TWI655951B - 用於調控nos3基因、plat基因、f3基因及／或serpine1基因表現的紅藜萃取物及其應用 - Google Patents
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Abstract
一種使用紅藜（Chenopodium formosanum
）萃取物於製造一組合物之用途，其中該組合物係用於以下之至少一者：提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及降低SERPINE1
基因表現，從而達到治療或預防與NOS3
基因、PLAT
基因、F3
基因及／或SERPINE1
基因相關之疾病的效果。
Description
本發明係關於紅藜萃取物之應用，尤其是關於紅藜水萃物的應用，包括使用該萃取物於治療或預防與NOS3
基因、PLAT
基因、F3
基因、及／或SERPINE1
基因相關之疾病，尤其是使用該萃取物於抑制血栓形成、分解血栓及輔助調節血壓之至少一者。
止血作用對於生物體的生存至關重要，然而，異常的凝血作用與血栓形成容易引起例如靜脈血栓、肺栓塞、中風、心肌梗塞、高血壓等高致死率之疾病的發生。形成異常或過量之血栓的因素眾多，常見的原因包含血管內皮受損、血液停滯、以及凝血功能亢進等。患有心臟病、高血壓、高血脂、糖尿病、癌症等疾病之患者，以及長時間久坐、缺乏運動者等，皆為血栓相關疾病的高危險群。
目前臨床上對於血栓相關疾病的主要治療方式，係採取對患者投予溶血栓藥物（例如：胞漿素原活化劑（tissue-type plasminogen activator，tPA））或抗凝血劑（例如：肝素（heparin）及苯甲香豆醇（warfarin）），但現有的溶血栓藥物有造成出血不止之危險性且無法溶解較大的血栓，抗凝血劑則無法使已形成的血栓變小。因此，持續開發可有效抑制血栓形成及／或分解血栓、且不易產生副作用的藥物或方法係有相當的必需性及迫切性。
研究已知，血栓的形成及分解係受到NOS3
、PLAT
、F3
及SERPINE1
等基因的調節。其中，F3
基因及SERPINE1
基因的過度表現會造成血栓形成，PLAT
基因的表現量提升則可促進已形成之血栓進行分解，而NOS3
基因的表現量提升係有助於促進血管擴張、降低血小板堆積，從而可輔助調節血壓及抑制血栓形成。因此，若能提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及／或降低SERPINE1
基因表現，即可有效調節血壓、抑制血栓形成及／或分解血栓。
本案發明人研究發現，紅藜萃取物具有調控NOS3
、PLAT
、F3
及SERPINE1
等基因的表現的效果，故可用於抑制血栓形成、分解血栓及輔助調節血壓，且可用於治療或預防與前述基因相關的疾病。
本發明之一目的，在於提供一種使用紅藜（Chenopodium formosanum
）萃取物於製造一組合物之用途，其中該組合物係用於以下之至少一者：提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及降低SERPINE1
基因表現。較佳地，該紅藜萃取物係紅藜水萃物，且該組合物係一醫藥組合物或食品組合物。
根據本發明所提供之醫藥組合物，係可用於治療心血管疾病（包括心肌梗塞、左心室功能缺損、慢性阻塞性肺高壓、高血壓、及血栓）、治療水腦畸形、治療皰瘡、治療肥胖、預防心血管疾病、預防水腦畸形、預防皰瘡、預防肥胖、預防胎兒死亡、及延緩老化之至少一者，尤其係用於抑制血栓形成及／或分解血栓。較佳地，該醫藥組合物係呈一選自以下群組之劑型：口服、靜脈注射、及皮下注射。
根據本發明所提供之食品組合物，係用於輔助抑制血栓形成、輔助分解血栓及／或輔助調節血壓。較佳地，該食品組合物係一健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。更佳地，該食品組合物係一乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、或營養飲料。
本發明之另一目的，在於提供一種提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及／或降低SERPINE1
基因表現的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之紅藜萃取物，較佳投予紅藜水萃物。該方法係用於治療心血管疾病（包括心肌梗塞、左心室功能缺損、慢性阻塞性肺高壓、高血壓、及血栓）、治療水腦畸形、治療皰瘡、治療肥胖、預防心血管疾病（包括心肌梗塞、左心室功能缺損、慢性阻塞性肺高壓、高血壓、及血栓）、預防水腦畸形、預防皰瘡、預防肥胖、預防胎兒死亡、及延緩老化之至少一者。較佳地，該方法係用於輔助調節血壓、抑制血栓形成及／或分解血栓。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者或後附申請專利範圍所界定者。
