TWI725276B - 茯苓萃取物及其活性成分於調節、預防及／或治療肺部損傷之用途 - Google Patents

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Abstract

一種使用茯苓萃取物及／或其活性成分於製備一組合物之用途，其中該組合物係用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病，且其中該活性成分係選自以下群組：土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、茯苓新酸A、及其組合。

Description

茯苓萃取物及其活性成分於調節、預防及／或治療肺部損傷之用途
本發明係關於茯苓（FU-LING（Poria cocos ））萃取物及／或其活性成分的應用，尤其是關於彼等於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的應用。前述肺部損傷，尤其係指因懸浮微粒（Particulate Matter，PM）所引起者。
肺臟係呼吸系統的核心，主要由支氣管、小支氣管、肺泡管及肺泡所組成，結構為海綿狀，柔軟且具有彈性。肺臟主要負責體內的氣體交換，包括將氧氣從空氣中運輸到血液中，以及將二氧化碳從血液中排出體外。近年的研究發現，肺部損傷所導致的肺功能下降或喪失，不僅會影響整個呼吸系統，亦可能對全身性的水分代謝、血液循環、免疫系統等造成影響。因此，即使是輕微的肺部損傷亦不容忽視。
造成肺部損傷的原因包括胸部嚴重外傷、有害物質（例如有毒氣體、胃內容物、海水等）的吸入、肺部感染等。隨著經濟及工業發展，運輸工具、工廠、以及焚燒垃圾長期排放大量廢氣（包括懸浮微粒、二氧化硫、一氧化碳、二氧化氮、臭氧），造成嚴重的空氣污染。漂浮在空氣中的大氣污染粒狀物通稱為懸浮微粒，其主要來源為交通污染、工業污染物、農業污染、民生污染（例如油煙、香煙等）等，組成複雜且形態多樣化。懸浮微粒依其顆粒大小可大分為粗懸浮微粒、細懸浮微粒、及超細懸浮微粒，乃評價空氣污染及定量健康危害的指標性污染物。其中，一般所稱之PM10以及PM2.5，分別指空氣動力學粒徑不大於10微米以及不大於2.5微米的懸浮微粒。懸浮微粒可經由呼吸而進入呼吸道，微粒大小則決定其在呼吸道沉積的位置，一般而言，粒徑大於10微米的懸浮微粒會被鼻腔絨毛阻攔，也可透過咳嗽排出人體，粒徑不大於10微米的懸浮微粒（例如PM10以及PM2.5）則可能進入肺部而沉積於肺泡組織中。
PM2.5的化學組成包括原生性懸浮微粒及衍生性懸浮微粒兩大類，前者主要包括重金屬、戴奧辛、多環芳香烴、有機碳等，後者則主要包括硝酸鹽、硫酸鹽（亞硫酸鹽）等。PM2.5因具體積小、重量輕等特色，故可長時間滯留於大氣中並進行傳播，造成大範圍的空氣污染。
研究發現，當PM2.5進入肺部並沉積於肺泡組織中時，即可能導致肺部損傷，造成肺部發炎，進而出現胸悶（肺活量降低、呼吸阻力增加）、咳嗽、痰液增多等症狀，影響個體健康狀態與生活品質。PM2.5或其他因素引起的嚴重肺部損傷可能會導致肺功能下降或喪失，甚至演變成慢性阻塞性肺病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）、特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）、肺氣腫（emphysema）、慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）、急性呼吸窘迫綜合症（acute respiratory distress syndrome，ARDS）、支氣管肺發育不良（broncho- pulmonary dysplasia，BPD）、阻塞性細支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）、及╱或隱源性機化性肺炎（cryptogenic organizing pneumonia，COP）等疾病。然而，迄今尚無可以有效隔絕PM2.5的手段，人們在生活中仍會不斷受到汽機車、工廠、火力發電廠等所排放之廢氣以及日常油煙、香煙等空氣汙染的侵擾。因此，持續開發可有效地調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的藥物或方法，以緩和或解除胸悶症狀（提升肺活量、降低呼吸阻力）、減少咳嗽、及／或減少痰液，改善空氣汙染對個體健康狀態與生活品質造成的影響，乃有其必需性及迫切性。
本案發明人研究發現，茯苓萃取物及其所含土莫酸（tumulosic acid，TA）、去氫土莫酸（dehydrotumulosic acid，DTA）、去氫栓菌酸（dehydrotrametenolic acid，DTTA）、及茯苓新酸A（poricoic acid A，PAA）等成分，皆可有效抑制基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteases，MMPs）之分泌量、表現量及活性的上升、抑制膠原蛋白之分泌及累積、抑制黏蛋白（mucin）之表現量，故可用於調節、預防、及／或治療肺部損傷（特別是因為懸浮微粒所引起的肺部損傷），從而可用於提供調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病之組合物。
本發明之一目的，在於提供一種使用茯苓萃取物於製備一組合物之用途，其中該組合物係用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病。較佳地，該茯苓萃取物係包含以下之至少一者：土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及茯苓新酸A。較佳地，該茯苓萃取物係茯苓之極性溶劑萃取物，該極性溶劑係選自水、C1-C4醇類、及前述之組合。較佳地，該茯苓萃取物係以下至少一者：茯苓肉部萃取物、茯苓皮部萃取物、及茯苓發酵產物之萃取物。該組合物係一食品組合物或醫藥組合物，其中該食品組合物係健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
本發明之另一目的，在於提供一種使用一活性成分於製備一用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病之組合物的用途，其中，該活性成分係選自以下群組：土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、茯苓新酸A、及其組合。較佳地，該活性成分係以植物萃取物或真菌萃取物的形式提供。該組合物係一食品組合物或醫藥組合物，該食品組合物可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
本發明之又一目的，在於提供一種用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的組合物，其中，該組合物係一食品組合物或醫藥組合物且係包含一有效量之上述活性成分或茯苓萃取物。其中，該食品組合物可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
本發明之再一目的，在於提供一種調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之上述活性成分或茯苓萃取物。上述活性成分或茯苓萃取物較佳係以一食品組合物或醫藥組合物的形式投予至該個體，該食品組合物可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
