TWI532488B - 用於治療慢性腎炎之醫藥組合物 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種製備冬蟲夏草發酵液的方法;本發明另關於一種用於治療慢性腎炎之醫藥組合物,其包含一有效劑量之冬蟲夏草發酵液。
傳統中藥材「冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)」係指由冬蟲夏草菌寄生於蝙蝠蛾之幼蟲,所長出的子實體與幼蟲蟲體複合體,然而自然界由真菌寄生昆蟲幼蟲形成的菌蟲複合體目前已發現有數十種;近年來,透過分子生物學的研究,利用DNA序列確定Hirsutella sinensis為冬蟲夏草之無性世代,即菌絲體的菌種。自古以來應用於『補腎益肺』等,現代臨床研究更顯示冬蟲夏草具多方面健康功效,主要可應用於慢性腎功能衰竭、免疫功能低下、急慢性肝炎、心腦血液循環功能保護、肺炎、肺結核、哮喘、腫瘤輔助治療及糖尿病改善等;但由於其生長環境嚴苛、藥源緊缺、真偽難辨、價格昂貴、且過度採集也使得生態資源遭受破壞,因此若能以人工培養方式培養出與野生種相似的冬蟲夏草,可望滿足市場上的需求、減少生態破壞。
本發明選用衛生署公告之中華被毛孢無性世代(Hirsutella sinensis)菌株輔以深層液態培養技術,培養出與天然野生冬蟲夏草活性成分及功效極為相似之冬蟲夏草菌絲體。
本發明培養之冬蟲夏草透過菌種鑑定平台、化學分析鑑定平台及生物活性評估平台,確保品質穩定安全、活性成份定性定量,並具一定成效之
調節作用。實驗結果顯示本發明培養之冬蟲夏草經DNA序列比對與天然冬蟲夏草之無性世代中華被毛孢(Hirsutella sinensis)相似度高達99.82%、HPLC指紋圖譜亦與野生冬蟲夏草相吻合,並於細胞生物活性實驗中明確發現具抑制發炎、抑制HBV病毒、抑制肝癌細胞存活,及抑制動脈硬化發生率等功效。本發明另在5/6腎臟切除引發慢性腎發炎動物模式下,發現可顯著改善慢性腎炎動物之血中尿素氮、血清肌酸酐、尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值及24小時尿蛋白濃度等指標,而有益於健康之調節作用。
本發明提供一種製備冬蟲夏草發酵液的方法,包含:(a)以冬蟲夏草之無性世代中華被毛孢(Hirsutella sinensis)進行液態發酵;及(b)分離出冬蟲夏草發酵液,並經膜過濾濃縮得到濃縮的冬蟲夏草發酵液。在一較佳實施例中,膜過濾係於低溫下進行。在另一較佳實施例中,該方法另包含冷凍乾燥該濃縮的冬蟲夏草發酵液。
本發明亦提供一種用於治療慢性腎炎之醫藥組合物,其包含一有效劑量之冬蟲夏草發酵液,其中該冬蟲夏草發酵液係由前述製備冬蟲夏草發酵液的方法製備而得。本發明之冬蟲夏草發酵液可降低血中尿素氮及血清肌酸酐、降低尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值並可減緩24小時尿蛋白濃度攀升。在一較佳實施例中,冬蟲夏草發酵液為凍乾粉之型式。
冬蟲夏草經深層液態發酵培養後分離得到冬蟲夏草發酵液,冬蟲夏草發酵液經低溫膜過濾濃縮,並將濃縮液冷凍乾燥以得到冬蟲夏草發酵液凍乾粉,製備過程如圖1所示。
冬蟲夏草發酵液凍乾粉於試驗期間內皆保存於-80C冰箱中,每日投藥前始取出以生理食鹽水溶解後進行試驗。冬蟲夏草發酵液凍乾粉之每日口服給藥濃度為100 mg/大鼠,溶媒體積為10 mL/kg。
15毫升及50毫升離心管(Coming,USA)、離心機(ALC PK131R,Italy)、1.5毫升微量離心管(SSI,USA)、1毫升及6毫升注射針筒(Terumo,Philippine)、Kodak Ektachem分析儀(Eastman Kodak Co.,USA)、Bio-Rad蛋白質檢測套組(Bio-Rad Laboratories,Ltd.,U.K.)、LabAssayTM肌酸酐套組(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Japan)。
