CN108261429B - 茯苓萃取物及其活性成分于调节、预防及／或治疗肺部损伤的用途 - Google Patents

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Abstract

一种使用茯苓萃取物及/或其活性成分于制备一组合物的用途，其中该组合物用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病，且其中该活性成分选自以下群组：土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸、茯苓新酸A及其组合。摘要附图：图1B。

Description

茯苓萃取物及其活性成分于调节、预防及／或治疗肺部损伤的 用途
技术领域
本发明涉及茯苓(FU-LING(Poria cocos))萃取物及/或其活性成分的应用，尤其涉及其于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的应用。前述肺部损伤，尤其是指因悬浮微粒(Particulate Matter，PM) 所引起的。
背景技术
肺脏是呼吸系统的核心，主要由支气管、小支气管、肺泡管及肺泡所组成，结构为海绵状，柔软且具有弹性。肺脏主要负责体内的气体交换，包括将氧气从空气中运输到血液中，以及将二氧化碳从血液中排出体外。近年的研究发现，肺部损伤所导致的肺功能下降或丧失，不仅会影响整个呼吸系统，也可能对全身性的水分代谢、血液循环、免疫系统等造成影响。因此，即使是轻微的肺部损伤也不容忽视。
造成肺部损伤的原因包括胸部严重外伤、有害物质(例如有毒气体、胃内容物、海水等)的吸入、肺部感染等。随着经济及工业发展，运输工具、工厂以及焚烧垃圾长期排放大量废气(包括悬浮微粒、二氧化硫、一氧化碳、二氧化氮、臭氧)，造成严重的空气污染。漂浮在空气中的大气污染粒状物通称为悬浮微粒，其主要来源为交通污染、工业污染物、农业污染、民生污染(例如油烟、香烟等)等，组成复杂且形态多样化。悬浮微粒依其颗粒大小可大分为粗悬浮微粒、细悬浮微粒及超细悬浮微粒，乃是评价空气污染及定量健康危害的指标性污染物。其中，一般所称的PM10以及PM2.5，分别指空气动力学粒径不大于10微米以及不大于2.5微米的悬浮微粒。悬浮微粒可通过呼吸而进入呼吸道，微粒大小则决定其在呼吸道沉积的位置，一般而言，粒径大于10微米的悬浮微粒会被鼻腔绒毛阻拦，也可通过咳嗽排出人体，粒径不大于10微米的悬浮微粒(例如PM10以及PM2.5)则可能进入肺部而沉积于肺泡组织中。
PM2.5的化学组成包括原生性悬浮微粒及衍生性悬浮微粒两大类，前者主要包括重金属、戴奥辛、多环芳香烃、有机碳等，后者则主要包括硝酸盐、硫酸盐(亚硫酸盐)等。PM2.5因具体积小、重量轻等特色，故，可长时间滞留于大气中并进行传播，造成大范围的空气污染。
研究发现，当PM2.5进入肺部并沉积于肺泡组织中时，即可能导致肺部损伤，造成肺部发炎，进而出现胸闷(肺活量降低、呼吸阻力增加)、咳嗽、痰液增多等症状，影响个体健康状态与生活质量。PM2.5或其他因素引起的严重肺部损伤可能会导致肺功能下降或丧失，甚至演变成慢性阻塞性肺病 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)、特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)、肺气肿(emphysema)、慢性支气管炎(chronic bronchitis，CB)、急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distresssyndrome，ARDS)、支气管肺发育不良(broncho-pulmonary dysplasia，BPD)、阻塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans，BO)及╱或隐源性机化性肺炎 (cryptogenicorganizing pneumonia，COP)等疾病。然而，迄今尚无可以有效隔绝PM2.5的手段，人们在生活中仍会不断受到汽机车、工厂、火力发电厂等所排放的废气以及日常油烟、香烟等空气污染的侵扰。因此，持续开发可有效地调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的药物或方法，以缓和或解除胸闷症状(提升肺活量、降低呼吸阻力)、减少咳嗽及 /或减少痰液，改善空气污染对个体健康状态与生活质量造成的影响，乃有其必需性及迫切性。
本发明人研究发现，茯苓萃取物及其所含有的土莫酸(tumulosic acid， TA)、去氢土莫酸(dehydrotumulosic acid，DTA)、去氢栓菌酸 (dehydrotrametenolic acid，DTTA)及茯苓新酸A(poricoic acid A，PAA) 等成分，都可有效抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs) 的分泌量、表现量及活性的上升、抑制胶原蛋白的分泌及累积、抑制黏蛋白 (mucin)的表现量，故可用于调节、预防及/或治疗肺部损伤(特别是因为悬浮微粒所引起的肺部损伤)，从而可用于提供调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的组合物。
发明内容
本发明的一目的，在于提供一种使用茯苓萃取物于制备一组合物的用途，其中，该组合物用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病。较佳地，该茯苓萃取物包括以下的至少一者：土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及茯苓新酸A。较佳地，该茯苓萃取物为茯苓的极性溶剂萃取物，该极性溶剂选自水、C1-C4醇类及前述的组合。较佳地，该茯苓萃取物为以下至少一者：茯苓肉部萃取物、茯苓皮部萃取物及茯苓发酵产物的萃取物。该组合物为医药组合物。
其中，该茯苓萃取物不含茯苓多醣。
其中，该肺部损伤相关疾病为以下的至少一者：慢性阻塞性肺病(ChronicObstructive Pulmonary Disease，COPD)、特发性肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis，IPF)、肺气肿(emphysema)、慢性支气管炎(chronic bronchitis，CB)及急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome， ARDS)。
其中，该肺部损伤相关疾病为以下的至少一者：支气管肺发育不良 (broncho-pulmonary dysplasia，BPD)、阻塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans，BO)及隐源性机化性肺炎(cryptogenic organizing pneumonia， COP)。
其中，该组合物通过降低基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases， MMPs)的表现及/或活性以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病。
