TWI615400B - ５'-經取代核苷化合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於新穎5'-經取代核苷化合物；包含該等化合物之醫藥組合物；及使用該等化合物治療癌症、更特定而言用於治療尤其以下癌症之方法：神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤。
Description
本發明係關於抑制蛋白精胺酸甲基轉移酶5(PRMT5)之活性之新穎5'-經取代核苷化合物；包含該等化合物之醫藥組合物；及使用該等化合物以治療生理病症、更特定而言用於治療癌症之方法。
蛋白精胺酸甲基轉移酶(PRMT)為可將一或兩個甲基增加至組蛋白及非組蛋白蛋白質上之精胺酸殘基之脈氮原子的酶家族。由PRMT導致之大量的後生修飾使得可調節廣泛多種細胞功能，包括例如RNA代謝、轉錄調節、信號轉導、胚胎發育及DNA損害修復。不同PRMT之過度表現已頻繁與諸多人類癌症相關。最近，增加之證據表明PRMT家族之一重要成員PRMT5為潛在癌蛋白且涉及腫瘤形成。PRMT5在許多腫瘤中過度表現，使重要致癌基因及癌症存活基因作為受質，且調控替代性拼接及RNA成熟，其為對蛋白表現重要之新穎機制。另外，顯示套細胞淋巴瘤對PRMT5抑制極其敏感。
PRMT5之潛在抑制劑已在文獻中已知。參見例如WO2011/079236、WVO2014/100764、WO2014/100716、WO2014/100695、WO2014/100730、WO2014/100734及WO2014/100719。另外，某些5'-經取代核苷在文獻中已知。參見例如WO2001/27114及WO2013/009735。
需要新癌症治療。詳言之需要針對神經膠母細胞瘤、胃癌、胰臟癌、膀胱癌、肺癌、白血病及淋巴瘤之新癌症治療。仍需要提供適用於治療癌症之替代PRMT5抑制劑。較佳地該等化合物具有使得能
夠得到為最大抑制腫瘤細胞生長所需的最優給藥之特性，同時對患者而言具有可接受耐受性。較佳地該等化合物亦將可經口生物利用。
本發明提供某些新穎5'-經取代核苷化合物，其為PRMT5之抑制劑且可作為單劑或與其他抗癌劑組合而具有臨床效用，以用於治療不同類型之癌症，且詳言之神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤。
本發明提供一種下式化合物：
其中：R1a為氫、C1-C2烷基、三氟甲基、氰基、氯或氟；R1b為氫、氯或氟；R2為氫或C1-C3烷基；且R3為氫、甲基或胺基；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明提供一種下式化合物：
其中：R1a為氫、C1-C2烷基、C3-C6環烷氧基、三氟甲基、氰基、氯或氟；R1b為氫、氯或氟；
R2為氫或C1-C3烷基；且R3為氫、甲基或胺基；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種下式化合物：
其中：R1a為氫、C1-C2烷基、三氟甲基、氰基、氯或氟；R1b為氫、氯或氟；R2為氫或C1-C3烷基；且R3為氫、甲基或胺基；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種下式化合物：
其中：R1a為氫、C1-C2烷基、C3-C6環烷氧基、三氟甲基、氰基、氯或氟；R1b為氫、氯或氟；R2為氫或C1-C3烷基；且R3為氫、甲基或胺基；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種下式化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種下式化合物：
其為結晶且藉由X射線粉末繞射圖(Cu輻射，λ=1.54060Å)表徵，該X射線粉末繞射圖包含25.1°之峰，以及一或多個選自由17.1°、13.6°、20.5°、24.0°及14.5°(2θ +/- 0.2°)組成之群的峰。
本發明進一步提供一種下式化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種下式化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種下式化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明進一步提供一種下式化合物：
或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
本發明提供一種治療需要該治療之患者中之癌症的方法，該癌症詳言之神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤，該方法包含投與患者有效量之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種用於治療之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽。另外，本發明提供一種用於治療癌症之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽，該癌症詳言之神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤。此外，本發明提供本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽用於製備供治療癌症用之藥劑的用途，該癌症詳言之神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤。
詳言之，化合物為
或其醫藥學上可接受之鹽。
詳言之，化合物為
或其醫藥學上可接受之鹽。
詳言之，化合物為
或其醫藥學上可接受之鹽。
詳言之，化合物為
或其醫藥學上可接受之鹽。
如本文中所使用，「治療(treat/treating/treatment)」係指抑制、減緩、停止或逆轉現有症狀或病症之進程或嚴重程度。
如本文中所使用，術語「患者」係指溫血動物，諸如哺乳動
物，尤其受特定疾病、病症或病狀折磨的人類。
以下段落描述本發明之較佳種類：a)R1a為氫、氯或環丙氧基；b)R1b為氫或氯；c)R2為氫或甲基；d)R3為胺基；e)R1a為氯，R1b為氫，且R2為氫；f)R1a為氯，R1b為氫，且R2為甲基；g)R1a為氫，R1b為氫，且R2為氫；h)R1a為環丙氧基，R1b為氯，且R2為氫；i)R1a為氯，R1b為氫，且R3為胺基；j)R1a為氫，R1b為氫，且R3為胺基；k)R1a為環丙氧基，R1b為氯，且R3為胺基；l)R2為氫且R3為胺基；m)R2為甲基且R3為胺基；n)R1a為氯，R1b為氫，R2為氫，且R3為胺基；o)R1a為氫，R1b為氫，R2為氫，且R3為胺基；p)R1a為氯，R1b為氫，R2為甲基，且R3為胺基；且q)R1a為環丙氧基，R1b為氯，R2為氫，且R3為胺基。
熟習之讀者應理解本發明化合物可形成鹽。本發明化合物含有鹼式雜原子，具體而言胺，且因此與許多無機酸及有機酸中之任一者反應，以形成醫藥學上可接受之酸加成鹽。該等醫藥學上可接受之酸加成鹽及製備其之常見方法在此項技術中已為所熟知。參見例如P.Stahl等人，HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS：PROPERTIES,SELECTION AND USE,(VCHA/Wiley-VCH,2008)；S.M.Berge等人，「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences，第66卷，第1期，1977年1月。
本發明化合物或其鹽可藉由多種此項技術中已知之程序製備，其中一些在以下流程、製備及實例中說明。針對各所述途徑之特定合成步驟可以不同方式組合或與來自流程之步驟結合，以製備本發明之化合物或鹽。在以下流程中，各步驟之產物可藉由此項技術中熟知之習知方法回收，該等方法包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、濕磨及結晶。
一些中間物或本發明化合物可具有一或多個對掌性或立體對稱中心。本發明涵蓋所有個別立體異構體、對映異構體及非對映異構體，以及該等化合物之對映異構體與非對映異構體的混合物，包括外消旋體。含有至少一個對掌性中心之本發明化合物較佳以單一對映異構體或非對映異構體形式存在。單一對映異構體或非對映異構體可以對掌性試劑為起始物質(如以下流程I中所說明)製備或藉由立體選擇性或立體特異性合成技術(如以下流程II中所說明)製備。或者，單一對映異構體或非對映異構體可藉由標準對掌性層析或結晶技術自混合物分離。
另外，以下流程中所描述之某些中間物可含有一或多個氧或氮保護基。可變保護基在每次出現時可視特定反應條件及待進行之特定轉化而相同或不同。保護及去保護條件已為熟習此項技術者所熟知，且描述於文獻(參見例如「Greene's Protective Groups in Organic Synthesis」，第四版，Peter G.M.Wuts及Theodora W.Greene,John Wiley and Sons,Inc.2007)中。
某些縮寫如下定義：「A375」係指人類黑素瘤腫瘤衍生之細胞株；「ACN」係指乙腈；「ATCC」係指美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)；「BID」係指每日兩次給藥；「cat.#」係指目錄號；「CDI」係指1,1'-羰基二咪唑；「CDKN1A」係指週期素依賴
型激酶抑制劑1、p21、p21Cip1或p21Waf1；「CPD」係指來自經化合物處理之樣品之值；「[Cp*IrCl2]2」係指二氯(戊甲基環-戊二烯基)銥(III)二聚體；「CPM」係指每分鐘計數；「CT」係指循環臨限值；「DCC」係指N,N'-二環己基碳化二亞胺；「DCM」係指二氯甲烷；「DIAD」係指偶氮二甲酸二異丙酯；「DIC」係指N,N'-二異丙基碳化二亞胺；「DIPEA」係指N,N-二異丙基乙胺；「DLBCL」係指彌漫性大B細胞淋巴瘤；「DMEM」係指杜爾貝科氏改質之伊格爾氏(組織培養)培養基(Dulbecco's Modified Eagle's(tissue culture)medium)；「DMSO」係指二甲亞碸；「DNA」係指去氧核糖核酸；「DNA酶」係指去氧核糖核酸酶；「cDNA」係指互補DNA；「dNTP」係指三磷酸去氧核苷酸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EDCI」係指1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「EGTA」係指乙二醇-雙(2-胺基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「EtOH」係指乙醇(ethanol)或乙醇(ethyl alcohol)；「FBS」係指胎牛血清；「GAPDH」係指甘油醛-3-磷酸酯去氫酶；「GC」係指氣相層析；「3H-SAM」係指S-[甲基-3H]-腺苷-L-甲硫胺酸；「HAT」係指次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷；「HATU」係指六氟磷酸[二甲基胺基(三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)亞甲基]-二甲基銨；「HBTU」係指六氟磷酸鄰(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基
；「HOBt」係指羥基苯并三唑；「HEC」係指羥乙基纖維素；「HEPES」係指4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸；「hr」係指小時；「HOAt」係指1-羥基-7-氮雜苯并三唑；「IC50」係指產生對藥劑而言可能的50%最大抑制反應之藥劑濃度；「IVTI」係指活體內標靶抑制；「KLH」係指匙孔螺血氰蛋白；「三第二丁基硼氫化鋰溶液」係指三(第二丁基)硼氫化鋰；「MDM4」係指小鼠雙微體4(mouse double minute 4)；「MeOH」係指甲醇；「MEP50」係指甲基轉移酶複合體蛋白50(methylosome protein 50)；「min」係指分鐘；
「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「OD」係指光學密度；「o.d.」係指外徑；「PAGE」係指聚丙烯醯胺凝膠電泳；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「PCR」係指聚合酶鏈反應；「PEG」係指聚乙二醇；「pNPP」係指磷酸4-硝基苯酯；「PO」係指經口或口服投藥；「ppm」係指百萬分之一；「PRMT5」係指蛋白精胺酸甲基轉移酶5；「PyBOP」係指(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基參吡咯啶基鏻)；「psig」係指磅-力每平方吋表壓；「PTFE」係指聚四氟乙烯；「PyBROP」係指六氟磷酸溴-參吡咯啶基鏻；「QD」係指一日一次或每日一次投藥；「qPCR」係指定量聚合酶鏈反應；「RNA」係指核糖核酸；「RPMI」係指羅斯威爾帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)；「(R,R)-Ts-DENEBTM」係指N-[(1R,2R)-1,2-二苯基-2-(2-(4-甲基苯甲氧基)乙基胺基)-乙基]-4-甲苯磺醯胺(氯)釕(II)；「(R,R)-Ts-DEPEN」係指(1R,2R)-(-)-N-(4-甲苯磺醯基)-1,2-二苯基乙二胺；「RT」係指逆轉錄酶；「SAH」係指S-腺苷-高半胱胺酸；「SAM」係指S-腺苷-甲硫胺酸；「(S)-CBS催化劑」係指(S)-科里-巴克希-柴田催化劑(Corey-Bakshi-Shibata catalyst)或(S)-1-丁基-3,3-二苯基六氫吡咯并[1,2-c][1,3,2]噁氮硼雜環戊烯；「sf9」係指純系衍生之草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)昆蟲細胞；「SmD1」係指小胞核核糖核蛋白D1；「SPA」係指閃爍近接分析；「SS」係指不鏽鋼；「SWFI」係指用於注射之無菌水；「TEA」係指三乙胺；「Tris」及「TRIZMA®」係指2-胺基-2-(羥基甲基)-1,3-丙二醇或參(羥基甲基)胺基甲烷；「TBS」係指Tris緩衝鹽水；「TEMPO」係指2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基；「THF」係指四氫呋喃；「TAME」係指N-α-對甲苯磺醯基-L-精胺酸酯鹽酸鹽；「TPCK」係指甲苯磺醯基苯基丙胺醯基氯甲烷；「wt.」係指重量；「YSI」係指矽酸釔，且「*」係指乘法之數學操作。
在以下流程中，除非另外指示，否則所有取代基皆為如先前所
定義。試劑及起始物質為一般熟習此項技術者容易獲得的。其他可藉由有機及雜環化學之標準技術或藉由所遵循之製備及實例中所描述之程序(包括本文中任何新穎程序)來製備。
流程1描繪式I化合物之形成。「PG」為針對羥基而產生之保護基。該等保護基團在此項技術中為人所熟知且瞭解。
在流程1步驟1子步驟1中在吡咯并氮下tris保護之1-乙醯化核呋喃
糖與4-氯-7H-吡咯并(2,3-d)嘧啶偶合，得到步驟1之受保護產物。與乙醯亞胺酸、N-(三甲基矽烷基)-、三甲基矽烷基酯組合之三氟甲烷磺酸三甲基矽烷酯可用作活化劑，以使用諸如ACN之溶劑將4-氯-7H-吡咯并(2,3-d)嘧啶偶合至受保護核呋喃糖。在一鍋2步驟程序中，在鹼式條件下使用無機鹼(諸如MeOH中之甲醇鈉)使羥基去保護，且隨後在諸如丙酮之溶劑中使用2,2-二甲氧基丙烷，使用對甲苯磺酸單水合物作為活化劑，將核糖主鏈之2,3-羥基取代選擇性地保護為縮酮，得到流程1步驟1子步驟2之產物，隨後得到步驟2子步驟1之產物。使用碘苯二乙酸酯及諸如TEMPO之催化劑在諸如ACN之溶劑中，在0℃至室溫之溫度下將5'醇氧化成羧酸，持續約1小時，得到流程1步驟2子步驟2之縮酮羧酸產物。流程1步驟3之魏因勒蔔(Weinreb)醯胺產物可按以下方式製備：在諸如EtOAc之適合溶劑中使用N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽，使用諸如2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷-2,4,6-三氧化物之肽偶合劑。諸如嗎啉醯胺之替代醯胺可在諸如DCM之溶劑中用流程1步驟2之羧酸產物及諸如嗎啉之適當親核胺，使用諸如CDI之偶合試劑來製備。熟習此項技術者將認識到，存在由羧酸與胺反應而形成醯胺之多種方法及試劑。舉例而言，在偶合試劑存在下在存在或不存在有機鹼(諸如DIPEA或三乙胺)之情況下，適當胺與流程1步驟2之羧酸產物之反應可提供流程1步驟3或流程1步驟4之化合物。偶合試劑包括碳化二亞胺，諸如DCC、DIC及EDCI；或羰基二咪唑，諸如CDI。諸如HOBt及HOAt之醯胺偶合添加劑亦可用以促進反應。另外，可使用諸如HBTU、HATU、PyBOP及PyBrOP之非親核陰離子之
或鏻鹽，來替代更傳統的偶合試劑。
可用格林納(Grignard)試劑處理流程1步驟3之魏因勒蔔醯胺產物或流程1步驟4之嗎啉醯胺產物，以分別形成流程1步驟5及流程1步驟6之產物。熟習此項技術者將認識到適當之格林納試劑可與醯胺反應，
或格林納試劑可在適當經溴或碘取代之苯化合物下由商業格林納試劑(諸如氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物)原位產生，得到流程1步驟5及流程1步驟6之產物。或可替代地，格林納試劑可用適當經溴或氯取代之苯化合物與鎂旋屑及碘原位產生，得到流程1步驟5之產物。
流程1步驟5及流程1步驟6之酮產物可在第二格林納反應中反應，得到流程1步驟7之羥基產物，其中R2不為氫且R2如先前所定義。在諸如THF之溶劑中在約0℃溫度下，將流程1步驟5或流程1步驟6之產物用適當烷基格林納試劑處理，且用1N HCl或氯化銨水溶液淬滅後得到流程1步驟7之產物。
在流程1步驟8子步驟1針對R3=NH2之式I之產物的置換中，吡咯并嘧啶之4-氯置換成胺可用NH3(諸如MeOH中之7N NH3)完成。該反應可在密封容器中進行且在微波中在約100℃下加熱。或者，在密封容器中在加熱下在約80-110℃下，氫氧化銨水溶液(約28-30% wt%於水中)可用以置換氯化物，持續約8-24小時。
在流程1步驟8子步驟1針對R3=CH3之偶合中，吡咯并嘧啶之4-氯可在以下條件下轉化成甲基：在Pd偶合條件下使用鈀源(諸如肆(三苯膦)鈀(0))與Al(CH3)3，在溶劑(諸如THF或1,4-二噁烷)中在惰性氛圍下在約70-80℃溫度下。
在流程1步驟8子步驟1針對R3=H之氫化中，在氫化條件下吡咯并嘧啶之4-氯可經移除。該等化合物之氫化在此項技術中為人所熟知且瞭解。
在流程1步驟8子步驟2中，在酸性條件下，諸如於水中之TFA或於二噁烷及MeOH中之HCl(諸如4N)或4.99M於2-丙醇及水中之HCl，受保護縮酮可去保護，得到式I化合物。該等化合物之去保護在此項技術中為人所熟知且瞭解。
流程2
或者在流程2中，針對R2=H，流程1步驟5或步驟6之酮產物可使用非對掌性或對掌性還原劑以非對映受控方式還原，得到一種非對映異構體富集的羥基產物。舉例而言，用三第二丁基硼氫化鋰溶液(L-SELECTRIDE®)在諸如THF之溶劑中在約-78℃溫度下，酮還原產生流程2步驟1之呈非對映異構性的富集或主要產物形式之羥基產物。或者在流程2步驟2中，對掌性還原催化劑可選擇性地產生呈富集或主要非對映異構體形式之羥基產物，其中羥基立體構型與用三第二丁基硼氫化鋰溶液條件產生之羥基產物之羥基立體組態相反。可用之該等對掌性催化劑之實例包括在諸如THF之溶劑中在約-15℃溫度下使用硼烷-THF複合物之(S)-CBS-催化劑；或可替代地，使用在約室溫下用甲酸/三乙胺複合物之側氧基系釕(II)錯合物催化劑，諸如(R,R)-Ts-DENEBTM；或可替代地，在諸如兩相水/DCM系統之溶劑混合物中在約室溫下用銥(III)錯合物。熟習此項技術者將認識到適當之銥(III)錯合物可自商業[Cp*IrCl2]2及(R,R)-Ts-DEPEN原位產生，得到流程2步
驟2之產物。
在本發明中所描述之實例中，通常發現使用以上對掌性還原催化劑(S)-CBS或(R,R)-DENEBTM或銥(III)錯合物之來自流程2步驟2的產物之主要或富集非對映異構體為所形成羥基中心之非對映組態。
產生本發明化合物之替代合成方法使用光延反應(流程2步驟3)，其涉及諸如4-硝基苯甲酸之親核試劑與醇反應以形成酯。光延反應在此項技術中已為所熟知，且涉及使用諸如4-硝基苯甲酸之酸、三苯膦及偶氮二羧酸酯(諸如偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)或偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD))在諸如THF之極性非質子性溶劑中在約0℃到室溫之溫度下，將醇轉化成酯。在用親核試劑之光延醇活化及置換期間，醇立構中心進行立體化學之反轉。藉由使用光延反應之此方法，在流程2步驟1中由三第二丁基硼氫化鋰溶液還原產生之富集非對映異構體可轉化成同一主要非對映異構體富集的具有醇立體組態的產物，如在流程2步驟2中用(S)-CBS或(R,R)-Ts-DENEBTM或銥(III)錯合物催化劑所產生。
在流程2步驟5子步驟1中，針對R3=NH2之式I之產物，酯可隨後皂化成醇，且吡咯并嘧啶之4-氯在一鍋反應中以與流程1步驟8所論述相同之方式經胺置換。在流程2步驟5子步驟2中，如流程1步驟8子步驟2中所論述，受保護縮酮可在酸性條件下去保護，得到式I化合物。
