TWI703979B - 綠豆皮醇類萃取物用於製備抗病毒的醫藥組合物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明為一種具抗病毒效果之綠豆皮萃取物，該綠豆皮萃取物可藉由抑制α-葡萄糖苷酶與神經胺酸酶達抗病毒的效果。本發明同時相關於一種具抗病毒效果之綠豆皮萃取物的萃取方法及藉由該方法萃取獲得之萃取物的應用。

Description

綠豆皮醇類萃取物用於製備抗病毒的醫藥組合物的用途

本發明係相關於一種綠豆皮萃取物的醫藥組合物及其萃取方法，尤其是指一種具有具抗病毒效果之綠豆皮萃取物的醫藥組合物及其萃取方法與應用。

根據《本草綱目》記載，綠豆主治消腫下氣、清熱解毒、治丹毒、利尿止渴、厚腸胃、作枕明目、治頭風、頭痛、補益元氣、和調五臟、安精神、行十二經脈、潤皮膚、解一切草木金石砒霜毒。綠豆味甘、性寒、無毒，具清熱消暑、利尿消腫，潤喉止渴及明目降壓的功效，對中暑與咽喉炎具有不錯的療效，因此是民間常用的消暑聖品。

綠豆、豆皮及豆芽均有不同功用，綠豆可消腫通氣，清熱解毒，補腸胃，治傷風頭痛，常吃補益元氣，和調五臟，通行十二經脈。綠豆皮甘寒無毒，能解熱毒，治頭風頭痛。綠豆芽甘平，解酒解熱毒，利三焦。綠豆莢可治長期血痢。現代研究證實，綠豆營養價值很高，含蛋白質高於大米，碳水化合物豐富，脂肪質較少，更含有蛋白質、鈣、磷、鐵、胡蘿蔔素等。夏季常喝綠豆湯，可防中暑及熱毒引起的各種瘡癤，對腎炎、糖尿病、高血壓、動脈硬化、腸胃炎、咽喉炎等有一定幫助。

綠豆含有大約20~24%蛋白，主要為球蛋白(globulin)和白蛋白(albumin)，其為主要的儲存蛋白型態。由於綠豆含有高蛋白質含量，且 富含很多必需胺基酸，但對於蘇胺酸(threonine)、含硫胺基酸、離胺酸(lysine)和色胺酸(tryptophan)含量較為缺乏，然對經濟動物的消化率不佳，而難以應用於經濟動物(Randhir and Shetty,2007)。而針對綠豆皮的營養成分目前則少有研究。

病毒是一種比細菌小且需要使用電子顯微鏡才看得到的有機體，目前醫藥尚未找出很有效抗病毒的藥劑，主要還是需要人體或動物體的免疫力來對抗病毒感染。常見的病毒感染包括腸病毒、愛滋病毒、肝炎病毒、小兒麻痺症、流行性感冒、上呼吸道感染等等，其傳播能力強，常常容易引起流行。其中流行性感冒(簡稱流感)，不論在人類或動物，流感病毒都造成巨大的公共衛生安全危害及經濟損失，亟待尋求解決辦法。

目前西方醫藥對於病毒感染的治療方式尚未有有效策略，在新藥研發的進展速度緩慢，因此使用傳統中國醫學的智慧，配合化學與生物科技之技術，使得應用傳統醫學之價值大為提升。然而傳統醫學中，對於植物性資材的原料品質變化差異極大，使得利用植物性資材的困難度提高，舉例而言，植物性飼料添加劑的原料來自於大自然，成分會因產地環境及氣候等因素的影響而變化，可能對產品效果造成干擾，此亦亟待解決之問題。

