KR101767337B1

KR101767337B1 - 독창적인 순수물질 추출법

Info

Publication number: KR101767337B1
Application number: KR1020160039897A
Authority: KR
Inventors: 추-밍 판; 야-웬 수
Original assignee: 선웨이 바이오테크 코., 엘티디.
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2017-08-23
Also published as: JP2016214235A; EP3093052A1; TWI568366B; KR20160134479A; US20160332091A1; TW201639478A

Abstract

본 발명은 독창적인 순수물질 추출법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 종래의 순수물질 추출법에서 관용되고 있는 유기추출액 및 컬럼 크로마토그래피를 대신하는 독창적인 순수물질 추출법을 말하며, 본 발명의 방법은 단지 에탄올 수용액을 사용하여 홍국 발효제품에서 모나신(Monascin) 및 안카플라빈(Ankaflavin)을 포함한 침전물을 추출하는 방법이고, 또한 본 발명의 방법을 통해 획득한 순수물질의 침전물은 감압농축공정을 거치지 않고도 자연스럽게 추출회수율 97.35%에 달하는 Monascin 및 추출회수율 95.16%에 달하는 Ankaflavin을 포함하고 있기 때문에 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법은 추출 속도가 빠르고 효율성이 높으며 유기용제 의 사용이 감소되는 등의 장점을 갖추고 있다.

Description

독창적인 순수물질 추출법{NOVEL PURE SUBSTANCE EXTRACTING METHOD}

본 발명은 물질의 추출과 순화 기술 영역에 관한 것으로서, 특히 홍국발효제품의 2차대사산물의 순화추출 방법에 관한 것이다.

NTU 568홍군균주(Monascus mutant, Monascus purpureus NTU 568)는 타이완 국립대학 미생물 및 생화학 연구소 판즈밍 교수와 그 연구개발팀에서 연구 개발한 우량의 타이완 본토 홍군균주이다. 본 NTU 568홍국균은 빠른 속도로 성장하고 전분 물용해 능력이 뛰어나고 2차 대사(metabolites production) 능력이 강한 특징을 가지고 있다. 또한 NTU 568홍국균의 가장 적합한 배양기는 반드시 2％의 쌀가루(rice powder)를 포함하고 있어야 하며, 또한 가장 적합한 배양 온도는 30℃, 가장 적합한 배양시간은 48 시간, 가장 적합한 배양압력은 1개 대기압이다.

본 NTU 568홍국균의 생존 능력(viability)을 테스트 하기 위해서는 NTU 568홍국균을 기울어진 튜브(slant tube) 내에서 감자한천배지(potato dextrose agar, PDA) 상으로 이전하여 15일간 배양을 한다. 이어서 PDA 상에서 3조각 1cm3의 균사체를 떼어 내어, 그 균사체를 2%의 쌀가루(rice powder)를 포함하고 있는 배양액 상에 넣는다. 이어서 약 48시간이 경과한 후, 배양액이 붉은 색을 띠게 되는데 이것이 NTU 568홍국균이 상당한 생존 능력을 가지고 있음을 입증해 주는 것이다. 또한 반드시 보충 설명을 해야할 사항은 NTU 568홍국균의 저장 방식인데, 본 NTU 568홍국균은 4℃ 의 환경 하에서 PDA배양기를 갖춘 기울어진 튜브 내에 보관해야 하며 또한 반드시 3개월마다 한 번씩 차배양을(sub-cultured)해야 한다.

근래 들어 보건식품의 활발한 발전으로 다양한 효능을 갖춘 기능성 발효 제품인 홍국이 점점 주목을 받고 있다. 아시아 지역에서는 홍국균(Monascus species)을 식생활 및 의학 상에서 응용하고 있으며, 이러한 응용법은 이미 천 년 이상의 역사를 가지고 있다. 그 중 홍국균의 주요한 2차대사 산물은 아래 4가지로 나뉠 수 있다.

(1)색소군으로는: 홍색색소(rubropunctamine、monascorubramine), 황색색소(ankaflavin、monascin), 귤색색소(rubropunctanin、monascorubrin);

(2)콜레스테롤을 낮추는 물질：예로 monacolin K；

(3)혈압을 낮추는 물질：예로 γ-아미노뷰티르산（γ-aminobutyric acid, GABA）；

(4)항산화물질로는：dimerumic acid 및 3-hydoxy-4-methoxy- benzoic acid

초기에는 모나신과 안카플라빈의 화학구조를 이해하기 위해, 연구원들이 박층 크로마토그래피 방법(Thin layer chromatography)을 사용해 홍국균사체에서 모나신와 안카플라빈을 분리해 내었으며, 이러한 초기의 박층 크로마토그래피 방법은 다음과 같은 순서로 진행되었다.

순서(S01a): 균사체를 수집해 물에 씻어 온실에서 건조 후, 가루로 제작한다.

순서(S02a): 분말이 된 균사체를 헥세인으로 추출하여 추출액 획득한다.

순서(S03a): 추출액을 농축하여 0^o 하에서 2일간 방치한다.

순서(S04a): 추출액를 여과하여 여과물 획득한다.

