TWI693072B - 含有硫苷化合物的抗癌組合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種利用微生物醱酵過程,使硫苷化合物結構改變,並以藻類醱酵液包覆硫苷化合物晶體,使前述硫苷化合物之溫度耐受性提高,且提升了其生理活性能力,因此減少使用量即可達到抗癌效果。此外,前述醱酵過程中可產生的抗氧化酵素,與硫苷化合物具有協同作用,能夠達到全面性的保護效果,螯合金屬能力則可協助體內排出PM2.5汙染物質,避免重金屬囤積體內。
Description
本發明關於一種含有硫苷化合物的抗癌組合物,特別關於一種含有十字花科蔬菜醱酵液及藻類醱酵液之抗癌組合物。
十字花科蔬菜為雙子葉植物十字花目的一科,是植物中最繁盛的科之一,常見十字花科植物如高麗菜、花椰菜、青花菜,特徵為葉生長順序為放射十字狀。
硫代化合物具有良好的抗癌功效,在學界中是一項熱門的主題,硫代化合物主要存在於前述十字花科蔬菜中,一般提取硫代化合物以合成或萃取方式取得,合成方式皆以化學合成,在食用上具有食用安全上的疑慮;而萃取方式取得之硫代化合物則容易受溫度破壞,間接影響功效性。又,硫苷化合物,或稱硫代葡萄糖苷,為一類帶硫化合物,如蘿蔔硫素,亦存在於十字花科中,需經由黑芥子酶催化後形成,因此常受到溫度破壞,提取困難。目前研究證實,硫苷化合物對於抗癌具有良好的生理
活性。
有鑑於此,十字花科所含之硫苷化合物不易提取,容易受到溫度破壞影響活性成分,因此如何有效萃取出具有良好抗癌效果的硫苷化合物,如何保護硫苷化合物之抗癌效果,即成為相當重要的課題。
有鑑於此,本發明提供一種利用微生物醱酵過程,使硫苷化合物結構改變,並以藻類醱酵液包覆硫苷化合物,使前述硫苷化合物之溫度耐受性提高,且提升了其生理活性能力。減少使用量即可達到抗癌效果。此外,前述醱酵過程中可產生的超氧化歧化酶SOD,與硫苷化合物具有協同作用,能夠達到全面性的保護效果,螯合金屬能力則可協助體內排出PM2.5汙染物質,避免重金屬囤積體內。
本發明提供一含有硫苷化合物的抗癌組合物,其包含:一十字花科醱酵液和一藻類醱酵液,該十字花科醱酵液包含一硫苷化合物,該藻類醱酵液包含一膠體結構,該膠體結構包覆於該硫苷化合物,其中該硫苷化合物含量為200-400mg/L。前述組合物,其中該十字花科醱酵液與該藻類醱酵液之混合比例係為5-10%。
本發明再提供一具有含有硫苷化合物的抗癌組合物之製備方法,其包含以下步驟:
(a)種植一十字花科蔬菜,將一含硒微生物之肥料施於該十字花科蔬
菜;有機肥料之有機硒含量為100~1000μg/L的液態肥料,以葉面噴灑方式,施肥量為30L/ha,每周1-3次。
(b)待該十字花科蔬菜長成後收成,以乳酸菌/酵母菌進行一醱酵方法,產生一十字花科蔬菜醱酵液;
(c)取一藻類,以乳酸菌/酵母菌進行該醱酵方法,產生一藻類醱酵液;
(d)將該十字花科醱酵液,以及該藻類醱酵液以10:1~30:1比例進行混合,產生前述之組合物;較佳的,以19:1比例進行混合。
較佳地,前述製備具有含有硫苷化合物的抗癌組合物過程中,該醱酵方法,包含:(1)第一階段醱酵:添加乳酸菌/酵母菌、一糖類,進行7~14天醱酵,(2)第二階段添加乳酸菌/酵母菌,進行7~14天醱酵;添加乳酸菌/酵母菌之含菌量為108CFU/ml,接種量為體積0.1%,醱酵溫度26-28℃。在某些實施例中,前述醱酵時間各為14天。
較佳地,本發明所使用之十字花科蔬菜係包含青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜或甘藍菜。
較佳地,本發明所使用之藻類包含海木耳Sarcodiamontagneana、石菜花Gelidiumamansii、石蓴Ulva lactuca、青絲藻Ulva prolifera、海葡萄Caulerpalentillifera或葛仙米藻Nostoc commune。
較佳地,前述製備具有含有硫苷化合物的抗癌組合物過程
中,前述乳酸菌包含Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcuslactis、Lactococcusacidophillus或Bifidobacterium bifidum,前述酵母菌包含Saccharomycopsisfibufigera、Pichia membramefaciens、Schizosaccharomyespombe或Saccharomyces cerevisiae。