本發明係相關於一種抗病毒的醫藥組合物，其係由綠豆皮原料經初萃取後，再以5至15倍(v/w)的C1至C6的醇類超音波浸泡萃取後，經濃縮乾燥所得之混合物。

較佳的是，本發明綠豆皮原料來源為商品名為戒炎令® (京冠)或VIVA®(京冠)或其組合之產品。

較佳的是，本發明中所使用的醇類萃取步驟為使用50%、75%、95%酒精或甲醇，且其萃取體積為原料的10倍體積(v/w)。

較佳的是，本發明醇類萃取方式為使用超音波震盪，於常溫震盪萃取一小時後，移除殘渣固形物，得到一綠豆皮醇類萃取液。

較佳的是，本發明綠豆皮醇類萃取液再經50-60℃乾燥後，得到一綠豆皮醇類萃取物。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取物含有重量百分比分別約為2~7%的牡荊素(vitexin)或2~7%異牡荊素(isovitexin)或其組合。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取物可抑制病毒所引起的細胞病變作用，該等病毒較佳包括正黏液病毒科(如流感病毒、禽流感病毒)、副黏液病毒科(如新城病毒)、疱疹病毒或里奧病毒(reovirus)。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取物可降低病毒對紅血球的血球凝集試驗(hemagglutination assay,HA)力價，該等病毒較佳包括正黏液病毒科(如流感病毒、禽流感病毒)、副黏液病毒科(如新城病毒)、疱疹病毒或里奧病毒(reovirus)。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取物係藉由抑制α-葡萄糖苷酶達抗病毒的效果。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取物係藉由抑制神經胺酸酶達抗病毒的效果，該等病毒較佳包括正黏液病毒科(如流感病毒、禽流感病毒)、副黏液病毒科(如新城病毒)、疱疹病毒或里奧病毒(reovirus)。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取物所抑制之病毒包括 正黏液病毒科(如流感病毒、禽流感病毒)、副黏液病毒科(如新城病毒)、疱疹病毒或里奧病毒(reovirus)。

本發明另相關於一種萃取抗病毒綠豆皮萃取物之醫藥組合物的方法，其係包含：(1)提供綠豆皮原料；(2)以5至15倍(v/w)的C1至C6的醇類浸泡前述綠豆皮原料進行萃取，以獲取浸泡液；(3)過濾浸泡液獲取醇類萃取液後濃縮乾燥；及(4)獲得一綠豆皮醇類萃取物。

較佳的是，本發明的綠豆皮原料來源為商品名為戒炎令®或VIVA®或其組合之產品。

較佳的是，本發明的醇類萃取步驟為使用50%、75%、95%酒精或甲醇，且其萃取體積為原料的10倍體積(v/w)。

較佳的是，本發明的醇類萃取方式為使用超音波震盪，於常溫震盪萃取一小時後，移除殘渣固形物，得到一綠豆皮醇類萃取液。

較佳的是，本發明的綠豆皮醇類萃取液再經50-60℃乾燥後，得到一綠豆皮醇類萃取物。

本發明同時相關於一種利用前述萃取方法所製得的飼料添加物。

圖一為以本發明之方法萃取後的牡荊素(Vitexin)和異牡荊素(Isovitexin)常態分布圖。

圖二為本發明以標準品25ppm牡荊素(Vitexin)、25ppm異牡荊素(Isovitexin)、VIVA®甲醇及VIVA®乙醇萃取物層析圖。

圖三為本發明之萃取流程示意圖。

圖四為本發明萃取物之HPLC管柱層析圖。

圖五為本發明綠豆皮酒精萃取物之細胞毒性試驗結果。

圖六為本發明綠豆皮酒精萃取物細胞病變作用試驗結果。

圖七為本發明綠豆皮酒精萃取物降低細胞表現之病毒HA力價試驗結果。

圖八為本發明綠豆皮酒精萃取物抑制α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)能力試驗結果。

圖九為本發明綠豆皮酒精萃取物抑制神經胺酸酶(neuraminidase)能力試驗結果。

本發明係關於一種可作為具抗病毒效果的綠豆皮萃取物，該萃取物經京冠生技之製程處理後，製成商品名為戒炎令®或VIVA®的產品，請參圖一所示，經常態分佈曲線分析不同批次、產地來源的綠豆皮，均可以獲取高含量之牡荊素與異牡荊素混和物，請參圖二所示，係為標準品25ppm牡荊素(Vitexin)、25ppm異牡荊素(Isovitexin)、VIVA®甲醇及VIVA®乙醇萃取物層析圖，可以發現經本發明萃取的方法可以克服一般天然產品可能因產地環境與氣候等因素所造成的變化，使活性成分可被定性與定量，以達品質穩定的效果，進而可應用在動物飼料添加物或食品添加物上。因此，本發明同時相關於一種促進動物健康之飼料添加物。