上述根據本發明之組合物或方法，係有效於抑制MMPs及／或黏蛋白之表現及／或活性，故可用於肺部損傷或以下肺部損傷相關疾病之調節、預防、及／或治療：慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化、肺氣腫、慢性支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合症、支氣管肺發育不良、阻塞性細支氣管炎、及隱源性機化性肺炎。前述肺部損傷，尤其是指因懸浮微粒所引起者。前述MMPs包括例如：基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotease-9，MMP-9）及基質金屬蛋白酶-12（matrix metalloprotease-9，MMP-12）。前述黏蛋白包括例如：黏蛋白5AC（Mucin 5AC）
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」，係指投予至個體時，可至少部分改善懷疑個體的肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病之劑量；所謂「個體」係指人類或非人的哺乳動物。
於本說明書中，所謂「肺部損傷」，係指肺臟結構完整性或肺臟功能遭到破壞或減損；所謂MMPs的「活性表現」，係由MMPs的分泌量、表現量以及活性所共同影響的結果；所謂「調節肺部損傷」，係指緩和或解除胸悶症狀（增加肺活量、降低呼吸阻力）、減少咳嗽、及／或減少痰液；所謂「治療」，不應被解釋為治療一個體直至完全恢復，而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、降低一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質。
本說明書中所使用之數值範圍（例如5至100）應理解為亦包含在該範圍中的所有有理數以及在該範圍中之任何有理數所組成的範圍，因此，本說明書中所使用之數值範圍係包含介於所列舉之最低值與最高值之間的數值的所有可能組合。另，當本文於數值前使用「約」時，實質上代表與所述數值相差在10%以內者，較佳在5%以內者。
茯苓藥材一般係指茯苓真菌（Poria cocos (Schw.) Wolf）之乾燥菌核。茯苓真菌常寄生在松樹根上，外皮呈淡棕色或黑褐色（茯苓皮部），內部則呈粉紅色或白色（茯苓肉部）。茯苓發酵產物則是指，將茯苓菌株接種於基質之後，置於20℃至35℃、相對濕度30%至70%之環境，避光發酵數週至數月所獲得之發酵產物。
如上述，當懸浮微粒（例如PM2.5）進入肺部並沉積於肺泡組織中時，即可能刺激肺部組織，引起不當或過度活化的免疫反應而導致肺部損傷，進而出現肺活量降低、呼吸阻力增加、咳嗽、痰液增多等症狀。研究已知，當動物肺部組織受到刺激時，活化的炎症細胞會分泌MMPs，破壞肺部組織構造，造成更嚴重的肺部損傷，而導致肺功能下降或喪失，甚至演變成慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化、肺氣腫、慢性支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合症等疾病，另外如支氣管肺發育不良、阻塞性細支氣管炎、及╱或隱源性機化性肺炎等疾病也與MMPs的過度活化有關。舉例言之，炎症細胞的MMPs活性過度表現會對肺部組織造成損害。
然而，當刺激存在或損害發生時，動物體內的因應機制會自行啟動，促進肺部纖維母細胞分泌膠原蛋白，然而，膠原蛋白過度分泌也可能導致包含肺實質（如肺泡）、肺間質（如結締組織及血管）等肺部組織的纖維化。換言之，在不接受任何治療的情形下，肺部組織持續受到刺激或損害係可能導致肺纖維化。
MMPs乃一群對鋅離子具有特殊依賴性的肽鏈內切酶（endopeptidase），具有降解胞外基質（ECM）的特性，能調節血管生成及組織重塑。MMPs依其分辦與降解基質蛋白的能力，可大致分類為第一基質金屬蛋白酶（如膠原酶）、第二型基質金屬蛋白酶（如明膠酶及彈性蛋白酶）、第三型基質金屬蛋白酶（如溶酶素）及第四型基質金屬蛋白酶（如膜型基質金屬蛋白酶）。
MMP-9又稱為明膠酶B，分類上歸屬於第二型基質金屬蛋白酶，係MMPs家族中分子量最大之明膠酶且存在於多種生物體內，兼具降解明膠、第IV型及第V型膠原蛋白之能力，故被認為是調節胞外基質降解的主要酵素。MMP-12係一彈性蛋白酶，分類上亦屬於第二型基質金屬蛋白酶，具有降解彈性蛋白之能力，亦為調節胞外基質降解的重要酵素之一。
於正常情形下，動物體組織內之MMP-9及MMP-12的產生及活性皆受到嚴密的調控而不會輕易活化，但在特殊刺激存在的情形下（例如肺部組織受到香煙煙霧或空氣中的有害顆粒刺激），肺部組織中的上皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞及內皮細胞等皆可被誘導產生MMP-9，肺部組織中的上皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞及嗜中性白血球等細胞皆可被誘導產生MMP-9及MMP-12。經誘導產生之MMP-9及MMP-12則可進一步破壞肺部組織，致使炎症細胞（如巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、自然殺傷細胞及樹突狀細胞等）能移出及聚集於標靶器官，加重組織內的炎性反應。有研究指出，肺部組織中細胞之MMP-9及／或MMP-12活性表現失調（過度分泌或過度活化）與肺部損傷的產生密切相關。
在肺部組織中受到刺激的情形下，氣道黏液亦會過度分泌，氣道黏液過度分泌是慢性阻塞性肺病或慢性支氣管炎等肺部損傷相關疾病的標誌性病理特徵之一，牽涉複雜的病理機轉。在氣道黏液過度分泌的個體可觀察到痰液增多的現象，增多的痰液積聚於氣管及肺部，使得氣道變窄、呼吸阻力增加，甚至可能導致氣道嚴重阻塞。
高分子量的黏蛋白是氣道黏液中最重要的成分，其中含量最高的為黏蛋白5AC，其次則為黏蛋白4B。在慢性阻塞性肺病或肺氣腫等肺部損傷相關疾病的患者痰液中，可檢測到黏蛋白5AC和黏蛋白4B表現量增高的情況，顯示患者的氣道黏液過度分泌與這兩種黏蛋白的過度表達具有相關性。目前氣道黏液產生和分泌的分子機制可透過體外細胞試驗模型（如人類肺黏膜上皮細胞株NCI-H292）或動物試驗模型得到很好的闡釋。
本案發明人研究發現，茯苓萃取物及其所含之土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及茯苓新酸A等成分，皆可有效抑制LPS所誘導之MMPs活性表現及／或黏蛋白表現量上升、及／或抑制TGF-β所誘導之膠原蛋白過度分泌及累積，故可用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病，其中，該肺部損傷尤其是懸浮微粒所引起者。該肺部損傷相關疾病係包括：慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化、肺氣腫、慢性支氣管炎、急性呼吸窘迫綜合症、支氣管肺發育不良、阻塞性細支氣管炎、及隱源性機化性肺炎。咸信本發明所使用之茯苓萃取物、土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及／或茯苓新酸A，係經由降低MMPs之活性表現、尤其是經由降低MMP-9及／或MMP-12之活性表現，及／或經由降低黏蛋白之表現量、尤其是經由降低黏蛋白5AC之表現量，以調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病。咸信本發明之使用茯苓萃取物、土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及／或茯苓新酸A，可經由調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病以增加肺活量、降低呼吸阻力、減少咳嗽、及／或減少痰液。
