TWI598332B - 以高效能離心分配層析儀純化馬來酸衍生物之製造方法 - Google Patents

以高效能離心分配層析儀純化馬來酸衍生物之製造方法 Download PDF

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Description

以高效能離心分配層析儀純化馬來酸衍生物之製造方法
本發明係關於一種製造方法，特別關於一種純化馬來酸衍生物之製造方法。
薄孔菌屬(Antrodia)中，香杉芝與樟芝為台灣特有真菌，具有豐富活性的天然物成分。Nakamura等人從樟芝液態發酵菌體中分離得到五種新的馬來酸和琥珀酸衍生物(Antrodin A-E)，是液態發酵樟芝菌體中的主要活性成分，具有顯著的抗肝炎活性(Journal of Nature product，67：46-48)，其中馬來酸衍生物Antrodin C(第1圖)為菌絲體(mycelium)中主要二級代謝物之一。研究顯示Antrodin C具有良好的保肝活性，對路易士肺癌(Lewis lung carcinoma)細胞具有良好的抑制效果，也對HCV病毒具有很好的抑制活性。
在先前研究中純化Antrodin C的方法，皆必須反覆使用矽膠層析管柱。管柱層析是在直立的玻璃管柱中，裝填已經用沖提劑潤濕的吸附性固態填充物(例如矽膠)作為靜相，要分離的混合物由管柱頂端載入，再以液態沖提劑(eluent)作為流動相，利用化合物與靜相之間的吸附力及化合物與沖提劑間溶解度的差異，造成各成分物被沖提的速率不同，而達到區帶分離的目的。最後，再使用高效液相層析儀進行最終純化。
多次分離純化中，部分樣品因與膠體二氧化矽的矽醇基行二級交互作用，無法洗脫下來而損失，且純化過程需反覆使用矽膠層析管柱及高效液相層析儀，耗時且費工，因此需開發簡易及快速的純化方法。
本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終於構思出本案，能夠克服先前技術之不足，以下為本案之簡要說明。
本發明之主要目的係在於開發簡易及快速的薄孔菌屬菌絲體活性物質Antrodin C的純化方法，並減少在純化過程中的樣品流失，以降低純化Antrodin C之成本及價格。
為了開發更簡易及快速的純化方法，本發明使用高效離心分配層析儀(HPCPC)開發Antrodin C之純化條件。有別於一般的高效液態層析管柱(HPLC)，HPCPC無需固體作為靜相，所以無固體對樣品的吸附、變性、失活、拖尾等現象，而達到高的回收率，節省昂貴的靜相矽膠材料和溶劑的消耗。藉由提高極性溶劑或非極性溶劑比例的方法，可以實現流動相從弱極性到強極性(或相反)的轉變，故不需更換不同極性材質的層析管柱。由於HPCPC層析管柱容積大、無填充料、管柱內的空間幾乎全部都是有效空間，因此樣品的負載能力強，製備分離量大，再現性也較好。
因此，本發明提供一種純化Antrodin C之方法，以有機溶劑萃取薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物，並將該萃取物注入一高效離心分配層析儀，以獲得Antrodin C。
本發明另提出一種製備Antrodin C之方法。該方法包括：以 有機溶劑萃取薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物；以及以無固體靜相層析技術純化該萃取物，獲得該Antrodin C。
本發明另提出一種製備一馬來酸衍生物之方法。該方法包括：以有機溶劑萃取薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物；以及以無產物殘留技術純化該萃取物，獲得該馬來酸衍生物。
201‧‧‧有機溶劑萃取薄孔菌屬菌絲體
202‧‧‧HPCPC分離程序
第1圖為Antrodin C的結構。
第2圖為本發明純化方法的流程圖。
第3圖為Antrodin C的HPLC鑑定結果。
第4A圖為Antrodin C的核磁共振氫譜。
第4B圖為Antrodin C的核磁共振碳譜。
第5圖為傳統方式與本發明製備方法純化Antrodin C的比較圖。
本發明利用HPCPC來純化薄孔菌屬菌絲體中的活性物質Antrodin C。第2圖為本發明純化方法的流程圖。在步驟201，將薄孔菌屬菌絲體以有機溶劑萃取，獲得粗萃取物。在步驟202，將粗萃取物注入HPCPC中，進行分離程序，以獲得純化的Antrodin C，最後再以薄層層析(TLC)、高效液相層析(HPLC)及核磁共振儀(NMR)進行純度及結構確認。