除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「治療」，不應被解釋為治療一個體直至完全恢復，而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、或提高一患者之生命品質；所謂「預防」係指抑制或防止一具體病況的發作、或維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性；所謂「調節」係指正向調控（包括誘導、刺激、及增強）或負向調控（包括抑制、及減弱）以使個體朝向所述生理機能之正常狀態者；所謂「調節血壓」係指朝正常值之方向改變血壓數值；所謂「有效量」，係指投予至個體時，可有效地至少部分改善懷疑個體之病情的物質數量；所謂「個體」係指哺乳動物，該哺乳動物可以為人類或非人動物。
本發明所涉紅藜（Chenopodium formosanum
），又稱台灣藜，是台灣原生種植物，亦為台灣原住民傳統的糧食作物，具有極高的營養價值。於後附實施例中作為對照組之藜麥（Chenopodium quinoa
），又稱印地安麥，其原產地為美洲。紅藜與藜麥在外觀、營養成分等方面皆有不同，但一般大眾仍常因此二者之命名相似而將其混淆。
如前述，本案發明人發現紅藜萃取物具有調控NOS3
、PLAT
、F3
、及SERPINE1
等基因表現的效果。針對前述基因，已知NOS3
基因表現低下與心肌梗塞及左心室功能缺損相關。因此，若可提升NOS3
基因的表現，則可治療或預防心肌梗塞及左心室功能缺損。有關NOS3
基因與心肌梗塞及左心室功能缺損之關聯性，可參見例如：Depletion of circulating blood NOS3 increases severity of myocardial infarction and left ventricular dysfunction.Basic Res Cardiol.
109(1):398 (2014)，該文獻之全文併於此處以供參考。
已知PLAT
基因表現低下與血栓形成、水腦畸形及胎兒死亡相關。因此，若可提升PLAT
基因的表現，則可治療或預防血栓、治療或預防水腦畸形及預防胎兒死亡。有關PLAT
基因與血栓形成、水腦畸形及胎兒死亡之關聯性，可參見例如：A lethal phenotype associated with tissue plasminogen deficiencyin humans.Hum Genet.
135(10):1209-11 (2016)，該文獻之全文併於此處以供參考。
已知F3
基因之過度表現與血栓、慢性阻塞性肺高壓及皰瘡相關。因此，若可降低F3
基因的表現，則可治療或預防血栓、慢性阻塞性肺高壓及皰瘡。有關F3
基因與血栓、慢性阻塞性肺高壓及皰瘡之關聯性，可參見例如：The role of mononuclear cell tissue factor and inflammatory cytokines in patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension.J Thromb Thrombolysis
. 42(1):38-45 (2016)、及Tissue Factor in Dermatitis Herpetiformis and Bullous Pemphigoid: Link between Immune and Coagulation System in Subepidermal Autoimmune Bullous Diseases.Mediators of Inflammation
. 2015, Article ID 870428, 9 pages，該等文獻之全文併於此處以供參考。
SERPINE1
基因之過度表現則與老化、肥胖及心血管疾病（包括血栓）相關。因此，若可降低SERPINE1
基因的表現，則可治療或預防肥胖、治療或預防心血管疾病、及延緩老化。有關SERPINE1
基因與老化、肥胖及心血管疾病之關聯性，可參見例如：Plasminogen Activator Inhibitor-1 Is a Marker and a Mediator of Senescence.Arterioscler Thromb Vasc Biol
. 37(8):1446-1452 (2017)、及PAI-1 and TNF-α profiles of adipose tissue in obese cardiovascular disease patients.Int J Clin Exp Pathol
8(12):15919-15925 (2015)，該等文獻之全文併於此處以供參考。
因此，本發明係提供一種使用紅藜萃取物於製造一組合物之用途，其中該組合物係用於提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及／或降低SERPINE1