因此，本發明係提供一種使用茯苓萃取物於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的應用，其中該肺部損傷尤指懸浮微粒所引起者，包括使用茯苓萃取物於製備一用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病之組合物的用途、對有需要之個體投予茯苓萃取物以調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的方法、以及提供一包含茯苓萃取物的組合物。
根據本發明，所採用之茯苓萃取物可以是一透過使用一極性溶劑以萃取茯苓原料所提供之萃取液。其中，該茯苓原料可以是茯苓肉部、茯苓皮部及／或茯苓發酵產物；該極性溶劑可以是水、C1-C4醇類、或前述之組合。較佳地，係使用水、乙醇、或其組合作為該極性溶劑。可視需要調整用於萃取之極性溶劑與茯苓的用量比率，一般而言，極性溶劑的用量並無特殊限制，只要可使原料均勻分散即可。於本發明一具體實施態樣中，係使用乙醇作為極性溶劑，並以體積比約1：8的茯苓原料：乙醇，將茯苓原料分散於乙醇中，以進行萃取。
於上述萃取操作中，係進行該萃取一段時間以達到所欲的萃取程度。以採用乙醇作為該極性溶劑為例，通常為至少1小時，較佳為至少2小時，更佳為至少3小時，且可視需要輔以例如水沉（即，於萃取液中加入適量的純水，以去除水溶性雜質）、煎煮、冷卻、過濾、減壓濃縮、樹脂管柱層析等其它操作。
根據本發明所採用之茯苓萃取物亦可以是一乾燥物，此乾燥物可透過乾燥前述萃取液而提供。為儘可能達到最大的萃取效益，視需要地，可以相同或不同極性溶劑重複萃取茯苓原料，並合併該多次萃取所得之萃取液，其後進行乾燥。其中，各萃取操作可以相同或不同的極性溶劑進行。
視需要地，可以對茯苓萃取液或乾燥物依序進行一或多次的鹼化及酸化處理，以提升萃取液或乾燥物中之總茯苓三萜（尤其是土莫酸及去氫土莫酸）的含量。其中，若係針對乾燥物進行鹼化及酸化處理，則可於完成該鹼化及酸化之後，再次進行乾燥，以提供最終乾燥物。
所謂「鹼化」係指使採用任何合宜之鹼性物質，以提高物料（於本發明係指前述透過使用極性溶劑以萃取茯苓原料所提供之萃取液）的pH值。一般而言，係於鹼化處理步驟中將物料之pH值提升到不小於約10；較佳是提升到不小於約11；更佳是提升到不小於約12。於本發明一具體實施態樣中，係於鹼化處理中添加使用1N的氫氧化鈉，以提升該萃取液的pH值到約12。在提升萃取液之pH值後，視需要於升溫下進行鹼化反應。舉例言之，該鹼化反應係於不小於50℃的溫度下進行，較佳係於不小於60℃的溫度下進行。如後附實施例所示，可以於例如約70℃的溫度下進行鹼化反應。
所謂「酸化」係指採用任何合宜之酸性物質，以調降物料（於本發明係指前述經鹼化之萃取液）之pH值。於本發明一具體實施態樣中，係使用鹽酸以調降經鹼化之萃取液的pH值。一般而言，該酸化處理所達之pH值的調降程度並無特殊要求，只要有降低pH值即可。舉例言之，係使萃取液之pH值調降至少約3.0，較佳係調降至少約4.0。於本發明一具體實施態樣中，係於酸化處理中將經鹼化之萃取液的pH值調降至約7。
如後附實施例所示，於根據本發明所採用之茯苓萃取物中，係含有土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及茯苓新酸A之至少一成分。
本發明亦提供一種使用一活性成分於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的應用，該肺部損傷尤指因懸浮微粒所引起者，其中該活性成分係選自以下群組：土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、茯苓新酸A、及其組合。前述應用包括使用該活性成分於製備一用於調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病之組合物的用途、對有需要之個體投予該活性成分以調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的方法、以及提供一包含該活性成分的組合物。該活性成分可以植物萃取物或真菌萃取物的形式提供，且該組合物係一食品組合物或醫藥組合物。
根據本發明之應用所提供之組合物可以是一食品組合物或一醫藥組合物，其中該食品組合物可以是健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品，且可製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品，但不以此為限。
根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用，端視投予個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群（例如老年人、兒童、青少年、孕婦、糖尿病患者、腎臟病患者、運動員等）之需要，調整根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品及特殊營養食品中之茯苓萃取物、土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及／或茯苓新酸A的含量，例如，調整至每日應服用的量。
針對根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品及／或特殊營養食品，可於其外包裝上標示建議使用量、特定族群（例如老年人、兒童、青少年、孕婦、糖尿病患者、腎臟病患者、運動員等）的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項等，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下自行服用而無安全疑慮。
視需要地，可於根據本發明所提供之食品組合物或醫藥組合物中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該食品組合物或醫藥組合物於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該食品組合物或醫藥組合物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
根據本發明所提供之醫藥組合物係可呈任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組合物可以口服或非經口服（例如：皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、鼻腔、及皮膚）之投藥方式施用至有需要之個體上。其中，視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該醫藥組合物，其中，該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以適於口服之劑型為例，於根據本發明所提供之醫藥組合物中係可含有任何不會不利影響本發明活性成分（即，茯苓萃取物、土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及茯苓新酸A之至少一者）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土（sugar bentonite）、及前述之組合。可利用任何合宜之方法，將該醫藥組合物以適於口服投藥的劑型提供，例如：錠劑（例如糖衣錠）、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