其中，该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)及基质金属蛋白酶-12(matrix metalloprotease-9，MMP-12)的至少一者。
其中，该组合物通过降低黏蛋白(mucin)的表现以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病。
其中，该黏蛋白为黏蛋白5AC(mucin 5AC)。
其中，该组合物通过调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病以增加肺活量、降低呼吸阻力、减少咳嗽及/或减少痰液。
其中，该组合物用于调节、预防及/或治疗悬浮微粒(particulate matter， PM)所引起的肺部损伤。
本发明的另一目的，在于提供一种使用一活性成分于制备一用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的组合物的用途，其中，该活性成分选自以下群组：土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸、茯苓新酸A 及其组合。较佳地，该活性成分以植物萃取物或真菌萃取物的形式提供。该组合物为医药组合物。
其中，该肺部损伤相关疾病为以下的至少一者：慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺气肿、慢性支气管炎及急性呼吸窘迫综合症。
其中，该肺部损伤相关疾病为以下的至少一者：支气管肺发育不良、阻塞性细支气管炎及隐源性机化性肺炎。
其中，该组合物通过降低基质金属蛋白酶的表现及/或活性以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病。
其中，该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-9或基质金属蛋白酶-12的至少一者。
其中，该组合物通过降低黏蛋白(mucin)的表现以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病。
其中，该黏蛋白为黏蛋白5AC。
其中，该活性成分通过调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病以增加肺活量、降低呼吸阻力、减少咳嗽及/或减少痰液。
其中，该组合物用于调节、预防及/或治疗悬浮微粒(particulate matter， PM)所引起的肺部损伤。
本发明的一目的，在于提供一种用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及 /或肺部损伤相关疾病的组合物，其中，该组合物为医药组合物且包括一有效量的上述活性成分或茯苓萃取物。
本发明的一目的，在于提供一种调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的方法，其包括对一有需要的个体投予一有效量的上述活性成分或茯苓萃取物。上述活性成分或茯苓萃取物较佳是以医药组合物的形式投予至该个体。
上述根据本发明的组合物或方法，有效于抑制MMPs及/或黏蛋白的表现及/或活性，故可用于肺部损伤或以下肺部损伤相关疾病的调节、预防及 /或治疗：慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合症、支气管肺发育不良、阻塞性细支气管炎及隐源性机化性肺炎。前述肺部损伤，尤其是指因悬浮微粒所引起的。前述MMPs包括例如：基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9，MMP-9)及基质金属蛋白酶-12 (matrix metalloprotease-9，MMP-12)。前述黏蛋白包括例如：黏蛋白5AC (Mucin5AC)
附图说明
图1A至图1C显示以西方墨点法检测，茯苓萃取物对脂多糖(简称LPS) 所诱导的MMPs表现量上升的影响的直方图，其中，图1A所示为pro-form MMP-9的相对表现量，图1B所示为active-form MMP-9的相对表现量，图1C 所示为MMP-12的相对表现量；
图2A至图2C显示以西方墨点法检测，土莫酸对LPS所诱导的MMPs表现量上升的影响的直方图，其中，图2A所示为pro-form MMP-9的相对表现量，图2B所示为active-formMMP-9的相对表现量，图2C所示为MMP-12的相对表现量；以及
图3A至图3C显示以西方墨点法检测，茯苓新酸A对LPS所诱导的MMPs 表现量上升的影响的直方图，其中，图3A所示为pro-form MMP-9的相对表现量，图3B所示为active-form MMP-9的相对表现量，图3C所示为MMP-12的相对表现量。
图4A至图4B显示以西方墨点法检测，土莫酸及茯苓新酸A分别对LPS所诱导的Mucin 5AC表现量上升的影响的直方图，其中，图4A所示为对照组、正控制组以及土莫酸组的结果，图4B所示为对照组、正控制组以及茯苓新酸 A的结果。
具体实施方式
本发明的详细技术内容及部分具体实施例，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。
以下将根据本发明的部分具体实施例进行描述；但是，在不背离本发明精神下，本发明还可以多种不同形式的实施例来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中 (尤其是在权利要求书中)所使用之“一”、“该”及类似用语应理解为包括单数及复数形式；所谓“有效量”是指投予至个体时，可至少部分改善怀疑个体的肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的剂量；所谓“个体”是指人类或非人的哺乳动物。
于本说明书中，所谓“肺部损伤”是指肺脏结构完整性或肺脏功能遭到破坏或减损；所谓MMPs的“活性表现」”是由MMPs的分泌量、表现量以及活性所共同影响的结果；所谓“调节肺部损伤”是指缓和或解除胸闷症状(增加肺活量、降低呼吸阻力)、减少咳嗽及/或减少痰液；所谓“治疗”不应被解释为治疗一个体直至完全恢复，而应包括将一个体的疾病进展或症状维持在一实质上静态的程度、增加一个体的恢复速率、降低一具体病况的严重性或提高一患者的生命质量。
本说明书中所使用的数值范围(例如5至100)应理解为也包括在该范围中的所有有理数以及在该范围中的任何有理数所组成的范围，因此，本说明书中所使用的数值范围包括介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合。另外，当本文于数值前使用“约”时，实质上代表与所述数值相差在10％以内，较佳在5％以内。
茯苓药材一般是指茯苓真菌(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核。茯苓真菌常寄生在松树根上，外皮呈淡棕色或黑褐色(茯苓皮部)，内部则呈粉红色或白色(茯苓肉部)。茯苓发酵产物则是指，将茯苓菌株接种于基质之后，置于20℃至35℃、相对湿度30％至70％的环境，避光发酵数周至数月所获得的发酵产物。