較佳地,前述十字花科醱酵液包含青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜或甘藍之醱酵液體。在某些實施例中,前述十字花科醱酵液係取等比例之青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜及甘藍。
較佳地,前述含硒微生物肥料包含:黃豆液、乳酸菌液、亞硒酸鈉。
前述十字花科蔬菜在經過微生物醱酵過程中,將十字花科中的硫代葡萄糖苷化合物轉換為有機態,並且增加含量;混合後之十字花科醱酵液添加醱酵液,經高速乳化頭乳化後,使藻類醱酵液中的膠體包覆於硫苷化合物上,提供保護性與提升功效性。
本發明提供含有硫苷化合物的抗癌組合物,其具有抑制癌細胞生長、抑制腫瘤生長,以及螯合亞鐵離子之有利功效,可用於製備治療癌症之藥物或螯合亞鐵離子之藥物。
第1圖為本發明硫苷結構化合物晶體示意圖;第2A圖及第2B圖顯示本發明抗癌組合物抑制結腸癌細胞
之效果;第3A圖及第3B圖顯示本發明抗癌組合物抑制肝癌細胞之效果;第4A圖及第4B圖顯示本發明抗癌組合物抑制乳癌細胞之效果;第5A圖及第5B圖顯示本發明抗癌組合物抑制肺腺癌細胞之效果;第6圖顯示本發明抗癌組合物之螯合亞鐵離子之效果;第7圖顯示本發明抗癌組合物抑制小鼠腸癌細胞之效果;第8圖顯示本發明抗癌組合物之抑制腫瘤體積效果;第9圖顯示本發明抗癌組合物之對於癌細胞凋亡之作用效果;第10圖顯示本發明抗癌組合物與他牌酵素液之SOD含量的比較結果。
為了比較本發明之抗癌組合物之有利功效,本發明實施例以一般種植十字花科,包含青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜、甘藍等,將蔬菜樣本洗淨後放入醱酵桶中,不添加菌種進行30天醱酵,各自獨立醱酵後以等比例混合萃取液,產生十字花科萃取液,作為本發明之抗癌組合
物之比較基礎。
為了比較本發明之抗癌組合物之有利功效,本發明實施例利用蘿蔔硫素(Sulforaphane)作為硫代葡糖糖苷標準品,為硫苷化合物之一,依照實驗濃度需求配置。
本發明之抗癌組合物如第1圖所示,本發明利用醱酵方式將十字花科中硫代化合物,以有機形態方式保留硫代化合物的功效性,並運用海木耳醱酵液乳化,形成特殊晶體結構,有助於提升原有功效性,使用量減低,增加生物利用度。
本發明提供一具有含有硫苷化合物的抗癌組合物之製備方法,其包含以下步驟:(a)種植一十字花科蔬菜,將一含硒微生物之肥料施於該十字花科蔬菜;有機肥料之有機硒含量為100~1000μg/L的液態肥料,以葉面噴灑方式,施肥量為30L/ha,每周1-3次;前述十字花科蔬菜種子包含青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜、甘藍;含硒微生物肥料為100mL黃豆液+1mL乳酸菌液+2.2g亞硒酸鈉,30℃培養24小時,硒濃度為10000ppm,施用肥料以噴灑方式,將含硒微生物肥料250ml加水定量至1000mL,每次噴灑2000mL。
(b)待前述十字花科蔬菜長成後,收成,並以整株植株壓榨後,添加乳酸菌Lactobacillus plantarum進行14天醱酵;之後再添加酵母菌Saccharomyces cerevisiae進行14天醱酵;醱酵依照醱酵情況適度添加醣類供給菌體養分,菌種添加比例為108CFU/ml接種量為體積0.1%,醱
酵溫度26-28℃,產生一十字花科蔬菜醱酵液;前述青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜、甘藍係各取相同重量(以等比例混合)。
(c)取一海木耳,以(b)所述之醱酵方法進行醱酵,產生一海木耳醱酵液,所述海木耳為Sarcodiaceylanica;
(d)將前述十字花科醱酵液,以及前述海木耳醱酵液以10:1~30:1比例進行混合,產生一具有硫苷化合物之抗癌組合物;較佳的,以19:1比例進行混合。