至於適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之針劑或點滴劑，則可於根據本發明所提供之醫藥組合物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液（如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液）、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組合物。或者，可將該醫藥組合物製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，提供所欲之注射劑。
根據本發明所提供之醫藥組合物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康況狀而異。於根據本發明所提供之醫藥組合物中，可視實際應用需求，調整本發明活性成分（即，茯苓萃取物、土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及茯苓新酸A之至少一者）於組合物中的含量比例。此外，該醫藥組合物可視需要另含一或多種其他活性成分，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分之效益沒有不利的影響即可。
本發明亦提供一種調節、預防、及／或治療肺部損傷及／或肺部損傷相關疾病的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之上述活性成分（即，茯苓萃取物、土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、及茯苓新酸A之至少一者）。有關該活性成分之態樣、投予途徑、投予形式、施用頻率、以及相關之應用等，均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[ 製備實施例 ]
A. 茯苓萃取物之製備
A-1. 取茯苓藥材（來源產地為雲南），清洗後剝取其外皮（下稱「茯苓皮部」），其餘即為肉部（下稱「茯苓肉部」）。
A-2. 茯苓肉部萃取物之製備
(A-2-1) 取 A-1 所獲得之茯苓肉部，於室溫下，以1：8（茯苓藥材：75%乙醇水溶液）的體積比浸泡於75%乙醇水溶液中，歷時12小時，然後煮沸並進行萃取（歷時3小時）。重複前述萃取步驟，共三次。合併三次萃取所得的萃取液並過濾以去除不溶物，以獲得一粗萃液。接著，對前述粗萃液進行減壓濃縮以去除乙醇，再以噴霧乾燥機進行乾燥，以獲得一茯苓肉部粗萃物粉末。
(A-2-2) 取 A-2-1 所獲得之茯苓肉部粗萃物粉末，以1：10（粗萃物粉末：純水）的體積比均勻分散於純水中。接著，加入氫氧化鈉使該混合物的鹼濃度為1N（即，使該混合物的pH值提升至約12），再倒入溫度維持於70℃的調製桶中且均勻攪拌直至反應完全。然後，以12N的濃鹽酸進行中和，使該混合物的pH值下降至7，再於室溫下以1000（rpm）進行離心（以平板式離心機），歷時30分鐘，再經過濾並去除濾液，並以純水清洗剩餘之不溶物。將該不溶物烘乾並研磨成粉末後，以1：40（不溶物：95%乙醇水溶液）之體積比使用95%乙醇水溶液進行萃取，重複該萃取步驟，共三次，合併三次萃取所得萃取液並進行減壓濃縮以去除乙醇，獲得一茯苓肉部萃取物（下稱「萃取物A」）。
(A-2-3) 取 A-2-2 所獲得之茯苓肉部萃取物A，以1：20（濃縮物：純水）的體積比均勻分散於純水中。加入氫氧化鈉以提升該混合物的pH值至少大於11.7。將該混合物於室溫下以1000 rpm進行離心（以平板式離心機），歷時30分鐘後，收集剩餘的不溶物，並將該不溶物以12N的濃鹽酸進行中和，使其pH值下降至7，再經過濾並去除濾液，以純水清洗剩餘之不溶物，將該不溶物烘乾並進行研磨，獲得一茯苓肉部萃取物粉末（下稱「萃取物B」）。
A-3. 茯苓皮部萃取物之製備
(A-3-1) 取 A-1 所獲得之茯苓皮部，於室溫下，以1：8（茯苓藥材：75%乙醇）的體積比浸泡於75%乙醇水溶液中，歷時12小時，然後煮沸並進行萃取（歷時3小時）。重複前述萃取步驟，共三次。合併三次萃取所得的萃取液並過濾以去除不溶物，以獲得一粗萃液。接著，對前述之粗萃液進行減壓濃縮以去除乙醇，獲得一濃縮粗萃液。於前述濃縮粗萃液中加入適量的純水，以去除水溶性雜質。不溶沉澱物再以噴霧乾燥機進行乾燥，以獲得一茯苓皮部粗萃物粉末。
(A-3-2) 取 A-3-1 所獲得之茯苓皮部粗萃物粉末，以1：8（粗萃物粉末：乙醇水溶液）的體積比與95%乙醇水溶液混合，並進行萃取（歷時3小時）獲得一萃取液，接著，再以噴霧乾燥機對前述萃取液進行乾燥，獲得一茯苓皮部萃取物（下稱「萃取物C」）。
A-4. 茯苓混合藥材萃取物之製備
(A-4-1) 取 A-1 所獲得之茯苓皮部及茯苓肉部（皮部：肉部 = 1：2），於室溫下，以1：8（茯苓藥材：75%乙醇）的體積比浸泡於75%乙醇水溶液中，歷時12小時，然後煮沸並進行萃取（歷時3小時）。重複前述萃取步驟，共三次。合併三次萃取所得的萃取液並過濾以去除不溶物，以獲得一粗萃液。接著，對前述之粗萃液進行減壓濃縮以去除乙醇，獲得一濃縮粗萃液。於前述濃縮粗萃液中加入適量的純水，以去除水溶性雜質。不溶沉澱物再經減壓濃縮，獲得一茯苓混合藥材浸膏，並收集剩餘之茯苓混合藥材藥渣。
(A-4-2) 取 A-4-1 所獲得之茯苓混合藥材浸膏，以噴霧乾燥機進行乾燥，獲得一粉末。將前述粉末與95%乙醇水溶液，以1：8（粉末：乙醇水溶液）的體積比混合，並進行萃取（歷時3小時）獲得一萃取液，接著，再以噴霧乾燥機對前述萃取液進行乾燥，獲得一茯苓混合藥材萃取物（下稱「萃取物D」）。
(A-4-3) 取 A-4-1 所剩餘之茯苓混合藥材藥渣，以1：10（藥渣：純水）的體積比與純水混合，並進行萃取（歷時3小時）。重複前述萃取步驟，共二次。合併二次萃取所得的萃取液並過濾以去除不溶物，以獲得一粗萃液。接著，取前述粗萃液與 A-4-1 所獲得之茯苓混合藥材浸膏混合。接著，再以噴霧乾燥機對前述混合物進行乾燥，以獲得一茯苓混合藥材萃取物（下稱「萃取物E」）。
A-5. 茯苓發酵產物萃取物之製備
(A-5-1) 取茯苓菌株（Poria cocos ；其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，寄存菌種編號為BCRC39126），以直徑5毫米（mm）之菌塊的接種量接種於麥芽抽出物培養基（malt extract agar，MEA；麥芽抽出物購自醫微生物科技有限公司，產品編號：218630；洋菜購自醫微生物科技有限公司，產品編號：LP0011）平板上，接著，將接種有茯苓菌株的MEA平板置於溫度為27±5℃、相對濕度為40±10%的條件下，以進行茯苓菌株預活化，歷時約6天。關於前述茯苓菌株之預活化，亦可以馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基（potato dextrose agar，PDA；購自醫微生物科技有限公司，產品編號：254920）平板取代MEA平板而進行。
(A-5-2) 取 A-5-1 所提供之長有預活化之茯苓菌株（即，茯苓菌塊）的麥芽抽出物培養基（MEA）平板，分別接種於基質表面（接種量：於每組基質上接種1/6平板面積的茯苓菌塊）。接著，於避光、溫度為20℃至35℃以及相對濕度為30%至70%的條件下進行發酵培養，歷時數週至數月，以獲得一茯苓發酵產物。
(A-5-3) 取 A-5-2 所提供之各組茯苓發酵產物，以60℃熱風進行乾燥並打粉，以獲得一茯苓發酵產物粉末。接著，以超音波震盪對該粉末進行酒精萃取（使用95%乙醇水溶液），重複前述萃取步驟，共三次。合併三次萃取所得的萃取液並過濾以去除不溶物，以獲得一粗萃取物。於60℃下，對前述粗萃取物進行減壓濃縮以去除乙醇，以獲得一茯苓發酵產物萃取物（下稱「萃取物F」）。