순서(S05a): 헥세인 및 섬유소 컬럼을 준비하여, 크로마토그래피 방법(chromatography) 으로 상기 여과물에 대해 순화를 진행한다.

순서(S06a): 20cm의 박층 크로마토그래피판(TLC, Thin Layer Chromatography) 및 전개액(25% 에테르를 포함한 벤젠)을 준비하고, 이어서 전술된 순서(S05a)에서 획득한 황색 분층 내의 안카플라빈와 모나신을 분리하고 안카플라빈분층을 긁어낸다.

순서(S07a): 다이클로로메테인과 초산에틸로 안카플라빈 분층을 추출한다.

순서(S08a): 전술된 순서(S07a)의 추출물을 건조시키고 에탄올로 그 결정을 만들어 황색 프리즘(yellow prism)을 획득하고, 그 중 각 1그램의 황색 프리즘에는 74밀리그램의 안카플라빈이 포함된다.

익히 널리 알려진 바대로, 박층 크로마토그래피 방법(Thin layer chromatography)은 미량의 순수물질에 대한 분리 순화를 진행하는데 사용되고 있으며, 대량의 순수물질에 대해서는 분리 순화를 진행할 수가 없다. 박층 크로마토그래피 방법에 대한 예를 들어보면, 반드시 동시에 20~100조각의 실리콘으로 제작된 크로마토그래피판이 있어야만 황색 분층 중에서 1그램의 안카플라빈을 분리해 낼 수 있다.

전통 박층 크로마토그래피 방법으로는 대량의 순수물질의 분리 순화 작업을 진행할 없는 문제점에 입각하여, 일종의 순수물질에서 대량으로 추출할 수 있는 방법이 문헌1로 제출되었는데, 해당 문헌1은 바로 Toshihiro et.al, “Azaphilones, Furanoisophthalides, and Amino Acids from the Extracts of Monascus pilosus-Fermented Rice (Red-Mold Rice) and Their Chemopreventive Effects”, J. Agric. Food Chem., 2005, Vol. 53, pp. 562-565이며, 해당 문헌1에 기재된 홍국 황색소 모나신와 안카플라빈의 순화 추출 방법과 순서는 다음과 같다.

순서(S01b): 12리터의 알콜(70%)로 1.5그램의 홍국미를 30분간 추출한다.

순서(S02b): 전술된 순서(S01b)의 산물을 여과하여 3리터의 알콜(70%)로 여과물을 씻어낸다.

순서(S03b): 50℃ 하에서 전술된 순서(S02b)의 여과액과 씻어낸 액에 대해 (진공)감압농축 작업을 진행한다.

순서(S04b): 전술된 순서(S03b)의 산물 내의 알코올을 제거하고 152.9그램의 제1거친추출물을 획득한다.

순서(S05b): 상기 거친추출물을 1리터의 물에 넣고 다시 0.5리터의 초산에틸로 5회의 액체-액체 추출을 진행한다.

순서(S06b): 50℃ 하에서 전술된 순서(S05b)에서 획득한 초산에틸 추출액에 대해 (진공)감압농축 작업을 진행한다.

순서(S07b): 전술된 순서(S06b)의 산물 내의 초산에틸을 제거하고 26.1 그램의 제2차 거친추출물을 획득한다.

순서(S08b): 실리콘 컬럼 및 용리용제를 준비하고, 크로마토그래피 방법 (chromatography)으로 11.9그램의 제2거친추출물에 대해 순화를 진행한다. 그 중 해당 용리용제는 11종을 사용하며, 그 내용은 각각 헥세인/초산에틸=1/0, 헥세인/초산에틸=9:1, 헥세인/초산에틸=4:1, 헥세인/초산에틸=1:1, 헥세인/초산에틸=3:7, 헥세인/초산에틸=1:9, 헥세인/초산에틸=0/1, 초산에틸/메틸알코올=9:1, 초산에틸/메틸알코올=1:1, 초산에틸/ 메틸알코올=0/1(v/v, 체적비)으로 구성된다.

순서(S09b): 전술된 순서(S08b)에서 획득한 11개의 분층(A~K) 내에서 250밀리그램의 C분층을 추출한다.

순서(S10b): 용리액을 준비하여 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 통해 2.5 mL/min의 용리액 유속으로 250밀리그램의 C분층에 정화를 진행하고, 이러한 방법으로 27 mL/min용리액에서 모나신 14밀리그램을 획득하게 되며, 40 mL/min용리액에서 안카플라빈 4밀리그램을 획득하게 된다. 그 중 상기 용리액은 메틸알코올/물/초산=75:25:3으로 구성된다.

순수물질 추출 기술에 익숙한 작업요원들은 실무 조작 과정에서 상기 문헌 중에 기록된 순화 추출 방법은 발효홍국미(Red Mold Rice) 내에서 대량의 홍국황색소를 추출해 낼 수 없음을 알 수 있을 것이다. 그 주요 원인을 살펴보면 다음과 같다. : 문헌 1의 순화 추출 방법을 통해 최종적으로 얻어지는 홍국 황색소는 18밀리그램(14밀리그램 모나신과 4밀리그램 안카플라빈)이며, 그러므로 우리는 250밀리그램의 C분층 내 단지 7.2%(18/250)의 황색소만 포함이 되어 있는 것을 알 수 있다. 즉 다시 말하면 문헌1의 순화 추출 방법의 순서(S01b)~순서(S09b)에서 사용된 기술은 황색 분층을 분리하기에 가장 적합한 기술이 아님을 알 수가 있다.