更進一步，本發明相關於一種具有降低病毒之細胞病變作用與降低HA力價的綠豆皮萃取物，該等病毒較佳包括正黏液病毒科(如流感病毒、禽流感病毒)、副黏液病毒科(如新城病毒)、疱疹病毒或里奧病毒 (reovirus)，其中經由本發明所揭露的萃取方法及其萃取物，該萃取物主要含有的活性成分為牡荊素和異牡荊素，二種活性成分具有抑制α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)酵素及神經胺酸酶(neuraminidase)之能力，進而達到抗病毒之效果。

本發明之綠豆皮萃取物，較佳可以使用C1至C6的醇類萃取，但不限於使用50%、75%、95%酒精、甲醇或其他醇類，較佳的是使用酒精萃取，且不同濃度之酒精萃取結果均含有一定量的牡荊素和異牡荊素。為利說明本發明的最佳實施例，下列醇類萃取物均稱酒精萃取物或酒萃物。

實施例一：綠豆皮萃取物之活性成分萃取

請參圖三所示，取綠豆皮原料，以京冠生技的製程，經生產排程、原料混拌、物理化學與生物處理法後，再經計量包裝，以獲取成品，商品名為戒炎令®或VIVA®，可作為動物飼料添加物或其他食品添加物之用。於實驗室進行小量萃取，使用之重量單位為50g。將取得動物飼料添加物50g加入10倍體積量(500ml)的95%酒精，利用超音波方式加以萃取，常溫震盪萃取一小時，經粗過濾去除殘渣固形物後，得到本發明的綠豆皮酒精萃取液，此時體積約為350-380ml，回收量約70-80%。減壓濃縮後，可得20-25g的浸膏，約占原料的40-50%。再經50-60℃乾燥後，去除殘留水分後，可得10-15g綠豆皮酒精萃取物，約占原料的20-30%(w/w)。

實施例二：綠豆皮酒精萃取物活性成分試驗

將實施例一所得的綠豆皮酒精萃取物以DMSO溶解，取1.4g的綠豆皮酒精萃取物以14ml DMSO溶解後，以甲醇稀釋100倍，HPLC初步進行成分分析。。請參圖四所示，經比對標準品，確認在滯留時間約25-30分鐘之間所產生的兩個波峰分別為牡荊素和異牡荊素。經實際計算絕對量，牡荊素(vitexin)為31.015mg(占酒精萃取物2.22%)，異牡荊素(isovitexin)為33.893mg(占酒精萃取物2.42%)

由於已知的文獻中得知，牡荊素(vitexin)與異牡荊素(isovitexin)具有抑制α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)的能力，同時亦有抑制神經胺酸酶(neuraminidase)之效果，進而達到抑制病毒活性的能力。而目前牡荊素和異牡荊素之純物質或標準品的價格非常昂貴，10mg的量視其純度其市價高達新台幣數千至數萬元，其中又以異牡荊素價格更高昂，但受限於價格而使得實際於產業的應用性不高，且應用層面侷限。

實施例三：細胞毒性試驗

由於所開發的藥品須符合安全性要求，且所使用的濃度不能具有毒性，因此本發明進一步測試該酒精萃取物的細胞毒性試驗，空白對照組為DMSO，在1%DMSO濃度之下，細胞的生長型態並無差異，不具有任何毒性。

所使用的細胞株為MDCK細胞(狗腎臟上皮細胞)，MDCK為探討流感試驗中常被使用的細胞株標的，所使用之細胞培養液為DMEM，添加10%FBS血清和1%PSA三合一抗生素，以5.6ml DMSO溶解1.4g綠豆皮酒精萃取物，成為高濃度的250mg/ml綠豆皮酒精萃取物保存 液，再分別以DMSO稀釋成作用濃度分別為62.5,125,250,500,1000,2000(μg/ml)。先於培養皿中接種細胞，使細胞生長24小時後，加入欲試驗的綠豆皮酒精萃取物，再經24、48、72小時分別進行細胞存活率分析(MTT assay)。請參圖五所示，以MDCK細胞進行試驗，當綠豆皮酒精萃取物的濃度在2000(μg/ml)以下時，均不具細胞毒性，顯示其安全性優良。

實施例四：抗病毒試驗-綠豆皮酒精萃取物抑制流感病毒細胞病變作用(Cytopathic effect，CPE)