B. 茯苓萃取物之成分分析
以液相層析／紫外光／質譜儀（LC／UV／MS，liquid chromatography coupled to diode array UV detection and mass spectrometry），分別於243奈米及210奈米波長下，檢測[製備實施例A]所提供之萃取物A至F的成分。
結果顯示，萃取物A至D及F皆不含茯苓多醣。萃取物A及萃取物B皆含有土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、及3-表-去氫土莫酸等成分。萃取物C係含有茯苓酸、去氫茯苓酸、土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表-去氫土莫酸、去氫栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氫層孔菌酸、茯苓新酸B、及層孔菌酸等成分。萃取物D至F則皆含有茯苓酸、去氫茯苓酸、土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表-去氫土莫酸、去氫栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氫層孔菌酸、茯苓新酸B及層孔菌酸等成分。
接著，以高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）定量該萃取物中各成分的含量。其中，萃取物A的分析結果示於表1，萃取物B的分析結果示於表2，萃取物C的分析結果示於表3。
表1
Figure 107100143-A0304-0001
表2
Figure 107100143-A0304-0002
表3
Figure 107100143-A0304-0003
C. 茯苓萃取物之活性成分的製備
C-1. 以1：500（萃取物：甲醇）的體積比，將[製備實施例A]所提供之萃取物F均勻溶解於甲醇中。過濾去除不溶物後，以製備級高效能液相層析儀（以甲醇與水混合作為移動相），分別於243奈米及210奈米波長下，針對茯苓酸、去氫茯苓酸、土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表-去氫土莫酸、去氫栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氫層孔菌酸、茯苓新酸B及層孔菌酸進行分離及收集，收集後再以減壓濃縮機去除甲醇，分別得到茯苓酸、去氫茯苓酸、土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表-去氫土莫酸、去氫栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氫層孔菌酸、茯苓新酸B及層孔菌酸。[製備實施例A]所提供之萃取物A至E亦可經由前述步驟而分離出其中所含之成分。
C-2. 以液相層析／紫外光／質譜儀，分別於243奈米及210奈米波長下檢測 C-1 所獲得之茯苓酸、去氫茯苓酸、土莫酸、去氫土莫酸、豬苓酸C、3-表-去氫土莫酸、去氫栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氫層孔菌酸、茯苓新酸B及層孔菌酸，結果顯示該等成分的純度皆大於98%。
實施例 1 ：茯苓萃取物及其活性成分於抑制 MMPs 之表現及／或活性的效果
如上述說明，當動物肺部組織發生發炎反應，活化的炎症細胞會分泌MMPs，破壞肺部組織構造，造成更嚴重的肺部損傷，而導致肺功能下降或喪失。為探討茯苓萃取物及其活性成分是否具有抑制炎症細胞之MMPs分泌量、表現量、及活性的效果，係以明膠酵素圖譜法（gelatin zymography）及西方墨點法（Western blot）測試茯苓萃取物及其活性成分對於脂多糖（LPS）所活化之大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株的MMP-9活性表現（其係由MMP-9之分泌量、表現量與活性共同影響）的抑制率。
（ 1-1 ）
將大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株（購自ATCC，CRL-2192™）分成十五組並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： (1) 空白組：巨噬細胞生長培養基； (2) 對照組：含有LPS（購自Sigma-Aldrich）（1 微克／毫升）的巨噬細胞生長培養基； (3) 正控制組：含有LPS（1 微克／毫升）與Dexamethacone（一種皮質類固醇，簡稱「Dex」；購自Sigma-Aldrich）（1 微莫耳濃度）的巨噬細胞生長培養基，； (4) 萃取物A組（共三組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例A-2-2]所提供之萃取物A的巨噬細胞生長培養基，其中，萃取物A於該三組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、及25微克／毫升； (5) 萃取物B組（共三組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例A-2-3]所提供之萃取物B的巨噬細胞生長培養基，其中，萃取物B於該三組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、及25微克／毫升； (6) TA組（共三組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之土莫酸（TA）的巨噬細胞生長培養基，其中，土莫酸（TA）於該三組培養基中的濃度分別為3.13、6.25、及12.5微克／毫升；以及 (7) DTA組（共三組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之去氫土莫酸（DTA）的巨噬細胞生長培養基，其中，去氫土莫酸（DTA）於該三組培養基中的濃度分別為3.13、6.25、及12.5微克／毫升。
其後，收集各組細胞培養液，並分別以下述步驟進行處理：以含有0.2% gelatin的10%聚丙烯酰胺凝膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳結束後，將凝膠浸泡於2.5% Triton X-100溶液中90分鐘以洗去SDS，再以雙蒸餾水（distillation-distillation water，ddH2 O）浸泡30分鐘，最後置於反應溶液（50 毫莫耳濃度Tris-HCl緩衝液，含10 毫莫耳濃度CaCl2 、0.02% NaN3 ）中，於37℃下反應18小時。反應完成後，以考馬斯亮藍（Coomassie blue）染色液進行凝膠染色，擷取染色後的凝膠影像並進行影像分析。各組凝膠上之反白條帶（表示此區域的明膠被MMPs分解，其係對應約95kD之分子量）的影像強度（以面積大小及顏色深淺計算）即可反映出不同條件下大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株的MMP-9活性表現（將空白組的結果設為0%、對照組的結果設為100%，計算其他各組之MMP-9的相對活性表現）。結果示於表4。
表4
Figure 107100143-A0304-0004
實驗結果顯示，經 1 微克／毫升LPS誘導之大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株，其MMP-9活性表現明顯上升。