本試驗使用六週齡之雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠(購自樂斯科生物科技股份有限公司),於試驗前預先經一週之檢疫及馴化。試驗進行期間,動物皆飼養於財團法人生物技術開發中心之大湖區研發用動物房,以一籠一隻、自由飲食飲水之方式飼養。環境溫度維持於23±1℃及12小時亮-12小時暗的亮暗周期。所有動物照護及試驗皆遵循財團法人生物技術開發中心之實驗動物照護委員會規定及批准。試驗結束日犧牲動物後摘取腎臟進行後續組織病理切片分析。
經檢疫後的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,於試驗分組前進行兩階段式5/6腎切除手術,於第二階段術後一週選取手術成功者進入後續試驗,分組方式為以每組二隻老鼠之方式隨機分成三組:(一)手術對照組(Sham group):開腹後未切除腎臟、(二)腎炎對照組(vehicle control group):手術切除腎臟產生慢性腎炎後以溶媒治療、(三)冬蟲夏草發酵液凍乾粉治療
組:手術切除腎臟產生慢性腎炎後以冬蟲夏草發酵液凍乾粉(100 mg/大鼠,每日口服給予)治療。
分組後,於七週的試驗期間內每日以口服給予之方式投予給各組動物試驗藥物,並每週持續監控動物體重、血中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酸酐(creatinine),及收取24小時尿液,追蹤24小時尿液體積、24小時尿蛋白、尿液中蛋白質與肌酸酐比值等腎功能指標;於試驗結束日犧牲動物後摘取腎臟進行後續組織病理切片分析。
血中尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)是以Kodak Ektachem分析儀(Eastman Kodak Co.,USA)進行偵測分析。尿蛋白濃度是以Bio-Rad蛋白質檢測套組(Bio-Rad Laboratories,Ltd.,U.K.)偵測組進行定量分析。血清及尿液中肌酸酐濃度則是以LabAssayTM肌酸酐套組(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.,Japan)進行定量。
試驗設計內容如表1所示。
實驗數據以平均值±標準誤(mean±SEM(Standard Error of the Mean))方式呈現,並以單向ANOVA方式計算,P值(P value)<0.05表示有顯著差異。
試驗期間於每週試驗動物體重追蹤記錄(圖2、表2)中,各組別於試驗期間之體重呈現穩定上升之現象;雖然冬蟲夏草發酵液凍乾粉組手術期間(第零天至第十四天)之體重呈現生長停滯之狀態,但手術期過後即呈現穩定上升之體重生長曲線。此結果顯示冬蟲夏草發酵液凍乾粉對慢性腎炎動物之體重生長曲現並無明顯毒性影響。
圖3及表3為每週試驗動物血中尿素氮(BUN)濃度變化;由結果可知於於腎切除手術後之慢性腎炎動物血中尿素氮濃度遠高於手術對照組,此表示本試驗中的腎切除手術有成功產生慢性腎炎之腎功能損傷。在冬蟲夏草發酵液凍乾粉治療組於實驗期間中對於實驗動物BUN之變化上顯示出具降低慢性腎炎動物血中BUN之效果。
圖4及表4為每週試驗動物血清肌酸酐(blood creatinine)濃度變化;由結果可知於腎切除手術後之慢性腎炎動物血清肌酸酐濃度遠高於手術對照組。將冬蟲夏草發酵液凍乾粉三組藥物治療組對於實驗動物血清肌酸酐之變化與腎炎對照組相比,可發現於投藥期(第二十一天至四十九天),
冬蟲夏草發酵液凍乾粉可明顯降低慢性腎炎動物血清肌酸酐之效果,且此降低效果持續至實驗末期。