在流程2步驟4中，針對R3=NH2、CH3或H之流程2步驟2之產物可如流程1步驟8子步驟1中所論述實現，或可替代地，氫氧化銨水溶液(約28-30% wt%於水中)及二噁烷可用以在以下條件下置換氯化物：使用連續流化學方法在加熱下在約200℃及10mL/min之流動速率(30分鐘滯留時間)下，或可替代地，在約200℃及流動速率0.251mL/min(30分鐘滯留時間)下。在流程2步驟4子步驟2中，受保護縮酮可如流程1步驟8子步驟2中所論述去保護，或可替代地，受保護縮酮可在以
下條件下去保護：用HCl水溶液(約6N於水中)在EtOH/MeOH/EtOAc混合物中使用連續流化學方法，在加熱下在約55℃及1.5mL/min之流動速率(20分鐘滯留時間)下，或用HCl水溶液(約4N於水中)在EtOH中在約82℃及流動速率0.288mL/min(10分鐘滯留時間)下，得到式I化合物。
熟習此項技術者將認識到所例示化合物之1H NMR光譜通常可用以確定所產生單一非對映異構體之非對映異構富集或純度的一致性以及程度。
在視情況選用之步驟中，式I化合物之醫藥學上可接受之鹽可藉由在合適的溶劑中在標準條件下使適當之式I游離鹼與適當醫藥學上可接受之酸反應來形成。該等鹽之形成在此項技術中為人所熟知且瞭解。
本發明化合物如以下實例中所說明來製備。以下製備及實例進一步說明本發明且代表本發明化合物之典型合成。試劑及起始物質易於利用或可由一般熟習此項技術者易於合成。應理解，製備及實例以說明而非限制之方式闡述，且一般熟習此項技術者可進行多種修改。
本發明化合物之非對映異構組態可藉由標準技術諸如X射線分析、1H nmr及與對掌性HPLC滯留時間之相關性確定。
LC-ES/MS在AGILENT® HP1100液相層析系統上進行。電噴霧質譜分析量測(以正及/或負模式獲得)在介接至HP1100 HPLC之質量選擇性偵測器四極質譜儀上進行。LC-MS條件(低pH)：管柱：PHENOMENEX® GEMINI® NX C18 2.1×50mm 3.0μm；梯度：3分鐘內5-100% B，隨後100% B持續0.75分鐘；管柱溫度：50℃ +/-10℃；流動速率：1.2mL/min；溶劑A：具有0.1% HCOOH之去離子水；溶劑B：具有0.1%甲酸之ACN；波長：214nm。替代LC-MS條件(高pH)：管柱：XTERRA® MS C18管柱2.1×50mm，3.5μm；梯度：5%
溶劑A持續0.25分鐘，3分鐘內梯度自5%至100%溶劑B，且100%溶劑B持續0.5分鐘，或3分鐘內10%至100%溶劑B且100%溶劑B持續0.75分鐘；管柱溫度：50℃ +/- 10℃；流動速率：1.2mL/min；溶劑A：10mM NH4HCO3 pH~9-10；溶劑B：ACN；波長：214nm。
NMR光譜在Bruker AVIII HD 400MHz NMR光譜儀上進行，按以ppm(化學位移δ)為單位報告之CDCl3或(CD3)2SO溶液獲得，使用殘餘溶劑[CDCl3，7.26ppm；(CD3)2SO，2.05ppm]作為參考標準。當報告峰多峰性時，可使用以下縮寫：s(單重峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、br-s或bs(寬單重峰)、dd(兩個二重峰)、dt(兩個三重峰)及td(三個二重峰)。當報告時偶合常數(J)以赫茲(Hz)為單位報告。
在室溫下懸浮含4-氯-7H-吡咯并-(2,3-d)嘧啶(55.3g，0.36mol)之ACN(1.8L)且攪拌。逐滴添加乙醯亞胺酸、N-(三甲基矽烷基)-、三甲基矽烷基酯(110.8mL，0.45mol)且在室溫下在N2下攪拌混合物20分鐘。逐滴添加三氟甲烷磺酸三甲基矽烷酯(1.0L，0.54mol)，隨後逐份添加苯甲酸[(2R,3R,4R,5S)-5-乙醯氧基-3,4-二苯甲醯氧基-四氫呋喃-2-基]甲酯(272.4g，0.54mol)。在85℃(固有)下加熱混合物4小時。將混合物冷卻至40℃(固有)且將額外苯甲酸[(2R,3R,4R,5S)-5-乙醯氧基-3,4-二苯甲醯氧基-四氫呋喃-2-基]甲酯(45.40g，90.0mmol)逐份添加至混合物中。在85℃(固有)下加熱反應混合物2小時。在N2下在室溫下再攪拌混合物18小時。將水(500mL)及EtOAc(500mL)添加至反應物中。分離所得有機層。用EtOAc(3×250mL)萃取水層。合併有機萃取物且用NaHCO3飽和水溶液(500mL)及氯化鈉飽和水溶液
(500mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下移除溶劑。經由矽膠層析用10-30% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到呈無色油狀之標題化合物(98.0g，41%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)598.0/600.0[M+H]+。
將苯甲酸[(2R,3R,4R,5R)-3,4-二苯甲醯氧基-5-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)四氫呋喃-2-基]甲酯(80.5g，134.61mmol)懸浮於MeOH(805mL)中，且在室溫下用0.5M甲醇鈉於MeOH(53.8mL，26.92mmol)中之溶液處理3小時。冷卻至0℃且用DOWEX® 50WX2樹脂(至pH<5)處理混合物。在真空中過濾且濃縮，得到殘餘物。在MTBE(100mL)中濕磨。傾析混合物且乾燥所得殘餘物，得到白色固體。將固體懸浮於丙酮(1100mL)中，且將2,2-二甲氧基丙烷(41.5mL，336.5mmol)及對甲苯磺酸單水合物(25.6g，134.6mmol)添加至混合物中。在室溫下攪拌反應混合物3小時。在減壓下移除高達~1/3的溶劑，且添加DCM(250mL)及水(100mL)。分離有機層且用DCM(2×100mL)萃取水層。合併有機萃取物，且用NaHCO3飽和水溶液(150mL；pH~9)及氯化鈉飽和水溶液(100mL)洗滌。有機層經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下移除溶劑，得到粗混合物。經由矽膠層析用30% EtOAc/DCM溶離純化，得到呈無色油狀之標題化合物(26.5g，60%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)326.0/328.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-
3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]甲醇(60.0g，184.2mmol)溶解於ACN(250mL)中。添加水(180mL)且將混合物冷卻至0℃。在0℃下逐份添加碘苯二乙酸酯(160g，496.8mmol)，隨後逐份添加TEMPO(14g，89.6mmol)。在室溫下攪拌混合物1小時。在減壓下移除溶劑且將粗殘餘物溶解於EtOAc(300mL)中。在0℃下添加水(100mL)且分離所得有機層。用EtOAc(3×100mL)萃取水層。合併有機萃取物且用10%硫代硫酸鹽水溶液(2×100mL)及水(2×100mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下移除溶劑，得到淺黃色固體。用己烷(400mL)混合粗物質且在室溫下攪拌混合物1小時。過濾所得固體，用己烷(100mL)洗滌，且乾燥，得到呈黃色固體狀之標題化合物(66.7g，89%純，100%粗)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)340.00/342.00[M+H]+。
將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]甲醇(45.0g，138.1mmol)溶解於ACN(175mL)中。添加水(133mL)且將混合物冷卻至0℃。在0℃下逐份添加碘苯二乙酸酯(122.3g，379.7mmol)，隨後逐份添加TEMPO(10.5g，67.0mmol)。在室溫下攪拌混合物1小時。在0℃下添加水(100mL)及EtOAc(250mL)，且分離所得有機層。用EtOAc(3×100mL)萃取水層。合併有機萃取物且用水(100mL)、20% w/v亞硫酸氫鈉水溶液(100mL)及水(100mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下移除溶劑，得到棕色固體(53.0g)。在室溫下將此固體溶解於EtOAc(400mL)中，且逐份添加N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(18.8g，193.0mmol)。在室溫下攪拌混合物5分鐘，逐滴
添加1.67M的2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧雜三磷雜環己烷-2,4,6-三氧化物於EtOAc(176.3mL，294mmol)中之溶液。在室溫下在N2下攪拌反應混合物3天。將反應混合物冷卻至0℃且添加水(150mL)及EtOAc(150mL)。分離所得有機層且用EtOAc(3×150mL)萃取水層。合併有機萃取物且用水(200mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且濃縮，得到粗混合物。藉由過濾經由二氧化矽塞用0-30% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化，得到呈白色玻璃固體狀之標題化合物(31.0g，經兩個步驟達至60%)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)383.0/385.0[M+H]+。
將(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲酸(63.7g，166mmol)懸浮於DCM(320mL)中且在0℃下攪拌。逐份添加1,1'-羰基二咪唑(37.7g，232mmol)，且在室溫下攪拌混合物45分鐘。將嗎啉(21.7g，249mmol)逐滴添加至混合物中，且在室溫下攪拌3天。用DCM及水(150mL)稀釋反應混合物。分離所得有機層且用DCM(3×100mL)萃取水層。合併有機萃取物且用水(100mL)及氯化鈉飽和水溶液(100mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下移除溶劑。經由矽膠層析用20-60% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到呈棕色泡沫狀之標題化合物(34g，50%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)409.00/411.00[M+H]+。
在0℃下歷經2分鐘將3.0M溴化苯基鎂於乙醚(1.79ml，5.38mmol)中之溶液逐滴添加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(1.00g，2.45mmol)於THF(15mL)中之溶液中。在0℃下攪拌30分鐘，且添加1N HCl水溶液(7.3mL)。3分鐘後，用DCM萃取水層。分離各層且在減壓下蒸發有機層。經由矽膠層析，歷經25分鐘用35-75%之MTBE/DCM之10%混合物/己烷的梯度溶離來純化，得到標題化合物(893mg，91%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)400.0/402.0[M+H]+。
將(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯胺(30.0g，78.4mmol)溶解於THF(300mL)中且冷卻至-10℃。逐滴添加1.0M溴化4-氯苯基鎂於乙醚(157mL，157mmol)中之溶液，且在室溫下攪拌混合物1小時。冷卻至0℃且藉由添加飽和氯化銨水溶液(50mL)及EtOAc(200mL)來淬滅反應混合物。分離所得有機層且用EtOAc(3×100mL)萃取水層。合併有機萃取物，用水(250mL)洗滌，且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下移除有機濾液，得到粗混合物。經由矽膠層析用0-15% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(30.1g，84%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)434.0/436.0[M+H]+。
將(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯胺(257.0g，617.7mmol)溶解於THF(2570mL)中且冷卻至-15℃。逐滴添加1.0M溴化4-氯苯基鎂於2-甲基四氫呋喃(1050mL，1050mmol)中之溶液，且在-15℃下攪拌混合物1小時。藉由添加飽和氯化銨水溶液(1000mL)及水(500mL)淬滅反應混合物。分離所得有機層且用EtOAc(2×500mL)萃取水層。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下蒸發濾液，得到白色固體。藉由自EtOH(5300mL)再結晶純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(238.3g，87%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)434.0/436.0[M+H]+。
在室溫下將1-溴-4-(三氟甲基)苯(4.0g，18mmol)逐滴添加至2.0M氯化異丙基鎂於THF(8mL，16mmol)中之溶液中，於額外THF(10mL)中。在室溫下攪拌混合物24小時。在室溫下向此混合物逐滴添加(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯胺(3.4g，8.9mmol)於THF(14mL)中之溶液，且在室溫下攪拌2小時。冷卻至0℃且用10%檸檬酸溶液(100mL)淬滅反應物。添加MTBE(200mL)且攪拌混合物20分鐘。分離兩相且用MTBE萃取水層。合併有機萃取物，用飽和氯化銨水溶液、水及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。藉由矽膠層析用0-50%EtOAc/己烷之梯度溶離來純化殘餘物，得到呈黃色泡沫狀之標題化合物(3.60g，87%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)468.00/470.00
[M+H]+。
將1-氯-3-碘苯(0.42g，1.7mmol)溶解於THF(5mL)中，且冷卻至0℃。歷經10分鐘逐滴添加1.3M氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物之於THF中的溶液(1.23mL，1.6mmol)，且在0℃下攪拌1小時。在0℃下添加[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(0.5g，1.2mmol)於THF(5mL)中之溶液。在0℃下攪拌1小時後，藉由添加1N HCl水溶液(2mL)來淬滅混合物。用EtOAc稀釋所得混合物，且用水及氯化鈉飽和水溶液洗滌有機層。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析，歷經20分鐘用0-25% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(0.35g，66%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)434.2/436.2[M+H]+。
將4-氯-2-氟基-1-碘-苯(1.9g，7.5mmol)溶解於THF(50mL)中，且冷卻至0℃。添加1.3M氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物於THF(6.3mL，8.2mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌1小時。在0℃下添加[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(2.8g，6.8mmol)於THF(10mL)中之溶液。在0℃下攪拌5小時後，
藉由添加1N HCl水溶液(9.09mL，9.09mmol)淬滅混合物。用EtOAc稀釋所得混合物，且用水及氯化鈉飽和水溶液洗滌有機層。經硫酸鈉乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用0-50% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(1.57g，51%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)452.0/454.0/456[M+H]+。
在0℃下歷經10分鐘將0.5M溴化3-乙基苯基鎂於THF(5.8mL，2.9mmol)中之溶液逐滴添加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(1.0g，2.5mmol)於THF(10mL)中之溶液中。在0℃下攪拌30分鐘且藉由添加1N HCl水溶液(3.9mL，3.9mmol)來淬滅。用水稀釋，且用EtOAc萃取水層。經硫酸鈉乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下蒸發濾液。經由矽膠層析，歷經30分鐘用0-100% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(0.98g，94%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)428/430[M+H]+。
在0℃下將4-溴苯甲腈(1.36g，7.40mmol)溶解於THF(10mL)中。添加1.3M氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物於THF(6.6mL，8.53mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌2小時。在0℃下藉由套管將此混合物加至(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯
胺(2.18g，5.68mmol)於THF(14mL)中之溶液中。溫至室溫且攪拌2小時。在0℃下藉由添加1N HCl水溶液(9.09mL)來淬滅。用EtOAc及水稀釋反應混合物。分離各層且用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用15-30% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(1.49g，62%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)425.0/427.0[M+H]+。
在-15℃下將4-溴-1,2-二氟-苯(2.21g，1.29mL，11.4mmol)添加至2.0M氯化異丙基鎂於THF(6.05mL，12.1mmol)中之溶液中，且攪拌15分鐘。升溫反應混合物且在0℃下攪拌1小時。在0℃下將此混合物添加至(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯胺(1.25g，3.27mmol)於THF(16.3mL)中之溶液中。15分鐘後，藉由添加1N HCl水溶液(5mL)來淬滅。用EtOAc(30mL)稀釋反應混合物且在室溫下劇烈攪拌兩相混合物15分鐘。分離各層且用EtOAc(2×40mL)萃取水層。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾且在減壓下蒸發濾液。經由矽膠層析用4% EtOAc/DCM溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(1.12g，74%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)436,438[M+H]+。
在-15℃下將1-溴-3,4-二氯苯(1.04g，4.57mmol)添加至2.0M氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物於THF(1.2mL，2.4mL)中之溶液中。15分鐘後，將混合物溫至0℃且攪拌1小時。在0℃下將此混合物添加至(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯胺(0.50g，1.31mmol)於THF(6.5mL)中之溶液中，且攪拌10分鐘。用1N HCl水溶液(5mL)淬滅，且添加EtOAc(30mL)。在室溫下劇烈攪拌15分鐘。分離各層且用EtOAc(2×40mL)萃取水層。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下移除溶劑。經由矽膠層析用10-20% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(1.49g，62%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)468/470[M+H]+。
