SB1之間的差成反比(亦即，當SA1和SB1之間的差為小時，給定量將為大，以及當SA1和SB1之間的差為大時，給定量將為小)，以及當斜率指示相對Z位置在第5圖中的曲線A的峰值和第5圖中的曲線B的峰值之間時，給定量可以與SA1和SB1之間的差值成比例(亦即，當SA1和SB1之間的差值為小時，給定量將為小，以及當SA1和SB1之間的差值為大時，給定量將為大)(在這個例子中，給定量可以被避免於降至一最小值以下，以便交點138可以被快速尋找)。
如上表所指示，當調整相對Z位置以使樣品S對焦時，過程600可以確定斜率MA2和MB2的方向是否彼此相反。為了確定交點處的斜坡MA2和MB2的方向，平台30及/或物鏡25可以首先從交點移動，直到樣品S處於Z位置137和142內的不同位置Z3處。在一些實施例中，位置Z3可以被選擇，使得其距交點的 距離是物鏡25的景深(DOF)的兩倍或者是小於2的另一倍數(例如，1.5乘以DOF、1乘以DOF或0.5乘以DOF)。所揭露的用於選擇位置Z3的方法僅是示例而非旨在進行限制。
接下來，銳度值SA3和SB3及Z3位置可以被記錄用於由偏移聚焦相機70和72捕獲的樣品的影像。
然後，在交點和(Z3,SA3)之間形成的線的斜率MA2，以及在交點和(Z3,SB3)之間形成的線的斜率MB2可以被計算。
如果斜率MA2和MB2的方向彼此相反，則交點在影像成形共軛平面處。否則，平台及/或物鏡可以根據上表中的指令繼續被調整。
在一些實施例中，在交點的銳度值可以與用於自動聚焦系統100、特殊樣品、樣品類別及/或任何其他合適的分類群組的被記錄的銳度設定點比較。如果在交點的銳度值與被記錄的銳度值相同或在被記錄的銳度值的可接受變異內，則當交點在影像成形共軛平面時交點發生。否則，平台及/或物鏡可以根據上表中的指令繼續被調整。
在一些實施例中，一旦樣品為對焦處的相對Z位置被確定，則：平台30；物鏡25；在平台30上的樣品的頂部；及/或平台30的頂部和物鏡25之間的距離的絕對位置可以由控制系統108儲存為位置設定點。位置設定點可以與特別樣品、特別樣品類別及/或用於樣品的任何其他合適的分類群組相關聯。
因為隨著某點，在銳度曲線A和B上的斜率指示平台與物鏡之間的距離是否必須減小或增加以使樣品對焦，較少的樣品的影像可以被拍攝來使樣品對焦。
在670處，在一些實施例中，一旦樣品確定為對焦，對焦影像就可以藉由成像裝置5捕獲。
在一些實施例中，一旦樣品使用在610-660中描述的方法被確定為對焦，成像裝置5可被使用於微調樣品的聚焦。例如，使用成像裝置5，樣品的銳度值可以對於平台和物鏡的至少兩個相對Z位置來計算，以確定是否估計的最大銳度已經實現或相對Z位置需要被調整以實現估計的最大銳度(亦即，在斜率為0或接近0的銳度曲線上的點)。
在一些實施例中，在610處，控制系統108對於放置在平台30上的樣品也可以確定是否存在與樣品、樣品類別及/或任何其他合適的分類組相關聯的位置設定點，並且可以將自動聚焦系統100置於該位置設定點。知道大約的目標相對Z位置，減小了聚焦樣品所需的相對Z距離，並允許偏移聚焦相機置於更靠近聚焦共軛平面80。如上所討論者，銳度曲線的斜率隨著偏移聚焦相機70和72移近聚焦共軛平面80而變得更陡峭。較陡峭的斜率表示更高的解析度或更大的銳度變化相對於Z高度的較小變化。較陡的斜率可以允許更精細的焦點調整和控制。
過程600的特別部分何時被執行的劃分可以改變，並且無劃分或不同的劃分為在本文揭露的標的主題的範圍內。應注意的是，在一些實施例中，過程600的方塊可以在任何合適的時間執行。應當理解，在一些實施例中，本文描述的過程600的部分的至少一些可以以不限於在第6圖中所描述的次序和順序的任何次序或順序來執行。而且，在一些實施例中，在適當或併行的情況下，本文描述的過程600的部分的一些可以是或基本上同時被執行。附加地或替代地，在一些實施例中過程600的一些部分可以被省略。
過程600可以以任何合適的硬體及/或軟體實施。例如，在一些實施例中，過程600可以在第1圖中所示的控制系統108中實施。
在一些實施例中，聚焦共軛平面80的位置可以以任何合適的方式確定。例如，在一些實施例中，聚焦共軛平面80可以基於自動聚焦系統100的特性來數學地確定。