由於流感病毒顆粒在感染細胞後會殺死寄主細胞，產生細胞病變作用(Cytopathic effect，CPE)，因此如能抑制細胞病變作用，亦能視為具有抗病毒的效果。

本發明利用MDCK細胞(狗腎臟上皮細胞)作為試驗標的，病毒株為PR8(H1N1)，所使用的綠豆皮酒精萃取物濃度為0,125,2000(μg/ml)，0μg/ml為DMSO空白對照組。方法為先接種細胞株，待24小時後，將不同濃度的綠豆皮酒精萃取物和MDCK細胞預處理1小時，並將不同濃度的綠豆皮酒精萃取物和PR8病毒株預處理1小時，接著將上述經綠豆皮酒精萃取物預處理後之病毒和經綠豆皮酒精萃取物預處理後之細胞株共同培養進行感染，感染1小時後移除病毒液並加入綠豆皮酒精萃取液，於24小時後觀察CPE試驗結果。

請參圖六所示，箭頭所表示者為產生細胞病變作用(CPE)處，使用本發明的綠豆皮酒精萃取物可降低細胞病變作用的發生，在2000μg/ml濃度下未見細胞病變作用產生，且顯微鏡下細胞外觀呈現正常狀態。

實施例五：抗病毒試驗-綠豆皮酒精萃取物降低細胞之流感 病毒HA力價

流感病毒表面的血球凝集素(hemagglutinin)可以和紅血球的受體結合，當病毒力價夠高時，紅血球會發生凝集現象(hemagglutination)，因此分析紅血球的凝集現象可做為病毒力價測試的方法，此又稱為血球凝集試驗(hemagglutination assay,HA)。

試驗所使用的細胞株與本發明的綠豆皮酒精萃取物濃度與實施例四相同。方法為先接種細胞株，待24小時後，將不同濃度的綠豆皮酒精萃取物和MDCK細胞預處理1小時，並將不同濃度的綠豆皮酒精萃取物和PR8病毒株預處理1小時，接著將上述經綠豆皮酒精萃取物預處理後之病毒和經綠豆皮酒精萃取物預處理後之細胞株共同培養進行感染，感染1小時後移除病毒並加入綠豆皮酒精萃取液，於24小時後，收取細胞培養液，進行HA力價試驗。

由圖七結果顯示，本發明的綠豆皮酒精萃取物在2000μg/ml時偵測不到細胞產生之HA力價，因此可知本發明綠豆皮酒精萃取物可降低流感病毒於MDCK細胞產生的HA力價。

實施例六：綠豆皮酒精萃取物的抑制α-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)能力測試

取0.8μL(濃度分別為將20,10,5,2.5,1.25,0.625,0mg/mL的綠豆皮酒精萃取物溶解於DMSO中)，再將溶解後的綠豆皮酒精萃取物與69.2μL的磷酸鹽緩衝液(phosphate buffer)(100mM,pH 6.8)與10μLα-葡萄糖苷酶(1U/mL,Sigma)混合，之後置入37℃培養箱培養15分鐘。

經培養後，將20μL p-nitrophenyl-α-d-glucopyranoside(5 mM,Sigma)作為基質(substrate)，加入前述培養液中，再於37℃培養箱培養20分鐘。而後加入50μL of Na₂CO₃(0.1M)終止反應，並以分光光度計450nm量測並記錄之。請參圖八所示，結果顯示綠豆皮酒精萃取物可降低α-葡萄糖苷酶之活性且具有劑量依賴效果(dose-dependent manner)，其IC₅₀為20.07±0.9μg/mL，該值低於文獻中所指牡荊素和異牡荊素，其IC₅₀值分別為23.9與46.9μg/mL。由此結果說明本發明的綠豆皮酒精萃取物具有優異的抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力，因而可展現抗病毒的能力與潛力。較佳的是，病毒種類可為同樣需要α-葡萄糖苷酶之病毒科，如正黏液病毒科(如流感病毒、禽流感病毒)、副黏液病毒科(如新城病毒)、疱疹病毒或里奧病毒(reovirus)等。

實施例七：綠豆皮酒精萃取物的抑制神經胺酸酶(neuraminidase)能力測試

由於神經胺酸酶為流感病毒顆粒(influenza virus)自寄主細胞釋放不可或缺的酵素，因此為治療流感，抑制神經胺酸酶活性亦為一種策略。實際上，在臨床上也已經經由神經胺酸酶抑制劑來治療流感。在本發明中，我們使用由哺乳動物流感病毒H1N1(PR8)與禽流感病毒H6N1(3937)所取得的神經胺酸酶，來進行本發明之綠豆皮酒精萃取物的神經胺酸酶活性抑制試驗。