如上所述，当悬浮微粒(例如PM2.5)进入肺部并沉积于肺泡组织中时，即可能刺激肺部组织，引起不当或过度活化的免疫反应而导致肺部损伤，进而出现肺活量降低、呼吸阻力增加、咳嗽、痰液增多等症状。研究已知，当动物肺部组织受到刺激时，活化的炎症细胞会分泌MMPs，破坏肺部组织构造，造成更严重的肺部损伤，而导致肺功能下降或丧失，甚至演变成慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合症等疾病，另外如支气管肺发育不良、阻塞性细支气管炎及╱或隐源性机化性肺炎等疾病也与MMPs的过度活化有关。举例言之，炎症细胞的MMPs活性过度表现会对肺部组织造成损害。
然而，当刺激存在或损害发生时，动物体内的因应机制会自行启动，促进肺部纤维母细胞分泌胶原蛋白，然而，胶原蛋白过度分泌也可能导致包括肺实质(如肺泡)、肺间质(如结缔组织及血管)等肺部组织的纤维化。换言之，在不接受任何治疗的情形下，肺部组织持续受到刺激或损害可能导致肺纤维化。
MMPs乃是一群对锌离子具有特殊依赖性的肽链内切酶 (endopeptidase)，具有降解胞外基质(ECM)的特性，能调节血管生成及组织重塑。MMPs依其分办与降解基质蛋白的能力，可大致分类为第一基质金属蛋白酶(如胶原酶)、第二型基质金属蛋白酶(如明胶酶及弹性蛋白酶)、第三型基质金属蛋白酶(如溶酶素)及第四型基质金属蛋白酶(如膜型基质金属蛋白酶)。
MMP-9又称为明胶酶B，分类上归属于第二型基质金属蛋白酶，为MMPs 家族中分子量最大的明胶酶且存在于多种生物体内，兼具降解明胶、第IV型及第V型胶原蛋白的能力，故被认为是调节胞外基质降解的主要酵素。 MMP-12为一弹性蛋白酶，分类上也属于第二型基质金属蛋白酶，具有降解弹性蛋白的能力，也为调节胞外基质降解的重要酵素之一。
于正常情形下，动物体组织内的MMP-9及MMP-12的产生及活性都受到严密的调控而不会轻易活化，但在特殊刺激存在的情形下(例如肺部组织受到香烟烟雾或空气中的有害颗粒刺激)，肺部组织中的上皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞等都可被诱导产生MMP-9，肺部组织中的上皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞及嗜中性白血球等细胞都可被诱导产生MMP-9 及MMP-12。经诱导产生的MMP-9及MMP-12则可进一步破坏肺部组织，致使炎症细胞(如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞及树突状细胞等)能移出及聚集于标靶器官，加重组织内的炎性反应。有研究指出，肺部组织中细胞的MMP-9及/或MMP-12活性表现失调(过度分泌或过度活化)与肺部损伤的产生密切相关。
在肺部组织中受到刺激的情形下，气道黏液也会过度分泌，气道黏液过度分泌是慢性阻塞性肺病或慢性支气管炎等肺部损伤相关疾病的标志性病理特征之一，牵涉复杂的病理机转。在气道黏液过度分泌的个体可观察到痰液增多的现象，增多的痰液积聚于气管及肺部，使得气道变窄、呼吸阻力增加，甚至可能导致气道严重阻塞。
高分子量的黏蛋白是气道黏液中最重要的成分，其中含量最高的为黏蛋白5AC，其次则为黏蛋白4B。在慢性阻塞性肺病或肺气肿等肺部损伤相关疾病的患者痰液中，可检测到黏蛋白5AC和黏蛋白4B表现量增高的情况，显示患者的气道黏液过度分泌与这两种黏蛋白的过度表达具有相关性。目前气道黏液产生和分泌的分子机制可通过体外细胞试验模型(如人类肺黏膜上皮细胞株NCI-H292)或动物试验模型得到很好的阐释。
本发明人研究发现，茯苓萃取物及其所含有的土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及茯苓新酸A等成分，都可有效抑制LPS所诱导的MMPs活性表现及 /或黏蛋白表现量上升及/或抑制TGF-β所诱导的胶原蛋白过度分泌及累积，故可用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病，其中，该肺部损伤尤其是悬浮微粒所引起的。该肺部损伤相关疾病包括：慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合症、支气管肺发育不良、阻塞性细支气管炎及隐源性机化性肺炎。相信本发明所使用的茯苓萃取物、土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及/或茯苓新酸 A，通过降低MMPs的活性表现、尤其是通过降低MMP-9及/或MMP-12的活性表现，及/或通过降低黏蛋白的表现量、尤其是通过降低黏蛋白5AC的表现量，以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病。相信本发明所使用的茯苓萃取物、土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及/或茯苓新酸A，可通过调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病以增加肺活量、降低呼吸阻力、减少咳嗽及/或减少痰液。
因此，本发明提供一种使用茯苓萃取物于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的应用，其中该肺部损伤尤指悬浮微粒所引起的，包括使用茯苓萃取物于制备一用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/ 或肺部损伤相关疾病的组合物的用途、对有需要的个体投予茯苓萃取物以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的方法、以及提供一包括茯苓萃取物的组合物。
根据本发明，所采用的茯苓萃取物可以是一通过使用一极性溶剂以萃取茯苓原料所提供的萃取液。其中，该茯苓原料可以是茯苓肉部、茯苓皮部及 /或茯苓发酵产物；该极性溶剂可以是水、C1-C4醇类或前述的组合。较佳地，使用水、乙醇或其组合作为该极性溶剂。可视需要调整用于萃取的极性溶剂与茯苓的用量比率，一般而言，极性溶剂的用量并无特殊限制，只要可使原料均匀分散即可。于本发明一具体实施例中，使用乙醇作为极性溶剂，并以体积比约1：8的茯苓原料：乙醇，将茯苓原料分散于乙醇中，以进行萃取。
于上述萃取操作中，进行该萃取一段时间以达到所欲的萃取程度。以采用乙醇作为该极性溶剂为例，通常为至少1小时，较佳为至少2小时，更佳为至少3小时，且可视需要辅以例如水沉(即，于萃取液中加入适量的纯水，以去除水溶性杂质)、煎煮、冷却、过滤、减压浓缩、树脂管柱层析等其它操作。
根据本发明所采用的茯苓萃取物也可以是一干燥物，此干燥物可通过干燥前述萃取液而提供。为尽可能达到最大的萃取效益，视需要地，可以相同或不同极性溶剂重复萃取茯苓原料，并合并该多次萃取所得的萃取液，其后进行干燥。其中，各萃取操作可以相同或不同的极性溶剂进行。
视需要地，可以对茯苓萃取液或干燥物依序进行一或多次的碱化及酸化处理，以提升萃取液或干燥物中的总茯苓三萜(尤其是土莫酸及去氢土莫酸) 的含量。其中，若是针对干燥物进行碱化及酸化处理，则可于完成该碱化及酸化之后，再次进行干燥，以提供最终干燥物。
所谓“碱化”是指使采用任何合宜的碱性物质，以提高物料(于本发明是指前述通过使用极性溶剂以萃取茯苓原料所提供的萃取液)的pH值。一般而言，于碱化处理步骤中将物料的pH值提升到不小于约10；较佳是提升到不小于约11；更佳是提升到不小于约12。于本发明一具体实施例中，于碱化处理中添加使用1N的氢氧化钠，以提升该萃取液的pH值到约12。在提升萃取液的pH值后，视需要于升温下进行碱化反应。举例言之，该碱化反应于不小于50℃的温度下进行，较佳于不小于60℃的温度下进行。如后附实施例所示，可以于例如约70℃的温度下进行碱化反应。