作為另一個示例，在一些實施例中，聚焦共軛平面80可以使用校準過程來確定。第7圖還參考第1圖至第6圖，顯示根據所揭露標的主題的一些實施例的用於分別尋找聚焦共軛平面80和用於校準偏移聚焦相機70和72的偏移距離f1和f2的校準過程700的示例。在一些實施例中，聚焦共軛平面80可以基於自動聚焦系統100的特性來數學地確定。在其他實施例中，例如，聚焦共軛平面80可以，藉由對於偏移聚焦相機70和72的一者產生一組銳度曲線而實驗地確定，如例如在710-740中所描述者。
在710處，在過程700開始之後，樣品S可以被放在平台30上，並且成像裝置5可以被使用於確定和記錄對於當樣品為對焦時的相對Z位置，如上面結合第4圖所討論者。例如，第4圖顯示在1500μm的相對Z位置處(由線130表示)對焦的樣品，其處於第4圖中所示的曲線的峰值處。過程700可以藉由步進通過由線137和142所示的Z位置的範圍內的任何合適數量的Z位置，在每個位置以成像裝置5捕獲影像，並確定相對銳度值(如上所述)來尋找這相對Z位置。這些銳度值的最高者可以被確定對應於對焦點。
在720處，偏移聚焦相機70可以在水平方向上遞增地移動，並且銳度曲線或相對於不同相對Z位置的一組銳度值可以在偏移聚焦相機的每一個水平位置處計算。偏移聚焦相機的位置於其銳度曲線的峰值或最大銳度值出現 處，可以被定義為處於聚焦共軛平面80所在的位置，如第1圖中所示。這位置可以被定義為對於相機70的對焦相對Z位置並且可以被記錄。在一些實施例中，對於相機70的對焦相對Z位置的最大銳度值可以由控制系統108儲存為對於自動聚焦系統100、特別樣品、樣品類及/或任何其他合適的分類群組的銳度設定點。
在725處，相機72的對焦相對Z位置可以與對於相機70的對焦相對Z位置相同(例如，當聚焦鏡頭22和24為相同時)。在此種情況下，相機72可以簡單地被移動到與相機70相同的對焦相對Z位置(其在聚焦共軛平面80處)。
在一些實施例中，然而，對於相機72的對焦相對Z位置可以與對於相機70的對焦相對Z位置不同。在此種情況下，偏移聚焦相機72可以在水平方向上遞增地移動，並且在偏移聚焦相機的每一個水平位置處，銳度曲線或相對於不同相對Z位置的一組銳度值可以被計算。偏移聚焦相機的位置於其銳度曲線的峰值或最大銳度值發生處，可以被定義為處於聚焦共軛平面所在的位置(圖中未示出)。這位置可以被定義為對於相機72的對焦相對Z位置並且可以被記錄。在一些實施例中，對於相機72的對焦相對Z位置處的最大銳度值可以由控制系統108儲存為相機72的銳度設定點。
雖然720討論了對於相機70的執行動作，並且725討論了對於相機72之執行動作，在一些實施例中在70和72中所採取的動作所針對的相機可以被交換。
在730處，偏移聚焦相機70可以置於其對焦相對Z位置的第一側(例如，正、負、左、右、頂部、底部)上的一偏移距離f1處。在一些實施例中任何合適的偏移距離值可以被使用。例如，在一些實施例中，偏移聚焦相機70最初 可以置於距其對焦相對Z位置30cm、15cm、10cm及/或任何其他合適的偏移距離處。
在735處，偏移聚焦相機72可以置於其對焦相對Z位置的第二相對側(例如，分別為正、負、左、右、底部、頂部)上的一偏移距離f2處。也就是說，例如，如果相機70被置於其對焦相對Z位置的左側，則相機72被置於其對焦相對Z位置的右側，且反之亦然。在一些實施例中任何合適的偏移距離值可以被使用。例如，在一些實施例中，偏移聚焦相機72最初可以置於距其對焦相對Z位置的相同偏移距離(相較於偏移聚焦相機70距其對焦相對Z位置)(例如，距其對焦相對Z位置的30cm、15cm、10cm，及/或任何其他合適的偏移距離)。
在一些實施例中，f1和f2的初始偏移距離不必要彼此相等。初始偏移距離可以基於自動聚焦系統100的光學特性及/或對於聚焦的精度要求。偏移聚焦相機70或72被放到愈靠近聚焦共軛平面80，其在聚焦共軛平面80處的銳度曲線的斜率愈陡峭。較陡峭的斜率表示銳度的較大變化相對於較小的Z高度變化(也稱為更高的解析度)。較陡峭的斜率可能是想要的，因為它允許較精細的聚焦調整和控制。
更具體地，如果Z移動的範圍(例如，在第6圖中所示的線137和142之間的距離)較大，則偏移聚焦相機70和72可以置於比如果Z移動的範圍為較小時更遠離聚焦共軛平面80。