在-15℃下將1.0M溴化對甲苯基鎂於THF(2.4mL，2.4mmol)中之溶液逐滴添加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(500mg，1.22mmol)於THF(6.1mL)中之攪拌溶液中。1小時後，用飽和氯化銨水溶液(15mL)淬滅且用EtOAc(3×40mL)萃取。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-20% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(405.3mg，80%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)414/416
[M+H]+。
向[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(2.0g，4.90mmol)於THF(20mL)中之溶液中添加1.0M溴化4-氟苯基鎂於THF(9.8mL，9.8mmol)中之溶液。在0℃下攪拌15分鐘，隨後在室溫下攪拌1.5小時。將混合物冷卻至0℃且添加飽和氯化銨(12mL)。添加EtOAc(25mL)且在室溫下劇烈攪拌15分鐘。分離各層且用EtOAc(2×25mL)萃取水層。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下蒸發濾液。經由矽膠層析用2-10% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化，得到標題化合物(1.76g，83%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)418/420[M+H]+。
在0℃下將1-溴-2-氟苯(2.39g，7.88mmol)溶解於THF(15mL)中。添加1.3M氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物於THF(9.1mL，11.8mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌1.5小時。在0℃下藉由套管將此混合物加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(2.93g，7.17mmol)於THF(30mL)中之溶液中，且攪拌45分鐘。使
混合物溫至室溫，且攪拌2小時。將反應物冷卻至0℃且藉由添加1N HCl水溶液(11.5mL)淬滅。用EtOAc及水稀釋反應混合物。分離各層且用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物且用NaHCO3飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-70% MTBE/己烷之梯度溶離來純化粗物質，得到標題化合物(2.14g，71%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)418.0/420.0[M+H]+。
在0℃下將2-溴苯并三氟化物(2.97g，13.1mmol)溶解於THF(15mL)中。添加1.3M氯化異丙基鎂-氯化鋰錯合物於THF(8.6mL，11.2mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌1.5小時。將混合物溫至室溫且攪拌30分鐘。將混合物再冷卻至0℃，且在0℃下藉由套管將此混合物加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(N-嗎啉基)-甲酮(3.05g，7.46mmol)於THF(20mL)中之溶液中，且攪拌2.5小時。使混合物溫至室溫且攪拌1小時。將混合物冷卻至0℃且添加1N HCl水溶液(14.9mL)。用EtOAc及水稀釋混合物。分離各層且用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物且用飽和NaHCO3及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用25-50% MTBE/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(1.48g，42%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)468.0/470.0[M+H]+。
在室溫下攪拌鎂旋屑(4.97g，204mmol)及碘(920mg，3.63mmol)於THF(150mL)中之混合物10分鐘。逐滴緩慢添加4-溴-1-氯-2-(環丙氧基)苯(46.0g，186mmol)於THF(400mL)中之溶液，且使混合物回流30分鐘。冷卻至40℃，且歷經10分鐘將此混合物逐滴緩慢添加至(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-N-甲氧基-N,2,2-三甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-甲醯胺(35.0g，91.6mmol)於THF(400mL)中之溶液中。在室溫下攪拌所得混合物30分鐘。冷卻至0℃且藉由添加飽和氯化銨水溶液(200mL)及MTBE(200mL)來淬滅反應混合物。分離所得有機層且用MTBE(2×200mL)萃取水層。合併有機萃取物，用水(150mL)、氯化鈉飽和水溶液(100mL)洗滌，且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液，得到粗混合物。藉由自MTBE(80mL)及庚烷(400mL)濕磨來純化，得到標題化合物(48.8g，89.9%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)490.0/492.0[M+H]+。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ 0.85-0.89(m,4H),1.44(s,3H),1.69(s,3H),3.74-3.83(m,1H),5.46-5.48(m,2H),5.68(dd,J=2.2,6.1Hz,1H),6.39(d,J=0.6Hz,1H),6.59(d,J=3.6Hz,1H),7.34-7.42(m,3H),7.65(d,J=1.8Hz,1H),8.45(s,1H)。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲酮(15.9g，36.6mmol)溶解於於THF(175mL)中，且冷卻至0℃。逐滴
添加3.4M溴化甲基鎂於2-甲基四氫呋喃(21.53mL，73.3mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌混合物2小時。用飽和氯化銨水溶液(50mL)淬滅反應混合物，且隨後添加EtOAc(250mL)。分離所得有機層且用EtOAc(3×100mL)萃取水層。合併有機萃取物，用水(100mL)洗滌，且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液，得到白色玻璃狀固體。經由矽膠層析用10-15% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(11.5g，70%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)450.00/452.00[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氯苯基)甲酮(0.50g，1.07mmol)溶解於THF(5.3mL)中，且冷卻至0℃。緩慢添加3.0M溴化甲基鎂於乙醚(0.53mL，1.60mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌1小時。藉由添加飽和氯化銨(20mL)來淬滅。用EtOAc(40mL)稀釋且分離各層。用額外EtOAc(3×40mL)萃取水層。合併有機萃取物，且用碳酸氫鹽飽和水溶液接著用氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用25-30% MTBE/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(342mg，66%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)484/486[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(2-氟苯基)甲酮(0.685g，1.64mmol)溶解於THF(20mL)中，且將混合物冷卻至0℃。添加3M溴化甲基鎂於乙醚(1.09mL，3.27mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌2小時。藉由添加1N HCl水溶液(3.44mL)來淬滅反應物。用EtOAc及水稀釋反應混合物。分離各層且用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物且用NaHCO3飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-75% MTBE/己烷之梯度溶離來純化物質，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.482g，68%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)434.0/436.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[2-(三氟甲基)苯基]甲酮(0.434g，0.928mmol)溶解於THF(12mL)中，且將混合物冷卻至0℃。添加3.0M溴化甲基鎂於乙醚(0.62mL，1.86mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌30分鐘。藉由添加1N HCl水溶液(1.95mL)來淬滅反應物。用EtOAc及水稀釋反應混合物。分離各層且用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物且用NaHCO3飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-50% MTBE/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.202g，45%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)484.0/486.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-(三氟甲基)苯基]甲酮(0.425g，0.908mmol)溶解於THF(10mL)中，且將混合物冷卻至0℃。添加3.0M溴化甲基鎂於乙醚(0.45mL，1.35mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌1小時。藉由添加1N HCl水溶液(1.45mL)淬滅反應物。用EtOAc及水稀釋混合物。分離各層且用EtOAc萃取水層。合併有機萃取物且用NaHCO3飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-25% MTBE/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體之混合物形式之標題化合物。(0.348g，79%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)484.0/486.0[M+H]+。
在-78℃下，向[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲酮(6.5g，15mmol)於THF(200mL)中之溶液中緩慢添加1.0M三第二丁基硼氫化鋰溶液於THF(19mL，19mmol)中之溶液。在-78℃下在N2下將混合物攪拌4小時，且隨後用飽和氯化銨水溶液(50mL)淬滅。添加EtOAc(200mL)且分離有機相。用EtOAc(3×70mL)萃取水相。合併有機萃取物，用水(100mL)洗滌，且經硫酸鈉
乾燥有機層。過濾且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由矽膠層析用10-30% EtOAc/己烷之梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(4.55g，70%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)436.0/438.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲酮(4.77g，11.0mmol)及(R,R)-Ts-DENEBTM(357mg，0.549mmol)懸浮於5：2甲酸-三乙胺複合物(45mL)中。在室溫下攪拌混合物18小時。用水(300mL)及DCM(75mL)稀釋混合物。分離各層且用DCM(3×75mL)萃取水層。合併有機萃取物且在減壓下濃縮。經由矽膠層析，用30-60%之丙酮/己烷之20%混合物/己烷的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(3.50g，73%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)436.0/438.0/440.0[M+H]+。
在50℃下將[Cp*IrCl2]2(8.41g，10.45mmol)及(R,R)-Ts-DEPEN(7.899，20.91mmol)於1.33/1水/DCM(3972mL)中之混合物攪拌45分鐘。冷卻至室溫且添加甲酸銨(509.7g，7840mmol)。在室溫下攪拌兩相混合物5分鐘，且添加[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲酮(227.0g，522.7mmol)。在室溫下攪拌混合物1小時。分離所得有機層且用DCM(1000mL)萃取水層。合併有機萃取物且在減壓下濃縮，得到橙色固體。藉由自EtOH(3400mL)再結晶來純化所得殘餘物，得到標題化合物(199.5g，86%產率)。ES/MS m/z
(35Cl/37Cl)436.0/438.0/440.0[M+H]+。
在40℃下將[Cp*IrCl2]2(1.58g，1.95mmol)及(R,R)-Ts-DEPEN(1.43g；3.90mmol)於1/1水/DCM(860mL)中之混合物攪拌45分鐘。冷卻至室溫且添加甲酸銨(100g，1462mmol)。在室溫下攪拌兩相混合物5分鐘，且逐滴添加[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-氯-3-(環丙氧基)苯基]甲酮(48.8g，97.4mmol)於DCM(100mL)中之溶液，持續10分鐘。在室溫下攪拌混合物1小時。分離所得有機層且用DCM(2×200mL)萃取水層。合併有機萃取物且用水(200mL)洗滌。經硫酸鈉乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用5-10% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(35.3g，70%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)492.0/494.0[M+H]+。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ 0.59-0.71(m,4H)1.30(s,3H),1.51(s,3H),3.61-3.65(m,1H),4.20-4.22(m,1H),4.68(t,J=4.9Hz,1H),5.12-5.14(m,1H),5.31-5.34(m,1H),6.09(d,J=4.7Hz,1H),6.34-6.35(m,1H),6.87-6.80(m,2H),7.11(s,1H),7.29(d,J=8.1Hz,1H),8.05(d,J=3.7Hz,1H),8.70(s,1H)。
在0℃下在N2下攪拌(S)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧
啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(10.3g，23.7mmol)、4-硝基苯甲酸(5.94g，35.5mmol)及三苯膦(9.32g，35.5mmol)於THF(120mL)中之混合物。將DIAD(7.19g，35.5mmol)逐滴添加至混合物中，且在室溫下攪拌6小時。在室溫下添加額外4-硝基苯甲酸(1.98，11.8mmol)、三苯膦(3.11g，11.8mmol)及DIAD(2.40g，11.8mmol)，且在室溫下在N2下攪拌混合物18小時。將混合物冷卻至0℃且用水(100mL)淬滅。添加EtOAc(100mL)且分離所得有機層。用EtOAc(3×75mL)萃取水層。合併有機萃取物，用水(100mL)洗滌，且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液，得到粗混合物。經由矽膠層析用10-15% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(10.1g，73%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)585.00/587.00[M+H]+。
在-78℃下向[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-(三氟甲基)苯基]甲酮(35.0g，74.8mmol)於THF(525mL)中之溶液中緩慢添加1.0M三第二丁基硼氫化鋰溶液於THF(93.5mL，93.5mmol)中之溶液。在N2氛圍下，在-78℃下將混合物攪拌30分鐘，且隨後溫至0℃。用飽和氯化銨水溶液淬滅。添加EtOAc且分離有機相。用EtOAc萃取水層兩次。合併有機萃取物且用水及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由矽膠層析用0-50% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到標題化合物(22.0g，55%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)470.00/472.00
[M+H]+。
將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-(三氟甲基)苯基]甲醇(21.0g，44.7mmol)之非對映異構體、4-硝基苯甲酸(14.9g，89.4mmol)及三苯膦(23.45g，89.4mmol)溶解於THF(315mL)中，且在0℃下在N2下攪拌。將DIAD(18.1g，89.4mmol)逐滴添加至混合物中，且在室溫下攪拌3小時。在室溫下添加額外4-硝基苯甲酸(7.50g，44.7mmol)、三苯膦(11.8g，44.7mmol)及DIAD(9.1g，44.7mmol)，且在室溫下在N2下攪拌混合物2小時。將混合物冷卻至0℃，用水(100mL)淬滅，且用EtOAc(200mL)稀釋。分離所得有機層且用EtOAc(3×75mL)萃取水層。合併有機萃取物且用水(100mL)及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。經由矽膠層析用0-50% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化殘餘物。，得到標題化合物(18.5g，60%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)619.00/621.00[M+H]+。
在-78℃下向[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-氯苯基)甲酮(0.35g，0.81mmol)於THF(10.7mL)中之溶液中緩慢添
加1.0M三第二丁基硼氫化鋰溶液於THF(1.05mL，1.05mmol)中之溶液。在-78℃下在N2下攪拌混合物10分鐘，且隨後添加1N HCl水溶液(1.3mL)。添加EtOAc(50mL)，且用水(10mL)接著用氯化鈉飽和水溶液(10mL)洗滌有機層。經硫酸鈉乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。經由矽膠層析用10-30% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(0.22g，61%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)436.2/438.2[M+H]+。