所谓“酸化”是指采用任何合宜的酸性物质，以调降物料(于本发明是指前述经碱化的萃取液)的pH值。于本发明一具体实施例中，使用盐酸以调降经碱化的萃取液的pH值。一般而言，该酸化处理所达的pH值的调降程度并无特殊要求，只要有降低pH值即可。举例言之，使萃取液的pH值调降至少约3.0，较佳调降至少约4.0。于本发明一具体实施例中，于酸化处理中将经碱化的萃取液的pH值调降至约7。
如后附实施例所示，于根据本发明所采用的茯苓萃取物中，含有土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及茯苓新酸A的至少一成分。
本发明也提供一种使用一活性成分于调节、预防及/或治疗肺部损伤及 /或肺部损伤相关疾病的应用，该肺部损伤尤指因悬浮微粒所引起的，其中该活性成分选自以下群组：土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸、茯苓新酸A 及其组合。前述应用包括使用该活性成分于制备一用于调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的组合物的用途、对有需要的个体投予该活性成分以调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的方法以及提供一包括该活性成分的组合物。该活性成分可以植物萃取物或真菌萃取物的形式提供，且该组合物为医药组合物。
根据本发明的应用所提供的组合物可以是医药组合物。
视需要地，可于根据本发明所提供的医药组合物中另外含有合宜用量的添加剂，例如可提高该医药组合物于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该医药组合物的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。
根据本发明所提供的医药组合物可呈任何合宜的型式，并无特殊限制，端视所欲的用途而呈对应的合宜剂型。举例言之，但不以此为限，该医药组合物可以口服或非经口服(例如：皮下、静脉内、肌肉、腹腔、鼻腔及皮肤) 的投药方式施用至有需要的个体上。其中，视使用形式及用途而定，可选用合宜的载剂以提供该医药组合物，其中，该载剂包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。
以适于口服的剂型为例，于根据本发明所提供的医药组合物中可含有任何不会不利影响本发明活性成分(即，茯苓萃取物、土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及茯苓新酸A的至少一者)的所欲效益的医药上可接受的载剂，例如：水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、纤维素、淀粉、糖膨润土(sugar bentonite)及前述的组合。可利用任何合宜的方法，将该医药组合物以适于口服投药的剂型提供，例如：锭剂(例如糖衣锭)、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、酊剂等。
至于适于皮下、静脉内、肌肉或腹腔注射的针剂或点滴剂，则可于根据本发明所提供的医药组合物中含有一或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂或干粉悬液注射剂等剂型提供该医药组合物。或者，可将该医药组合物制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，提供所欲的注射剂。
根据本发明所提供的医药组合物可以一日一次、一日多次或数日一次等不同投药频率施用，端视投予个体的需求、年龄、体重及健康况状而异。于根据本发明所提供的医药组合物中，可视实际应用需求，调整本发明活性成分(即，茯苓萃取物、土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及茯苓新酸A的至少一者)于组合物中的含量比例。此外，该医药组合物可视需要另外含有一或多种其他活性成分，或者与含有该一或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该医药组合物的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分的效益没有不利的影响即可。
本发明也提供一种调节、预防及/或治疗肺部损伤及/或肺部损伤相关疾病的方法，其包括对一有需要的个体投予一有效量的上述活性成分(即，茯苓萃取物、土莫酸、去氢土莫酸、去氢栓菌酸及茯苓新酸A的至少一者)。有关该活性成分的形态、投予途径、投予形式、施用频率以及相关的应用等，均如上述说明。
现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围应以权利要求书所界定为准。
实施例
[制备实施例]
A.茯苓萃取物的制备
A-1.取茯苓药材(来源产地为云南)，清洗后剥取其外皮(下称茯苓皮部)，其余即为肉部(下称茯苓肉部)。
A-2.茯苓肉部萃取物的制备
(A-2-1)取A-1所获得的茯苓肉部，于室温下，以1：8(茯苓药材：75％乙醇水溶液)的体积比浸泡于75％乙醇水溶液中，历时12小时，然后煮沸并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物，以获得一粗萃液。接着，对前述粗萃液进行减压浓缩以去除乙醇，再以喷雾干燥机进行干燥，以获得一茯苓肉部粗萃物粉末。
(A-2-2)取A-2-1所获得的茯苓肉部粗萃物粉末，以1：10(粗萃物粉末：纯水)的体积比均匀分散于纯水中。接着，加入氢氧化钠使该混合物的碱浓度为1N(即，使该混合物的pH值提升至约12)，再倒入温度维持于70℃的调制桶中且均匀搅拌直至反应完全。然后，以12N的浓盐酸进行中和，使该混合物的pH值下降至7，再于室温下以1000(rpm)进行离心(以平板式离心机)，历时30分钟，再经过滤并去除滤液，并以纯水清洗剩余的不溶物。将该不溶物烘干并研磨成粉末后，以1：40(不溶物：95％乙醇水溶液)的体积比使用95％乙醇水溶液进行萃取，重复该萃取步骤，共三次，合并三次萃取所得萃取液并进行减压浓缩以去除乙醇，获得一茯苓肉部萃取物(下称萃取物A)。
(A-2-3)取A-2-2所获得的茯苓肉部萃取物A，以1：20(浓缩物：纯水) 的体积比均匀分散于纯水中。加入氢氧化钠以提升该混合物的pH值至少大于 11.7。将该混合物于室温下以1000rpm进行离心(以平板式离心机)，历时30 分钟后，收集剩余的不溶物，并将该不溶物以12N的浓盐酸进行中和，使其 pH值下降至7，再经过滤并去除滤液，以纯水清洗剩余的不溶物，将该不溶物烘干并进行研磨，获得一茯苓肉部萃取物粉末(下称萃取物B)。
A-3.茯苓皮部萃取物的制备
(A-3-1)取A-1所获得的茯苓皮部，于室温下，以1：8(茯苓药材：75％乙醇)的体积比浸泡于75％乙醇水溶液中，历时12小时，然后煮沸并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物，以获得一粗萃液。接着，对前述的粗萃液进行减压浓缩以去除乙醇，获得一浓缩粗萃液。于前述浓缩粗萃液中加入适量的纯水，以去除水溶性杂质。不溶沉淀物再以喷雾干燥机进行干燥，以获得一茯苓皮部粗萃物粉末。