在一些實施例中，偏移距離f1和f2也可以基於在Z位置處的銳度曲線的陡峭度，其中樣品是在對於成像裝置5的最佳聚焦。例如，如果需要使樣品對焦的Z運動的範圍為小(例如，在1300μm-1700μm之間)，則偏移聚焦相機70和72可以放得更靠近聚焦共軛平面80，因為與更遠離聚焦共軛平面80的偏移距 離相比，更近的位置具有更陡峭的斜率和更高的解析度。在一些實施例中，更遠離聚焦共軛平面80的偏移距離f1和f2可以被選擇以適應對於自動聚焦系統100的最大Z移動範圍，使得偏移聚焦相機70和72不必要經常地對於改變厚度的樣品重新定位。
在740處，偏移聚焦相機70和72中的一個可以保持在固定位置，並且另一個偏移聚焦相機可以被重定位，直到對於偏移聚焦相機70和72所分別計算的銳度曲線(例如，第5圖中所示的銳度曲線A和B)在聚焦共軛平面80處相交。例如，第二偏移聚焦相機72可以在從聚焦共軛平面80偏移的固定位置中，而且使用第二偏移聚焦相機72對於樣品S的銳度曲線可以被計算和記錄。特別地，對於樣品S(例如，28)在對焦Z位置130(例如，1500μm)處的銳度值使用偏移聚焦相機72可以被記錄。然後，第一偏移聚焦相機70可以在水平方向上朝向或遠離聚焦共軛平面80遞增地移動，直到確定的銳度曲線A與銳度曲線B在對焦Z位置130處相交(例如，如第5圖中所示)，該對焦Z位置130位在聚焦共軛平面80上。當使用第一聚焦相機70時，對於在對焦Z位置130處的樣品的銳度值與使用第二偏移聚焦相機72(例如，28)在對焦Z位置130處的值相同時，該等斜率將相交。在交點處，銳度曲線A和B的斜率(亦即，囊括交點的任何斜率)彼此相反。銳度曲線A可以在交點處被計算並記錄。在一些實施例中，被記錄的銳度曲線A和B可以被使用於評估曲線A和B上不同點之間的關係(亦即，交點以外的點)相對於聚焦共軛平面80，並被使用於分析樣品或將聚焦設定在共軛平面以外的平面處。
在一些實施例中，曲線A和B的交點處的相對銳度值優選地不出現在銳度曲線的最頂部或最底部。而是，在一些實施例中，交點可以出現在銳度 曲線的最小和最大值內的任何合適的範圍內，像是在銳度曲線的最小和最大值的10-90%之間、在銳度曲線的最小和最大值的5-95%之間、在銳度曲線的最小和最大值的20-80%之間等。
其他實施例中，偏移聚焦相機70和72兩者都可以被移動朝向及/或遠離聚焦共軛平面80，直到銳度曲線A與曲線B在對焦Z位置130處相交。例如，銳度曲線A和B可以如連結第4圖所描述者來計算。所揭露的用於校準偏移距離f1和f2的方法僅僅是示例，而非旨在進行限制。
在一些實施例中，銳度曲線不需要被計算用於聚焦相機A和B以尋找偏移距離f1和f2。例如，偏移聚焦相機70或72中的一個可以被移動，直到對於由聚焦相機A和B在聚焦Z位置130處捕獲的樣品的影像所計算的銳度值相等。
在一些實施例中，偏移距離f1和f2對於自動聚焦系統100可以被設定一次。在其他實施例中，偏移距離f1和f2可以被重新校準以適應不同的物鏡、不同的樣品厚度、不同的樣品類別或任何合適的標準。例如，對於較高放大率的物鏡，偏移距離f1和f2可以被減小，以適應較小的景深(聚焦)和較小的Z移動範圍。在一些實施例中，偏移距離f1和f2可以由控制系統108保存為偏移距離設定點。偏移距離設定點可以為例如與樣品的厚度及/或任何其他合適的特性、樣品類別及/或樣品的任何其他合適的分組、及/或顯微鏡的光學特性(例如，物鏡的放大率)關聯。偏移距離設定點可被使用於自動定位偏移聚焦相機70和72。
在一些實施例中，樣品類別可以基於從具有相似的反射品質的材料製成的樣品來定義。
何時過程700的特別部分被執行之劃分可以改變，並且無劃分或不同的劃分為在本文揭露的標的主題的範圍內。應注意的是，在一些實施例中， 過程700的方塊可以在任何合適的次數被執行。應當理解，本文描述的過程700的部分的至少一些可以以不限於在第7圖中所描述的次序和順序的任何次序或順序來執行。而且，在一些實施例中，在適當或併行的情況下，本文描述的過程700的部分的一些可以是或實質上同時或上同時被執行。附加地或替代地，在一些實施例中過程500的一些部分可以被省略。
過程700可以以任何合適的硬體及/或軟體實施。例如，在一些實施例中，過程700可以在控制系統108中實施。
在一些實施例中，控制系統108可以收集與自動聚焦系統100的操作及/或配置有關的資料。例如，資料可以包含關於當樣品(或樣品的部分)為對焦時自動聚焦系統100的配置的細節，像是：偏移聚焦相機70和72的位置；平台30、物鏡25、在平台30上的樣品頂部、及/或平台30的頂部與物鏡25之間的距離的絕對位置；銳度設定值、位置設定點；被使用於確定樣品(或樣品的區域)為對焦的銳度測量。此外，與自動聚焦的操作有關的資料，像是，實現對於被掃描的樣品的每個區域的聚焦所花費的時間、在樣品(或樣品的區域)被確定為對焦之前所捕獲的影像的數量、平台30及/或物鏡25必須行進以實現聚焦的總距離、所記錄的銳度值。關於樣品、樣品類別及/或任何其他合適的分類群組的資料也可以被收集。前述者僅是示例，並且非旨在限制可以被收集的資料類型。