在前述醱酵過程中,可以依照發酵情況適度添加碳源供給菌體養分,碳源種類可做替換,添加比例占比重為0.1%-5%,碳源種類包含植物或藻類來源的澱粉、多醣、寡糖、雙糖或單醣,如藻類多醣體、玉米澱粉、甜菜根糖、蔗糖或糖蜜。
十字花科萃取液(Cruciferae extract),選自一般種植十字花科(青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜、甘藍),將蔬菜樣本洗淨後放入醱酵桶中,不添加菌種進行30天醱酵,各自獨立醱酵後以等比例混合萃取液,產生十字花科萃取液。
十字花科醱酵液(Cruciferae fermentation liquid),選自十字花科(青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜、甘藍)蔬菜,以特殊製程生產,於種植過程中噴灑含硒微生物肥料,收成後經30天,共2株菌(乳酸
菌:Lactobacillus plantarum;酵母菌:Saccharomyces cerevisiae各發酵兩周)醱酵生成,各自獨立醱酵後以等比例混合醱酵液,產生十字花科醱酵液。
微生物在醱酵過程中,將十字花科中硫代葡萄糖苷化合物轉換為有機態,並且增加含量;混合後之十字花科醱酵液添加5%海木耳醱酵液(以同樣醱酵方式生產醱酵液),經高速乳化頭乳化後,使海木耳醱酵液中的膠體包覆於硫苷化合物上,提供保護性與提升功效性,完成本發明之抗癌組合物。
硫苷化合物的萃取:取20ml十字花科蔬菜醱酵液,或20ml十字花科萃取液於均質瓶中,加入100mL含有100%的70℃甲醇,均質處理15秒,於沸水浴中攪拌10分鐘(轉速為350rpm),再移至70℃水浴進行10分鐘,然後離心15分鐘(轉速為3000rpm),上清液置於35℃烘箱使甲醇揮發,以100mL 0.5M pH 7磷酸緩衝溶液回溶,離心15分鐘(轉速為3000rpm),以0.45μm的聚偏二氟乙烯過濾膜(PVDF濾膜)過濾,以高效液相色譜法HPLC進行分析。
硫苷化合物分析條件:以去離子水配製0.02M四丁基硫酸氫胺tetrabutylammoniumhydrogensulfate(TBA)水溶液,再以磷酸氫二鈉˙二水(Na2HPO4˙2H2O)調整pH值至7.0,以0.45μm濾膜過濾並去氣後作為移動向A液,100%乙晴以0.45μm濾膜過濾並去氣後作為移動向B液,以梯度洗脫進行分析0min:B 5%,25min:B 25%,35min:B 25%,35.1min:B 5%,40min:Stop,流速1mL/min,UV偵測器波長設定227nm,取10μL
樣品注入高效液相色譜法HPLC進行分析。
實施例一之結果如表一所示,十字花科萃取液之硫苷化合物為25±0.01μmole/ml,十字花科蔬菜醱酵液之硫苷化合物為70±0.02μmole/ml。
本實施例針對抑制癌細胞之效果進行測試,設計四個不同組別,分別為:控制組(control)、蘿蔔硫素(Sulforaphane)、十字花科萃取液(Cruciferae extract)、十字花科蔬菜醱酵液(Cruciferaefemented liquid)。
(1)抑制結腸癌細胞:
以WiDr細胞(結腸癌細胞)作為模型,WiDr(細胞數為5×104cell/well,樣品濃度為0.01、0.025、0.05、0.075、0.1μM(此為換算含有硫代葡萄糖苷/蘿蔔硫素濃度),分別培養24與48小時,與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
其結果如第2A圖和第2B圖所示,結果顯示,以十字花科
蔬菜醱酵液處理的細胞,在抑制癌細胞生長能力上,無論何種濃度及時間處理,都與以蘿蔔硫素或十字花科萃取液處理的癌細胞有顯著的差異。
(2)抑制肝癌細胞:
以HepG2(肝癌細胞)作為模型,HepG2細胞數為5×104cell/well,樣品濃度為0.01、0.025、0.05、0.075、0.1μM(此為換算含有硫代葡萄糖苷或蘿蔔硫素之濃度,分別培養24與48小時,與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
其結果如第3A圖和第3B圖所示,結果顯示,以十字花科蔬菜醱酵液處理的細胞,在抑制癌細胞生長能力上,無論何種濃度及時間處理,都與以蘿蔔硫素或十字花科萃取液處理的癌細胞有顯著的差異。