(A-3-2)取A-3-1所获得的茯苓皮部粗萃物粉末，以1：8(粗萃物粉末：乙醇水溶液)的体积比与95％乙醇水溶液混合，并进行萃取(历时3小时)获得一萃取液，接着，再以喷雾干燥机对前述萃取液进行干燥，获得一茯苓皮部萃取物(下称萃取物C)。
A-4.茯苓混合药材萃取物的制备
(A-4-1)取A-1所获得的茯苓皮部及茯苓肉部(皮部：肉部＝1：2)，于室温下，以1：8(茯苓药材：75％乙醇)的体积比浸泡于75％乙醇水溶液中，历时12小时，然后煮沸并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物，以获得一粗萃液。接着，对前述的粗萃液进行减压浓缩以去除乙醇，获得一浓缩粗萃液。于前述浓缩粗萃液中加入适量的纯水，以去除水溶性杂质。不溶沉淀物再经减压浓缩，获得一茯苓混合药材浸膏，并收集剩余的茯苓混合药材药渣。
(A-4-2)取A-4-1所获得的茯苓混合药材浸膏，以喷雾干燥机进行干燥，获得一粉末。将前述粉末与95％乙醇水溶液，以1：8(粉末：乙醇水溶液)的体积比混合，并进行萃取(历时3小时)获得一萃取液，接着，再以喷雾干燥机对前述萃取液进行干燥，获得一茯苓混合药材萃取物(下称萃取物D)。
(A-4-3)取A-4-1所剩余的茯苓混合药材药渣，以1：10(药渣：纯水) 的体积比与纯水混合，并进行萃取(历时3小时)。重复前述萃取步骤，共两次。合并两次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物，以获得一粗萃液。接着，取前述粗萃液与A-4-1所获得的茯苓混合药材浸膏混合。接着，再以喷雾干燥机对前述混合物进行干燥，以获得一茯苓混合药材萃取物(下称萃取物E)。
A-5.茯苓发酵产物萃取物的制备
(A-5-1)取茯苓菌株(Poria cocos；其寄存于财团法人食品工业发展研究所，寄存菌种编号为BCRC39126)，以直径5毫米(mm)的菌块的接种量接种于麦芽抽出物培养基(maltextractagar，MEA；麦芽抽出物购自医微生物科技有限公司，产品编号：218630；洋菜购自医微生物科技有限公司，产品编号：LP0011)平板上，接着，将接种有茯苓菌株的MEA平板置于温度为27±5℃、相对湿度为40±10％的条件下，以进行茯苓菌株预活化，历时约6 天。关于前述茯苓菌株的预活化，也可以马铃薯葡萄糖洋菜培养基(potato dextrose agar，PDA；购自医微生物科技有限公司，产品编号：254920)平板取代MEA平板而进行。
(A-5-2)取A-5-1所提供的长有预活化的茯苓菌株(即，茯苓菌块) 的麦芽抽出物培养基(MEA)平板，分别接种于基质表面(接种量：于每组基质上接种1/6平板面积的茯苓菌块)。接着，于避光、温度为20℃至35℃以及相对湿度为30％至70％的条件下进行发酵培养，历时数周至数月，以获得一茯苓发酵产物。
(A-5-3)取A-5-2所提供的各组茯苓发酵产物，以60℃热风进行干燥并打粉，以获得一茯苓发酵产物粉末。接着，以超音波震荡对该粉末进行酒精萃取(使用95％乙醇水溶液)，重复前述萃取步骤，共三次。合并三次萃取所得的萃取液并过滤以去除不溶物，以获得一粗萃取物。于60℃下，对前述粗萃取物进行减压浓缩以去除乙醇，以获得一茯苓发酵产物萃取物(下称萃取物F)。
B.茯苓萃取物的成分分析
以液相层析/紫外光/质谱仪(LC/UV/MS，liquid chromatography coupled todiode array UV detection and mass spectrometry)，分别于243纳米及 210纳米波长下，检测[制备实施例A]所提供的萃取物A至F的成分。
结果显示，萃取物A至D及F都不含茯苓多醣。萃取物A及萃取物B都含有土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C及3-表-去氢土莫酸等成分。萃取物C含有茯苓酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表-去氢土莫酸、去氢栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氢层孔菌酸、茯苓新酸B及层孔菌酸等成分。萃取物D至F则都含有茯苓酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表-去氢土莫酸、去氢栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氢层孔菌酸、茯苓新酸B及层孔菌酸等成分。
接着，以高效液相色谱法(high performance liquid chromatography， HPLC)定量该萃取物中各成分的含量。其中，萃取物A的分析结果示于表1，萃取物B的分析结果示于表2，萃取物C的分析结果示于表3。
表1
Figure GDA0003852583850000171
Figure GDA0003852583850000181
表2
成分 重量％
茯苓多醣(Poria cocos polysaccharides) －
茯苓酸(pachymic acid，PA) －
去氢茯苓酸(dehydropachymic acid，DPA) －
土莫酸(tumulosic acid，TA) 47.72
去氢土莫酸(dehydrotumulosic acid，DTA) 18.42
猪苓酸C(polyporenic acid C，PAC) 2.93
3-表-去氢土莫酸(3-epi-dehydrotumulosic acid，EDTA) 0.81
表3
Figure GDA0003852583850000182
Figure GDA0003852583850000191
C.茯苓萃取物的活性成分的制备
C-1.以1：500(萃取物：甲醇)的体积比，将[制备实施例A]所提供的萃取物F均匀溶解于甲醇中。过滤去除不溶物后，以制备级高效能液相层析仪 (以甲醇与水混合作为移动相)，分别于243纳米及210纳米波长下，针对茯苓酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表-去氢土莫酸、去氢栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氢层孔菌酸、茯苓新酸B及层孔菌酸进行分离及收集，收集后再以减压浓缩机去除甲醇，分别得到茯苓酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、3-表-去氢土莫酸、去氢栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氢层孔菌酸、茯苓新酸B及层孔菌酸。[制备实施例A] 所提供的萃取物A至E也可通过前述步骤而分离出其中所含有的成分。
C-2.以液相层析/紫外光/质谱仪，分别于243纳米及210纳米波长下检测C-1所获得的茯苓酸、去氢茯苓酸、土莫酸、去氢土莫酸、猪苓酸C、3- 表-去氢土莫酸、去氢栓菌酸、栓菌酸、茯苓新酸A、去氢层孔菌酸、茯苓新酸B及层孔菌酸，结果显示这些成分的纯度都大于98％。
实施例1：茯苓萃取物及其活性成分于抑制MMPs的表现及/或活性的效果