문헌1의 순화 추출 방법이 발효홍국미 내에서 모나신과 안카플라빈을 효과적으로 추출해 낼 수 없음에 입각하여, 일종의 고성능 액체크로마토그래피 방법(Liquid Chromatograph)이 문헌2로 제출되었는데, 해당 문헌2는 바로 중국 특허 제CN101255168 B호이다. 문헌2에 기재된 고성능 액체크로마토그래피 방법은 다음과 같은 순서를 포함하고 있다.

순서(S01c): 헥세인 추출액으로 10그램의 홍국미분말에서 추출액이 무색이 될 때까지 추출한다.

순서(S02c): 추출액을 수집하여 여과를 통해 여과액을 획득한다.

순서(S03c): 해당 여과액에 대해 (진공)감압농축을 진행하여 거친추출물을 획득한다.

순서(S04c): 상기 거친추출물을 메틸알코올 내에 용해시키고 50mL의 메틸알코올 용액을 획득한다.

순서(S05c): 전술된 순서(S04c)에서 획득한 메틸알코올 용액을 여과하여 샘플용액을 획득한다.

순서(S06c): 용리액을 준비하고, 고성능 액체크로마토그래피 방법(high performance liquid chromatography, HPLC)을 통해 5mL/min n의 용리액 유속으로 해당 샘플용액에 대해 순화를 진행하여 용리액을 수집한다. 그 중 상기 용리액은 메틸알코올/물=8:2로 구성된다.

비록 문헌2에서 제시한 고성능 액체크로마토그래피 방법은 순도 96. 761%의 모나신 및 순도 99. 234%의 안카플라빈을 얻을 수 있지만, 순수물질 추출 기술에 익숙한 작업요원들은 실무 작업을 통해 문헌2의 고성능 액체크로마토그래피 방법에 여전히 아래와 같은 문제점이 있음을 쉽게 알 수 있다.

매번 HPLC 공정을 진행할 때마다 80분이 걸러야 1 밀리리터의 샘플용액을 얻을 수 있기 때문에 50밀리리터의 샘플용액을 얻으려면 반드시 50회의 HPLC (총 4000분이 걸리는 과정)를 진행해야만 한다. 또한 매 80분 간의 HPLC으로 0.6밀리그램의 모나신을 획득할 수 있기 때문에 매우 비효율적이라고 할 수 있다.

문헌2의 순화 추출 방법이 발효홍국미 내에서 빠른 속도로 모나신과 안카플라빈을 추출해 낼 수 없음에 입각하여, 일종의 고속역류 크로마토그래피 방법(High Speed Counter Current Chromatograph, HSCCC)이 문선3으로 제출되었는데, 해당 문헌3은 바로 중국 특허 제CN101864191 B호이다. 문헌3에 기재된 고속역류 크로마토그래피 방법은 다음과 같은 순서를 포함하고 있다.

순서(S01d): 60°C의 수욕 상태 하에서, 메틸알코올 용액을 이용해 분말형태의 홍국미를 추출하며, 그 중 분말형태의 홍국미와 메틸알코올 용액의 고액 비율은 1:15로 한다.

순서(S02d): 전술된 순서(S01d)에서 획득한 산물에 대해 진공 농축을 진행하여 거친추출을 획득한다.

순서(S03d): 800mg의 거친추출물을 준비하여 고정상으로 용해한다.

순서(S04d): 고속역류 크로마토그래피 시스템과 용리용제(즉, 유동상)을 준비하여, 고속역류 크로마토그래피 방법(HSCCC)으로 전술된 순서(S03d)에서 획득한 산물에 대해 순화를 진행한다. 그 중 해당 용리용제는 석유 에테르/초산에틸/에탄올/물 = 2.5:7.5:5:5 (v：v：v:v)로 구성된다.

순서(S05d): 황색색소 순화조 분층을 수집하고, 이어서 85% 아세톤 용액으로 해당 황색색소 순화조 분층을 용해한다.

순서(S06d): 60°C 하에서, 전술된 순서(S07d)의 산물에 대해 과포화가 될 때까지 진공 농축을 진행하고, 이어서 온도를 천천히 15°C까지 내리면 모나신과 안카플라빈결정체를 획득할 수 있게 된다.

그러나 순수물질 추출 기술에 익숙한 작업요원들은 실무 작업을 통해 문헌3의 HSCCC 방법에 여전히 아래와 같은 문제점이 있음을 쉽게 알 수 있다.

(1) HSCCC는 동시에 여러 종류의 용제를 사용해 800 mg홍국 추출물에 대해 단일 처리를 해야 하는데, 그 중 800 mg홍국 추출물은 약 12 그램의 홍국미에서 추출해 얻은 양이다.

(2) 또한 기존의 HSCCC 설비는 48그램(=12그램x4)의 홍국미 분말에 대해 추출을 진행할 때, 역시 133분이라는 시간이 걸리며 이는 결국 생산량 부족의 문제에 부딪히게 된다. 또 다른 하나는 기존의 HSCCC 설비 가격이 매우 비싼 편이며, 그 판매 가격이 타이완 달러 1400만원에 달한다.

