TWI656878B - 靈芝萃取物於抑制或降低ｐｍ.細懸浮微粒引發的毒性之用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示關於有效量之靈芝萃取物於抑制或降低PM_2.5細懸浮微粒引發的細胞毒性之用途。本發明之某些實施例中，靈芝萃取物可降低PM_2.5細懸浮微粒誘導之血管通透，在本發明另一些實施例中，本發明之靈芝萃取物可降低PM_2.5細懸浮微粒造成之DNA的傷害。

Description

靈芝萃取物於抑制或降低PM 2.5 細懸浮微粒引發的毒性之用途

本發明係關於細懸浮微粒(PM_2.5)導致之傷害。特定言之，本發明係關於有效量之靈芝萃取物於抑制或降低PM_2.5細懸浮微粒引發的細胞毒性之用途。

顆粒物(atmospheric particulate matter,particulate matter(PM),particulates)，指懸浮在空氣中的固體顆粒或液滴，為一種空氣污染物；其中，空氣動力學直徑(以下簡稱直徑)小於或等於10微米(μm)的顆粒物稱為可吸入顆粒物(PM₁₀)；直徑小於或等於2.5微米的顆粒物稱為細懸浮微粒(PM_2.5)。PM_2.5之監測方法分為「手動監測」及「自動監測」二種，由於監測方法不同，兩者數據有系統性的差異，需經過比對及統計分析後，適度轉換校正才能掌握一致性的數據。依空氣品質標準規定，PM_2.5之監測數據係以「手動監測」標準方法所量測之數據為準。

空氣污染PM_2.5懸浮粒子不僅會提高人類血管硬化和突變發生的機率，也會在短時間內造成心肌梗塞與誘導心臟病發作。先前文獻利用活體外血管內皮細胞HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)模型發現PM_2.5懸浮粒子可藉由刺激內生性自由基生成，造成內皮細胞與細胞間鈣黏蛋白(Complexus adherent junctions)斷裂增加血管通透度 (Permeability)，PM_2.5細懸浮微粒便可藉此穿透血管壁進入血液循環系統(Chao,M.W.,Kozlosky,J.,Po,I.P.,Strickland,P.O.,Svoboda,K.K.,Cooper,K.,Laumbach,R.J.,and Gordon,M.K.(2011).Diesel exhaust particle exposure causes redistribution of endothelial tube VE-cadherin.Toxicology279,73-84)。雖然已有文獻說明PM_2.5細懸浮微粒在人體內可能的傳遞路徑和進入人體之後所造成的各種下游反應(Chao,M.W.,Po,I.P.,Laumbach,R.J.,Koslosky,J.,Cooper,K.,and Gordon,M.K.(2012).DEP induction of ROS in capillary-like endothelial tubes leads to VEGF-A expression.Toxicology297,34-46；Nemmar,A.,Hoet,P.H.,and Nemery,B.(2006).Translocation of ultrafine particles.Environmental health perspectives114,A211-212；author reply A212-213)，然而要如何有效減少此懸浮粒子接觸到血管內皮細胞並降低其進入血液循環的機率，仍尚待釐清。

在一方面，本發明提供一種有效量之靈芝萃取物於抑制或降低PM_2.5細懸浮微粒引發的細胞毒性之用途。在一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物可抑制血管通透並降低PM_2.5細懸浮微粒穿透血管壁。在另一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物可降低DNA的傷害。在另一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物係來自松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(Ganoderma sinensis)。

圖1為松杉靈芝萃取物避免PM_2.5造成的細胞毒性。將HUVEC暴露於0、0.1、1、10、100及1000μg/mL之PM_2.524小時後，再以100μg/mL之松杉靈芝水萃物(GTHE)、松杉靈芝酒精萃取物(GTEE)或松杉靈芝DMSO萃取物共處理後，恢復細胞存活。

圖2為DMSO靈芝萃取物抑制PM_2.5懸浮粒子所造成的細胞毒性。 DEP：柴油廢氣微粒；DEP+GL：柴油廢氣微粒+靈芝萃取物。

圖3為GTDE在低劑量對HUVEC不具細胞毒性。HUVEC暴露於0、0.1、1、10、100及1000μg/mL之GTDE24小時後，以MTS試驗檢測細胞存活率。