圖5及表5為在尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值結果,在試驗前、中期(第二十一天至四十九天)之結果中可知:腎切除手術後之慢性腎炎動物其尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值在手術後一個月內開始攀升;經冬蟲夏草發酵液凍乾粉治療的慢性腎炎動物,其尿蛋白/尿液肌酸酐比值皆低於腎炎對照組,此表示冬蟲夏草發酵液凍乾粉具有降低慢性腎炎動物的尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值之效果。
表5、5/6腎切除大鼠在七週實驗期間內尿液尿蛋白及尿液肌酸酐比值變化
圖6及表6為在24小時尿蛋白濃度變化,由試驗期間之結果中可知:腎切除手術後之慢性腎炎動物其尿液中24小時尿蛋白濃度在手術後一個月內開始攀升;經冬蟲夏草發酵液凍乾粉治療的慢性腎炎動物,其24小時尿蛋白濃度則可維持在手術對照組的正常濃度範圍中,此表示冬蟲夏草發酵液凍乾粉具有減緩慢性腎炎動物的24小時尿蛋白濃度攀升之效果。
在慢性腎炎動物的腎臟組織病理切片結果(圖7)中可觀測到本試驗中的腎切除手術成功誘發動物產生腎絲球肥大等慢性腎炎病徵,且此一病徵在經過連續五週的冬蟲夏草發酵液凍乾粉治療周期後,具有明顯改善經腎切除手術造成之腎臟局部性腎絲球硬化症的結果。
本試驗結果顯示5/6腎切除手術已成功造成動物慢性腎炎之疾病模式。在以冬蟲夏草發酵液凍乾粉(100 mg/大鼠)治療的慢性腎炎動物組別中,其腎功能指標在試驗期內可觀測到冬蟲夏草發酵液凍乾粉對於慢性腎炎動物之血中尿素氮、血清肌酸酐、尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值、24小時尿蛋白濃度及組織病理切片具有改善之效。本試驗結果顯示,冬蟲夏草發酵液凍乾粉對慢性腎炎發生之前期的腎臟功能指標具有改善之效。
圖1、本發明所用冬蟲夏草發酵液凍乾粉製備過程。
圖2、試驗藥物對大鼠之體重-時間分析。試驗所使用的溶媒為生理食鹽水(含0.9% NaCl之水溶液),且所有試驗藥物皆為每日口服給予,數據以
平均值±SEM表示(各組皆為n=2)。
圖3、試驗藥物對大鼠血漿中之血中尿素氮濃度的影響。數據以平均值±SEM表示(各組皆為n=2)。
圖4、試驗藥物對大鼠血漿中之肌酸酐濃度的影響。數據以平均值±SEM表示(各組皆為n=2)。
圖5、試驗藥物對大鼠血漿中之尿液尿蛋白及肌酸酐比值的影響。數據以平均值±SEM表示(各組皆為n=2)。
圖6、試驗藥物對大鼠血漿中之24小時尿蛋白濃度的影響。數據以平均值±SEM表示(各組皆為n=2)。
圖7、手術對照組、腎炎對照組及冬蟲夏草發酵液凍乾粉治療組之腎皮質之蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,H&E)染色。
Claims (4)
- 一種組合物用於製備治療慢性腎炎之醫藥組合物的用途,其中該組合物包含一有效劑量之冬蟲夏草發酵液凍乾粉,其中該冬蟲夏草發酵液凍乾粉係由下列步驟製備而得:(a)以冬蟲夏草之無性世代中華被毛孢(Hirsutella sinensis)進行液態發酵;(b)分離出冬蟲夏草發酵液,並經膜過濾濃縮得到濃縮的冬蟲夏草發酵液;及(c)冷凍乾燥該濃縮的冬蟲夏草發酵液以得該冬蟲夏草發酵液凍乾粉;其中該有效劑量為100mg,其中該治療慢性腎炎係治療腎絲球硬化症。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該冬蟲夏草發酵液凍乾粉可降低血中尿素氮及血清肌酸酐。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該冬蟲夏草發酵液凍乾粉可降低尿液尿蛋白/尿液肌酸酐比值。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途,其中該冬蟲夏草發酵液凍乾粉可減緩24小時尿蛋白濃度攀升。
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