그러므로 종래에 널리 사용되는 순수물질 추출 방법, 액상 크로마토그래피 방법, 고속역류 크로마토그래피 방법 들은 실제 응용 상에서 여전히 많은 결점을 가지고 있으며, 이에 본 발명인은 다년간의 노력과 연구를 통해 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법을 발명해 내게 되었고, 본 독창적인 순수물질 추출법은 홍국발효제품 내에서 추출 작업을 통해 최소한 한 종의 2차대사산물을 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

상술된 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 주요 목적 종래의 순수물질 추출법과 다른 독창적인 순수물질 추출법을 제공하는 데 있다. 종래의 유기추출액 및 컬럼 크로마토그래피을 대체하여 본 발명에서 사용한 방법은 에탄올 수용액만을 사용하여 홍국발효제품 내에서 모나신(Monascin)과 안카플라빈(Ankaflavin)을 함유한 침전물을 획득하게 되며, 그 결과 추출속도가 빨라지고 사용되는 유기용제의 양이 감소되는 장점을 가지고 있다. 또한 본 발명의 방법을 통해 획득한 침전물은 감압농축공정을 거치지 않고도 자연스럽게 추출 회수율이 97.35%에 달하는 모나신과 추출 회수율이 95.16%에 달하는 안카플라빈를 얻을 수 있다.

그러므로 본 발명의 주요 목적을 달성하기 위해 본 발명인은 독창적인 순수물질 추출법을 제시하며, 본 추출법은 홍국발효제품 내에서 최소한 1종의 2차대사산물을 추출하기에 적합하다. 본 독창적인 순수물질 추출법은 다음과 같은 순서를 포함하고 있다.

(1) 특정 중량의 홍국발효제품을 준비하고，제1체적의 추출액으로 제1온도 하에서 홍국발효제품에 대해 추출을 진행하며, 제1추출시간을 경과시킨다.

(2) 전술된 순서 (1)의 제1추출액을 수집하여 여과를 시키며, 이어서 제1여과 추출액 및 1차 추출을 끝낸 홍국발효제품을 획득한다.

(3) 제2체적의 추출액으로 제1온도 하에서 1차 추출이 끝난 홍국발효제품에 대해 다시 한 번 추출을 진행하며, 제2추출시간을 경과 시킨다.

(4) 전술된 순서(3)의 제2추출액을 수집하여 여과시키며, 이어서 제2여과 추출액을 얻는다.

(5) 이어서 제1여과 추출액과 제2여과 추출액을 수집하여 하나의 순수물질로 처리를 진행한다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 순서(5)의 과정은 다음과 같은 세부 순서를 포함하게 된다.

(51) 해당 제1여과 추출액과 해당 제2여과 추출액을 혼합하여 혼합추출액을 획득하고 해당 혼합추출액을 끈적한 상태가 되도록 농축시킨다.

(52) 제3체적의 용제를 해당 혼합추출액 내에 넣고 샘플용액을 획득한다.

(53) 제2온도의 수욕 하에서 해당 샘플용액을 골고루 교반하고, 제1교반 시간을 경과시킨다.

(54) 이어서 제4체적의 물을 해당 샘플용액에 넣고 다시 샘플용액을 교반하면서 제2교반시간을 경과시킨다.

(55) 회전속도 2000 rpm/min으로 전술된 순서(54)에서 획득한 샘플용액에 대해 원심 분리 과정을 진행하며, 제1원심 분리 시간을 경과시킨다.

(56) 원심 분리 과정을 끝낸 후, 이어서 해당 순수물질의 침전물을 수집한다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 홍국발효제품의 특정 중량은 최소한 60그램 이상이며, 또한 상술된 홍국발효제품은 다음 제품 중 하나를 사용하는 것이 좋다. : 홍국미와 홍국산약 중 하나의 제품 사용.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 제1추출액과 해당 제2추출액은 농도가 95%인 에탄올이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 제1체적과 제2체적은 250밀리리터에서 320밀리리터 사이가 좋으며, 해당 제4체적은 8~12밀리리터가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 제1온도는 50℃와 65℃사이가 좋으며, 또한 해당 제2온도는 55℃와 75℃사이가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 제1추출시간은 1~3시간이 좋으며, 또한 해당 제2추출시간은 1~3시간이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 용제는 농도가 95%인 에탄올이 좋으며, 또한 해당 용제의 제3체적은 8~12밀리리터가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 제1교반시간은 3~7분이 좋고, 또한 해당 제2교반시간은 3~7분이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 각 그램 당 해당 침전물은 최소한 22.5밀리그램의 모나신와 최소한 16.83그램의 안카플라빈을 포함하는 것이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 해당 침전물이 해당 샘플용액에서 차지하는 비율의 중량 백분율은 최소한 25%가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 모나신의 추출 회수율은 최소한 97.35%이고, 또한 안카플라빈의 추출 회수율은 최소한 95.16%인 것이 좋다.