在本發明中，薄孔菌屬包括白薄孔菌(A.albida)、白褐薄孔菌(A.albobrunnea)、高山薄孔菌(A.alpina)、碳薄孔菌(A.carbonica)、樟芝(A. cinnamomea)、軟薄孔菌(A.gossypina)、杜松薄孔菌(A.juniperina)、拉拉山薄孔菌(A.lalashana)、蘋果薄孔菌(A.malicola)、香薄孔菌(A.odora)、脆薄孔菌(A.oleracea)、根薄孔菌(A.radiculosa)、香杉芝(A.salmonea)、狹簷薄孔菌(A.serialis)、波狀薄孔菌(A.sinuosa)、西加薄孔菌(A.sitchensis)、髒薄孔菌(A.sordida)、紫杉薄孔菌(A.taxa)、威蘭薄孔菌(A.vaillantii)及黃薄孔菌(A.xantha)。較佳地，本文中的薄孔菌屬為樟芝(A.cinnamomea)及香杉芝(A.salmonea)。
本發明中使用的有機溶劑包括烴類、鹵代烴、醇類、酮類、醚類等。在實施例中，有機溶劑為醇類。較佳地，醇類為甲醇或乙醇。
以下為本發明的實施例及比較例
實施例1：香杉芝菌絲體萃取物的製備
將香杉芝菌絲體凍乾粉末1.2kg，加入10倍體積甲醇浸泡並震盪萃取，震盪一小時後進行抽氣過濾，收集濾液並減壓濃縮，重複以上萃取步驟共三次，取得香杉芝甲醇萃取物148.9g。雖然在本實施例中僅揭露以甲醇萃取香杉芝，但本領域具通常知識者應了解，甲醇也可以乙醇或其它合適的有機溶劑取代。
實施例2：不同比例的溶劑系統測試結果
為得出分離Antodin C的最佳條件，選擇正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水作為HPCPC的溶劑系統，並測試不同比例的溶劑的分離效果。條件測試的比例為以下四種：
(1)正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為1：1：1：1
(2)正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為2：1：2：1
(3)正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為3：1：3：1
(4)正庚烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為5：1：5：1
各比例分別取6ml，溶解香杉芝甲醇萃取物0.1g，靜置待平衡後，上層及下層液使用正相薄層層析片(N-TLC)分析，沖提比例為正己烷：乙酸乙酯(3：1，v/v)，利用UV燈偵測。結果顯示正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：水在1-5：1：1-5：1比例下，皆可達到分離純化Antrodin C的效果，其中正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：水在2：1：2：1比例下，其上層及下層液所含Antodin C濃度最為相近，能達到最好的分離純化效果。
實施例3：以HPCPC純化香杉芝Antrodin C
儀器
(1)高效離心分配層析儀(HPCPC)型號為SCPC-250-L(Armen Instrument，法國)，規格如下：內部主體由12個圓盤所構成，包含2136個管柱(channel)，管柱總容積為250ml，幫浦為四項閥250ml/min，最高耐壓為230bars，自動進樣器最大注射量為10ml，偵測器UV/Vis範圍為200-600nm，含集管收集器及Armen Glider CPC軟體。
(2)正相薄層層析(NTLC)型號為Silica gel 60 F254(Merck，德國)
(3)高效液相層析(HPLC)
管柱：COSMOSIL 5c18-MS-II 4.6*250mm
推動馬達(Pump)：Chromaster 5110(Hitachi)
二極體陣列偵測器(Diode Array Detector)：Chromaster 5430(Hitachi)
自動注射器(Auto Sampler)：Chromaster 5210(Hitachi)
(4)核磁共振儀(NMR)
Varian Unity Inova-500：(Varian Co.，USA)
純化方法
溶劑系統為正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2：1：2：1，v/v)，以上升法(Asceding mode)注入下層水相溶劑作為液體靜相，利用上述溶劑系統，進行以下步驟。
管柱準備：轉速500rpm，上層溶劑(upper)注入，流速每分鐘30ml，共10分鐘；平衡系統：轉速1600rpm，下層溶劑(lower)沖提流速每分鐘8ml，沖提15分鐘。樣品進樣：取0.5g濃縮後的香杉芝菌絲體甲醇萃取物溶於5ml甲醇，並以0.45μm濾膜過濾後的濾液注入進樣。沖提系統：轉速1600rpm，每15ml收集一管，下層溶劑(lower)沖提流速每分鐘8ml，沖提45分鐘，最終上層溶劑(upper)沖提流速每分鐘30ml，沖提12分鐘。