被收集的資料可以進一步由控制系統108及/或耦合至控制系統108的遠程計算裝置來分析，以識別在自動聚焦配置及/或操作中的無效率。控制系統108及/或遠程計算裝置可以進一步確定被檢測到的無效率是否與自動聚焦系統100的配置及/或操作的方面相關，並且對自動聚焦系統100的配置及/或操作進行適當的調整。
在一些實施例中，任何合適的人工智慧演算法可以被使用來識別無效率及/或進行適當的調整。例如，在一些實施例中，人工智慧演算法可以包含以下中的一或多個、單獨或組合：機器學習；隱藏馬可夫模型；循環的類神經網路；卷積類神經網路；貝氏符號方法；一般的對立網路(adversarial network)；支持向量機器；及/或任何其他合適的人工智慧。
應注意的是，在一些實施例中，本文描述的用於聚焦樣品的技術可以應用於聚焦整個樣品或僅聚焦樣品的部分。
本文描述的示例的提供(以及表述為“像是”、“例如”、“包含”及其類似者的子句)不應被直譯為對於特定示例來限制所要求保護的標的主題；而是，示例旨在說明許多可能方面中的僅一些。還應注意的是，如本文所使用的，術語機制可以囊括硬體、軟體、韌體或其任何合適的組合。
以上描述的一些部分呈現了就在資訊上的操作的演算法和符號表示而言的本揭露的特徵。這些演算法的描述和表示是資料處理領域的技術人員所使用的手段，以最有效地將他們工作的實質傳達給本領域其他技術人員。雖然在功能上或邏輯上被描述，但應理解這些操作將被電腦程式所實施。此外，也已有時被證明方便於將這些操作的安排稱為模組或由功能名稱稱呼，而不失一般性。
除非明顯地從上面的討論中具體地陳述，應當理解，在整個說明中，使用像是“確定”、“顯示”或其類似者的術語的討論是指電腦系統、或類似的電子計算裝置的動作和過程，該電腦系統、或類似的電子計算裝置操縱和轉換在電腦系統記憶體或暫存器或其他此類資訊儲存、傳輸或顯示裝置內所表示為物理(電子)量的資料。
本揭露的特定方面包含演算法的形式的本文所此描述的過程步驟和指令。應當注意的是，本揭露的過程步驟和指令可以體現於軟體、韌體或硬體中，並且當以軟體體現時，可以被下載以駐留在由實時網路操作系統所使用的不同平台上以及從由實時網路操作系統所使用的不同平台上所操作。
本揭露還涉及用於執行本文的操作的裝置。此裝置可以為所需目的而特殊地建構，或者它可以包括由儲存在電腦可讀媒體上的電腦程式所選擇性地啟動或重新配置的通用的電腦，該電腦可讀媒體可以由電腦存取。此種電腦程式可以儲存在電腦可讀儲存媒體中，像是但不限於任何類型的碟，該碟包括軟碟、光碟、CD-ROM、磁-光碟、唯讀記憶體(ROM)、隨機存取記憶體(RAM)、EPROM、EEPROM、磁或光卡、專用積體電路(ASIC)、或適用於儲存電子指令的任何類型的非暫時性電腦可讀儲存媒體。此外，在說明書中提到的電腦可以包含單個處理器或可以是為了提高的計算能力的利用多個處理器設計的架構。
本文所呈現的演算法和操作並非固有地與任何特殊電腦或其他裝置相關。根據本文的教導，各種通用系統也可以與程式一起被使用，或者可以證明方便於建構更專用的裝置以執行所需的方法步驟。對於本領域技術人員而言，對於各種系統所需的結構以及等同的變化是顯而易見的。另外，本揭露是不參考任何特別編程語言來描述。應當理解，各種編程語言可以被使用來實施如本文所描述的本揭露的教示，並且對於特定語言的任何參考被提供以用於據以實現的揭露以及本揭露的最佳模式。
自動顯微聚焦系統和方法已經連同對這些示出的實施例的具體參考而被詳細地描述。然而，顯而易見的是，各種修飾和改變可以在如前述說明 書中所描述的本揭露的精神和範圍內完成，並且此等修飾和改變將被認為是本揭露的等同物和部分。本發明的範圍僅受以下申請專利範圍所限制。
5:成像裝置、成像相機
6:成像裝置影像成形共軛平面/成像共軛平面
8:樣品影像成形共軛平面/樣品共軛平面
10:成像顯微鏡筒透鏡
13:照明器
14:視場光闌
20:稜鏡
21:視場光闌(F-stop)影像成形共軛平面/視場光闌共軛平面
23:精聚焦致動器
25:物鏡