取1μL的綠豆皮酒精萃取物(濃度分別為200,50,12.5,3.125,0mg/ml並使其溶解於DMSO)，再與25μL的病毒(內含128倍稀釋的3937病毒顆粒與8倍稀釋的PR8病毒顆粒)混合，以1倍的分析緩衝液(33mM MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid，4-Morpholineethanesulfonic acid，SIGMA,M3671),20mM CaCl₂,pH 6.5)調整體積至50μL，放置在37℃培養箱培養20分鐘。再加入50μL fluorogenic substrate(50μM 4-methylumbelliferyl-N-acetylneuraminic acid,sigma)於37℃培養箱共培養60分鐘。最後加入100μL的0.2M Na₂CO₃終止反應。螢光以激發波長為355nm與發射波長為460nm量測之。相對螢光單位(Relative fluorescence units，RFU)則由背景值取得，抑制率(inhibition rate，IR)則經由下列公式計算而得：IR(%)=(1-RFU樣品/RFU DMSO)×100%。

與克流感(oseltamivir)相似，請參圖九所示，綠豆皮酒精萃取物不論是對於哺乳動物流感病毒或是禽流感病毒，其在神經胺酸酶的抑制能力均具有劑量依賴效果。由此結果說明本發明的綠豆皮酒精萃取物具有優異的抑制神經胺酸酶活性的能力，因而可展現抗病毒的能力與潛力。較佳的是，病毒種類可為哺乳流感病毒或禽流感病毒。

由本發明的實施例顯示，本發明的綠豆皮酒精萃取物具有抗病毒的能力，且其機制可能為藉由抑制病毒的α-葡萄糖苷酶與神經胺酸酶，達到抗病毒的效果，因此可應用於對抗具有α-葡萄糖苷酶與神經胺酸酶或具其一酵素之病毒種類，同時本發明的綠豆皮酒精萃取物在體外試驗顯示不具細胞毒性，為一種安全優異的抗病毒產品。

本發明所提供的萃取方法與所得的萃取物，其原料來源成本低廉，而所獲得的牡荊素和異牡荊素或其組合的產量高，回收率佳，且萃取方法簡單，具有優異的成本優勢，有利於產業應用，極具發展與保護的價值。

Claims (10)

1. 一種綠豆皮醇類萃取物用於製備抗病毒的醫藥組合物的用途，該綠豆皮醇類萃取物係由綠豆皮原料經初萃取後，再以5至15倍(v/w)的C1至C6的醇類超音波浸泡萃取後，經濃縮乾燥所得，其中該醇類為50%至95%的酒精或甲醇；該綠豆皮醇類萃取物含有2~7重量百分比的牡荊素(vitexin)及2~7重量百分比的異牡荊素(isovitexin)；且該綠豆皮醇類萃取物所抑制之病毒係選自由以下所組成之群組：正黏液病毒科、副黏液病毒科、疱疹病毒與里奧病毒(reovirus)。
2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中綠豆皮原料來源為商品名為戒炎令®或VIVA®或其組合之產品。
3. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中醇類萃取步驟為使用50%、75%、或95%的酒精或甲醇，且其萃取體積為原料的10倍體積(v/w)。
4. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中醇類萃取方式為使用超音波震盪，於常溫震盪萃取一小時後，移除殘渣固形物，得到一綠豆皮醇類萃取液。
5. 如申請專利範圍第4項所述的用途，其中該綠豆皮醇類萃取液再經50-60℃乾燥後，得到該綠豆皮醇類萃取物。
6. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該綠豆皮醇類萃取物可抑制病毒所引起的細胞病變作用。
7. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該綠豆皮醇類萃取 物可降低細胞表現之病毒力價(HA titer)。
8. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該綠豆皮醇類萃取物係藉由抑制α-葡萄糖苷酶達抗病毒的效果。
9. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該綠豆皮醇類萃取物係藉由抑制神經胺酸酶達抗病毒的效果。
10. 如申請專利範圍第1項所述的用途，該醫藥組合物進一步被製成一飼料添加物。

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