共收集5個部份(Fraction I~V)的成分，其中第1部分為第1-16管，第2部分為第17-20管，第3部分為第21-27管，第4部分為第28-39管，第5部分為第40-48管，並以正相TLC分析。Antrodin C在21~27管被純化出來，共獲得6mg Antrodin C，產率為1.2%。後續使用HPLC及NMR進行純度及結構確認。純化結果顯示Antrodin C純度為96%。
HPLC純化鑑定
HPLC條件
管柱為COSMOSIL 5c18-MS-II 4.6*250mm，流速為1ml/分鐘，移動相溶劑包括溶劑A：乙腈以及溶劑B：水含0.1%甲酸。梯度沖題時間與溶劑B的關係如下表1所示。
首先以標準品進行定性分析，確定Antrodin C的滯留時間，之後再對經HPCPC純化的Antrodin C進行高效液相層析。藉由與標準品的比對，得知HPCPC純化後的部分的HPLC圖譜僅有Antrodin C的吸收峰，顯示HPCPC有很好的純化效果，由HPLC結果計算出Antrodin C的純度為96%。
NMR結構分析
取HPCPC純化後的第3部分，同時溶於CDCl3溶液作為進行核磁共振光譜分析的測試溶劑。以解析度500MHz進行1H核磁共振圖譜實驗，並以解析度150MHz進行13C核磁共振圖譜實驗。由NMR氫譜及碳譜可確定13C核磁共振圖譜所對應於1H核磁共振圖譜的信號(如表2)，由表2中可確認各官能基的位置，得出第3部分中所含的化合物具有式一結構，即Antrodin C。
表2
實施例4：樟芝菌絲體萃取物的製備
將樟芝菌絲體凍乾粉末1kg，加入10倍體積甲醇浸泡並震盪萃取，震盪一小時後進行抽氣過濾，收集濾液並減壓濃縮，重複以上萃取步驟共三次，取得樟芝甲醇萃取物130g。雖然在本實施例中僅揭露以甲醇萃取樟芝，但本領域具通常知識者應了解，甲醇也可以乙醇或其它合適的有機溶劑取代。
實施例5：以HPCPC純化樟芝Antrodin C
本實施例使用的儀器與實施例3相同。
純化方法
溶劑系統為正庚烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2：1：2：1，v/v)，以上升法(Asceding mode)注入下層水相溶劑作為液體靜相，利用上述溶劑系統，進行以下步驟。
管柱準備：轉速500rpm，上層溶劑(upper)注入，流速每分鐘30ml，共10分鐘；平衡系統：轉速1600rpm，下層溶劑(lower)沖提流速每分鐘8ml，沖提15分鐘。樣品進樣：取0.5g濃縮後的樟芝菌絲體甲醇萃取物溶於5ml甲醇，並以0.45μm濾膜過濾後的濾液注入進樣。沖提系統：轉速1600rpm，每15ml收集一管，下層溶劑(lower)沖提流速每分鐘8ml，沖提45分鐘，最終上層溶劑(upper)沖提流速每分鐘30ml，沖提12分鐘。
共收集5個部份(Fraction I~V)的成分，其中第1部分為第1-16管，第2部分為第17-20管，第3部分為第21-27管，第4部分為第28-39管，第5部分為第40-48管，並以正相TLC分析。Antrodin C在21~27管被純化出來，共獲得5mg Antrodin C，產率為1%。後續使用HPLC及NMR進行結構及純度確認。純化結果顯示Antrodin C純度為95%。
本實施例後續的HPLC純化鑑定及NMR結構分析與實施例3相同。
比較例1：以傳統方式純化香杉芝Antrodin C
取40.6g濃縮後的香杉芝菌絲體甲醇萃取物，以矽膠進行劃分，可得到7.6克含有Antrodin C的分餾產物，將7.6g的分餾產物注入中壓液相層析儀(MPLC)中，可得到893mg含有Antrodin C的的次分餾產物。將893mg的次分餾產物再注入HPCPC，最後獲得98.7mg的Antrodin C。
如第5圖所示，與實驗例3相比，由甲醇萃取物中獲得Antrodin C，傳統方式的產率為0.24%，而以HPCPC純化的產率為1.2%，可見本發明的方法可有效提升Antrodin C的純化產率。除此之外，傳統的管柱層析方式往往需要更換不同的管柱，利用極性、分子量等差異來分離活性成分，但每次層析皆需要以TLC分析，常需要三個禮拜至數個月的時間，也耗費大量人力。相較之下，本發明的純化方法僅需要在HPCPC之後以TLC分析一次，所需的時間縮短至一天，提高流程效率。
透過本發明的方法，不僅克服傳統層析方式產率過低的問題，更由於本發明的方法無須固體作為靜相，所有成分皆可隨著動相及液體靜相被沖提出來，無產物殘留的缺點，減少純化過程中的樣品流失，降低了純化Antrodin C之成本及價格。