在0℃下在N2下將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-氯苯基)甲醇之非對映異構體(0.100g，0.229mmol)、4-硝基苯甲酸(0.76g。0.46mmol)及三苯膦(0.12g，0.46mmol)攪拌於THF(1mL)中。將DIAD(0.95g，0.46mmol)逐滴添加至混合物中，且在室溫下攪拌1.5小時。添加額外4-硝基苯甲酸(1.98g，11.8mmol)、三苯膦(0.015g，0.057mmol)及DIAD(0.012g，0.057mmol)，且在室溫下在N2下攪拌混合物18小時。將混合物冷卻至0℃。添加水(10mL)、EtOAc(10mL)，且分離所得有機層。用EtOAc(2×10mL)萃取水層。合併有機萃取物，用水(100mL)洗滌，且經硫酸鈉乾燥有機層。過濾且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-15% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.11g，82%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)585.0/587.0[M+H]+。
將4-[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-羰基]苯甲腈(1.33g，3.14mmol)，及1.0M(S)-1-丁基-3,3-二苯基六氫吡咯并[1,2-c][1,3,2]噁氮硼雜環戊烯於甲苯中之溶液(0.31mL，0.31mmol)溶解於THF(50mL)中，且將混合物冷卻至-15℃。添加1.0M硼烷-THF複合物於THF(2.07mL，2.07mmol)中之溶液。使反應物溫至室溫且攪拌反應物17小時。將反應混合物冷卻至0℃且藉由添加MeOH(5mL)淬滅。用飽和氯化銨水溶液(40mL)及EtOAc(80mL)稀釋。分離各層且用額外EtOAc萃取水層。合併有機萃取物，經硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用25-40% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.75g，58%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)427.0/429.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氯苯基)甲酮(490.0mg，1.045mmol)，及1.0M(S)-1-丁基-3,3-二苯基六氫吡咯并[1,2-c][1,3,2]噁氮硼雜環戊烯(0.10mL，0.10mmol)於甲苯中之溶液溶解於THF(20.9mL)中，且將混合物冷卻至-15℃。添加1.0M硼烷-THF複合物於THF(0.69mL，0.69mmol)中之溶液。使反應物溫至室溫且攪拌反應物17小時。藉由添加MeOH(1mL)淬滅。用飽和氯化銨水溶液(40mL)及EtOAc(40mL)稀釋。分離各層且用額外EtOAc(2×
40mL)萃取水層。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用5-25% MTBE/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(246.8mg，50%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)470/472[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-苯基-甲酮(0.866g，2.17mmol)及(R,R)-Ts-DENEBTM(70.4mg，10.8mmol)懸浮於5：2甲酸-三乙胺複合物(15mL)中，且在室溫下攪拌4小時。用水(60mL)稀釋反應混合物。用DCM萃取水層。在減壓下蒸發有機萃取物。經由矽膠層析，歷經20分鐘用15-30%丙酮/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.420g，48%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)402.0/404.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯-2-氟-苯基)甲酮(0.50g，1.0mmol)及(R,R)-Ts-DENEBTM(30mg，0.05mmol)懸浮於5：2甲酸-三乙胺複合物(10mL)中，且在室溫下攪拌1小時。用水(50mL)稀釋反應混合物，且用DCM萃取水層。經硫酸鈉乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用0-40% EtOAc/
己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.45g，95%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)454.0/456.0/458.0[M+H]+。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-乙基苯基)甲酮(0.975g，2.28mmol)及(R,R)-Ts-DENEBTM(74mg，0.11mmol)懸浮於5：2甲酸-三乙胺複合物(22mL)中，且在室溫下攪拌4小時。用水(250mL)稀釋反應混合物。用DCM萃取水層。經硫酸鈉乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析，歷經30分鐘用0-20% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.37g，38%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)430.2/432.2[M+H]+。
在室溫下將(R,R)-Ts-DENEBTM(93mg，0.143mmol)添加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氟苯基)甲酮(1.12g，2.57mmol)與5：2甲酸-三乙胺複合物(10mL)之混合物中。用N2沖洗反應容器且在室溫下攪拌混合物1.5小時。用水(75mL)及DCM(25mL)稀釋所得混合物且混合5分鐘。分離各層且用DCM萃取水層。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用5-10% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化所得殘餘
物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.8g，69%產率)。ES/MS m/z 438[M+H]+。
在室溫下將5：2甲酸-三乙胺複合物(4.0mL)添加至(R,R)-Ts-DENEBTM(31.8mg，0.048mmol)及[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(對甲苯基)甲酮(405.0mg，0.978mmol)於1,4-二噁烷(4.0mL)中之混合物中。在室溫下攪拌4小時。用水(15mL)稀釋且用EtOAc(3×40mL)萃取。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用10-30% MTBE/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(144mg，38%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)416/418[M+H]+。
將(R,R)-Ts-DENEBTM(242mg，0.372mmol)添加至[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氟苯基)甲酮(1.41g，3.24mmol)、5：2甲酸-三乙胺複合物(25mL)及1,4-二噁烷(12mL)之混合物中，且在室溫下攪拌反應混合物2小時。將混合物用水(80mL)及DCM(40mL)稀釋且混合5分鐘。分離各層且用額外DCM
(2×40mL)萃取水層。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用4-10% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(1.01g，73%產率)。ES/MS m/z 420[M+H]+。
在密封之反應容器中，攪拌(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-苯基-甲醇(0.399g，0.993mmol)及7N NH3於MeOH(15mL，105mmol)中之混合物。在100℃下微波混合物8小時。將容器冷卻至室溫且在N2流下蒸發溶劑。經由矽膠層析，用50-100%之10% MeOH/MTBE混合物/己烷的梯度溶離25分鐘來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.295g，78%產率)。ES/MS m/z 383.2[M+H]+。
將(R)-4-硝基苯甲酸[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲基]酯(10.1g，17.3mmol)、氫氧化銨(28%於水中，50mL)及1,4-二噁烷(50mL)添加至密封容器中，且在110℃下加熱18小時。將反應物冷卻至0℃且添加水(50mL)及EtOAc(100mL)。分離所得有機層且用EtOAc(3×50mL)萃取水層。合併有機萃取物且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由過濾經由二氧化矽塞用己烷：EtOAc(1：1)之等度溶劑混合物溶離，來純化殘餘物，
得到呈棕色玻璃固體狀之標題化合物(6.78g，75%產率)，其不經進一步純化即使用。
將300mL無縫不鏽鋼管狀反應器(o.d.=1/8")置放於GC烘箱內部。歷經40分鐘用3：10比率之氫氧化銨(28%於水中)/二噁烷以10mL/min沖洗。將N2之背壓(800psig)施加至反應系統之出口，且將GC烘箱之溫度設定在200℃下。使用高壓1L Teledyne ISCOTM注射泵，以10mL/min(30分鐘滯留時間)泵送(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(200.0g，458.41mmol)於3：10比率之氫氧化銨(28%於水中)/二噁烷(1300mL)中之溶液通過反應器。耗盡此進料溶液後，用以10mL/min泵送之3：10氫氧化銨(28%於水中)：二噁烷(600mL)沖洗反應器。在真空下將經收集溶液之溶劑移除至1/3體積，添加水(300mL)且用EtOAc(3×150mL)萃取。合併有機萃取物，用氯化鈉飽和水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下蒸發濾液。藉由自己烷(200mL)濕磨純化所得殘餘物，得到標題化合物(189.0g，95%純度)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)416.0/418.0[M+H]+。
在密封容器中，將(1R)-1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(4-氯苯基)乙醇(11.4g，25.3mmol)溶解於氫氧化銨(28%於水中，60mL)及1,4-二噁烷(60mL)中，且在110℃下加熱18小時。冷卻至室溫且在減壓下移除溶劑。添加水(50mL)及EtOAc(100mL)。
分離所得有機層且用EtOAc(3×100mL)萃取水層。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下蒸發濾液，得到呈棕色玻璃固體狀之標題化合物(10.7g，96%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)431.00/433.20[M+H]+。
在密封管中，將4-硝基苯甲酸[[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-(三氟甲基)苯基]甲基]酯之非對映異構體(21g，33.9mmol)溶解於氫氧化銨(28wt%於水中，100mL)及1,4-二噁烷(100mL)中，且在110℃下加熱混合物18小時。將管子冷卻至室溫，藉由過濾收集經沈澱固體，且用水洗滌濾餅。將濾餅溶解於EtOAc(300mL)中。用水洗滌所得有機層且經硫酸鈉乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物。藉由過濾經由矽膠塞用己烷：EtOAc(1：1)之等度溶劑混合物溶離，來純化殘餘物，得到呈無色油狀物之呈非對映異構體形式之標題化合物(13.5g，80%產率)。ES/MS m/z 451.2/452.2[M+H]+。
在密封之反應容器中，攪拌4-硝基苯甲酸[[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-氯苯基)甲基]酯之非對映異構體
(0.105g，0.18mmol)、1,4-二噁烷(4mL)及氫氧化銨(30wt%於水中，6mL)。將反應物加熱至85℃。在85℃下24小時後冷卻至室溫，添加額外氫氧化銨(30wt%於水中，6mL)，且在95℃下再攪拌24小時。冷卻至室溫且添加水(50mL)。用EtOAc萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用50-100% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.053g，71%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)417.2/419.2[M+H]+。
在密封之反應容器中，攪拌[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯-2-氟-苯基)甲醇之非對映異構體(0.12mg，0.26mmol)、1,4-二噁烷(2mL)及氫氧化銨(30wt%於水中，4mL)之混合物。將混合物加熱至80℃。12小時後，將管子冷卻至室溫，且添加額外氫氧化銨(30wt%於水中，4mL)。在80℃下再繼續加熱密封容器3小時。將反應物冷卻至室溫，用水稀釋，且用DCM(3×25mL)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下蒸發濾液。經由矽膠層析，歷經30分鐘用0-50% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.070g，61%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)435.2/437.2[M+H]+。
在密封之反應容器中，攪拌[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-乙基苯基)甲醇之非對映異構體(0.370g，0.861mmol)、1,4-二噁烷(4mL)及氫氧化銨(30wt%於水中，6mL)之混合物。將混合物加熱至80℃後維持12小時。將容器冷卻至室溫，用水稀釋混合物，且用EtOAc(3×25mL)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下蒸發濾液。經由矽膠層析，歷經30分鐘用0-100% EtOAc/DCM之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.240g，68%產率)。ES/MS m/z 411.2[M+H]+。
在密封之反應容器中，將4-[[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-羥基-甲基]苯甲腈之非對映異構體(0.765g，1.79mmol)溶解於1,4-二噁烷(4mL)及氫氧化銨(28wt%於水中，4mL)中。將反應物加熱至85℃且攪拌18小時。將反應物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。經由矽膠層析用60-75%之10% 7N於MeOH中之NH3/MTBE之9：1混合物/己烷的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.64g，88%產率)。ES/MS m/z 408[M+H]+。
在反應容器中，將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-
基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氟苯基)甲醇之非對映異構體(795.9mg，1.76mmol)溶解於1,4-二噁烷(4mL)中，且添加氫氧化銨(28wt%於水中，6mL)。密封容器，且在攪拌下將混合物加熱至85℃後維持18小時。將容器冷卻至室溫且在減壓下濃縮。將所得固體溶解於2% MeOH於DCM中之溶液中，且經由玻璃羊毛塞過濾溶液。濃縮濾液，得到標題化合物(694.5mg，79%產率)。ES/MS m/z 419[M+H]+。
在密封之反應容器中，將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氯苯基)甲醇之非對映異構體(245.0mg，0.520mmol)溶解於氫氧化銨(28wt%於水中，2.0mL)及1,4-二噁烷(2.0mL)中。將容器加熱至85℃且攪拌18小時。將混合物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。經由矽膠層析用10-50%之10% MeOH/MTBE之混合物/己烷的梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(184.6mg，78%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)451/453[M+H]+。
在密封之反應容器中，將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(對甲苯基)甲醇之非對映異構體(144mg，0.346mmol)溶解
於氫氧化銨(28wt%於水中，4.0mL)及1,4-二噁烷(4.0mL)中。將反應物加熱至85℃且攪拌18小時。將反應物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。經由矽膠層析用25-75%之10% MeOH/MTBE之混合物/己烷的梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(119.4mg，87%產率)。ES/MS m/z 397[M+H]+。
向兩個密封容器中各自饋入[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氟苯基)甲醇之非對映異構體(505mg，1.20mmol)、氫氧化銨(28wt%於水中，15mL)及1,4-二噁烷(15mL)。將混合物加熱至85℃且攪拌18小時。將混合物冷卻至室溫且添加氫氧化銨(28wt%於水中，8mL)。將兩種混合物均加熱至75℃且攪拌60小時。合併兩個容器之內含物，且在減壓下濃縮至乾燥。將所得殘餘物溶解於2% MeOH於DCM中之溶液中，且經由玻璃羊毛塞過濾。濃縮濾液，從而獲得殘餘物。經由矽膠層析用5% MeOH/DCM之梯度溶離來純化殘餘物，得到標題化合物(909.6mg，93%產率)。ES/MS m/z 401[M+H]+。
將1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(3,4-二氯苯基)乙醇之非對映異構體(150.0mg，0.309mmol)、氫氧化銨(28wt%
於水中，3.0mL)及1,4-二噁烷(3.1mL)溶解於密封之反應容器中。將反應物加熱至85℃且攪拌18小時。將反應物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。經由矽膠層析用10-50%之10% MeOH/MTBE之混合物/己烷的梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(110.9mg，77%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)465/467[M+H]+。
在密封之反應容器中，將1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(2-氟苯基)乙醇之非對映異構體(0.48g，1.1mmol)溶解於1,4-二噁烷(6mL)及氫氧化銨(28wt%於水中，4mL)中。將容器加熱至85℃且攪拌22小時。將混合物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。經由矽膠層析用25-75%之10% 7N於MeOH中之NH3/MTBE之9：1混合物/己烷的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.35g，75%產率)。ES/MS m/z 415.0[M+H]+。
在密封之反應容器中，將1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙醇之非對映異構體(0.18g，0.37mmol)溶解於1,4-二噁烷(3mL)及氫氧化銨(28wt%於水中，1mL)中。將容器加熱至85℃且攪拌22小時。將混合物冷卻至室溫且在減壓下濃