또한 본 발명의 주요 목적을 달성하기 위해 본 발명인은 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예를 제시하며, 해당 실시예는 다음과 같은 순서를 포함하고 있다.

(1') 특정 중량의 홍국발효제품을 준비하고，제1체적의 추출액으로 제1온도 하에서 홍국발효제품에 대해 추출을 진행하며, 제1추출시간을 경과시킨다.

(2') 전술된 순서(1')의 제1추출액을 수집하여 여과를 시키며, 이어서 제1여과 추출액 및 1차 추출을 끝낸 홍국발효제품을 획득한다.

(3') 제2체적의 추출액으로 제1온도 하에서 1차 추출이 끝난 홍국발효제품에 대해 다시 한 번 추출을 진행하며, 제2추출시간을 경과 시킨다.

(4’) 전술된 순서(3’)의 제2추출액을 수집하여 여과시키며, 이어서 제2여과 추출액을 얻는다.

(5’) 이어서 제1여과 추출액과 제2여과 추출액을 수집하여 하나의 순수물질로 처리를 진행한다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법 중, 비교적 바람직한 순서(5’)의 과정은 다음과 같은 세부 순서를 포함하게 된다.

(51’) 해당 제1여과 추출액과 해당 제2여과 추출액을 혼합하여 혼합추출액을 획득한다.

(52’) 해당 혼합추출액을 제3의 체적이 될 때까지 농축시키고, 다시 제4 체적의 물을 해당 혼합추출액에 넣어 제1 샘플용액을 획득한다.

(53’) 회전속도 2000 rpm/min으로 전술된 순서(52’)，52’에서 획득한 제1샘플용액에 대해 원심 분리 과정을 진행하며, 제1원심 분리 시간을 경과시킨다.

(54’) 원심 분리 과정을 끝낸 후, 이어서 제1 침전물을 수집한다.

(55’) 해당 제1침전물을 제5체적의 용제에 넣어 제2샘플용액을 획득한다.

(56’) 제2온도의 수욕 하에서 해당 제2 샘플용액을 교반하면서 제1교반시간을 경과시킨다.

(57’) 이어서 제6 체적의 물을 해당 제2샘플용액에 넣고, 다시 제2샘플용액을 교반하면서 제2교반시간을 경과시킨다.

(58’) 회전속도 2000 rpm/min으로 전술된 순서(57’)，57’에서 획득한 제2샘플용액에 대해 원심 분리 과정을 진행하며, 제2원심 분리 시간을 경과시킨다.

(59’) 원심 분리 과정을 끝낸 후, 이어서 제2 침전물, 즉 순수물질을 수집한다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 홍국발효제품의 특정 중량은 최소한 20킬로그램 이상이며, 또한 상술된 홍국발효제품은 다음 제품 중 하나를 사용하는 것이 좋다. : 홍국미와 홍국산약 중 하나의 제품 사용.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 추출액은 농도가 95%인 에탄올이고, 또한 해당 제1체적과 해당 제2체적은 최소한 60리터 이상이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 제1온도는 50℃와 65℃사이가 좋으며, 또한 해당 제2온도는 55℃와 75℃사이가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 제1추출시간은 1~3시간이 좋으며, 또한 해당 제2추출시간은 1~3시간이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 제3체적은 최소한 4리터 이상이고, 해당 제4체적은 최소한 4리터 이상이며, 또한 해당 제6체적은 1.5~2.5리터가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 제1원심 분리 시간은 8~12분이고, 해당 제2원심 분리 시간은 8~12분이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 용제는 농도가 95%인 에탄올이고, 해당 제5 체적은 1~2리터가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 제1교반시간은 10~20분이고, 해당 제2교반시간은 3~7분이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 각 그램당 침전물은 최소한 22.5밀리그램의 모나신과 최소한 16.83밀리그램의 안카플라빈을 포함하는 것이 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 해당 침전물이 해당 샘플용액에서 차지하는 비율의 중량 백분율은 최소한 25%가 좋다.

상술된 독창적인 순수물질 추출법의 또 다른 하나의 실시예 중에서 비교적 바람직한 모나신의 추출 회수율은 최소한 97.35%이고, 또한 안카플라빈의 추출 회수율은 최소한 95.16%인 것이 좋다.

도1a와 도1b는 본 발명에서 제시하는 독창적인 순수물질 추출법의 제1실시예의 순서를 나타낸 흐름도이다.
도2a와 도2b는 본 발명에서 제시하는 독창적인 순수물질 추출법의 제2실시예의 순서를 나타낸 흐름도이다.

실시방식

본 발명인 독창적인 순수물질 추출법에 관한 이해를 돕기 위해 도식과 함께 본 발명의 비교적 우수한 실시예에 대해 설명을 해보면 다음과 같다.

도1a와 도1b는 본 발명에서 제시하는 독창적인 순수물질 추출법의 제1실시예의 순서 흐름도이다. 도1a와 도 1b에 나타난 바와 같이, 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법의 제1실시예는 다음과 같은 순서를 포함하고 있다.

순서(S01): 60그램의 발효홍국미를 준비하고, 300밀리리터의 에탄올(95%)을 추출액으로 사용하여, 60℃ 하에서 발효홍국미에 대해 추출을 진행하며, 2시간을 경과시킨다.