如上述说明，当动物肺部组织发生发炎反应，活化的炎症细胞会分泌MMPs，破坏肺部组织构造，造成更严重的肺部损伤，而导致肺功能下降或丧失。为探讨茯苓萃取物及其活性成分是否具有抑制炎症细胞的MMPs分泌量、表现量及活性的效果，以明胶酵素图谱法(gelatin zymography)及西方墨点法(Western blot)测试茯苓萃取物及其活性成分对于脂多糖(LPS)所活化的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株的MMP-9活性表现(其由MMP-9的分泌量、表现量与活性共同影响)的抑制率。
(1-1)
将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株(购自ATCC，CRL-2192TM)分成十五组并分别以如下培养基进行培养，历时24小时：
(1)空白组：巨噬细胞生长培养基；
(2)对照组：含有LPS(购自Sigma-Aldrich)(1微克/毫升)的巨噬细胞生长培养基；
(3)正控制组：含有LPS(1微克/毫升)与Dexamethacone(一种皮质类固醇，简称Dex；购自Sigma-Aldrich)(1微摩尔浓度)的巨噬细胞生长培养基，；
(4)萃取物A组(共三组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例 A-2-2]所提供的萃取物A的巨噬细胞生长培养基，其中，萃取物A于该三组培养基中的浓度分别为6.25、12.5及25微克/毫升；
(5)萃取物B组(共三组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例 A-2-3]所提供的萃取物B的巨噬细胞生长培养基，其中，萃取物B于该三组培养基中的浓度分别为6.25、12.5及25微克/毫升；
(6)TA组(共三组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例C-1]所提供的土莫酸(TA)的巨噬细胞生长培养基，其中，土莫酸(TA)于该三组培养基中的浓度分别为3.13、6.25及12.5微克/毫升；以及
(7)DTA组(共三组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的去氢土莫酸(DTA)的巨噬细胞生长培养基，其中，去氢土莫酸 (DTA)于该三组培养基中的浓度分别为3.13、6.25及12.5微克/毫升。
其后，收集各组细胞培养液，并分别以下述步骤进行处理：以含有0.2％ gelatin的10％聚丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。电泳结束后，将凝胶浸泡于2.5％Triton X-100溶液中90分钟以洗去SDS，再以双蒸馏水(distillation-distillationwater，ddH2O)浸泡30分钟，最后置于反应溶液(50毫摩尔浓度Tris-HCl缓冲液，含10毫摩尔浓度CaCl2、0.02％NaN3) 中，于37℃下反应18小时。反应完成后，以考马斯亮蓝(Coomassieblue) 染色液进行凝胶染色，撷取染色后的凝胶影像并进行影像分析。各组凝胶上的反白条带(表示此区域的明胶被MMPs分解，其对应约95kD的分子量)的影像强度(以面积大小及颜色深浅计算)即可反映出不同条件下大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株的MMP-9活性表现(将空白组的结果设为0％、对照组的结果设为100％，计算其他各组的MMP-9的相对活性表现)。结果示于表4。
表4
Figure GDA0003852583850000211
Figure GDA0003852583850000221
实验结果显示，经1微克/毫升LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 细胞株，其MMP-9活性表现明显上升。
由表4可知，Dex在LPS浓度为1微克/毫升时无法抑制MMP-9的活性表现。然而，萃取物A、萃取物B及土莫酸(萃取物A及萃取物B的主要成分)，对LPS所诱导的MMP-9活性表现上升都具有良好的抑制效果，其中，萃取物 B与土莫酸的效果更呈现出明显的剂量-反应关系(dose-response relationship)，浓度25微克/毫升的萃取物B及12.5微克/毫升的土莫酸都可完全地抑制LPS所诱导的MMP-9活性表现上升。前述结果显示，萃取物A、萃取物B、土莫酸(萃取物A及萃取物B的主要成分)都可有效降低MMPs的活性表现上升，且效果优于Dex，故都可用于开发帮助调节动物体内MMPs 活性表现的医药品。
(1-2)
将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株分成二十八组并分别以如下培养基进行培养，历时24小时：
(1)空白组：巨噬细胞生长培养基；
(2)对照组：含有LPS(1微克/毫升)的巨噬细胞生长培养基；
(3)正控制组：含有LPS(1微克/毫升)与Prednisolone(一种皮质类固醇，简称Pred；购自Sigma-Aldrich)(5微摩尔浓度)的巨噬细胞生长培养基；
(4)萃取物C组(共五组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例 A-3-2]所提供的萃取物C的巨噬细胞生长培养基，其中，萃取物C于该五组培养基中的浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；
(5)萃取物D组(共五组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例 A-4-2]所提供的萃取物D的巨噬细胞生长培养基，其中，萃取物D于该五组培养基中的浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；
(6)萃取物E组(共五组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例 A-4-3]所提供的萃取物E的巨噬细胞生长培养基，其中，萃取物E于该五组培养基中的浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；
(7)DTTA组(共五组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的去氢栓菌酸(DTTA)的巨噬细胞生长培养基，其中，去氢栓菌酸 (DTTA)于该五组培养基中的浓度分别为0.39、0.78、1.56、3.13及6.25微克/毫升；以及
(8)PAA组(共五组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的茯苓新酸A(PAA)的巨噬细胞生长培养基，其中，茯苓新酸A(PAA) 于该五组培养基中的浓度分别为6.25、12.5、25、50及100微克/毫升。
接着，比照(1-1)的试验方法进行分析，结果示于表5。
表5
Figure GDA0003852583850000241
Figure GDA0003852583850000251
实验结果显示，经1微克/毫升LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 细胞株，其MMP-9活性表现明显上升。另一方面，Pred(于本实验中作为正控制组)对浓度1微克/毫升LPS所诱导的MMP-9活性表现抑制效果不佳。萃取物C及萃取物D对浓度1微克/毫升LPS所诱导的MMP-9活性表现上升都无明显抑制效果。