縮。經由矽膠層析用50-75%之10% 7N於MeOH中之NH3/MTBE之9：1混合物/己烷的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.14g，84%產率)。ES/MS m/z 465.0[M+H]+。
在密封之反應容器中，將1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-[4-(三氟甲基)苯基]乙醇(0.33g，0.68mmol)溶解於1,4-二噁烷(2mL)及氫氧化銨(28wt%於水中，3mL)中。將容器加熱至85℃且攪拌內含物22小時。將反應物冷卻至室溫且在減壓下濃縮。經由矽膠層析用25-75%之10% 7N於MeOH中之NH3/MTBE之9：1混合物/己烷的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.152g，48%產率)。ES/MS m/z 465.0[M+H]+。
將59mL無縫不鏽鋼管狀反應器(o.d.=1/8")置放於GC烘箱內部。歷經40分鐘用1：6比率之氫氧化銨(28%於水中)/二噁烷以2.0mL/min沖洗。將N2之背壓(1400-1500psig)施加至反應系統之出口，且將GC烘箱之溫度設定在200℃下。使用高壓1L Teledyne ISCOTM注射泵，以0.25mL/min(30分鐘之滯留時間)泵送(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-氯-3-(環丙氧基)苯基]甲醇的非對映
異構體(35.3g，70.2mmol)於1/6氫氧化銨(28%於水中)/二噁烷(350mL)之混合物中之溶液通過反應器。耗盡此進料溶液後，用以2.0mL/min泵送之1：6氫氧化銨(28%於水中)：二噁烷(89mL)沖洗反應器。添加水(1400mL)及EtOAc(500mL)。分離所得有機層且用EtOAc(200mL)萃取水層。合併有機萃取物且經硫酸鎂乾燥。過濾且在減壓下濃縮濾液，從而獲得標題化合物(34g，88.6%純度)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)473.1/475.1[M+H]+。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ 0.73-0.63(m,4H),1.30(s,3H),1.49(s,3H),4.10(dd,J=1.6,6.6Hz,1H),4.66(dd,J=4.3,6.4Hz,1H),5.11(dd,J=1.8,6.2Hz,1H),5.33(dd,J=3.3,6.3Hz,1H),6.12(d,J=3.3Hz,1H),6.30(d,J=4.1Hz,1H),6.64(d,J=3.6Hz,1H),6.86-6.90(m,1H),6.93(d,J=1.6Hz,1H),7.14(s,2H),7.28(d,J=8.0Hz,1H),7.39(d,J=3.6Hz,1H),8.09(s,1H)。
在N2氛圍下向高壓反應容器中，將2.0M Al(CH3)3於甲苯(120μL，0.24mmol)中之溶液添加至(1R)-1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(4-氯苯基)乙醇(0.30mg，0.666mmol)、肆(三苯膦)鈀(0)(0.154g，0.016mmol)及無水THF(8mL)之攪拌混合物中。密封反應容器且將混合物加熱至70℃。70℃下6小時後，將容器冷卻至室溫且謹慎地添加1N HCl水溶液(15mL)。將混合物用水(15mL)稀釋且用EtOAc(3×20mL)萃取。合併有機萃取物，用氯化鈉飽和水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥有機層，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用1：1 EtOAc：己烷之等度溶劑混合物溶離來純化所得殘餘物，
得到標題化合物(0.270g，89%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)430.0/432.0[M+H]+。
在N2氛圍下向高壓反應容器中，將2.0M Al(CH3)3於甲苯(120μL，2.4mmol)中之溶液添加至[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯-2-氟-苯基)甲醇之非對映異構體(0.271mg，0.597mmol)、肆(三苯膦)鈀(0)(0.138mg，0.119mmol)及無水THF(2.2mL)的攪拌混合物中。密封反應容器且將混合物加熱至80℃。80℃下6小時後，將容器冷卻至室溫且謹慎地添加1N HCl水溶液(10mL)。用水(15mL)稀釋且用EtOAc(3×20mL)萃取。合併有機萃取物，用氯化鈉飽和水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下蒸發濾液，得到標題化合物(0.266g，83%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)434.2/436.2[M+H]+。
在室溫下將2.0M Al(CH3)3於甲苯(0.57g，1.41mmol)中之溶液添加至1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(3,4-二氯苯基)乙醇之非對映異構體(171.4mg，0.354mmol)、肆(三苯膦)鈀(0)(0.082g，0.071mmol)於1,4-二噁烷(4.4mL)中之混合物中。在80℃下
加熱混合物8小時。將混合物冷卻至室溫且用飽和氯化銨(20mL)淬滅。添加EtOAc(40mL)且用EtOAc(4×30mL)萃取水層。合併有機萃取物且用碳酸氫鹽飽和水溶液及氯化鈉飽和水溶液洗滌。經硫酸鎂乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用25-40%之10% 7N於MeOH中之NH3/MTBE之9：1混合物/己烷的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到標題化合物(125.9mg，77%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)451/453[M+H]+。
在N2氛圍下向高壓反應容器中，將2.0M Al(CH3)3於甲苯(120μL，0.24mmol)中之溶液添加至(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(0.50g，1.15mmol)、肆(三苯基膦)鈀(0)(0.266g，0.230mmol)及無水THF(13.8mL)之攪拌混合物中。密封反應容器且加熱至70℃。70℃下6小時後，冷卻至室溫且謹慎地用1N HCl水溶液(15mL)淬滅。用水(15mL)稀釋且用EtOAc(3×20mL)萃取。合併有機萃取物，用氯化鈉飽和水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用1：1 EtOAc：己烷之等度溶劑混合物溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.50g，95%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)416.0/418.0[M+H]+。
在0℃下將(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(6.78g，13.0mmol)溶解於TFA(90mL)中。添加水(9mL)且在室溫下攪拌混合物1小時。在減壓下移除溶劑且將殘餘物吸收於MeOH(25mL)中。將混合物冷卻至0℃且逐滴添加氫氧化銨水溶液(28wt%)至pH~10。在減壓下移除溶劑，得到粗混合物。藉由矽膠層析用0-2% MeOH/EtOAc之梯度溶離來純化，得到殘餘物。將殘餘物溶解於EtOAc(50mL)中且在減壓下移除溶劑。將所得淡玻璃狀固體添加至水(約50mL)中，且在室溫下攪拌混合物隔夜。過濾所得白色固體且用水(50mL)洗滌。乾燥固體，得到標題化合物(3.24g，66%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)377.05/379.05[M+H]+。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ 4.01(d,J=4.0Hz,2H),4.63(dd,J=5.3,7.5Hz,1H),4.81(d,J=4.0Hz,1H),5.01(bs,1H),5.20(bs,1H),5.91(d,J=7.7Hz,1H),6.59(d,J=3.7Hz,1H),6.69(bs,1H),7.11(bs,2H),7.32-7.45(m,5H),8.05(s,1H)。
在0℃下將(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(15.38g，0.037mol)漿化於2-丙醇(50mL)中。添加4.99M的2-丙醇HCl(200mL，1000mmol)及水(4mL)之溶液，且在室溫下攪拌18小時。添加額外4.99M的2-丙醇HCl(25mL)之溶液，且在室溫下攪拌混合物24小時。在40℃下加熱混合物2小時。在減壓下
濃縮且將EtOH(50mL)及水(50mL)添加至所得殘餘物中。冷卻至0℃且逐滴添加NH4OH水溶液(28%產率)，以將pH調整至~10且在室溫下攪拌混合物2小時。在減壓下濃縮，產生淺黃色固體。將水(50mL)逐滴添加至黃色固體中，接著添加NH4OH(28%，2mL)以將pH調整至9，且在室溫下攪拌混合物3小時。藉由過濾收集所得沈澱，用水(50mL)沖洗濾餅，且在真空下乾燥2天，得到標題化合物(13.37g，96%產率)。
將200mL PTFE反應器(o.d.=1/8")置放於GC烘箱內部。用EtOAc(300mL)沖洗。將GC烘箱之溫度設定在55℃下。使用1L Teledyne ISCOTM注射泵，以8.5mL/min泵送(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(186.0g，01.57mmol)於5：2：2 EtOH：MeOH：EtOAc(1674mL)中之溶液，且於T-混合器中將其與6N HCl水溶液之流組合。用蠕動泵以1.5mL/min泵送混合物通過反應器(給出20分鐘之總滯留時間)。耗盡此進料溶液後，用5：1的EtOAc：6N HCl水溶液混合物(400mL)以10mL/min中洗反應器。在減壓下濃縮經收集溶液，且在冰/水浴中將所得水溶液冷卻至10℃。逐滴添加NH4OH(28%，2mL)以調整至pH~10，且攪拌冷卻在10℃下之混合物35小時。收集所得固體，用水(100mL)沖洗，且在真空下在35℃下乾燥2天，得到無水標題化合物(134.5g；89%產率)。
在配備有CuKa源(λ=1.54060Å)及Vantec偵測器且在35kV及50mA下操作之Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上獲得結晶固體之X射線粉末繞射圖案。以2θ在4與40°之間掃描樣品，其中2θ之步長為0.0087°且掃描速率為0.5秒/步，且發散度為0.6mm，固定抗散射性為
5.28mm，且偵測器狹縫為9.5mm。將乾粉裝填於石英樣品固持器上，且使用玻璃載片獲得光滑表面。結晶學技術中已熟知，對於任何既定結晶形式，由於由諸如晶體形態及習性之因素所產生之較佳定向，繞射峰之相對強度可能有所變化。在存在較佳取向之影響的情況下，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見例如The U.S.Pharmacopeia 35-National Formulary 30第<941>章Characterization of crystalline and partially crystalline solids by X-ray powder diffraction(XRPD)官方2012年12月1日-2013年5月1日。此外，結晶學技術中亦熟知，對於任何既定結晶形式，角峰位置可略微變化。舉例而言，峰位置可能由於分析樣品時之溫度或濕度變化、樣品移位或內標存在或不存在而有位移。在本發明之情況下，2θ之±0.2之峰位置變化將考慮此等潛在變化而不妨礙明確鑑別指定結晶形式。結晶形式可基於有區別之峰(以°2θ為單位)，通常為更顯著之峰之任何獨特組合來確認。基於8.84及26.76度2θ之NIST 675標準峰，來調整在環境溫度及相對濕度下收集之結晶形式繞射圖案。
藉由X射線繞射圖案使用如具有如下表1中所描述之繞射峰(2-θ值)的CuKa輻射，來表徵替代製備A實例1形式I之製備樣品。具體言之，圖案含有25.1°處之峰以及一或多個選自由17.1°、13.6°、20.5°、24.0°及14.5°組成之群的峰；其中繞射角公差為0.2度。
在室溫下攪拌(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-苯基-甲醇(0.293g，0.766mmol)、4N HCl於1,4-二噁烷(9.6mL)及水(3滴)中之溶液。在室溫下45分鐘後，在減壓下濃縮溶液。經由矽膠層析，歷經25分鐘用50-100%丙酮/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.195g，74%產率)。ES/MS m/z 343.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 4.04-4.06(m,2H),4.55-4.67(m,1H),4.81(t,J=3.5Hz,1H),4.95(d,J=3.9Hz,1H),5.19(d,J=7.1Hz,1H),5.92(d,J=7.9Hz,1H),6.60(t,J=3.4Hz,2H),7.11-7.13(m,2H),7.24(t,J=7.2Hz,1H),7.32-7.35(m,3H),7.42(d,J=7.3Hz,2H),8.06(s,1H)。
將(1R)-1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(4-氯苯基)乙醇(10.3g，23.9mmol)溶解於2-丙醇(100mL)中，且在0℃下攪拌。逐滴添加4.99M HCl於2-丙醇(200mL，1000mmol)及水(2mL)中之溶液，且在室溫下攪拌混合物6小時。在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。將殘餘物溶解於EtOH(50mL)中，將混合物冷卻至0℃，且逐滴添加氫氧化銨水溶液(28wt%產率)至pH~10。在減壓下濃縮，得到白色玻璃狀固體。將固體添加至水(約40mL)中，且在室溫下攪拌混合物4小時。過濾且收集所得白色固體，用水(50mL)洗滌且空氣乾燥，得到標題化合物(9.0g，96%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)391.10/393.10[M+H]+。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ 1.40(s,3H),3.65-3.67(m,1H),4.13(s,1H),4.61-4.68(m,1H),4.78(d,J=3.7Hz,1H),5.12(d,J=7.0Hz,1H),5.81(d,J=8.1Hz,1H),6.59(d,J=3.7Hz,1H),7.10(bs,1H),7.19(bs,2H),7.32(d,J=3.3Hz,1H),7.40(d,J=8.8Hz,2H),7.58(d,J=8.8Hz,2H),8.07(s,1H)。
將15mL鐵氟龍塗佈之SS反應器(o.d.=1/8")置放於Vapourtec E系
列設備中。將背壓調節器(4-5巴)施用至反應系統之出口，且設定溫度且將溫度設定在82℃下。以1.1mL/min泵送(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-氯-3-(環丙氧基)苯基]甲醇之非對映異構體(32.1g，60.1mmol)於EtOH(317mL)中之溶液，且於T-混合器中將此溶液與4N HCl水溶液之流組合，且在82℃下以0.288mL/min泵送此混合物通過反應器(給出10分鐘之總滯留時間)。耗盡此進料溶液後，用混合物EtOH/4N HCl水溶液(400mL)以0.29mL/min沖洗反應器。用活性碳、Darco KB®(100網目；濕粉末，13g)處理粗反應混合物，且經由矽藻土之短墊過濾。用活性碳Darco KB®(100網目；濕粉末，26g)重複處理，且經由矽藻土過濾。在真空下減少經收集溶液之有機溶劑達¼體積，逐滴添加水(150mL)及NH4OH水溶液(28%，40mL)，以將pH調整至~10，且用EtOAc(2×300mL)萃取。合併有機萃取物，用氯化鈉飽和水溶液洗滌，經硫酸鎂乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液，得到殘餘物(17g)。另外，用MeOH(1000mL)沖洗兩個矽藻土襯墊，且在減壓下移除有機濾液洗液，得到額外殘餘物(7.89g)。將兩種殘餘物合併於1：10 MeOH：EtOAc(300mL)中，且在減壓下蒸發溶劑，得到標題化合物(17.45g；67%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)433.0/435.0[M+H]+。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ 0.73-0.81(m,4H),3.77-3.83(m,1H),4.00(d,J=4.6Hz,1H),4.04-4.09(m,1H),4.67-4.73(m,1H),4.81(t,J=4.0Hz,1H),5.04(d,J=3.8Hz,1H),5.21(d,J=7.3Hz,1H),5.91(d,J=7.9Hz,1H),6.58(d,J=3.6Hz,1H),6.65(d,J=3.4Hz,1H),7.01(dd,J=1.5,8.2Hz,1H),7.10(bs,2H),7.35(d,J=1.6Hz,1H),7.43(d,J=1.4Hz,1H),8.06(s,1H)。
將[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-[4-(三氟甲基)苯基]甲醇之非對映異構體(13.5g，27.0mmol)溶解於2-丙醇(50mL)中，且在0℃下攪拌。將4.99M HCl於2-丙醇(200mL,0.998mol)及水(2mL)中之溶液逐滴添加至混合物中，且在室溫下攪拌3小時。在減壓下移除溶劑，得到殘餘物。將殘餘物溶解於EtOH(50mL)中，且將混合物冷卻至0℃。逐滴添加氫氧化銨水溶液(28wt%)至pH~10，且攪拌混合物10分鐘。在減壓下移除溶劑，得到白色玻璃狀固體。藉由矽膠層析用80-100% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到發泡體。將發泡體懸浮於水(300mL)中，且在室溫下攪拌混合物1小時。過濾所得白色固體，用水(50mL)洗滌濾餅，且乾燥，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(7.85g，71%產率)。ES/MS m/z 411.10[M+H]+。1H NMR(300MHz,d6-DMSO)δ 4.02-4.07(m,2H),4.65(td,J=7.4,5.1Hz,1H),4.92(t,J=3.6Hz,1H),5.02(d,J=3.8Hz,1H),5.22(d,J=7.1Hz,1H),5.92(d,J=8.0Hz,1H),6.60(d,J=3.6Hz,1H),6.81(d,J=3.3Hz,H),7.11(s,2H),7.32(d,J=3.8Hz,1H),7.71-7.63(m,4H),8.06(s,1H)。
混合[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-氯苯基)甲醇之非對映異構體(0.052g，0.124mmol)、4N於1,4-二噁烷(5mL)及MeOH(5mL)中之HCl。在室溫下攪拌混合物。在室溫下1小時後，在N2流下濃縮溶液以移除溶劑。溶解於水(5mL)中且用EtOAc(2mL)萃取。添加1N NaOH水溶液直至溶液為鹼性，且用DCM(4×3mL)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析用50-100% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.023g，49%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)377.0/379.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 3.37(bs,1H),4.04-4.08(m,2H),4.63-4.69(m,1H),4.85-4.88(m,1H),5.07(d,J=3.6Hz,1H),5.26(d,J=7.0Hz,1H),5.96(d,J=8.1Hz,1H),6.64(d,J=3.5Hz,1H),6.76-6.74(m,1H),7.15-7.18(bs,1H),7.33-7.42(m,4H),7.50-7.52(m,1H),8.09(s,1H)。
在室溫下攪拌[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-