순서(S02): 전술된 순서(S01)의 제1추출액을 수집해서 여과를 진행하여, 제1여과 추출액과 1차 추출을 끝낸 발효홍국미를 획득한다.

순서(S03): 300밀리리터의 에탄올(95%)을 추출액으로 사용하여 60℃ 하에서 해당 발효홍국미에 대해 다시 한 번 추출을 진행하며, 2시간을 경과시킨다.

순서(S04): 전술된 순서(S03)의 제2추출액을 수집해서 여과를 진행하여, 제2여과 추출액을 획득한다.

순서(S05): 상기 제1여과 추출액과 제2여과 추출액을 혼합하여 혼합추출액을 획득하고 해당 혼합추출액을 끈적한 상태가 되도록 농축시킨다.

순서(S06): 10mL의 에탄올(95%)을 해당 혼합추출액에 넣고 샘플용액을 획득한다.

순서(S07): 60℃의 수욕(water bath) 하에서 해당 샘플용액을 5분간 교반하고, 이어서 10mL의 물을 해당 샘플용액에 넣은 후, 다시 해당 샘플용액을 5분간 교반한다.

순서(S08): 회전속도 2000 rpm/min으로 전술된 순서(S07)에서 획득한 샘플용액에 대해 10분간의 원심 분리 과정을 진행하여 침전물을 수집한다.

여기서 반드시 보충 설명을 해야하는 부분은 비록 순서(S01) 상에서 에탄올을 사용해 발효홍국미에 대해 추출을 진행하였지만, 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법은 이를 이용해 홍국발효제품 내에서 순수물질을 추출하는 것이기 때문에 순서(S01)에서 에탄올을 사용해 홍국산약에 대해서 추출 작업을 진행해도 무방하다. 또한 순서(S01)의 설명에서 사용한 발효홍국미가 60그램이기는 하지만 본 발명 신청 범위는 이에 국한되지 않는다. 또한 본 발명은 순서(S01)과 순서(S03)에서 사용된 에탄올추출액의 체적이 반드시 300밀리리터로 국한 되지도 않으며, 실무 작업 하에서 해당 추출액의 체적은 250밀리리터에서 320밀리리터 사이면 된다. 또한 추출온도(30℃) 역시 상황에 따라 50℃에서 65℃ 사이로 조절이 가능하며, 60℃의 수욕 온도 역시 상황에 따라 55℃에서 75℃사이로 조절이 가능하다.

또한 특별히 강조를 해야할 내용은 순서(S06)에서 서술된 에탄올 용제의 체적(즉，10밀리리터) 및 순서(S07)에서 서술된 물 체적(즉，10밀리리터)는 반드시 적합하게 배합이 되어야 하며, 해당 두 종류의 체적의 크기는 침전물이 샘플용액에서 차지하는 백분비율 및 홍국황색소(안카플라빈과 모나신)의 추출회수율에 영향을 미치게 된다. 아래 표는 서로 다른 에탄올 용체 체적과 물 체적이 침전물 중량과 홍국황색소 추출회수율에 미치는 차이를 정리한 내용이다.

	조건1	조건2	조건3	조건4
에탄올 체적(mL)	10	8	7	6
물 체적 (mL)	10	12	13	14
모나신 추출회수율 (%)	97.99	99.8	98.51	97.35
안카플라빈 추출회수율 (%)	98.03	99.79	97.54	95.16
침전물이 추출물에서 차지하는 중량 ( %)	37.23	43.24	25.57	27.97
잡물질이 추출물에서 차지하는 중량 (%)	62.77	66.76	74.43	72.03

표1의 내용을 참조해 보면, 순서(S05)에서 서술된 에탄올 체적 및 순서(S06)에서 서술된 물 체적을 8밀리리터 및 12밀리리터고 적합하게 배합하면, 획득되는 침전물이 최대 중량의 백분 비율(43.24%)을 나타내고, 또한 이와 동시에 홍국황색소 안카플라빈과 모나신의 추출회수율 역시 최고인 99.8%와 99.79%를 나타내는 것을 알 수 있다.

전술된 제1실시예의 추출방법은 실험실 레벨의 추출방법이며, 실무 상에서는 에탄올 수용액을 추출액으로 사용해야만 홍국발효제품의 2차대사산물 내에서 모나신과 안카플라빈을 획득할 수 있다. 계속해서 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법의 제2실시예를 설명해 보면, 본 내용은 양산 과정 레벨의 추출 방법을 설명한 것이다. 도2a와 도2b는 본 발명에서 제시하는 독창적인 순수물질 추출법의 제2실시예의 순서를 나타낸 흐름도이다. 도2a와 도2b에 나타난 바와 같이, 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법의 제2실시예는 다음과 같은 순서를 포함하고 있다.

순서(S01'): 20킬로그램의 발효홍국미를 준비하고, 60리터의 에탄올(95%)을 추출액으로 사용하여, 60℃ 하에서 발효홍국미에 대해 추출을 진행하며, 2시간을 경과시킨다.

순서(S02'): 전술된 순서(S01')의 제1추출액을 수집해서 여과를 진행하여, 제1여과 추출액과 1차 추출을 끝낸 발효홍국미를 획득한다.