(3)抑制乳癌細胞:
以MCF-7(乳癌細胞)作為模型,MCF-7細胞數為5×104cell/well,樣品濃度為0.1、0.5、1、1.5、2μM(此為換算含有硫代葡萄糖苷或蘿蔔硫素濃度),分別培養24與48小時,與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
其結果如第4A圖和第4B圖所示,結果顯示,以十字花科蔬菜醱酵液處理的細胞,在抑制癌細胞生長能力上,無論何種濃度及時間處理,都與以蘿蔔硫素或十字花科萃取液處理的癌細胞有顯著的差異。
(4)抑制肺腺癌細胞:
以LCC-1(肺腺癌細胞)作為模型,LCC-1細胞數為5×104
cell/well,樣品濃度為0.1、0.5、1、1.5、2μM(此為換算含有硫代葡萄糖苷或蘿蔔硫素濃度),分別培養24與48小時,與樣品共培養後以MTT assay檢驗抑制癌細胞生長能力。
其結果如第5A圖和第5B圖所示,結果顯示,以十字花科蔬菜醱酵液處理的細胞,在抑制癌細胞生長能力上,無論何種濃度及時間處理,都與以蘿蔔硫素或十字花科萃取液處理的癌細胞有顯著的差異。
螯合亞鐵離子能力實驗設計:
0.02mL的FeCl2.4H2O(2mM)於1.5ml離心管中,加入0.94mL待測樣品及0.04mL的Ferrozine(5mM)混合均勻,在室溫下靜置反應10分鐘,使用光譜儀檢測562nm吸光值,吸光值越低表示樣品螯合亞鐵離子能力越強,EDTA為標準品。
其結果如第6圖所示,結果顯示,以十字花科蔬菜醱酵液處理的細胞,在螯合亞鐵離子能力上,無論何種濃度處理,都與以蘿蔔硫素或十字花科萃取液處理的癌細胞有顯著的差異。
本試驗分為四組:第一組為控制組(control);第二組為5-FU組,5-FU為已知癌症化療藥物;第三組為十字花科蔬菜醱酵液
(Cruciferaefemented liquid)(本發明抗癌組合物);第四組為5-FU和十字花科蔬菜醱酵液,以十字花科蔬菜醱酵液作為輔助治療(5-FU+Cruciferaefemented liquid)。
(1)抑制小鼠大腸癌細胞:
以小鼠BALB/c為模型,CT-26細胞株經過繼代為106細胞數量之細胞液,於4週齡時在左後肢皮下注射CT-26細胞液100μL,誘導大腸癌後晶由樣本治療,以腹腔注射食鹽水/5-FU,醱酵液為每日進行管餵,使用量為人體建議使用量轉換,0.5ml/kg,實驗持續4周後犧牲,於每周進行腫瘤大小測量。其結果如第7圖所示,結果顯示,十字花科醱酵液抑制腫瘤大小可比擬化療藥物5-FU,作為化療藥物輔助實更能降低腫瘤的大小,可發展為抗癌藥物或化療輔助藥物。
(2)小鼠犧牲後腫瘤體積評估:
治療28天後小鼠犧牲,將腫瘤取出比對腫瘤大小。其結果如第8圖所示,結果顯示十字花科醱酵液能有效縮小動物模型中腫瘤的大小,作為輔助藥物實效果最佳。
(3)腫瘤組織切片:
將犧牲小鼠腫瘤進行切片後鏡檢,判斷細胞凋亡程度。其結果如第9圖所示,結果顯示,使用十字花科醱酵液之腫瘤組織,細胞凋亡狀況皆有顯著影響,以凋亡型態判斷,化療藥物5-FU可減少腫瘤的生長,但對於癌細胞無明顯誘導凋亡作用;經十字花科醱酵液治療,能顯著
提升癌細胞凋亡作用,此結果證實十字花科醱酵液中的硫代化合物具有靶向特性,可針對癌細胞誘導其凋亡作用。
本發明抗癌組合物有經過SOD含量檢驗。有關於SOD與硫代化合物協同作用為目前文獻研究中已知結果。
本實施例以商業分析套組(Superoxide dismutase assay kit,Cayman,Ann Arbor,MI,USA)分析本發明抗癌組合物之SOD之活性。可於波長450nm下測定其吸光值,依據SOD之標準活性曲線計算出發酵液中超氧歧化酵素的含量,單位以Uint/mL表示。其結果如第10圖所示A、B、C發酵液分別含890、280、950Uints/mL之SOD,綜合發酵液含3500Units/mL之SOD。
前述A、B和C為不同菌種之發酵液,蔬果種類、數量相同,蔬果種類為番茄、青梅、紅甜椒、番石榴、甘藍、西蘭花、葡萄、蘋果、花椰菜、苦瓜、甘薯、梨子、紅茶、菠菜、絲瓜、橙子、香蕉、萵苣、西瓜、西番蓮、芥菜、葡萄柚、蘿蔔、冬瓜、芥藍、空心菜、黃瓜、小白菜、菠蘿、黑木耳、香菇、檸檬、李子、獼猴桃、芹菜、茄子、甜瓜、莧菜、金橘、胡蘿蔔、哈密瓜、蓮霧、大白菜、荔枝、蘆筍、火龍果、番荔枝、蓮藕、柿子、茼蒿、油菜、楊桃、木瓜、豆瓣菜、菜豆、蕪菁、馬鈴薯、山藥、芋頭和南瓜。