基]-(4-氯-2-氟-苯基)甲醇之非對映異構體(0.067g，0.154mmol)、4N HCl於1,4-二噁烷(5.0mL)及MeOH(5.0mL)中之溶液。在室溫下1小時後，在N2流下濃縮溶液以移除溶劑。用ACN濕磨所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.046g，69%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)395/397[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 3.97-4.00(m,1H),4.09-4.11(m,1H),4.44-4.49(m,1H),4.92-4.96(m,1H),6.06-6.09(m,1H),6.98-7.00(m,1H),7.26-7.28(m,1H),7.32-7.35(m,1H),7.51-7.56(m,1H),7.65-7.66(m,1H),8.35(s,1H)。
在標準容器中，在減壓下抽空(2R,3R,4S,5R)-2-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-5-[(4-氯-2-氟-苯基)-羥基-甲基]四氫呋喃-3,4-二醇鹽酸鹽之非對映異構體(0.036g，0.083mmol)、10% Pd/C(0.010mg，0.009mmol)及EtOH(2.0mL)之混合物。用氫氣使容器增壓至10psi。在10psi下攪拌24小時後，添加三乙胺(0.25mg，0.25mmol)及額外10% Pd/C(0.010mg，0.009mmol)。抽空容器，且用氫氣增壓至10psi。在室溫下再攪拌24小時。經由矽藻土過濾所得混合物，且在減壓下濃縮。經由反相高壓層析(PHENOMENEX® GEMINI®-NX)，歷經20分鐘，在5-45% ACN於5% MeOH/10mM碳酸氫銨之混合物(pH~10)中的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.010g，33%產率)。ES/MS m/z 361[M+H]+。1H NMR(400
MHz,d6-DMSO)δ 4.01-4.03(m,2H),4.63-4.64(m,1H),4.97-5.01(m,1H),5.19-5.21(m,1H),5.89-5.93(m,1H),6.56-6.57(m,1H),6.85-6.89(m,1H),7.31-7.32(m,5H),7.60-7.61(m,1H),8.02(s,1H)。
在室溫下攪拌[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3-乙基苯基)甲醇之非對映異構體(0.240g，0.585mmol)、4N HCl於1,4-二噁烷(5.0mL)及MeOH(5.0mL)中之溶液。在室溫下1小時後，在N2流下濃縮溶液以移除溶劑。用ACN濕磨所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.160g，67%產率)。ES/MS m/z 371[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.12(t,J=7.6Hz,3H),2.51-2.57(q,J=7.6Hz,2H),3.98-4.02(m,1H),4.08-4.11(m,1H),4.546-4.50(m,1H),4.69-4.72(m,1H),6.06(d,J=7.7Hz,1H),6.97(d,J=3.7Hz,1H),7.01-7.06(m,1H),7.14-7.27(m,4H),7.68(d,J=3.6Hz,1H),8.35(s,1H)。
混合TFA(3.5mL)及水(0.5mL)且冷卻至0℃。將此添加至4-[[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-羥基-甲基]苯甲腈之非對映異構體(0.50g，1.24mmol)中，且在0℃下攪拌。1小時後，在減壓下濃縮且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離。收集適當溶離份，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.47g，100%產率)。ES/MS m/z 368[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 3.33-3.41(m,2H),4.04(d,J=4.2Hz,2H),4.61-4.65(m,1H),4.91(d,J=4.3Hz,1H),5.06(d,J=2.4Hz,1H),5.22-5.26(m,1H),5.94(d,J=7.8Hz,1H),6.65(d,J=3.6Hz,1H),6.71-6.79(m,1H),7.31-7.35(m,2H),7.39(d,J=3.6Hz,1H),7.62(d,J=8.3Hz,2H),7.80(d,J=8.3Hz,2H),8.10(s,1H)。
在0℃下混合[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氟苯基)甲醇之非對映異構體(694mg，1.66mmol)、1,4-二噁烷(6mL)、水(2mL)、4M於1,4-二噁烷中之HCl(3mL，12
mmol)。攪拌混合物18小時，再添加另外的4M於1,4-二噁烷中之HCl(4mL，16mmol)。在室溫下再攪拌混合物18小時。添加HCl(31wt%於水中，0.5mL)。在室溫下攪拌混合物4小時。在0℃下冷卻混合物，且緩慢添加飽和NaHCO3溶液直至達成pH~7。用2-4% MeOH/DCM萃取。經硫酸鎂乾燥有機萃取物，過濾，且在減壓下濃縮濾液，得到粗殘餘物。經由矽膠層析用77%DCM、15%EtOAc及7%MeOH之等度溶劑混合物溶離，來純化殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(408mg，64%產率)。ES/MS m/z 379[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 4.02-4.04(m,2H),4.63(td,J=7.3,5.2Hz,1H),4.82(t,J=3.9Hz,1H),5.03(d,J=4.0Hz,1H),5.22(d,J=7.1Hz,1H),5.92(d,J=7.8Hz,1H),6.61(d,J=3.6Hz,1H),6.73(d,J=3.6Hz,1H),7.11(s,2H),7.27(dd,J=4.0,8.2Hz,1H),7.34(d,J=3.6Hz,1H),7.39-7.46(m,2H),8.06(s,1H)。
在室溫下混合[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(3,4-二氯苯基)甲醇之非對映異構體(180.0mg，0.398mmol)、水(0.20mL)及TFA(2.0mL)。45分鐘後，在減壓下濃縮混合物且將所得殘餘物溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離混合物。收集適當溶離份且在真空中濃縮，得到粗殘餘
物。經由矽膠層析用10% NH3/MeOH於CHCl3中之混合物的梯度溶離，來純化殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(98.3mg，60%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)411/413[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 4.01-4.03(m,2H),4.62(td,J=7.3,5.0Hz,1H),4.84(t,J=4.0Hz,1H),5.05(d,J=3.9Hz,1H),5.22(d,J=7.1Hz,1H),5.92(d,J=7.8Hz,1H),6.60(d,J=3.6Hz,1H),6.77(d,J=3.6Hz,1H),7.11(s,2H),7.34(d,J=3.6Hz,1H),7.41(dd,J=1.8,8.4Hz,1H),7.59(d,J=8.3Hz,1H),7.65(d,J=1.8Hz,1H),8.06(s,1H)。
在室溫下混合[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(對甲苯基)甲醇之非對映異構體(115mg，0.290mmol)、水(0.15mL)及TFA(1.5mL)。90分鐘後，在減壓下濃縮且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離。收集適當溶離份且在減壓下蒸發至乾燥，得到殘餘物。經由矽膠層析用5-15%之10% 7N NH3/MeOH之混合物/DCM/的梯度溶離，來純化殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(50.2mg，49%產率)。ES/MS m/z 357[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 2.29(s,H),4.62-4.67(m,1H),4.77(t,J=3.3Hz,1H),4.93(d,J=3.8Hz,1H),5.18(d,J=7.1Hz,1H),5.90(d,J=7.9Hz,1H),6.58(dd,J=3.4,12.3Hz,
2H),7.11-7.15(m,3H),7.29-7.33(m,3H),8.06(s,1H)。
混合[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氟苯基)甲醇之非對映異構體(158mg，0.394mmol)、1,4-二噁烷(3mL)、水(0.75mL)及4M HCl於1,4-二噁烷(3mL，12mmol)中之溶液，且在0℃下攪拌混合物5分鐘，隨後在室溫下攪拌1小時。在減壓下濃縮，隨後添加EtOAc(30mL)且再次濃縮。重複添加EtOAc且再濃縮兩次之此程序。經由矽膠層析用7% MeOH於DCM中之等度溶劑混合物溶離來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(103.5mg，73%產率)。ES/MS m/z 361[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 4.03(dd,J=4.3,10.6Hz,2H),4.63(td,J=7.3,5.2Hz,1H),4.81(t,J=3.7Hz,1H),4.99(d,J=3.9Hz,1H),5.20(d,J=7.1Hz,1H),5.92(d,J=7.8Hz,1H),6.61(dd,J=3.6,9.5Hz,2H),7.11-7.17(m,4H),7.32(d,J=3.6Hz,1H),7.45(dd,J=5.8,8.5Hz,2H),8.06(s,1H)。
將[(3aR,4R,6S,6aS)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲酮之非對映異構體(426.9mg，0.983mmol)溶解於THF(5mL)中，且將混合物冷卻至0℃。歷經1分鐘添加1.0M溴化乙基鎂於THF(1.97mL，1.97mmol)中之溶液。攪拌15分鐘且溫至室溫。1小時後，藉由添加1N HCl水溶液(2.48mL)淬滅。用DCM(10mL)稀釋反應混合物。分離各層且用DCM(5mL)萃取水層。合併有機萃取物且在減壓下蒸發。將殘餘物溶解於7M NH3/MeOH(10mL，70mmol)中且在微波反應器中在100℃下加熱6小時。在N2流下在50℃下蒸發所得混合物。將所得殘餘物溶解於4N於1,4-二噁烷(1.29mL，49.2mmol)中之HCl中，且添加水(35μL，1.97mmol)。在室溫下攪拌混合物1.5小時，且隨後在減壓下濃縮混合物。經由反相高壓液相層析(PHENOMENEX® GEMINI®-NX)，用13-48% ACN於5% MeOH/10mM碳酸氫銨之混合物(pH~10)中的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(97.8mg，25%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)405.1/407.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 0.54(t,J=7.4Hz,3H),1.75-1.92(m,2H),3.63(d,J=5.0Hz,1H),4.22(s,1H),4.69(dd,J=5.3,7.6Hz,1H),4.78-4.82(m,1H),5.14-5.20(m,1H),5.75(d,J=8.1Hz,1H),6.59(d,J=3.5Hz,1H),7.11(s,1H),7.23(s,1H),7.31(d,J=3.6Hz,1H),7.42(d,J=8.7Hz,2H),7.53-7.56(m,2H),8.08(s,1H)。
在室溫下組合1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(3,4-二氯苯基)乙醇之非對映異構體(101.2mg，0.217mmol)、水(0.1mL)及TFA(1.0mL)。攪拌1小時後，在減壓下濃縮且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離。收集適當溶離份，得到殘餘物。經由矽膠層析用5-30%的10% 7N NH3於MeOH/MeOH/氯仿(按體積計1：1：2)中之混合物/CHCl3的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(81.7mg，88%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)426/428[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.42(s,3H),3.66(t,J=4.4Hz,1H),4.15(s,1H),4.56-4.65(m,1H),4.85(d,J=3.7Hz,1H),5.14(d,J=7.2Hz,1H),5.83(d,J=8.0Hz,1H),6.61(d,J=3.6Hz,1H),7.20(s,2H),7.27(s,1H),7.33(d,J=3.5Hz,1H),7.55(dd,J=2.0,8.5Hz,1H),7.62(d,J=8.5Hz,1H),7.81(d,J=2.0Hz,1H),8.08(s,1H)。
混合TFA(4mL)及水(1mL)且冷卻至0℃。將此添加至1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(2-氟苯基)乙醇之非對映異構體(0.341g，0.823mmol)中，且在0℃下攪拌。30分鐘後，在減壓下濃縮且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離。收集適當溶離份，且經由矽膠層析用0-100%之10% 7N NH3/MeOH之混合物/DCM的梯度溶離來進一步純化，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.271g，88%產率)。ES/MS m/z 375.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.49(s,3H),3.33(s,2H),3.64(t,J=4.4Hz,1H),4.32(s,1H),4.68(td,J=7.5,5.2Hz,1H),4.80(d,J=3.7Hz,1H),5.13(d,J=7.1Hz,1H),5.83(d,J=8.1Hz,1H),6.61(d,J=3.5Hz,1H),7.15-7.27(m,4H),7.31-7.35(m,3H),7.81(td,J=8.0,1.6Hz,1H),8.09(s,1H)。
混合TFA(3mL)及水(1mL)且冷卻至0℃。將此混合物添加至1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-[2-(三氟甲基)苯基]乙醇之非對映異構體(0.137g，0.295mmol)中，且在0℃下攪拌。20分鐘後，在減壓下濃縮反應混合物且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離溶液。收
集適當溶離份，且經由矽膠層析用0-100%之10% 7N NH3/MeOH之混合物/DCM的梯度溶離來進一步純化，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.109g，87%產率)。ES/MS m/z 425.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.52(s,3H),3.76(t,J=4.4Hz,1H),4.38(s,1H),4.64(dd,J=7.6,12.8Hz,1H),4.80(d,J=3.7Hz,1H),5.14(d,J=7.2Hz,1H),5.86(d,J=8.1Hz,1H),6.61(d,J=3.5Hz,1H),6.93(s,1H),7.17(s,2H),7.38(d,J=3.6Hz,1H),7.48(t,J=7.6Hz,1H),7.65(t,J=7.5Hz,1H),7.81(d,J=7.8Hz,1H),7.87(d,J=8.0Hz,1H),8.06(s,1H)。
混合TFA(2mL)及水(0.5mL)且冷卻至0℃。將此添加至1-[(3aR,4R,6S,6aR)-4-(4-胺基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-[4-(三氟甲基)苯基]乙醇之非對映異構體(0.136g，0.292mmol)中，且在0℃下攪拌。45分鐘後，在減壓下濃縮且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離。收集適當溶離份，且經由矽膠層析用10-25%之10% 7N NH3/MeOH之混合物/DCM的梯度溶離來進一步純化，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.095g，76%產率)。ES/MS m/z 425.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.44(s,3H),3.66(t,J=4.3Hz,1H),4.20(s,1H),4.67(td,
J=7.5,5.2Hz,1H),4.81(d,J=3.7Hz,1H),5.14(d,J=7.2Hz,1H),5.83(d,J=8.1Hz,1H),6.61(d,J=3.6Hz,1H),7.21(s,2H),7.27(s,1H),7.33(d,J=3.6Hz,1H),7.73(d,J=8.4Hz,2H),7.81(d,J=8.2Hz,2H),8.09(s,1H)。
在室溫下攪拌(1R)-1-[(3aR,4R,6S,6aR)-2,2-二甲基-4-(4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(4-氯苯基)乙醇(0.265g，0.616mmol)、4N HCl水溶液於1,4-二噁烷(10mL)及MeOH(10mL)中之混合物。在室溫下1小時後，在N2流下濃縮溶液以移除溶劑。添加水(30mL)，用NaHCO3飽和水溶液中和至pH~7，且用DCM(3×20mL)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析歷經35分鐘用0-50% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到標題化合物(0.180g，75%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)390.02/392.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.39(s,3H),2.46-2.48(m,5H),3.30(s,1H),2.65(s,3H),3.68(t,J=4.3Hz,1H),4.08(s,1H),4.51-4.54(m,1H),4.84(d,J=3.7Hz,1H),5.15-5.17(m,1H),6.07(d,J=7.9Hz,1H),6.18(s,1H),6.76(d,J=3.7Hz,1H),7.37-7.39(m,2H),7.53-7.56(m,2H),7.79(d,J=3.7Hz,1H),8.64(s,1H)。
在室溫下攪拌[(3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-4-(4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯-2-氟-苯基)甲醇之非對映異構體(0.220g，0.507mmol)、4N HCl於1,4-二噁烷(10.0mL)及MeOH(10.0mL)中之溶液。在室溫下1小時後，在N2流下濃縮溶液以移除溶劑。在DCM(25mL)與水(25mL)之間分配殘餘物。用NaHCO3飽和水溶液中和至pH~7，且用DCM(4×20mL)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。經由矽膠層析歷經5分鐘用0-100% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.192g，96%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)394.2/396.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 2.63(s,3H),3.28-3.32(m,2H),3.97-4.02(m,1H),4.08-4.10(m,1H),4.54-4.57(m,1H),4.94-4.97(m,1H),5.13-5.16(m,1H),5.26-5.30(m,1H),6.14(d,J=7.7Hz,1H),6.23(d,J=4.5Hz,1H),6.75(d,J=3.7Hz,1H),7.26(dd,J=1.9,8.3Hz,1H),7.33(dd,J=2.0,10.2Hz,1H),7.54(t,J=8.2Hz,1H),7.71(d,J=3.9Hz,1H),8.61(s,1H)。