순서(S03'): 60리터의 에탄올(95%)을 추출액으로 사용하여 60℃ 하에서 해당 발효홍국미에 대해 다시 한 번 추출을 진행하며, 2시간을 경과시킨다.

순서(S04’): 전술된 순서(S03’)의 제2추출액을 수집해서 여과를 진행하여, 제2여과 추출액을 획득한다.

순서(S05’): 해당 제1여과 추출액과 해당 제2여과 추출액을 혼합하여 혼합추출액을 획득한다.

순서(S06’): 해당 혼합추출액을 4리터로 농축한 후, 다시 4리터의 물을 해당 혼합추출액에 넣고 제1샘플용액을 획득한다.

순서(S07’): 회전속도 2000 rpm/min으로 전술된 순서(S06’)에서 획득한 샘플용액에 대해 10분간의 원심 분리 과정을 진행하여 제1침전물을 수집한다.

순서(S08’): 해당 제1침전물을 1.5리터의 에탄올(95%)에 용해하여 제2샘플용액을 획득한다.

순서(S09’): 60℃의 수욕(water bath) 하에서 해당 제2 샘플용액을 15분간 교반하고, 이어서 2리터의 물을 해당 제2샘플용액에 넣은 후, 다시 해당 제2샘플용액을 5분간 교반한다.

순서(S10’): 회전속도 2000 rpm/min으로 전술된 순서(S09’)에서 획득한 제2 샘플용액에 대해 10분간의 원심 분리 과정을 진행하여 제2 침전물을 수집한다. 그 중 해당 제2침전물 내에는 추출회수율이 98.59%에 달하는 모나신과 추출회수율이 98.51%에 달하는 안카플라빈이 포함되어 있다.

상술된 순서 순서(S10’)에서 획득한 제2침전물이 확실하게 모나신과 안카플라빈을 포함하고 있음을 입증하기 위해 우리는 더 아나가 아래의 순수물질 분리 순서를 통해 제2침전물 내의 모나신과 안카플라빈을 분리해 낼 수 있다.

순서(S11’): 건조된 제2침전물, 총 662그램과 용리액을 준비하고, 이어서 중압 액체 크로마토그래피 방법(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC)을 이용해 해당 제2침전물에 대해 순화를 진행한다. 그 중 서술된 용리용제는 5종이며, 각각 헥세인/초산에틸=1/0, 헥세인/초산에틸=9:1, 헥세인/초산에틸=8:2, 헥세인/초산에틸=7:3, 헥세인/초산에틸=6:4(v/v, 체적비)가 된다.

순서(S12’): 전술된 순서(S11’)에서 획득한 5개의 분층 내에서 황색소분층을 추출해 낸다.

순서(S13’): 해당 황색소분층에 대해 (진공)감압농축을 진행하여 건조 샘플을 획득한다.

순서(S14’): 1그램의 건조 샘플을 50밀리리터의 메틸알코올에 용해 시키고, 고성능 액체크로마토그래피 방법(high performance liquid chromatography, HPLC)을 이용해 15 mL/min의 용리액을 해당 메틸알코올 용액에 유속시켜 순화를 진행한다. 이러한 방식으로 13.51 mL/min 용리액에서 모나신 22.5밀리그램(순도=99.1%)를 수집할 수 있고, 18.78 mL/min용리액에서 안카플라빈 16.83밀리그램(순도=99.0%)를 수집할 있다. 그 중 서술된 용리액은 메틸알코올/물=87:13으로 구성된다.

이러한 방식으로 전술된 순서(S11’)~순서(S14’)을 통해 상기 순서(S10’)에서 획득한 제2침전물 내에 고순도의 모나신과 안카플라빈이 포함되어 있음을 입증할 수 있고, 또한 서술된 제2침전물은 중압 액체 크로마토그래피 방법을 거친 후, 크로마토그래피를 통해 획득한 황색소 분층에 최소한 57.5%의 모나신과 안카플라빈을 포함하고 있다. 여기서 잘 알 수 있듯이, 만약 기존형 HPLC설비를 이용해 황색소분층의 모나신과 안카플라빈을 분리해 내면, 즉 매번 분리작업(약 20분)을 통해 22.5밀리그램의 모나신과 16.83밀리그램의 안카플라빈을 획득할 수 있게 되는 것이다.

상술한 내용은 또한 본 발명의 구체적인 실시예로 결코 이에 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 신청범위 내에서 가한 어떠한 첨가나 수정도 본 발명의 범위에 속함을 밝혀둔다.

상술된 내용에서 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법의 상세한 순서와 기술 특징을 설명하였으며, 이러한 설명을 통해 보면 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법은 다음과 같은 장점과 효과를 얻을 수 있다.

(1) 종래의 순수물질 추출법과는 달리 본 발명인 독창적인 순수물질 추출법은 에탄올 수용액으로 종래의 추출액과 컬럼 크로마토그래피를 대체하였으며, 그로 인해 빠른 추출 속도와 사용 유기 용제 감소라는 장점을 얻을 수 있다.