30:平台
32:聚焦機構
33:定位裝置
35:致動器
62:虛線、成像光束
80:聚焦單元影像成形共軛平面/聚焦共軛平面
100:自動聚焦系統
105:輸入裝置
107:控制器介面
108:控制系統
110:控制器
120:通信
200:照明單元
300:聚焦單元
S:樣品

Claims (20)

  1. 一種用於自動聚焦一顯微鏡的系統，包括：一物鏡；一平台，用於將一樣品置於一第一影像成形共軛平面上；一第一聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於一第二影像成形共軛平面的一第一側；一第二聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於該第二影像成形共軛平面的一第二側；一主要照明源；一成像裝置，被置於一第三影像成形共軛平面上；以及一硬體處理器，被耦合到該第一聚焦相機和該第二聚焦相機，其被配置為當使用該第一聚焦相機的該樣品的一銳度值等於使用該第二聚焦相機的該樣品的一銳度值時，確定該樣品為對焦。
  2. 如請求項1所述的系統，其中該硬體處理器還被配置為：使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第一位置(Z1)的該樣品的一第一銳度值(SA1)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第一位置(Z1)的該樣品的一第二銳度值(SB1)；使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第二位置(Z2)的該樣品的一第三銳度值(SA2)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第二位置(Z2)的該樣品的一第四銳度值(SB2)； 計算等於(SA2-SA1)/(Z2-Z1)的一第一斜率；計算等於(SB2-SB1)/(Z2-Z1)的一第二斜率；以及調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第三位置，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第五銳度值(SA3)等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第六銳度值(SB3)。
  3. 如請求項2所述的系統，其中該硬體處理器還被配置為：調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第四位置(Z4)並使用該第一聚焦相機測量該樣品的一第七銳度值(SA4)以及使用該第二聚焦相機測量該樣品的一第八銳度值(SB4)；計算等於(SA4-SA3)/(Z4-Z3)的一第三斜率；計算等於(SB4-SB3)/(Z4-Z3)的一第四斜率；確定該第三斜率的一方向和該第二斜率的一方向是否相反；以及當該第三斜率的該方向與該第二斜率的該方向為不相反時，繼續調整該物鏡和該平台之間的該距離，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第九銳度值等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第十銳度值。
  4. 如請求項1所述的系統，還包括：一次要照明源；其中該主要照明源被配置為發射在一第一波長範圍中被該成像裝置接收的光；以及其中該次要照明源被配置為發射在一第二波長範圍中的光，該第二波長範圍不同於該第一波長範圍並且其投射光穿過一聚焦圖案，該聚焦圖案被置於一第四影像成形共軛平面上，其被該第一聚焦相機和該第二聚焦相機接收。
  5. 如請求項4所述的系統，還包括：一第一濾鏡，被置於該次要照明源和該成像裝置之間的一第一光路中，以避免來自該次要照明源的光到達該成像裝置；以及一第二濾鏡，被置於該主要照明源與該第一聚焦相機和該第二聚焦相機之間的一第二光路中，以避免來自該主要照明源的光到達該第一聚焦相機和該第二聚焦相機。