在標準容器中在減壓下抽空(2R,3S,4R,5R)-2-[(4-氯-2-氟-苯基)-羥基-甲基]-5-(4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)四氫呋喃-3,4-二醇之非對映異構體(0.090g，0.228mmol)、10% Pd/C(0.025g)、三乙胺(0.069g，0.68mmol)及EtOH(4.0mL)之混合物。用氫氣將容器增壓至10psi，且在室溫下攪拌所得混合物15小時。經由矽藻土過濾所得混合物，且在減壓下濃縮。經由矽膠層析歷經5分鐘用0-100% EtOAc/己烷之梯度溶離來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(0.082g，85%產率)。ES/MS m/z 360.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 2.63(s,3H),4.01-4.04(m,1H),4.08-4.11(m,1H),4.56-4.58(m,1H),4.97-5.00(m,1H),5.10(d,J=4.2Hz,1H),5.26(d,J=7.1Hz,1H),6.13-6.18(m,2H),6.75(d,J=3.7Hz,1H),7.12-7.14(m,1H),7.18-7.21(m,1H),7.29-7.31(m,1H),7.56-7.57(m,1H),7.71-7.72(m,1H),8.62(s,1H)。
在室溫下混合1-[(3aR,4R,6S,6aR)-2,2-二甲基-4-(4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-1-(3,4-二氯苯基)乙醇之非對映異構體(122.0mg，0.26mmol)、水
(0.15mL)及TFA(1.5mL)。1小時後，在減壓下濃縮且將所得固體溶解於MeOH中。經由SILICYCLE®碳酸矽柱(70mL，5g)使用MeOH溶離。收集適當溶離份且在減壓下濃縮至乾燥，得到殘餘物。經由矽膠層析用10-50%之10% MeOH/MTBE之混合物/己烷的梯度溶離來純化所得殘餘物，得到呈非對映異構體形式之標題化合物(62.8mg，56%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)426/428[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 1.45(s,3H),2.69(s,3H),3.73(t,J=4.5Hz,1H),4.14(s,1H),4.52(dd,J=7.4,12.7Hz,1H),4.92(d,J=4.0Hz,1H),5.19(d,J=7.0Hz,1H),6.12(d,J=7.8Hz,1H),6.32(s,1H),6.80(d,J=3.7Hz,1H),7.55(dd,J=2.0,8.5Hz,1H),7.63(d,J=8.5Hz,1H),7.80-7.81(m,2H),8.68(s,1H)。
將(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-4-(4-氯吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-2,2-二甲基-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(200.0mg，0.264mmol)溶解於EtOAc(30mL)中。在室溫下用
THALESNANOTM H-Cube流動系統(2000kPa/1mL/min/70mm Pd/Al2O3濾筒)氫化溶液。在減壓下蒸發所得溶液，將所得殘餘物溶解於EtOAc(20mL)中，且用新Pd/Al2O3濾筒重複氫化。在減壓下蒸發所得溶液。將殘餘物溶解於4N於1,4-二噁烷(5.73mL，22.9mmol)中之HCl中，且添加水(3滴)。在室溫下攪拌溶液45分鐘且在減壓下蒸發。經由反相高壓層析(PHENOMENEX® GEMINI®-NX)用5-38% ACN於5% MeOH/10mM碳酸氫銨之混合物(pH~10)中的梯度溶離，來純化所得殘餘物，得到實例23及實例24。
實例24(2R,3S,4R,5R)-2-[(R)-羥基(苯基)甲基]-5-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基-四氫呋喃-3,4-二醇(15.0mg，9.11%產率)。ES/MS m/z 328.1[M+H)]。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 3.18(d,J=5.3Hz,3H),4.05-4.15(m,3H),4.62(dd,J=5.2,7.5Hz,1H),4.80(t,J=4.2Hz,1H),5.10(s,1H),5.22-5.30(m,1H),6.22(d,J=7.8Hz,1H),6.74(d,J=3.7Hz,1H),7.24(t,J=7.2Hz,1H),7.32(t,J=7.5Hz,2H),7.41(d,J=7.4Hz,2H),7.87(d,J=3.7Hz,1H),8.81(s,1H),9.04(s,1H)。
實例25(2R,3S,4R,5R)-2-[(R)-(4-氯苯基)-羥基-甲基]-5-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基-四氫呋喃-3,4-二醇(51.9mg，28.8%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)362.1/364.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 3.18(d,J=5.3Hz,3H),4.01(d,J=5.2Hz,1H),4.08-4.14(m,2H),4.61(dd,J=7.2,12.4Hz,1H),4.81(t,J=4.7Hz,1H),5.14(d,J=4.2Hz,1H),5.31(d,J=6.9Hz,1H),8.81(s,1H),6.06(d,J=4.4Hz,1H),6.21(d,J=7.7Hz,1H),6.74(d,J=3.7Hz,1H),7.35-7.43(m,4H),7.88(d,J=3.7Hz,1H),9.04(s,1H)。
在室溫下攪拌(R)-[(3aR,4R,6R,6aR)-2,2-二甲基-4-(4-甲基吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-基)-3a,4,6,6a-四氫呋喃并[3,4-d][1,3]間二氧雜環戊烯-6-基]-(4-氯苯基)甲醇(0.500g，1.08mmol)、4N HCl於1,4-二噁烷(50mL)及MeOH(50mL)中之溶液。在室溫下1小時後，在N2流下濃縮溶液以移除溶劑。向殘餘物中添加DCM(20mL)及水(20mL)。用DCM萃取，且丟棄。用碳酸氫鹽飽和水溶液調整水相之pH至pH~10，且用DCM(4×20mL)萃取。合併有機萃取物，經硫酸鈉乾燥，過濾，且在減壓下濃縮濾液。將所得殘餘物溶解於EtOAc中，將溶液經由矽膠墊過濾，且用EtOAc溶離。在減壓下移除濾液，得到標題化合物(0.393g，97%產率)。ES/MS m/z(35Cl/37Cl)376.2/378.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ 2.63(s,3H),3.95-3.97(m,1H),4.05-4.08(m,1H),4.53-4.59(m,1H),4.75-4.79(m,1H),5.09(d,1H,J=4.4Hz),5.25(d,1H,J=7.0Hz),6.07-6.13(m,2H),6.75(d,1H,J=3.6Hz),7.31-7.34(m,2H),7.36-7.40(m,2H),7.76(s,1H,J=3.6Hz),8.62(s,1H)。
以下分析結果顯示本文中例示之化合物適用作PRMT5抑制劑且可適用於治療癌症。
此分析之目的為量測測試化合物藉由抑制PRMT5/MEP50複合物之催化活性來活體外抑制PRMT5之酶活性的能力，此藉由放射性標記之甲基-3H轉移至衍生自人類組蛋白H4之N端序列的受質肽來指示。
使用桿狀病毒/Sf9系統表現PRMT5/MEP50酶複合物，且使用抗
FLAG親和層析來純化，(基本上如以下之製備中所描述，Stephen Antonysamy,Zahid Bonday,Robert M.Campbell,Brandon Doyle,Zhanna Druzina,Tarun Gheyi,Bomie Han,Louis N.Jungheim,Yuewei Qian,Charles Rauch,Marijane Russell,J.Michael Sauder,Stephen R.Wasserman,Kenneth Weichert,Francis S.Willard,Aiping Zhang及Spencer Emtage；Crystal structure of the human PRMT5：MEP50 complex，美國國家科學院之論文集(Proceedings of the National Academy of Sciences),2012，第109卷，第17960-17965頁)。將經純化酶稀釋成於分析緩衝液(50mM TRIZMA®預設pH 8.5，1mM DTT，0.005% TWEEN® 800.01% HSA)中之6.67nM工作儲備液。
將酶(15微升/孔)添加至384孔分析培養盤(CORNING®目錄號3706)中。將來自10mM DMSO儲備溶液之測試化合物以於分析緩衝液中之連續稀釋形式添加至培養盤中，以達成50.0μM至25nM範圍內之最終測試濃度。在分析緩衝液中建立反應混合物，其含有藉由FastMoc化學方法用ABI 431肽製備之1μM組蛋白H4生物素標記肽受質，H-SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRDK-生物素(SEQ ID NO：1)，及4μM 3H-SAM(15Ci/mmol、0.366mCi/mL、37μM，PERKIN-ELMER®目錄號NET155000MC)。向各培養盤孔中添加5μL肽/3H-SAM反應混合物，得到以下最終分析條件：5nM酶、1μM 3H-SAM、250nM肽，及與0.5% DMSO之50μM最大測試化合物濃度，在20μL最終體積下。在室溫下培育分析物2小時。用脈HCl(5M，20μL，Sigma目錄號G3272)之添加來終止反應。
在1mg/mL下將鏈黴親和素YSI SPA閃爍珠粒(PERKIN-ELMER®，編號RPNQ0012)懸浮於pH 8.5之含有5M胍HCl之Tris緩衝液中。向各孔中添加20μL此珠粒懸浮液，攪拌所得混合物，且在室溫下培育1小時，之後使用微板液體閃爍計數器作為形成甲基化肽產
物之指示來量測其放射性。
自放射性量度如計數值/分鐘(CPM)生成原始資料。使用不受抑制之對照(DMSO)及最大抑制之對照(250μM脫氫西奈芬淨(dehydrosinefungin)，(基本上如Berry,D.R.& Abbott,B.J.Incorporation of carbon-14-labeled compounds into sinefungin(A9145),a nucleoside antifungal antibiotic.J.Antibiot.1978(31)185-191及其所引用之文獻中所描述來分離))。在相對於對照之各測試化合物濃度下如下計算抑制百分比：%抑制=[中間CPM(不受抑制之對照)-中間CPM(測試化合物)]/[中間CPM(不受抑制之對照)-中間CPM(最大抑制之對照)]*100
使用ActivityBase XE或Genedata軟體以%抑制(y軸)相較於Log測試化合物濃度(x軸)繪製資料。使用4參數對數曲線擬合演算法計算IC50值。
此分析結果顯示所有例示化合物抑制PRMT5/MEP50催化活性，其中IC50小於500nM。另外，實例1-3基本上如上所述測試，且如表1中所展示對PRMT5/MEP50呈現以下活性。
平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差
此分析之目的為量測測試化合物抑制癌細胞增殖之能力。
在第1天，在96孔分析培養盤(BD Falcon 35-3219)中以250細胞/孔(100微升/孔)培養A375細胞(ATCC，DMEM高葡萄糖/10% Hi FBS)。在37℃培育箱(5% CO2)中將培養盤培育18-24小時。在第2天，
在培養基中自化合物儲備溶液(10mM於100% DMSO中)製備且連續稀釋測試化合物(1：2 10點連續稀釋)。將10μL連續稀釋之測試化合物添加至細胞培養盤(0.2% DMSO最終濃度)中。將10μL參考化合物(實例1)添加至細胞培養盤(最終20μM，0.2% DMSO)之行1中。在37℃/5% CO2下將細胞培養盤培育7天。在第9天，融化CELL TITER-GLO®(Promega編號G7571)緩衝液且在使用之前平衡至室溫。同樣，在使用之前將凍乾之CELL TITER-GLO®受質平衡至室溫。將CELL TITER-GLO®緩衝液轉移至琥珀色受質瓶中，以使凍乾之酶/受質混合物復原以形成CELL TITER-GLO®試劑。將細胞培養盤平衡至室溫5-10分鐘。藉由在一標紙巾上輕擊且吸取來輕緩地移除細胞培養盤中之培養基。將CELL TITER-GLO®試劑(25μL)添加至各孔中。在室溫下將培養盤培育10-20分鐘，隨後讀數。使用PERKIN-ELMER® ENVISION®多標記板讀取器量測發光。藉由4參數曲線擬合使用活性基底分析此發光資料，得到細胞增殖IC50值。
此分析結果顯示，實例1-3根據其抑制PRMT5活性之能力對腫瘤細胞具有抗增殖影響。所得增殖IC50值展示於表2中：
平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差
此分析之目的為如藉由帶有外顯子5及6與僅帶有外顯子5之MDM4 mRNA的比率所量測，藉由量測測試化合物調節A375黑素瘤細胞中MDM4之PRMT5依賴型替代性拼接的能力，來展現測試化合物抑制癌細胞中之PRMT5功能的能力。
在具有生長培養基(DMEM；具有10% FBS之HYCLONETM編號SH30022；GIBCO® 10082-147或等效物)之T150燒瓶中，將A375腫瘤細胞(ATCC)-黑素瘤癌細胞株培養至70%-90%匯合。將細胞用標準胰蛋白酶/EDTA處理來處理3分鐘，且抽吸且用PBS洗滌以自培養燒瓶釋放黏附細胞。在96孔培養盤(Costar 3596)中將細胞以5000個/孔接種於生長培養基(90μL)中。在37℃及5% CO2下將培養盤培育隔夜，且用測試化合物在連續稀釋(20、6.67、2.22、0.74、0.247、0.082、0.027、0.009、0.003、0.010μM，0.2%產率之最終DMSO添加)下處理細胞72小時。相對於最大(2.0μM實例2)及最小(0.2% DMSO)對照量測活性。
在培育後第5天，自培養盤移除培養基且用冷PBS(150微升/孔)洗滌細胞兩次。藉由以1/100將DNA酶1稀釋成裂解溶液，自TAQMAN®基因表現細胞至CT套組(INVITROGENTM目錄號AM1729)來製備裂解工作試劑。將裂解工作試劑(50微升/孔)添加至細胞培養盤中，混合孔，且在室溫下培育5分鐘。將套組終止溶液(5μL)添加至各孔中，混合各孔，且在室溫下培育2分鐘。按以下體積比率製備逆轉錄酶母體混合物；62.5：31.25：6.25之RT緩衝液：無核酸酶之水：RT酶。將RT混合物(48微升/孔)添加至96孔NUNCTM培養盤(THERMO SCIENTIFICTM編號260860)之各孔中。將RT混合物(20μL)及各細胞裂解樣品(5μL)添加於384 PCR培養盤(光學透明之反應培養盤，目錄號4309849，APPLIED BIOSYSTEMS®)象限1中，且將RT混合物與細胞裂解物之第二添加物添加至象限3中。對於RT反應，密封培養盤，且隨後將其置放於設定在37℃下之熱循環儀中維持60分鐘；95℃維持5分鐘；在4℃下終止。對於qPCR，分別按10：6：1之RT混合物：H2O：外顯子探針之體積比率製備MDM4外顯子5引物(Life Technologies Hs00967240-m1)及外顯子6引物(Life Technologies Hs00967242-m1)。
將外顯子5(17μL)添加至384 PCR培養盤之奇數行中，且將外顯子6(17μL)添加至偶數行中。藉由象限衝壓將cDNA(3μL，來自RT培養盤)添加至含有17μL外顯子引物溶液之qPCR培養盤之各孔中。以此方式，對來自單RT反應之cDNA、對個別細胞裂解物之外顯子進行qPCR。將培養盤密封，旋轉，且置放於即時PCR儀器(Life Technologies ViiA7即時PCR)上。在以下分階段循環中運作TAQMAN®反應：階段1(50℃，2分鐘)，階段2(95℃，10分鐘)，階段3(95℃，15秒)，階段4(60℃，60秒)，其中階段3及4重複40個循環。
自即時PCR讀取器擷取CT資料且使用Excel範本進行以下計算，其中「CPD」為經化合物處理之樣品之值，且「DMSO」為最小對照樣品：(外顯子6 CT CPD-外顯子6 CT DMSO)-(外顯子5 CT CPD-外顯子5 CT DMSO)=△CT
2(-△CT)=倍數變化
使用Genedata軟體繪製呈倍數變化(y軸)相較於Log測試化合物濃度(x軸)形式之資料，且使用4參數對數擬合計算EC50值。
此分析表明如所藉由帶有外顯子6之所製備mRNA相較於帶有外顯子5及6之mRNA的比率指示，所有在此分析中測試之例示化合物抑制MDM4之拼接的PRMT5介導調控。
舉例而言，針對實例1、2及3調節MDM4之拼接之能力的所得EC50值展示於表3中。
平均值±SEM；SEM=平均值之標準誤差
此分析之目的為表明當PRMT5抑制劑與BCL2抑制劑ABT-199(Abbot Laboratories)組合時對AML細胞株增殖之協同抑制作用。
在第1天，在96孔分析培養盤(BD FALCON® 35-3219)中，分別以4000及10000細胞/孔(100微升/孔)培養GDM-1[ATCC®，維持在整個GDM-1分析培養基中：RPMI-1640培養基/20%加熱不活化之FBS(GIBCO®)]及EOL-1細胞[ATCC®，維持在整個EOL-1分析培養基中：RPMI-1640培養基/10%加熱不活化之FBS(GIBCO®)]。在37℃培育箱(5% CO2)中將培養盤培育18-24小時。在第2天，用分析培養基(對於GDM-1及EOL-1，如以上所指示或分別為RPMI-1640/20%加熱不活化之FBS及RPMI-1640/10% FBS)製備2.0% DMSO，且將100μL添加至製備培養盤中之行3-12中。製備10μM之於2% DMSO中之測試化合物ABT-199，及25μM之於2% DMSO中之PRMT5抑制劑實例1，且分別分配於孔A2及B2中，接著分別連續稀釋(1：3，10點)至孔A11及B11中。對於組合處理，在孔C2-C11(0.1μM)至H2-H11中，在分析培養基(對於GDM-1及EOL-1，如以上所指示或分別為RPMI-1640/20%加熱不活化之FBS及RPMI-1640/10% FBS)中，以1：2連續稀釋測試化合物實例，隨後自C2-H2(1.0μM)至C11-H11按1：3連續稀釋測試化合物ABT-199。在孔A1至H1中製備20μM於2% DMSO中之星形孢菌素(在Sigma可用)作為參考化合物。將11μL連續稀釋之化合物添加至細胞培養盤中之含100μl細胞的孔中。細胞培養盤中之最終起始濃度如下：對於單一化合物，PRMT5抑制劑實例1為2.5μM且ABT-199為1μM；對於兩種化合物之組合，PRMT5抑制劑實例1之起始濃度為0.01μM且ABT-199為0.1μM；最終DMSO濃度為0.2%。在37℃/5% CO2下將細胞培養盤培育四或七天。在第6天或第9天(對於測試分別為第四天或第
七天處理)，融化CELL TITER-GLO®(Promega編號G7571)緩衝液且在使用之前平衡至室溫。同樣，在使用之前將凍乾之CELL TITER-GLO®受質平衡至室溫。將CELL TITER-GLO®緩衝液轉移至琥珀色受質瓶中，以使凍乾之酶/受質混合物復原以形成CELL TITER-GLO®試劑。將細胞培養盤平衡至室溫5-10分鐘。將CELL TITER-GLO®試劑(100μL)添加至各孔。在室溫下將培養盤培育10-15分鐘，隨後讀取。使用PERKIN-ELMER® ENVISION®多標記板讀取器量測發光。用中等通量背分析資料，得到細胞增殖IC50值及基於Chou-Talalay分析之抑制組合指數。[Chou TC,Talalay P.Analysis of combined drug effects：a new look at a very old problem.Trends Pharmacol Sci 1983；4：450-4.]