基因表現。該組合物可以是一醫藥組合物或一食品組合物。根據本發明所提供之醫藥組合物係可用於以下之至少一者：治療心血管疾病（包括心肌梗塞、左心室功能缺損、慢性阻塞性肺高壓、高血壓、及血栓）、治療水腦畸形、治療皰瘡、治療肥胖、預防心血管疾病（包括心肌梗塞、左心室功能缺損、慢性阻塞性肺高壓、高血壓、及血栓）、預防水腦畸形、預防皰瘡、預防肥胖、預防胎兒死亡、及延緩老化。根據本發明所提供之醫藥組合物尤其係用於抑制血栓形成及／或分解血栓。根據本發明所提供之食品組合物係用於輔助抑制血栓形成、輔助分解血栓及／或輔助調節血壓。
本發明所採用之紅藜萃取物係可透過包含如下步驟之操作提供：（a）以一極性溶劑萃取紅藜，以提供一粗萃液；（b）對該粗萃液進行離心處理，取上清液進行過濾，以提供一濾液；以及（c）對該濾液進行減壓濃縮，獲得一濃縮萃取液（此即，本發明之紅藜萃取物）。其中，本發明所採用之紅藜可以是未脫殼之紅藜、或經脫殼之紅藜。
於步驟（a）中，該極性溶劑可以為水、醇（例如C1-C4醇）、或其組合，且可視需要調整極性溶劑與紅藜之用量比率。一般而言，極性溶劑的用量並無特殊限制，只要可以使原料均勻分散即可。舉例言之，可於步驟（a）採用極性溶劑與紅藜之體積比為約1：1至約20：1的用量。於本發明一具體實施態樣中，係以水作為極性溶劑，並以體積比約10：1之水：紅藜進行步驟（a）之萃取。
於步驟（a）中，可視所採用之極性溶劑來選用合宜的萃取時間。以採用水作為極性溶劑且水：紅藜之體積比為約10：1為例，通常萃取歷時至少0.5小時，較佳至少1.5小時，更佳至少3小時。此外，可視需要輔以例如加溫、冷卻、超音波等其它操作以進行步驟（a）。舉例言之，可於50至100°C下進行步驟（a）。於本發明一具體實施態樣中，係於75°C下進行步驟（a），歷時0.5小時。另可視需要於進行步驟（a）之前，先以搗碎、研磨、切碎等方式使紅藜成為體積盡可能小之顆粒，以提高萃取效果。
於步驟（c）中，可視需要調整減壓濃縮時的溫度。舉例言之，可於45至70°C下進行步驟（c）之減壓濃縮。於本發明一具體實施態樣中，係於60°C下進行步驟（c）之減壓濃縮。根據本發明所採用之紅藜萃取物，亦可以是一乾燥物，此乾燥物可透過乾燥步驟（c）所得之濃縮萃取液而提供。為儘可能達到最大的萃取效益，視需要地，可於進行步驟（b）之前，以相同或不同的極性溶劑對紅藜進行重複萃取，並合併該多次萃取所得之萃取液以提供進行步驟（b）之粗萃物；亦可重複進行步驟（b）、步驟（c）、以及前述視需要之其它操作之循環。
根據本發明所提供之醫藥組合物係可呈任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該醫藥組合物可以口服或非經口服（例如：皮下及靜脈內）之投藥方式施用至有需要之個體上。其中，視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該醫藥組合物，其中，該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以適於口服之劑型為例，於根據本發明所提供之醫藥組合物中係可含有任何不會不利影響活性成分（即，紅藜萃取物）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、食鹽水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土（sugar bentonite）、及前述之組合。可利用任何合宜之方法，將該醫藥組合物以適於口服投藥的劑型提供，例如：錠劑（例如糖衣錠）、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、酊劑等。
至於適於皮下或靜脈注射之針劑或點滴劑，則可於根據本發明所提供之醫藥組合物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液（如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液）、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組合物。或者，可將該醫藥組合物製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，提供所欲之注射劑。
根據本發明所提供之醫藥組合物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康況狀而異。於根據本發明所提供之醫藥組合物中，可視實際應用需求，調整紅藜萃取物於組合物中的含量比例。此外，該醫藥組合物可視需要另含一或多種其他活性成分（例如胞漿素原活化劑、肝素、及苯甲香豆醇等），或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該醫藥組合物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分（即，紅藜萃取物）之效益沒有不利的影響即可。