  6. 如請求項4所述的系統，其中該硬體處理器還被配置為：使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第一位置(Z1)的該樣品的一第一銳度值(SA1)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第一位置(Z1)的該樣品的一第二銳度值(SB1)；使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第二位置(Z2)的該樣品的一第三銳度值(SA2)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第二位置(Z2)的該樣品的一第四銳度值(SB2)；計算等於(SA2-SA1)/(Z2-Z1)的一第一斜率；計算等於(SB2-SB1)/(Z2-Z1)的一第二斜率；以及調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第三位置，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第五銳度值(SA3)等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第六銳度值(SB3)。
  7. 如請求項6所述的系統，其中該硬體處理器還被配置為： 調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第四位置(Z4)並使用該第一聚焦相機測量該樣品的一第七銳度值(SA4)以及使用該第二聚焦相機測量該樣品的一第八銳度值(SB4)；計算等於(SA4-SA3)/(Z4-Z3)的一第三斜率；計算等於(SB4-SB3)/(Z4-Z3)的一第四斜率；確定該第三斜率的一方向和該第二斜率的一方向是否相反；以及當該第三斜率的該方向與該第二斜率的該方向為不相反時，繼續調整該物鏡與該平台之間的該距離，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第九銳度值等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第十銳度值。
  8. 如請求項1所述的系統，其中該成像裝置被配置用於當該樣品被該第一聚焦相機和該第二聚焦相機確定為對焦時拍攝該樣品的影像。
  9. 如請求項1所述的系統，其中該硬體處理器還被配置為使得該平台和該物鏡的至少一個被移動以實現一粗聚焦和一精聚焦。
  10. 如請求項1所述的系統，其中該硬體處理器還被配置為保存該平台相對於該物鏡的一位置、該平台的一絕對位置以及該物鏡的一絕對位置的至少一個。
  11. 一種用於自動聚焦一顯微鏡的方法，該顯微鏡具有至少一物鏡、用於將一樣品置於一第一影像成形共軛平面上的一平台、一第一聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於在一第一偏移距離的一第二影像成形共軛平面的一第一側上、一第二聚焦相機，被配置用於聚焦，被置於在一第二偏移距離的該第二影像成形共軛平面的一第二側、一主要照明源、一成像裝置，該成像裝置被置於一第三影像成形共軛平面上，該方法包括： 當使用該第一聚焦相機的該樣品的一銳度值等於使用該第二聚焦相機的該樣品的一銳度值時，確定該樣品為對焦。
  12. 如請求項11所述的方法，該方法還包括：使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第一位置(Z1)的該樣品的一第一銳度值(SA1)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第一位置(Z1)的該樣品的一第二銳度值(SB1)；使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第二位置(Z2)的該樣品的一第三銳度值(SA2)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第二位置(Z2)的該樣品的一第四銳度值(SB2)；計算等於(SA2-SA1)/(Z2-Z1)的一第一斜率；計算等於(SB2-SB1)/(Z2-Z1)的一第二斜率；以及調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第三位置，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第五銳度值(SA3)等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第六銳度值(SB3)。