由表4可知，Dex在LPS濃度為 1 微克／毫升時無法抑制MMP-9的活性表現。然而，萃取物A、萃取物B、及土莫酸（萃取物A及萃取物B之主要成分），對LPS所誘導之MMP-9活性表現上升皆具有良好的抑制效果，其中，萃取物B與土莫酸的效果更呈現出明顯的劑量-反應關係（dose-response relationship），濃度25微克／毫升的萃取物B、及12.5微克／毫升的土莫酸皆可完全地抑制LPS所誘導之MMP-9活性表現上升。前述結果顯示，萃取物A、萃取物B、土莫酸（萃取物A及萃取物B之主要成分）皆可有效降低MMPs之活性表現上升，且效果優於Dex，故皆可用於開發幫助調節動物體內MMPs活性表現的食品或醫藥品。
（ 1-2 ）
將大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株分成二十八組並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： (1) 空白組：巨噬細胞生長培養基； (2) 對照組：含有LPS（1 微克／毫升）的巨噬細胞生長培養基 (3) 正控制組：含有LPS（1 微克／毫升）與Prednisolone（一種皮質類固醇，簡稱「Pred」；購自Sigma-Aldrich）（5 微莫耳濃度）的巨噬細胞生長培養基； (4) 萃取物C組（共五組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例A-3-2]所提供之萃取物C的巨噬細胞生長培養基，其中，萃取物C於該五組培養基中的濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升； (5) 萃取物D組（共五組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例A-4-2]所提供之萃取物D的巨噬細胞生長培養基，其中，萃取物D於該五組培養基中的濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升； (6) 萃取物E組（共五組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例A-4-3]所提供之萃取物E的巨噬細胞生長培養基，其中，萃取物E於該五組培養基中的濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升； (7) DTTA組（共五組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之去氫栓菌酸（DTTA）的巨噬細胞生長培養基，其中，去氫栓菌酸（DTTA）於該五組培養基中的濃度分別為0.39、0.78、1.56、3.13、及6.25微克／毫升；以及(8) PAA組（共五組）：含有LPS（1微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之茯苓新酸A（PAA）的巨噬細胞生長培養基，其中，茯苓新酸A（PAA）於該五組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、25、50、及100微克／毫升。
接著，比照（1-1）之試驗方法進行分析，結果示於表5。
表5
Figure 107100143-A0304-0005
實驗結果顯示，經 1 微克／毫升LPS誘導之大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株，其MMP-9活性表現明顯上升。另一方面，Pred（於本實驗中作為正控制組）對濃度 1 微克／毫升LPS所誘導之MMP-9活性表現抑制效果不佳。萃取物C及萃取物D對濃度 1 微克／毫升LPS所誘導之MMP-9活性表現上升皆無明顯抑制效果。
由表5可知，Pred在LPS濃度為 1 微克／毫升時無法有效抑制MMP-9的活性表現。然而，萃取物E、去氫栓菌酸及茯苓新酸A對LPS所誘導之MMP-9活性表現上升皆具有抑制效果，其中，茯苓新酸A的抑制效果較佳且呈現出明顯的劑量-反應關係。前述結果顯示，茯苓萃取物E、去氫栓菌酸及茯苓新酸A皆可降低MMPs之活性表現上升，且效果優於Pred（推測也優於Dex），皆可用於開發幫助調節動物體內MMPs活性表現的食品或醫藥品。
（ 1-3 ）
將大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株分成六組並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： (1) 對照組：含有LPS（0.01 微克／毫升）的巨噬細胞生長培養基； (2) 正控制組：含有LPS（0.01 微克／毫升）與Dex（1 微莫耳濃度）的巨噬細胞生長培養基； (3) 萃取物A組（共四組）：含有LPS（0.01 微克／毫升）與[製備實施例A-2-2]所提供之萃取物A的巨噬細胞生長培養基，其中，萃取物A於該四組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、25、及50微克／毫升；
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測pro-form MMP-9（即，酶原形式之MMP-9）、active-form MMP-9（即，活化型之MMP-9）、MMP-12等蛋白的表現。最後，以對照組的結果為基準（即，將對照組之表現量設為1倍），計算其他各組細胞之pro-form MMP-9、active-form MMP-9、或MMP-12的相對表現量，結果示於第1A圖至第1C圖。
由第1A圖至第1C圖可知，相較於對照組，萃取物A組之pro-form MMP-9、active-form MMP-9、及MMP-12的表現量皆較低，其中，50微克／毫升之萃取物A對active-form MMP-9及MMP-12表現量的抑制率可分別達到38%及35%。
（ 1-4 ）
將大鼠肺泡巨噬細胞NR8383細胞株分成十組並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： (1) 對照組：含有LPS（0.01 微克／毫升）的巨噬細胞生長培養基； (2) 正控制組：含有LPS（0.01 微克／毫升）與Dex（1 微莫耳濃度）的巨噬細胞生長培養基； (3) TA組（共四組）：含有LPS（0.01 微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之土莫酸（TA）的巨噬細胞生長培養基，其中，土莫酸（TA）於該四組培養基中的濃度分別為1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升；以及 (4) PAA組（共四組）：含有LPS（0.01 微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之茯苓新酸A（PAA）的巨噬細胞生長培養基，其中，茯苓新酸A（PAA）於該四組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、25、及50微克／毫升。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測pro-form MMP-9（即，酶原形式之MMP-9）、active-form MMP-9（即，活化型之MMP-9）、MMP-12等蛋白的表現。最後，以對照組的結果為基準（即，將對照組之表現量設為1倍），計算其他各組細胞之pro-form MMP-9、active-form MMP-9、或MMP-12的相對表現量，結果示於第2A圖至第2C圖、及第3A圖至第3C圖。