應注意的是，雖然本發明實施例僅揭露純化Antrodin C之方法，但本領域具通常知識者在參照本發明的揭露內容後，可改變Antrodin C之純化條件而推導出Antrodin A、B、D及E之純化條件，因此本發明的純化方法不限於純化Antrodin C。
實施例
1.一種純化Antrodin C之方法，包括：以一有機溶劑萃取一薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物；以及將該萃取物注入一高效離心分配層析儀(high performance centrifugal partition chromatography，HPCPC)，以獲得Antrodin C。
2.如實施例1所述之方法，其中該有機溶劑為甲醇及乙醇其中之一。
3.如實施例1或2所述之方法，其中該薄孔菌屬包括樟芝(Antrodia cinnamomea)及香杉芝(Antrodia salmonea)。
4.如實施例1-3任一項所述之方法，其中該HPCPC中使用的一溶劑系統為由正庚烷、乙酸乙酯、甲醇及水組成的一混合物。
5.如實施例1-4任一項所述之方法，其中該溶劑系統中正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：水的體積比為1-5：1：1-5：1。
6.一種製備Antrodin C之方法，包括：以一有機溶劑萃取一薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物；以及以一無固體靜相層析技術純化該萃取物，獲得該Antrodin C。
7.如實施例6所述之方法，其中該無固體靜相層析技術為一高效離心分配層析儀(high performance centrifugal partition chromatography，HPCPC)。
8.一種製備一馬來酸衍生物之方法，包括：以一有機溶劑萃取一薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物；以及以一無產物殘留技術純化該萃取物，獲得該馬來酸衍生物。
9.如實施例8所述的方法，其中該無產物殘留技術為一高效離心分配層析儀(high performance centrifugal partition chromatography，HPCPC)。
10.如實施例8或9所述的方法，其中該馬來酸衍生物為Antrodin C。
本發明時屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。
201‧‧‧有機溶劑萃取薄孔菌屬菌絲體
202‧‧‧HPCPC分離程序

Claims (5)

  1. 一種純化Antrodin C之方法，包括：以一有機溶劑萃取一薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物，其中該有機溶劑為甲醇及乙醇其中之一；以及將該萃取物注入一高效離心分配層析儀(high performance centrifugal partition chromatography，HPCPC)，以獲得Antrodin C，其中該HPCPC中使用的一溶劑系統為由正庚烷、乙酸乙酯、甲醇及水組成的一混合物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該薄孔菌屬包括樟芝(Antrodia cinnamomea)及香杉芝(Antrodia salmonea)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該溶劑系統中正庚烷：乙酸乙酯：甲醇：水的體積比為1-5：1：1-5：1。
  4. 一種製備一馬來酸衍生物之方法，包括：以一有機溶劑萃取一薄孔菌屬(Antrodia)的菌絲體，獲得一萃取物，其中該有機溶劑為甲醇及乙醇其中之一；以及以一高效離心分配層析儀(high performance centrifugal partition chromatography，HPCPC)純化該萃取物，獲得該馬來酸衍生物，其中該HPCPC中使用的一溶劑系統為由正庚烷、乙酸乙酯、甲醇及水組成的一混合物，且該馬來酸衍生物包括Antrodin A、Antrodin B、Antrodin C、Antrodin D及Antrodin E。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該馬來酸衍生物為Antrodin C。
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