由表5可知，Pred在LPS浓度为1微克/毫升时无法有效抑制MMP-9的活性表现。然而，萃取物E、去氢栓菌酸及茯苓新酸A对LPS所诱导的MMP-9 活性表现上升都具有抑制效果，其中，茯苓新酸A的抑制效果较佳且呈现出明显的剂量-反应关系。前述结果显示，茯苓萃取物E、去氢栓菌酸及茯苓新酸A都可降低MMPs的活性表现上升，且效果优于Pred(推测也优于Dex)，都可用于开发帮助调节动物体内MMPs活性表现的医药品。
(1-3)
将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株分成六组并分别以如下培养基进行培养，历时24小时：
(1)对照组：含有LPS(0.01微克/毫升)的巨噬细胞生长培养基；
(2)正控制组：含有LPS(0.01微克/毫升)与Dex(1微摩尔浓度)的巨噬细胞生长培养基；
(3)萃取物A组(共四组)：含有LPS(0.01微克/毫升)与[制备实施例A-2-2]所提供的萃取物A的巨噬细胞生长培养基，其中，萃取物A于该四组培养基中的浓度分别为6.25、12.5、25及50微克/毫升；
(4)其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法检测pro-form MMP-9(即，酶原形式的MMP-9)、active-form MMP-9(即，活化型的MMP-9)、 MMP-12等蛋白的表现。最后，以对照组的结果为基准(即，将对照组的表现量设为1倍)，计算其他各组细胞的pro-formMMP-9、active-form MMP-9 或MMP-12的相对表现量，结果示于图1A、图1B、及图1C。
由图1A、图1B及图1C可知，相较于对照组，萃取物A组的pro-form MMP-9、active-form MMP-9及MMP-12的表现量都较低，其中，50微克/毫升的萃取物A对active-form MMP-9及MMP-12表现量的抑制率可分别达到 38％及35％。
(1-4)
将大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞株分成十组并分别以如下培养基进行培养，历时24小时：
(1)对照组：含有LPS(0.01微克/毫升)的巨噬细胞生长培养基；
(2)正控制组：含有LPS(0.01微克/毫升)与Dex(1微摩尔浓度)的巨噬细胞生长培养基；
(3)TA组(共四组)：含有LPS(0.01微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的土莫酸(TA)的巨噬细胞生长培养基，其中，土莫酸(TA)于该四组培养基中的浓度分别为1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；以及
(4)PAA组(共四组)：含有LPS(0.01微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的茯苓新酸A(PAA)的巨噬细胞生长培养基，其中，茯苓新酸A(PAA) 于该四组培养基中的浓度分别为6.25、12.5、25及50微克/毫升。
其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法检测pro-form MMP-9 (即，酶原形式的MMP-9)、active-form MMP-9(即，活化型的MMP-9)、 MMP-12等蛋白的表现。最后，以对照组的结果为基准(即，将对照组的表现量设为1倍)，计算其他各组细胞的pro-form MMP-9、active-form MMP-9 或MMP-12的相对表现量，结果示于图2A、图2B、图2C、图3A、图3B、及图3C。
由图2A、图2B、及图2C可知，相较于对照组，土莫酸组的pro-form MMP-9、active-form MMP-9及MMP-12的表现量都较低，其中，12.5微克/ 毫升的土莫酸对pro-form MMP-9、active-form MMP-9及MMP-12表现量的抑制率可分别达到53％、100％及45％。由图3A、图3B、及图3C可知，茯苓新酸A对pro-form MMP-9、active-form MMP-9及MMP-12的表现量都具有抑制效果，其中，茯苓新酸A对于active-form MMP-9抑制效果最明显，50微克/ 毫升的茯苓新酸A对active-form MMP-9表现量的抑制率可达到44％。
(1-3)及(1-4)的结果再次显示，萃取物A、土莫酸及茯苓新酸A对LPS 所诱导的MMPs活性表现上升都具有抑制效果，故可用于用开发帮助调节动物体内MMPs活性表现的医药品。
实施例2：茯苓萃取物及其活性成分于抑制胶原蛋白分泌/累积的效果
如上述说明，MMPs的活性过度表现会对肺部组织造成损害，但在大多数的情形下，动物体内的修复机制会自行启动，其中巨噬细胞会分泌TGF-β， TGF-β则会促进肺部纤维母细胞分泌胶原蛋白以修补受损组织，然而，胶原蛋白过度分泌也可能导致肺纤维化。为探讨茯苓萃取物及其活性成分是否具有调节、预防及/或治疗肺纤维化等肺部损伤相关疾病的效果，以天狼猩红 (Picrosirius Red，PSR)染色法进行胶原蛋白半定量，测试茯苓萃取物及其活性成分对于TGF-β所诱导的肌纤维母细胞WI38细胞株的胞内胶原蛋白累积量的抑制率。
(2-1)
将肌纤维母细胞WI38细胞株(购自ATCC，产品编号CCL75TM)分成十组并分别以如下培养基进行培养，历时48小时：
(1)空白组：肌纤维母细胞生长培养基；
(2)对照组：含有TGF-β(购自R&D Systems)(1纳克/毫升)的纤维母细胞生长培养基；
(3)正控制组：含有TGF-β(1纳克/毫升)与Pirfenidone(简称Pir；购自Sigma-Aldrich)(200微克/毫升)的纤维母细胞生长培养基；
(4)萃取物A组(共四组)：含有TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例 A-2-2]所提供的萃取物A的纤维母细胞生长培养基，其中，萃取物A于该四组培养基中的浓度分别为12.5、25、50及100微克/毫升；以及
(5)萃取物B组(共三组)：含有TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例 A-2-3]所提供的萃取物B的纤维母细胞生长培养基，其中，萃取物B于该三组培养基中的浓度分别为12.5、25及50微克/毫升。
接着，移除培养基，加入甲醇并置于-20℃下，历时1至2小时，以固定细胞。以PBS清洗细胞后，加入0.1％的天狼星红染剂(购自Sigma-Aldrich)，于室温下作用4小时。以0.1％醋酸溶液清洗细胞后，再以0.1N氢氧化钠溶解细胞并测量OD540(即，波长540nm下的吸光值)。各组的OD540值代表各组的胶原蛋白含量，可反映不同条件下纤维母细胞WI38细胞株的胶原蛋白含量(将空白组的结果设为0％、对照组的结果设为100％，计算其他各组的胶原蛋白相对含量)。结果示于表6。
表6
Figure GDA0003852583850000281
Figure GDA0003852583850000291