由第2A圖至第2C圖可知，相較於對照組，土莫酸組之pro-form MMP-9、active-form MMP-9、及MMP-12的表現量皆較低，其中，12.5微克／毫升之土莫酸對pro-form MMP-9、active-form MMP-9、及MMP-12表現量的抑制率可分別達到53%、100%及45%。由第3A圖至第3C圖可知，茯苓新酸A對pro-form MMP-9、active-form MMP-9、及MMP-12的表現量皆具抑制效果，其中，茯苓新酸A對於active-form MMP-9抑制效果最明顯，50微克／毫升之茯苓新酸A對active-form MMP-9表現量的抑制率可達到44%。
（1-3）及（1-4）的結果再次顯示，萃取物A、土莫酸及茯苓新酸A對LPS所誘導之MMPs活性表現上升皆具有抑制效果，故可用於用開發幫助調節動物體內MMPs活性表現的食品或醫藥品。
實施例 2 ：茯苓萃取物及其活性成分於抑制膠原蛋白分泌／累積的效果
如上述說明，MMPs的活性過度表現會對肺部組織造成損害，但在大多數的情形下，動物體內的修復機制會自行啟動，其中巨噬細胞會分泌TGF-β，TGF-β則會促進肺部纖維母細胞分泌膠原蛋白以修補受損組織，然而，膠原蛋白過度分泌也可能導致肺纖維化。為探討茯苓萃取物及其活性成分是否具有調節、預防、及／或治療肺纖維化等肺部損傷相關疾病的效果，係以天狼猩紅（Picrosirius Red，PSR）染色法進行膠原蛋白半定量，測試茯苓萃取物及其活性成分對於TGF-β所誘導之肌纖維母細胞WI38細胞株的胞內膠原蛋白累積量的抑制率。
（ 2-1 ）
將肌纖維母細胞WI38細胞株（購自ATCC，產品編號CCL75TM ）分成十組並分別以如下培養基進行培養，歷時48小時： (1) 空白組：肌纖維母細胞生長培養基； (2) 對照組：含有TGF-β（購自R&D Systems）（1 奈克／毫升）的纖維母細胞生長培養基； (3) 正控制組：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與Pirfenidone（簡稱「Pir」；購自Sigma-Aldrich）（200 微克／毫升）的纖維母細胞生長培養基； (4) 萃取物A組（共四組）：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例A-2-2]所提供之萃取物A的纖維母細胞生長培養基，其中，萃取物A於該四組培養基中的濃度分別為12.5、25、50、及100微克／毫升；以及 (5) 萃取物B組（共三組）：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例A-2-3]所提供之萃取物B的纖維母細胞生長培養基，其中，萃取物B於該三組培養基中的濃度分別為12.5、25、及50微克／毫升。
接著，移除培養基，加入甲醇並置於-20℃下，歷時1至2小時，以固定細胞。以PBS清洗細胞後，加入0.1%之天狼星紅染劑（購自Sigma-Aldrich），於室溫下作用4小時。以0.1%醋酸溶液清洗細胞後，再以0.1N氫氧化鈉溶解細胞並測量OD540（即，波長540 nm下的吸光值）。各組的OD540值係代表各組的膠原蛋白含量，可反映不同條件下纖維母細胞WI38細胞株的膠原蛋白含量（將空白組的結果設為0%、對照組的結果設為100%，計算其他各組之膠原蛋白相對含量）。結果示於表6。
表6
Figure 107100143-A0304-0006
由表6可知，萃取物A或萃取物B對TGF-β所誘導之細胞內膠原蛋白分泌及累積具有抑制效果，且高濃度之萃取物A或萃取物B效果優於Pir（於本實驗中作為正控制組）。另一方面，以直線迴歸法分別計算萃取物A及萃取物B的半數有效濃度（簡稱「ED50」，即，萃取物A或萃取物B將TGF-β所誘導之膠原蛋白累積量的上升幅度抑制至對照組之50%時的濃度），其中，萃取物A之ED50為50至80微克／毫升，萃取物B之ED50則為26至28微克／毫升。前述結果顯示，萃取物A及萃取物B皆可有效抑制肺部細胞過度分泌膠原蛋白、抑制膠原蛋白過度累積，故可用於肺部損傷相關疾病（尤其是肺纖維化）之調節、預防及／或治療，且萃取物B之效果略優於萃取物A。
（ 2-2 ）
將肌纖維母細胞WI38細胞株分成二十八組並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： (1) 空白組：肌纖維母細胞生長培養基； (2) 對照組：含有TGF-β（購自R&D Systems）（1 奈克／毫升）的纖維母細胞生長培養基； (3) 正控制組：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與Pirfenidone（簡稱「Pir」；購自Sigma-Aldrich）（200 微克／毫升）的纖維母細胞生長培養基； (4) 萃取物C組（共五組）：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例A-3-2]所提供之萃取物C的纖維母細胞生長培養基，其中，萃取物C於該五組培養基中的濃度分別為0.78、1.56、3.125、6.25、及12.5微克／毫升； (5) 萃取物D組（共五組）：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例A-4-2]所提供之萃取物D的纖維母細胞生長培養基，其中，萃取物D於該五組培養基中的濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升； (6) 萃取物E組（共五組）：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例A-4-3]所提供之萃取物E的纖維母細胞生長培養基，其中，萃取物E於該五組培養基中的濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升； (7) DTTA組（共五組）：含有TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之去氫栓菌酸（DTTA）的纖維母細胞生長培養基，其中，去氫栓菌酸（DTTA）於該五組培養基中的濃度分別為0.39、0.78、1.56、3.13、及6.25微克／毫升；以及 (8) PAA組（共五組）：含有LPS TGF-β（1 奈克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之茯苓新酸A（PAA）的纖維母細胞生長培養基，其中，茯苓新酸A（PAA）於該五組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、25、50、及100微克／毫升。
接著，比照（2-1）之試驗方法進行分析。結果示於表7。
表7
Figure 107100143-A0304-0007
由表7可知，萃取物C、D、E及前述三者之主要成分（去氫栓菌酸、茯苓新酸A）對TGF-β所誘導之細胞內膠原蛋白累積皆具有抑制效果，其中，萃取物E與茯苓新酸A的抑制效果更呈現劑量-反應關係。前述結果顯示，萃取物C、D、E及前述三者之主要成分（去氫栓菌酸、茯苓新酸A）皆可有效抑制肺部細胞過度分泌膠原蛋白、抑制膠原蛋白過度累積，故可用於肺部損傷相關疾病（尤其是肺纖維化）之調節、預防及／或治療。
實施例 3 ：茯苓萃取物之活性成分於抑制黏蛋白表現量的效果