  13. 如請求項12所述的方法，該方法還包括：調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第四位置(Z4)並使用該第一聚焦相機測量該樣品的一第七銳度值(SA4)以及使用該第二聚焦相機測量該樣品的一第八銳度值(SB4)；計算等於(SA4-SA3)/(Z4-Z3)的一第三斜率；計算等於(SB4-SB3)/(Z4-Z3)的一第四斜率； 確定該第三斜率的一方向和該第二斜率的一方向是否相反；以及當該第三斜率的該方向與該第二斜率的該方向為不相反時，繼續調整該物鏡和該平台之間的該距離，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第九銳度值等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第十銳度值。
  14. 如請求項11所述的方法，其中該顯微鏡還具有一次要照明源；其中該主要照明源被配置為發射在一第一波長範圍中被該成像裝置接收的光；以及其中該次要照明源被配置為發射在一第二波長範圍中的光，該第二波長範圍不同於該第一波長範圍並且其投射光穿過一聚焦圖案，該聚焦圖案被置於一第四影像成形共軛平面上，其被該第一聚焦相機和該第二聚焦相機接收。
  15. 如請求項14所述的方法，其中該顯微鏡還具有一第一濾鏡，其被置於該次要照明源和該成像裝置之間的一第一光路中，以避免來自該次要照明源的光到達該成像裝置；以及一第二濾鏡，被置於該主要照明源與該第一聚焦相機和該第二聚焦相機之間的一第二光路中，以避免來自該主要照明源的光到達該第一聚焦相機和該第二聚焦相機。
  16. 如請求項14所述的方法，該方法還包括：使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第一位置(Z1)的該樣品的一第一銳度值(SA1)；使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第一位置(Z1)的該樣品的一第二銳度值(SB1)；使用該第一聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的一第二位置(Z2)的該樣品的一第三銳度值(SA2)； 使用該第二聚焦相機測量相對於該物鏡的在該平台的該第二位置(Z2)的該樣品的一第四銳度值(SB2)；計算等於(SA2-SA1)/(Z2-Z1)的一第一斜率；計算等於(SB2-SB1)/(Z2-Z1)的一第二斜率；以及調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第三位置，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第五銳度值(SA3)等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第六銳度值(SB3)。
  17. 如請求項16所述的方法，該方法還包括：調整該物鏡和該平台之間的一距離至一第四位置(Z4)並使用該第一聚焦相機測量該樣品的一第七銳度值(SA4)以及使用該第二聚焦相機測量該樣品的一第八銳度值(SB4)；計算等於(SA4-SA3)/(Z4-Z3)的一第三斜率；計算等於(SB4-SB3)/(Z4-Z3)的一第四斜率；確定該第三斜率的一方向和該第二斜率的一方向是否相反；以及當該第三斜率的該方向與該第二斜率的該方向為不相反時，繼續調整該物鏡與該平台之間的該距離，使得使用該第一聚焦相機對於該樣品所測量的一第九銳度值等於使用該第二聚焦相機對於該樣品所測量的一第十銳度值。
  18. 如請求項11所述的方法，其中該成像裝置被配置用於當該樣品被第一聚焦相機和該第二聚焦相機確定為對焦時拍攝該樣品的影像。
  19. 如請求項11所述的方法，該方法還包括使得該平台和該物鏡的至少一個被移動以實現一粗聚焦和一精聚焦。
  20. 如請求項11所述的方法，保存該平台相對於該物鏡的一位置、該平台的一絕對位置以及該物鏡的一絕對位置的至少一個。
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