視需要地，可於根據本發明所提供之醫藥組合物或食品組合物中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該醫藥組合物或食品組合物於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該醫藥組合物或食品組合物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
根據本發明所提供之食品組合物可以是健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品，且可製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品，但不以此為限。較佳地，根據本發明的食品組合物係以健康食品的型式提供。
根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率食用，端視投予個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群調整根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品及特殊營養食品中紅藜萃取物的含量，較佳為調整至每日應服用的量。
可於本發明健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品及／或特殊營養食品之外包裝標示建議使用量、特定族群（例如高血壓患者、中風患者、孕婦等）的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下可在家自行服用而無安全疑慮。於根據本發明所提供之食品組合物中，有關該紅藜萃取物之態樣以及相關之應用，均如上述之說明。
本發明亦提供一種用於提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及／或降低SERPINE1
基因表現的方法，其係包含對一有需要之個體投予一有效量之紅藜萃取物。有關該紅藜萃取物之態樣、投予途徑、投予形式、施用頻率、以及相關之應用，均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[
製備實施例
]
A.
紅藜萃取物的製備
將紅藜（學名：Chenopodium formosanum
、產地：台灣屏東縣）進行以下操作處理，以提供紅藜萃取物： 1. 以研磨之方式將紅藜粉碎，並將粉碎後之紅藜以10網目（mesh）之篩網進行過濾，以提供一紅藜粉末； 2. 將步驟1之紅藜粉末與水混和（紅藜粉末與水之體積比為1：10），並置於75°C下進行萃取，歷時0.5小時，以提供一粗萃液； 3. 待步驟2之粗萃液冷卻至室溫（約25°C），以5000 r.p.m.之轉速對其進行離心，歷時10分鐘，再以400網目之濾網進行過濾，以提供一濾液； 4. 於60°C下，對步驟3之濾液進行減壓濃縮，以提供一濃縮萃取液（即，本發明之紅藜萃取物）。
B.蔾 麥萃取物的製備
將藜麥（學名：Chenopodium quinoa
、產地：智利）比照上述紅藜萃取物之製備步驟進行萃取，以提供一藜麥萃取物。
C.細胞的處理
將人類臍帶靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）（購自ATCC，產品編號CRT-1730）接種於6-孔盤中（每孔1.5 x 105
個細胞）中，培養24小時後，將細胞分為控制組、紅藜組及藜麥組（共三組，各組皆二重複），並分別以如下培養基進行培養，歷時24小時： 1. 控制組：含有0.1毫克／毫升之肝素、0.03-0.05毫克／毫升之內皮細胞生長添加劑、10%之胎牛血清之F-12K培養基； 2. 紅藜組：如控制組之培養基，但另添加0.3125毫克／毫升由[製備實施例A]獲得之紅藜萃取物； 3. 藜麥組：如控制組之培養基，但另添加0.3125毫克／毫升由[製備實施例B]獲得之藜麥萃取物。
其後，分別收集上述各組細胞，以RNA萃取套組（RNA Extraction Kit，購自Geneaid公司）進行RNA萃取，再以反轉錄酶（SuperScript® III Reverse Transcriptase，購自Invitrogrn公司）將該RNA反轉錄為cDNA。接著，使用ABI Step One Plus儀器及KAPA SYBR FAST套組對前述之cDNA進行qPCR（quantitative polymerase chain reaction），以檢測各組細胞之血管擴張相關基因（包括NOS3
）、血栓分解相關基因（包括PLAT
）、及血栓形成相關基因（包括F3
及SERPINE1
）的表現量。以控制組的結果為基準（即，將控制組的基因表現量設定為1倍），計算其他各組的相對基因表現量。結果示於表1、及圖1至圖3。
表1