如上述說明，在慢性阻塞性肺病或肺氣腫等肺部損傷相關疾病患者氣道可觀察到的氣道黏液過度分泌現象，該現象與肺部組織中黏蛋白的過度表達有關。氣道黏液過度分泌表現的病患會有痰液增多的症狀，增多的痰液積聚於氣管及肺部將使得氣道變窄，導致呼吸阻力增加。為探討茯苓萃取物的活性成分是否具有調節、預防、及／或治療慢性阻塞性肺病或肺氣腫等肺部損傷相關疾病的效果，係以西方墨點法測試茯苓萃取物之活性成分（土莫酸及茯苓新酸A）對於LPS所誘導之人類肺黏膜上皮細胞NCI-H292細胞株的Mucin 5AC表現量的抑制率。
將人類肺黏膜上皮細胞NCI-H292細胞株分成十組並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： (1) 對照組：含有LPS（1 微克／毫升）的上皮細胞生長培養基； (2) 正控制組：含有LPS（1 微克／毫升）與Dex（10 微莫耳濃度）的上皮細胞生長培養基； (3) TA組（共四組）：含有LPS（1 微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之土莫酸（TA）的上皮細胞生長培養基，其中，土莫酸（TA）於該四組培養基中的濃度分別為1.56、3.13、6.25、及12.5微克／毫升；以及 (4) PAA組（共四組）：含有LPS（1 微克／毫升）與[製備實施例C-1]所提供之茯苓新酸A（PAA）的上皮細胞生長培養基，其中，茯苓新酸A（PAA）於該四組培養基中的濃度分別為6.25、12.5、25、及50微克／毫升。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測Mucin 5AC的表現量。最後，以對照組的結果為基準（即，將對照組之表現量設為1倍），計算其他各組細胞之Mucin 5AC的相對表現量，結果示於第4A圖及第4B圖。
由第4A圖及第4B圖可知，相較於對照組，土莫酸（TA）組、及茯苓新酸A（PAA）組對LPS所誘導之Mucin 5AC表現量皆具抑制效果，其中，低劑量（1.56微克／毫升）與高劑量（12.5微克／毫升）之土莫酸對Mucin 5AC表現量的抑制率分別可達到75%及81%，低劑量（6.25微克／毫升）及高劑量（50微克／毫升）之茯苓新酸A對Mucin 5AC表現量的抑制率分別可達到65%及87%。
上述結果顯示，茯苓萃取物之活性成分土莫酸及茯苓新酸A對LPS所誘導之Mucin 5AC表現量上升皆具有抑制效果，故可用於用開發幫助調節動物體內Mucin 5AC表現量的食品或醫藥品，而可緩解痰液過度增多的現象。
如上述實施例所示，本發明茯苓萃取物及／或其活性成分確實可抑制有效抑制LPS所誘導之MMPs活性表現及／或黏蛋白表現量上升、及／或抑制TGF-β所誘導之膠原蛋白過度分泌及累積，故可用於調節、預防及／或治療肺部損傷，尤其是懸浮微粒所引起之肺部損傷。
第1A圖至第1C圖係顯示以西方墨點法檢測，茯苓萃取物對脂多糖（簡稱「LPS」）所誘導之MMPs表現量上升之影響的長條圖，其中，第1A圖所示為pro-form MMP-9之相對表現量，第1B圖所示為active-form MMP-9之相對表現量，第1C圖所示為MMP-12之相對表現量；
第2A圖至第2C圖係顯示以西方墨點法檢測，土莫酸對LPS所誘導之MMPs表現量上升之影響的長條圖，其中，第2A圖所示為pro-form MMP-9之相對表現量，第2B圖所示為active-form MMP-9之相對表現量，第2C圖所示為MMP-12之相對表現量；
第3A圖至第3C圖係顯示以西方墨點法檢測，茯苓新酸A對LPS所誘導之MMPs表現量上升之影響的長條圖，其中，第3A圖所示為pro-form MMP-9之相對表現量，第3B圖所示為active-form MMP-9之相對表現量，第3C圖所示為MMP-12之相對表現量；以及
第4A圖及第4B圖係顯示以西方墨點法檢測，土莫酸及茯苓新酸A分別對LPS所誘導之Mucin 5AC表現量上升之影響的長條圖，其中，第4A圖所示為對照組、正控制組、以及土莫酸組之結果，第4B圖所示為對照組、正控制組、以及茯苓新酸A之結果。

Claims (20)

  1. 一種使用茯苓肉部萃取物於製備一組合物之用途，其中該組合物係用於調節、預防、及/或治療以下之至少一者：慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、肺氣腫(emphysema)、急性呼吸窘迫綜合症(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、支氣管肺發育不良(broncho-pulmonary dysplasia，BPD)、及阻塞性細支氣管炎(bronchiolitis obliterans，BO)。
  2. 如請求項1之用途，其中該茯苓肉部萃取物係包含以下之至少一者：土莫酸(tumulosic acid，TA)及去氫土莫酸(dehydrotumulosic acid，DTA)。
  3. 如請求項1之用途，其中該茯苓肉部萃取物係茯苓肉部之極性溶劑萃取物，該極性溶劑係選自以下群組：水、C1-C4醇類、及前述之組合。
  4. 如請求項1之用途，其中該茯苓肉部萃取物係不含茯苓多醣。
  5. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該組合物係一食品組合物或醫藥組合物。
  6. 如請求項5之用途，其中該食品組合物係健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
  7. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該組合物係用於降低基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)之表現及/或活性。
  8. 如請求項7之用途，其中該基質金屬蛋白酶係基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)及基質金屬蛋白酶-12(matrix metalloprotease-9，MMP-12)之至少一者。
  9. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該組合物係用於降低黏蛋白(mucin)之表現。
  10. 如請求項9之用途，其中該黏蛋白係黏蛋白5AC(mucin 5AC)。
  11. 如請求項1至4中任一項之用途，其中該組合物係用於增加肺活量、降低呼吸阻力、減少咳嗽、及/或減少痰液。
  12. 一種使用一活性成分於製備一組合物的用途，其中該組合物用於調節、預防、及/或治療慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化、肺氣腫、急性呼吸窘迫綜合症、支氣管肺發育不良、及阻塞性細支氣管炎之至少一者，且該活性成分係選自以下群組：土莫酸、去氫土莫酸、去氫栓菌酸、茯苓新酸A、及其組合。
  13. 如請求項12之用途，其中該活性成分係以植物萃取物或真菌萃取物的形式提供。
  14. 如請求項12或13之用途，其中該組合物係一食品組合物或醫藥組合物。
  15. 如請求項14之用途，其中該食品組合物係健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
  16. 如請求項12或13之用途，其中該組合物係用於降低基質金屬蛋白酶之表現及/或活性。
  17. 如請求項16之用途，其中該基質金屬蛋白酶係基質金屬蛋白酶-9或基質金屬蛋白酶-12之至少一者。
  18. 如請求項12或13之用途，其中該組合物係用於降低黏蛋白之表現。
  19. 如請求項18之用途，其中該黏蛋白係黏蛋白5AC。
  20. 如請求項12或13之用途，其中該組合物係用於增加肺活量、降低呼吸阻力、減少咳嗽、及/或減少痰液。
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