由表6可知，萃取物A或萃取物B对TGF-β所诱导的细胞内胶原蛋白分泌及累积具有抑制效果，且高浓度的萃取物A或萃取物B效果优于Pir(于本实验中作为正控制组)。另一方面，以直线回归法分别计算萃取物A及萃取物B 的半数有效浓度(简称ED50，即，萃取物A或萃取物B将TGF-β所诱导的胶原蛋白累积量的上升幅度抑制至对照组的50％时的浓度)，其中，萃取物A的 ED50为50至80微克/毫升，萃取物B的ED50则为26至28微克/毫升。前述结果显示，萃取物A及萃取物B都可有效抑制肺部细胞过度分泌胶原蛋白、抑制胶原蛋白过度累积，故可用于肺部损伤相关疾病(尤其是肺纤维化)的调节、预防及/或治疗，且萃取物B的效果略优于萃取物A。
(2-2)
将肌纤维母细胞WI38细胞株分成二十八组并分别以如下培养基进行培养，历时24小时：
(1)空白组：肌纤维母细胞生长培养基；
(2)对照组：含有TGF-β(购自R&D Systems)(1纳克/毫升)的纤维母细胞生长培养基；
(3)正控制组：含有TGF-β(1纳克/毫升)与Pirfenidone(简称Pir；购自Sigma-Aldrich)(200微克/毫升)的纤维母细胞生长培养基；
(4)萃取物C组(共五组)：含有TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例 A-3-2]所提供的萃取物C的纤维母细胞生长培养基，其中，萃取物C于该五组培养基中的浓度分别为0.78、1.56、3.125、6.25及12.5微克/毫升；
(5)萃取物D组(共五组)：含有TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例 A-4-2]所提供的萃取物D的纤维母细胞生长培养基，其中，萃取物D于该五组培养基中的浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；
(6)萃取物E组(共五组)：含有TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例 A-4-3]所提供的萃取物E的纤维母细胞生长培养基，其中，萃取物E于该五组培养基中的浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；
(7)DTTA组(共五组)：含有TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例 C-1]所提供的去氢栓菌酸(DTTA)的纤维母细胞生长培养基，其中，去氢栓菌酸(DTTA)于该五组培养基中的浓度分别为0.39、0.78、1.56、3.13及 6.25微克/毫升；以及
(8)PAA组(共五组)：含有LPS TGF-β(1纳克/毫升)与[制备实施例C-1]所提供的茯苓新酸A(PAA)的纤维母细胞生长培养基，其中，茯苓新酸A(PAA)于该五组培养基中的浓度分别为6.25、12.5、25、50及100微克/毫升。
接着，比照(2-1)的试验方法进行分析。结果示于表7。
表7
Figure GDA0003852583850000311
Figure GDA0003852583850000321
由表7可知，萃取物C、D、E及前述三者的主要成分(去氢栓菌酸、茯苓新酸A)对TGF-β所诱导的细胞内胶原蛋白累积都具有抑制效果，其中，萃取物E与茯苓新酸A的抑制效果更呈现剂量-反应关系。前述结果显示，萃取物C、D、E及前述三者的主要成分(去氢栓菌酸、茯苓新酸A)都可有效抑制肺部细胞过度分泌胶原蛋白、抑制胶原蛋白过度累积，故可用于肺部损伤相关疾病(尤其是肺纤维化)的调节、预防及/或治疗。
实施例3：茯苓萃取物的活性成分于抑制黏蛋白表现量的效果
如上述说明，在慢性阻塞性肺病或肺气肿等肺部损伤相关疾病患者气道可观察到的气道黏液过度分泌现象，该现象与肺部组织中黏蛋白的过度表达有关。气道黏液过度分泌表现的病患会有痰液增多的症状，增多的痰液积聚于气管及肺部将使得气道变窄，导致呼吸阻力增加。为探讨茯苓萃取物的活性成分是否具有调节、预防及/或治疗慢性阻塞性肺病或肺气肿等肺部损伤相关疾病的效果，以西方墨点法测试茯苓萃取物的活性成分(土莫酸及茯苓新酸A)对于LPS所诱导的人类肺黏膜上皮细胞NCI-H292细胞株的Mucin 5AC表现量的抑制率。
将人类肺黏膜上皮细胞NCI-H292细胞株分成十组并分别以如下培养基进行培养，历时24小时：
(1)对照组：含有LPS(1微克/毫升)的上皮细胞生长培养基；
(2)正控制组：含有LPS(1微克/毫升)与Dex(10微摩尔浓度)的上皮细胞生长培养基；
(3)TA组(共四组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的土莫酸(TA)的上皮细胞生长培养基，其中，土莫酸(TA)于该四组培养基中的浓度分别为1.56、3.13、6.25及12.5微克/毫升；以及
(4)PAA组(共四组)：含有LPS(1微克/毫升)与[制备实施例C-1] 所提供的茯苓新酸A(PAA)的上皮细胞生长培养基，其中，茯苓新酸A(PAA) 于该四组培养基中的浓度分别为6.25、12.5、25及50微克/毫升。
其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法检测Mucin 5AC的表现量。最后，以对照组的结果为基准(即，将对照组的表现量设为1倍)，计算其他各组细胞的Mucin 5AC的相对表现量，结果示于图4A、及图4B。
由图4A、及图4B可知，相较于对照组，土莫酸(TA)组及茯苓新酸A (PAA)组对LPS所诱导的Mucin 5AC表现量都具抑制效果，其中，低剂量 (1.56微克/毫升)与高剂量(12.5微克/毫升)的土莫酸对Mucin 5AC表现量的抑制率分别可达到75％及81％，低剂量(6.25微克/毫升)及高剂量(50 微克/毫升)的茯苓新酸A对Mucin 5AC表现量的抑制率分别可达到65％及 87％。
上述结果显示，茯苓萃取物的活性成分土莫酸及茯苓新酸A对LPS所诱导的Mucin5AC表现量上升都具有抑制效果，故可用于用开发帮助调节动物体内Mucin 5AC表现量的医药品，而可缓解痰液过度增多的现象。
如上述实施例所示，本发明的茯苓萃取物及/或其活性成分确实可抑制有效抑制LPS所诱导的MMPs活性表现及/或黏蛋白表现量上升及/或抑制 TGF-β所诱导的胶原蛋白过度分泌及累积，故可用于调节、预防及/或治疗肺部损伤，尤其是悬浮微粒所引起的肺部损伤。

Claims (6)

1.一种使用一活性成分于制备一组合物的用途，其中该组合物为医药组合物，且该医药组合物通过降低基质金属蛋白酶的表现及/或活性、抑制胶原蛋白分泌及累积、降低黏蛋白的表现而用于预防及／或治疗慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合症、支气管肺发育不良、阻塞性细支气管炎及隐源性机化性肺炎之至少一者，且其中该活性成分为去氢栓菌酸。
2.如权利要求1所述的使用一活性成分于制备一组合物的用途，其特征在于，该活性成分以植物萃取物或真菌萃取物的形式提供。
3.如权利要求1或2所述的使用一活性成分于制备一组合物的用途，其特征在于，该组合物用于降低基质金属蛋白酶的表现及／或活性。
4.如权利要求3所述的使用一活性成分于制备一组合物的用途，其特征在于，该基质金属蛋白酶为基质金属蛋白酶-9或基质金属蛋白酶-12的至少一者。
5.如权利要求1或2所述的使用一活性成分于制备一组合物的用途，其特征在于，该组合物用于降低黏蛋白的表现。
6.如权利要求5所述的使用一活性成分于制备一组合物的用途，其特征在于，该黏蛋白为黏蛋白5AC。
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