此分析結果表明BCL2抑制劑ABT-199及PRMT5抑制劑實例1之組合對癌細胞增殖具有協同抑制作用。所得增殖絕對IC50值及組合指數值展示於表4中：
平均值±平均值之標準誤差
此分析之目的為量測測試化合物抑制小鼠腫瘤異種移植模型中A375腫瘤細胞中之經處理MDM4 mRNA的外顯子6之PRMT5介導滯溜的能力。此分析呈現測試化合物對動物模型中腫瘤中之特定PRMT5介導之拼接事件的影響。
在培育箱(5% CO2)中在37℃下，在培養基(DMEM高葡萄糖/10% Hi FBS)中使A375細胞生長18-24小時。使細胞與MATRIGEL®(1：1)混
合且將細胞(5×106/動物)皮下植入小鼠(雌性裸小鼠，Harlan)腹脅後部。經植入腫瘤細胞生長為固體腫瘤。用測徑規一週兩次量測腫瘤體積及體重。腫瘤體積達至大約200-250mm3後(植入後約20天)，將動物隨機化，且將其分成化合物處理組。藉由口服管飼投與測試化合物(調配於具有1% HEC/0.25% TWEEN® 80/0.05%消泡劑之SWFI中)。測試化合物劑量在3至100mg/kg範圍內。最後劑量(4天的給藥)後4小時處死小鼠。
收穫腫瘤組織且如下文所描述均勻化。將腫瘤樣品置放於碗中且添加1mL液體N2。在碗中擠壓腫瘤。將腫瘤之小片段(各約20mg)轉移至2個裂解基質D管(MPBIO目錄號6913-250)中。將一個管子用於RNA加工且另一者用於蛋白裂解物製備。對於RNA加工，使用Bio101 FastPrep FP120勻化器(設在6)在RNEASY®微套組(QIAGEN-74104)萃取緩衝液(各0.5mL)中使腫瘤組織均勻化30秒。用QUARTZY® RNEASY®微套組-50(QIAGEN-74104，RNEASY®微型手冊，第四版，2012年6月)純化總RNA。檢查RNA濃度以確保OD 260/280nM
1.9。對於cDNA合成，使用A&B APPLIED BIOSYSTEMS®，高容量cDNA逆轉錄套組(目錄號4368813)。在20μL含有10×RT緩衝液-2.0μL；25×dNTP混合物(100mM)-0.8μL；10×RT隨機引物-2.0μL；MULTISCRIBETM逆轉錄酶-1.0μL；無核酸酶之H2O-4.2μL的各RT反應體積中，使用1μg總RNA(10μL)。針對與高容量cDNA逆轉錄套組一起使用，使此等條件(來自APPLIED BIOSYSTEMS®之熱循環儀)最佳：步驟1-溫度25℃/時間10分鐘；步驟2-溫度37℃/時間120分鐘；步驟3-溫度85℃/時間5分鐘；步驟4溫度4℃直至進一步使用。隨後，以20μL含有10μL 2×PCR混合物、1μL探針、3μL經製備cDNA(20ng)及水(6μL)之總體積，運作TAQMAN® qPCR反應之熱循環儀程式。[來自THERMO SCIENTIFICTM之絕對藍色QPCR ROX混合物
(2×)，目錄號：AB-4139；來自APPLIED BIOSYSTEMS®之MDM4(外顯子5及外顯子6)探針，分別地目錄號：Hs00967240-m1及目錄號：Hs00967242-m1；來自APPLIED BIOSYSTEMS®之GAPDH探針，目錄號：Hs02758991-g1；來自APPLIED BIOSYSTEMS®之CDKN1A(P21)探針，目錄號：Hs02758991-g1]。在ViiA7 TAQMAN®熱循環機(APPLIED BIOSYSTEMS®)上運作樣品。
對於西方墨點法，在500μL包括完全小蛋白酶抑制劑混合液(Roche，目錄號：11 836 170 001)之套組XY裂解緩衝液中如以上所進行使腫瘤組織均勻化[此混合液含有10mg/mL抗纖維蛋白溶酶肽半硫酸鹽(Sigma目錄號L2884)；10mg/mL胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制劑(Sigma目錄號T9777)；10μg/mL TPCK(Sigma目錄號T4376)；10μg/mL抑肽酶(Sigma目錄號A1153)；60mM β甘油磷酸二鈉鹽水合物(Sigma目錄號G9891)；1% TRITONTM X-100(Sigma目錄號T9284)；25mM Tris pH~7.5(INVITROGENTM目錄號15567-027)；2.5mM二磷酸二鈉(Fluka目錄號71501)；300mM NaCl2(Mallinckrodt目錄號7581)；2mM TAME(Sigma目錄號T4626)；15mM pNPP(pNPP二鈉鹽六水合物，Sigma目錄號P4744)；5mM苯甲脒鹽酸鹽水合物(Sigma目錄號B6506)；10mM氟化鈉(Sigma目錄號S-7920)；1mM無水偏釩酸鈉(Sigma目錄號59088)；5g 1mM DTT(Sigma目錄號D9779)；15mM EDTA pH~8.0(INVITROGENTM目錄號15575020)；5mM EGTA pH~8.0(Sigma目錄號E3889)；1mM微囊藻素LR(Fisher/Axxora目錄號A350012m001)；0.25mM Pefa Bloc(Sigma目錄號76307)]。在8,000rpm下向下旋轉蛋白裂解物10分鐘，且將清液層轉移至1.5mL管子中以音波處理(振幅25%產率)15秒。再次在15,000rpm下向下旋轉裂解物10分鐘。將60μg各蛋白裂解物自清液層獲得，與SDS-PAGE樣品加
樣緩衝液[15μL蛋白裂解物；5μL 4×樣品緩衝液(Bio-Rad目錄號161-0791)；2.25μL 10×樣品還原劑(INVITROGENTM目錄號NP0004)；在100℃下使樣品沸騰10分鐘]混合，且在SDS-PAGE中使用4-20% Tris-甘胺酸凝膠-1.5mm×15孔(INVITROGENTM)運作。一旦染料前沿達至凝膠底部，終止電泳且將蛋白質自凝膠轉移至硝化纖維素膜以用以下初級抗體且用家兔抗GAPDH抗體(目錄：AB9485 Abcam)進行西方墨點法：抗MDM4純系8c6，來自Millipore之小鼠單株，目錄號04-1555；抗SmD1-me2S[小鼠單株，2.14mg/mL]。抗SmD1-me2S單株抗體在Eli Lilly處在NZB/W小鼠(傑克遜實驗室(The Jackson Laboratory))中產生。將五隻6週大之雌性小鼠用75μg結合至完全弗氏(Freund's)佐劑(參見下文)中之KLH之兩種肽的混合物皮下免疫接種。
CREAVAGR*GR*GR*GR*GR*GGPRR(SEQ ID NO：2)
REAVAGR*GR*GR*GR*GR*GGPRRC(SEQ ID NO：3)
星號指示對稱二甲基-Arg。KLH與Cys胺基酸(C)結合。引發後，小鼠每3週用50μg結合至不完全弗氏佐劑中之KLH之兩種肽的混合物皮下注射。第三次增強免疫後10天，使用眶後程序收集血液以量測血清中之抗體力價。分離來自陽性小鼠之脾細胞且使用PEG以比率(1：4)與骨髓瘤細胞株P3X63Ag8.653(ATCC® CRL-1580)融合，如由Harlow(Antibodies：a laboratory manual.Cold Spring Harbor,NY,2004)所描述。將融合細胞在96孔培養盤中接種，且在含有HAT及清液層之選擇培養基中1週後藉由ELISA測試與SmD1-me2S肽之結合。藉由ELISA用未甲基化肽及SmD3-對稱二甲基-Arg肽測試特異性。藉由連續稀釋來次選殖ELISA陽性融合瘤細胞，且藉由親和層析用以上肽抗原來純化抗體。
一旦轉移完全，用阻斷緩衝液(具有0.05% TWEEN®-20，Biorad目錄號161-0781之Odyssey阻斷緩衝液，LI-COR Biosciences目錄號
927-40000)阻斷膜，且隨後在4℃下於用阻斷緩衝液中按1：500稀釋之抗MDM4純系8c6(來自Millipore之小鼠單株，目錄號04-1555)、按1：300稀釋之抗-SmD1-me2S(自產小鼠單株，2.14mg/mL)，且用按1：1000稀釋之家兔抗GAPDH抗體(目錄：AB9485 Abcam)，來處理膜隔夜。用TBS TWEEN®洗滌膜3次(0.05%產率)，每次10-15分鐘[10×TBS(Sigma目錄號170-6435)]。隨後在室溫下用以下二級抗體以於阻斷緩衝液中之以下稀釋培育膜1.5小時：IRDye 680LT，山羊抗家兔，LICOR®目錄號926-68021，批號C10314-03，按1：6000稀釋，及IRDye 800CW，山羊抗小鼠IgG(H+L)，LICOR®目錄號926-32210，批號C10131-01，按1：6000稀釋。用TBS TWEEN®洗滌膜3×(各10分鐘)。用LICOR® ODYSSEY®成像系統使膜顯影以用於掃描，來量測偵測之西方墨點條帶強度。使用以下等式計算相對於作為最小抑制組之媒劑處理組樣品，經測試化合物處理之組之抑制百分比：%抑制=[中間條帶強度(不受抑制之對照)-中間條帶強度(測試化合物)]/[中間條帶強度(不受抑制之對照)-中間條帶強度(最大抑制對照)]*100
其中最大抑制對照樣品經選擇為來自A375腫瘤，其活體外獲自在口服投藥實例1 10mg/kg BID 4天後的帶有腫瘤之小鼠。
自劑量反應研究將ED50計算為此時為達成50%效應所必需之劑量。
對於所描述分析(小鼠A375異種移植腫瘤MDM4外顯子5/6 RNA拼接分析及小鼠A375腫瘤異種移植MDM4及SmD1-me2S西方墨點分析)，實例1、2及3之化合物在劑量
30mg/kgPO QD或BID給出後達至50%效應。此等結果表明實例1、2及3之例示化合物活體內抑制PRMT5活性，如藉由其對PRMT5受質及相關所得分子細胞生物學端點之影響所指示。
此分析之目的為在小鼠癌症模型中量測回應於測試化合物投藥之腫瘤體積的減少。
在具有10% HI FBS(GIBCO®目錄號10082-147)之DMEM/高葡萄糖(HYCLONETM目錄號SH30022)中使A375(黑素瘤)細胞生長。在具有L-麩醯胺酸及20%加熱不活化之FBS之RPMI 1640中使Will-2(DLBCL)細胞生長。在補充有L-麩醯胺酸、25mM HEPES(GIBCO® 22400-089)、1mM丙酮酸鈉及7.5% FBS之RPMI 1640培養基中使Namalwa(伯基特氏(Burkitt's)淋巴瘤)細胞(ATCC)生長。在具有L-麩醯胺酸、25mM HEPES[GIBCO 22400-089]、1mM丙酮酸鈉及10% FBS之RPMI 1640中使Molt 4細胞生長。收穫細胞且皮下注射於裸小鼠之腹脅後部上(A375：5×106細胞/動物，與MATRIGEL® 1：1混合；Will-2；1×107細胞/動物；Namalwa：2×106細胞/動物；Molt 4：5×106細胞/動物，與MATRIGEL® 1：1混合)。當確立腫瘤(植入後7-21天，大約200mm3)時，使動物隨機化，且將其分成對照及測試組。將測試化合物調配於1% HEC/0.25% TWEEN®-80/0.05%消泡劑中。藉由口服管飼投與測試化合物及媒劑。藉由處理過程期間一週兩次地進行之腫瘤體積量測(測徑規)確定腫瘤反應，且報告為相較於媒劑對照組之腫瘤體積之抑制百分比。
實例1表明所有三個異種移植腫瘤模型中之劑量依賴型抗腫瘤活性。舉例而言，在黑素瘤模型(A375)中，當在第4天給藥及第3天停藥排程以10mg/kg QD給藥持續26天時，達成64%抑制；當在同一排程以15mg/kg給藥時，達成71%抑制。在DLBCL腫瘤模型(WILL-2)中，當以2mg/kg(BID持續14天)給藥時，達成50%退化；當以5mg/kg(QD持續14天)給藥時，達成74%抑制。在淋巴瘤腫瘤模型(Namalwa)中，當以2mg/kg(BID持續14天)給藥時，達成74%抑制；當以5
mg/kg(QD持續14天)給藥時，達成61%抑制。此資料表明實例1抑制以上3個腫瘤模型中之腫瘤異種移植生長。
在急性淋巴母細胞白血病模型(Molt4)中，實例4當以60mg/kg(BID持續30天)給藥時，達成-75%抑制。此資料表明實例4抑制以上腫瘤模型中之腫瘤異種移植生長。
較佳將本發明化合物調配為經多種途徑投與之醫藥組合物。最佳地，該等組合物用於口服或靜脈內投藥。該等醫藥組合物及製備其之方法在此項技術中已為所熟知。參見例如REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(D.Troy等人編，第21版，Lippincott Williams & Wilkins,2005)。
如本文中所使用，術語「有效量」係指當向患者投與單一或多次劑量時，在診斷或治療下於患者中提供所需效應之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的量或劑量。
有效量可由主治診斷醫師(如熟習此項技術者)藉由使用已知技術且藉由觀察在類似情況下所獲得之結果容易地確定。在確定用於患者之有效量中，主治診斷醫師考慮多個因素，其包括(但不限於)：哺乳動物之種類；其大小、年齡及總體健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；涉及程度或疾病或病症之嚴重程度；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投藥模式；所投與之製劑之生物可用性特徵；所選擇之劑量方案；伴隨藥療之使用；及其他相關情況。
本發明化合物在寬劑量範圍內通常為有效的。舉例而言，劑量/天正常處於每天約0.05-1000mg範圍內。較佳地該等劑量處於每天0.1-500mg範圍內。更佳地該等劑量處於每天0.5-100mg範圍內。在一些情況下，低於前述範圍之下限之劑量可能已過量，而在其他情況下，可採用仍更大的劑量而並不導致任何有害副作用，且因此以上劑量範圍並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。將理解，實際上投與
之化合物量將由醫師，鑒於相關情況，包括待治療之病狀、選擇投藥途徑、所投與的實際化合物、年齡、重量及個體患者之反應及患者症狀嚴重程度決定。
<110> 美國禮來大藥廠
<120> 5'-經取代核苷化合物
<130> X20426
<140> 15382225.9
<141> 2015-05-04
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (26)..(26)
<223> 位置26之離胺酸經生物素標記
<400> 1
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 位置8之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 位置10之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 位置12之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (14)..(14)
<223> 位置14之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 位置16之Arg為對稱二甲基-Arg
<400> 2
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 位置7之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 位置9之Arg為對稱二甲基-Arge
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 位置11之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> 位置13之Arg為對稱二甲基-Arg
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> 位置15之Arg為對稱二甲基-Arg
<400> 3
Claims (17)
- 一種化合物，其具有下式：
- 如請求項1之化合物，其具有下式：
- 如請求項1或2之化合物，其中連接該R2取代基之對掌性碳的組態為R、S或其混合物。
- 如請求項1或2之化合物，其為
- 如請求項4之化合物，其為結晶且藉由X射線粉末繞射圖(Cu輻射，λ=1.54060Å)表徵，該X射線粉末繞射圖包含25.1°之峰，以及一或多個選自由17.0°、13.6°、20.5°、24.0°及14.5°(2θ±0.2°)組成之群的峰。
- 如請求項1或2之化合物，其為
- 如請求項1或2之化合物，其為
- 如請求項1或2之化合物，其為
- 如請求項1或2之化合物，其中R1a為氫、氯或環丙氧基。
- 如請求項1或2之化合物，其中R1b為氫或氯。
- 如請求項1或2之化合物，其中R2為氫或甲基。
- 如請求項1或2之化合物，其中R3為胺基。
- 如請求項1或2之化合物，其用做為蛋白精胺酸甲基轉移酶5(PRMT5)抑制劑。
- 如請求項1或2之化合物，其用於治療癌症。
- 如請求項14之化合物，其中該癌症係選自由以下組成之群：神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，與醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
- 一種如請求項1至12中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製備供治療癌症用之藥劑，其中該癌症係選自由以下組成之群：神經膠母細胞瘤、黑素瘤、肉瘤、胃癌、胰臟癌、膽管癌、膀胱癌、乳癌、非小細胞肺癌、包括急性骨髓白血病之白血病及淋巴瘤。
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