*表示p＜0.05；**表示p＜0.01
由表1及圖1可知，相較於控制組，紅藜組及藜麥組的NOS3
基因表現量皆有增加，其中紅藜組的增加趨勢更為顯著。前述結果顯示，本發明紅藜萃取物確實可以提升NOS3
基因表現量，可有效促進血管擴張、降低血小板堆積，達到輔助調節血壓及抑制血栓形成的效果，且效果較藜麥萃取物為佳。
由表1及圖2可知，相較於控制組，紅藜組的PLAT
基因表現量顯著增加，而藜麥組的PLAT
基因表現量則無明顯變化。前述結果顯示，本發明紅藜萃取物確實可提升PLAT
基因表現量，可有效促進已形成之血栓進行分解。然而，藜麥萃取物則無法達成前述效果。
由表1及圖3可知，相較於控制組，紅藜組的F3
及SERPINE1
基因表現量皆有降低。藜麥組的F3
基因表現量雖有降低，但SERPINE1
基因表現量並無明顯變化。前述結果顯示，本發明紅藜萃取物確實可降低F3
及SERPINE1
基因表現量，可有效抑制血栓形成。然而，藜麥萃取物無法有效達成前述效果。
上述結果顯示，相較於藜麥萃取物，本發明紅藜萃取物於提升NOS3
基因表現、提升PLAT
基因表現、降低F3
基因表現、及降低SERPINE1
基因表現的效果更為優異，更可用於治療心血管疾病、治療水腦畸形、治療皰瘡、治療肥胖、預防心血管疾病、預防水腦畸形、預防皰瘡、預防肥胖、預防胎兒死亡、及延緩老化之至少一者，尤其是用於抑制血栓形成、分解血栓及／或輔助調節血壓。
圖1所示為不同組別HUVEC細胞之NOS3
基因的表現量（相對於控制組之表現量），其中，「控制組」係於不含紅藜萃取物與藜麥萃取物的培養液中培養24小時，「紅藜組」與「藜麥組」則分別於含有紅藜萃取物或藜麥萃取物的培養液中培養24小時；
圖2所示為不同組別HUVEC細胞之PLAT
基因的表現量（相對於控制組之表現量），其中包含「控制組」、「紅藜組」及「藜麥組」的結果；以及
圖3所示為不同組別HUVEC細胞之F3
及SERPINE1
基因的表現量（相對於控制組之表現量），其中包含「控制組」、「紅藜組」及「藜麥組」的結果。
Claims (7)
- 一種使用紅藜(Chenopodium formosanum)萃取物於製造一組合物之用途，其中該組合物係用於以下之至少一者：提升PLAT基因表現、降低F3基因表現、及降低SERPINE1基因表現。
- 如請求項1之用途，其中該紅藜萃取物係紅藜水萃物。
- 如請求項1或2之用途，其中該組合物係一醫藥組合物或食品組合物。
- 如請求項3之用途，其中該組合物係醫藥組合物，且該醫藥組合物係用於以下之至少一者：治療肥胖、預防肥胖、及預防胎兒死亡。
- 如請求項3之用途，其中該組合物係醫藥組合物，且該醫藥組合物係呈一選自以下群組之劑型：口服、靜脈注射、及皮下注射。
- 如請求項3之用途，其中該食品組合物係一健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品。
- 如請求項3之用途，其中該食品組合物係一乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、或營養飲料。
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| "upregulation of thrombo-inflammatory pathways may contribute to increased thrombotic risk in polycythemia vera and essential thrombocythemia", BLOOD, vol. 128, 1 December 2016 (2016-12-01), pages 3143 * |
| 【國圖上架時間:2014/08/06】 藥用植物主題館，紅藜，2014/11/10 * |
| Blood 2016 128:3143,upregulation of thrombo-inflammatory pathways may contribute to increased thrombotic risk in polycythemia vera and essential thrombocythemia,Dec.1,2016。 |
| European Journal of Human Genetics(2003)11,p.603-610。 |
| EUROPEAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 11, 2003, pages 603 - 610 * |
| 探討臺灣藜多醣調節巨噬細胞之免疫活性，施品岑，國立屏東科技大學食品科學系，101年1月31日 * |
| 探討臺灣藜多醣調節巨噬細胞之免疫活性，施品岑，國立屏東科技大學食品科學系，101年1月31日。 【國圖上架時間:2014/08/06】 |
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