(2) 또한 본 발명의 방법을 통해 획득한 침전물은 감압농축공정을 거치지 않고도 자연스럽게 추출회수율이 97.35%에 달하는 모나신과 추출회수율이 95.16%에 달하는 안카플라빈을 획득할 수 있다.

(3)또한 종래의 고속역류 크로마토그래피 방법과는 달리, 본 발명의 방법을 통해 획득한 침전물은 기존형 HPLC 설비를 통해서 매 회 분리 과정(매 회20분)을 통해서 22.5밀리그램의 모나신 및 16.83밀리그램의 안카플라빈을 획득할 수 있으며, 이를 통해 보면 본 발명은 원가를 낮추고 생산량을 늘릴 수 있는 장점을 가지고 있다.

S01~S04, S05~S08, S01’~S05’, S06’~S10’ : 방법 순서

Claims

홍국발효제품 유래 모나신 및 안카플라빈을 포함하는 2차 대사산물 추출에 사용되는 순수물질 추출법으로서, 상기 순수물질 추출법은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법:
(1) 60g의 홍국발효제품을 제공하고，그 후 300mL 에탄올을 이용하여 60℃ 하 2시간 동안 홍국발효제품을 추출한다;
(2) 전술된 순서 (1)로부터 얻어진 제1추출액을 수집하여 여과를 시켜, 제1여과 추출액 및 1차 추출을 끝낸 홍국발효제품을 획득한다;
(3) 300mL 에탄올을 이용하여 60℃ 하에서 2시간 동안 상기 1차 추출이 끝난 홍국발효제품에 대해 다시 한 번 추출을 진행한다;
(4) 전술된 순서 (3)으로부터 얻어진 제2추출액을 수집하여 여과시켜, 제2여과 추출액을 획득한다;
(51) 상기 제1여과 추출액과 상기 제2여과 추출액을 혼합하여 혼합추출액을 획득하고, 상기 혼합추출액을 농축시킨다;
(52) 10 mL 에탄올을 사용하여 상기 농축한 혼합추출액을 용해시켜 샘플 용액을 수득한다;
(53) 60 ℃에서 수욕법(water bath)을 이용하여 5분 동안 상기 샘플용액을 교반한다;
(54) 상기 샘플용액에 10-mL 물을 첨가한 다음, 상기 샘플용액을 5분 동안 교반한다;
(55) 상기 (54) 단계에서 얻은 샘플용액을 2000rpm/분으로 10분간 원심분리를 수행한다;
(56) 침전물을 수집한다, 이 때, 상기 침전물은 샘플용액의 25%의 중량비를 차지하고, 상기 침전물의 1g은 적어도 22.5mg의 모나신(monascin) 및 16.83mg 이상의 안카플라빈(ankaflavin)을 함유한다.
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제1항에 있어서, 상기 홍국발효제품은 분말화된 홍국미 또는 홍국산약인 추출법.
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홍국발효제품 유래 모나신 및 안카플라빈을 포함하는 2차 대사산물 추출에 사용되는 순수물질 추출법으로서, 상기 순수물질 추출법은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법:
(1') 20kg의 홍국발효제품을 제공하고，그 후 60L 에탄올을 이용하여 60℃ 하 2시간 동안 홍국발효제품을 추출한다;
(2') 전술된 순서 (1')로부터 얻어진 제1추출액을 수집하여 여과를 시켜, 제1여과 추출액 및 1차 추출을 끝낸 홍국발효제품을 획득한다;
(3') 60L 에탄올을 이용하여 60℃ 하에서 2시간 동안 상기 1차 추출이 끝난 홍국발효제품에 대해 다시 한 번 추출을 진행한다;
(4') 전술된 순서 (3')로부터 얻어진 제2추출액을 수집하여 여과시켜, 제2여과 추출액을 획득한다;
(51') 상기 제1여과 추출액과 상기 제2여과 추출액을 혼합하여 혼합추출액을 획득한다;
(52') 상기 혼합추출액의 체적이 4L까지 감소되도록 농축시키고, 다시 상기 농축된 혼합추출액에 4L의 물을 첨가하여 제1 샘플용액을 획득한다.
(53') 회전속도 2000 rpm/min으로 10분동안 상기 (52’)에서 획득한 제1샘플용액에 대해 원심분리를 진행한다;
(54') 제1침전물을 수집한다;;
(55') 상기 제1침전물을 1.5L의 에탄올에서 용해시켜 제2 샘플용액을 획득한다;
(56') 60℃ 하에서 수욕법을 이용하여 10분동안 상기 제2 샘플용액을 교반한다;
(57')상기 제2 샘플용액에 2L의 물을 첨가하고, 상기 제2 샘플용액을 5분동안 교반한다;
(58')회전속도 2000 rpm/min으로 10분동안 상기 (57’)에서 획득한 제2 샘플용액에 대해 원심분리를 진행한다;
(59') 제2 침전물을 수집한다, 이 때, 상기 제2 침전물은 제2 샘플용액의 25%의 중량비를 차지하고, 상기 제2 침전물의 1g은 적어도 22.5mg의 모나신(monascin) 및 16.83mg 이상의 안카플라빈(ankaflavin)을 함유한다.
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제13항에 있어서, 상기 홍국발효제품은 분말화된 홍국미 또는 홍국산약인 추출법.
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