前述A發酵液之製程以乳酸菌(ATCC 14917)菌株進行60天發酵;前述B發酵液之製程以乳酸菌(ATCC 8014)菌株+Coopers市售酵母菌進行60天發酵;前述C發酵液之製程以乳酸菌(ATCC 14917)菌株+Coopers市售酵母菌進行60天發酵。
綜上所述,本發明經乳酸菌和酵母菌醱酵過的十字花科蔬菜萃取物,再混以海木耳醱酵液,可將抗癌成分硫苷化合物形成一硫苷化合物晶體,提升了有效成分的抗癌效果,並增加螯合亞鐵離子能力。
本發明所揭露的所有特徵應可以任何結合方式實現。本發明所揭露的每一特徵應可以相同、均等或相似目的的取代物所取代。因此,除非有明確的指定,否則所揭露的每一個特徵僅僅只是均等物或相似特徵的一個種類的一實施例。
Claims (13)
- 一種醱酵液組合物,其包含一十字花科醱酵液和一藻類醱酵液,該十字花科醱酵液包含一硫苷化合物,該藻類醱酵液包含一膠體結構,該膠體結構包覆於該硫苷化合物;其中,該十字花科醱酵液係選自由青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜和甘藍之醱酵液所組成,該藻類醱酵液係選自由海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄和葛仙米藻之醱酵液體所組成,該十字花科醱酵液與該藻類醱酵液之混合比例係為10:1~30:1。
- 如專利申請範圍第1項所述之組合物,其中該硫苷化合物含量為40~100μmole/ml。
- 如專利申請範圍第1項所述之組合物,其中該十字花科醱酵液係取等比例之青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜及甘藍。
- 一種如專利申請範圍第1項所述之組合物之製備方法,包含以下步驟:(a)種植一十字花科蔬菜,將一含硒微生物之肥料施於該十字花科蔬菜;(b)待該十字花科蔬菜長成後收成,進行一醱酵方法,產生一十字花科蔬菜醱酵液;(c)取一藻類,進行該醱酵方法,產生一藻類醱酵液;(d)將該十字花科醱酵液,以及該藻類醱酵液以10:1~30:1比例進 行混合,產生如專利申請範圍第1項所述之組合物;其中,該十字花科蔬菜係選自由青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜和甘藍所組成,該藻類係選自由海木耳、石菜花、石蓴、青絲藻、海葡萄和葛仙米藻所組成。
- 如專利申請範圍第4項所述之製備方法,該醱酵方法,包含:(1)第一階段醱酵:添加乳酸菌,進行7~14天醱酵;(2)第二階段添加酵母菌,進行7~14天醱酵;添加之乳酸菌或酵母菌含菌量為108CFU/ml,接種量為體積0.1%,醱酵溫度26-28℃。
- 如專利申請範圍第5項所述之製備方法,該乳酸菌包含Lactobacillus plantarum、Lactobacillus delbrueckii、Lactococcuslactis、Lactococcusacidophillus或Bifidobacterium bifidum。
- 如專利申請範圍第5項所述之製備方法,該酵母菌包含Saccharomycopsisfibufigera、Pichia membramefaciens、Schizosaccharomyespombe或Saccharomyces cerevisiae。
- 如專利申請範圍第4項所述之製備方法,其中該十字花科醱酵液係取等比例之青花菜、花椰菜、芥菜、小白菜及甘藍。
- 如專利申請範圍第4項所述之製備方法,其中該含硒微生物肥料包含:黃豆液、乳酸菌液或亞硒酸鈉。
- 一種如專利申請範圍第1項所述之組合物用於製備治療癌症之藥物之用途。
- 如專利申請範圍第10項所述之用途,其中該癌症包含大腸結腸癌、肝癌、乳癌或肺腺癌。
- 一種如專利申請範圍第1項所述之組合物用於製備螯合亞鐵離子之藥物之用途。
- 如專利申請範圍第12項所述之用途,其中該用途包含協助體內排出PM2.5汙染物質,避免重金屬囤積體內。
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