圖4為顯示PM_2.5引起DNA傷害之彗星試驗。細胞用0、500和1000μg/mL之PM_2.5處理，收集50-150彗星並於每一試驗分析。(A)螢光顯微鏡圖。放大倍數=400X。(B)圖4A之定量：DNA的彗星尾部%；在彗星尾部DNA的強度；彗星尾部動量為距離與從彗星頭部的中心的DNA的強度的函數；從頭部區域的左右邊界至尾部末端測量彗星尾長。以PM_2.5處理後，檢測出顯著的DNA損傷。與此相反，預GTDE處理，與未處理對照相比顯著降低DNA鏈斷裂。*、**和***分別表示P<0.05，P<0.01和p<0.001顯著差異，分別與陰性對照相比。§和#顯示P<0.05和p<0.01，分別與PM_2.5處理的對照組比較。

圖5為PM_2.5誘導單層的內皮通透性。(A)單層培養物之細胞與細胞通路藉由暴露於PM_2.5而破壞，以葡聚糖進入下部腔室測定(即，培養物通透)。(B)將HUVEC暴露於PM_2.5後，收集含或不含GTDE的培養基進行ELISA評估。根據與標準曲線相比，VEGFA的濃度被測定並定量。**表示顯著差異(P<0.01)，相較於PM_2.5處理的控制組(0微克/毫升)。相較於同樣量的PM_2.5加上GTDE，樣品之顯著在# P<0.01時達成。數值代表平均值±SDs(N=6)。統計分析使用學生t檢驗。(C)細胞遷移率為使用遷移試驗測定。遷移的細胞以Image J細胞計數模型評估。PM_2.5促進HUVEC在trans-well中從頂部至底部的遷移，而另外GTDE的添加減少反移動。**和***表示p<0.01和p<0.001的顯著差異，相較於負對照組。§與#顯示p<0.05或p<0.01，分別與PM_2.5處理的對照組相比。

本發明之發現主要基於靈芝水萃物可有效降低PM_2.5細懸浮微粒所引發的細胞毒性，並達到抑制血管通透與降低PM_2.5細懸浮微粒穿透血管壁的機率。

在一方面，本發明提供一種有效量之靈芝萃取物於抑制或降低PM_2.5細懸浮微粒引發的細胞毒性之用途。術語「有效量」為當一活性劑(化合物或組合物或萃取物)投予一對象時達到有利結果之量。

在一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物可抑制血管通透並降低PM_2.5細懸浮微粒穿透血管壁。在另一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物可降低DNA的傷害。

在一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物係來自松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(Ganoderma sinensis)。

在一些具體實施例，本發明之靈芝萃取物為有機溶劑萃取物或水萃取物。較佳的，有機溶劑萃取物或水萃取物為該高溫下得到的有機溶劑萃取物或水萃取物。更佳的，該靈芝萃取物為以沸水得到的含水萃取物。在一較佳具體實施例，靈芝和水以0.1至10：0.1至10、0.5至10：0.5至10、0.5至5：0.5至5、1至10：1至10、1至5：1至5、0.5至4：0.5至4(較佳為1：10至1：50)的比例的溶液通過煮沸而獲得的含水萃取物；較佳地，該靈芝為松杉靈芝；較佳地，該加熱時間為10至30小時，更加為6至15小時，特佳為8至10小時；接著，該所得水萃取物再經有機溶劑(較佳為乙醇或DMSO)萃取得到有機溶劑萃取物。在另一較佳具體實施例，該靈芝萃取物至少包含以重量計0.5%至5%之三萜類(triterpenes)及/或至少以重量計1.5%至10%之多醣(polysaccharides)；較佳地，該靈芝為松杉靈芝。較佳地，該靈芝萃取物至少包含以重量計0.5%至4%、0.5%至3%、0.5%至2%、1.0%至4%、1.0%至3%、1.5%至4%或1.5%至3%之三萜類及/或以重量計1.5%至8%、1.5%至6%、1.5%至5%、1.5% 至4%、2.0%至10%、2.0%至8%、2.0%至6%、2.0%至5%、2.5%至10%、2.5%至8%、2.5%至6%、2.5%至5%、2.5%至4%、3.0%至10%、3.0%至8%、3.0%至6%、3.0%至5%、3.0%至4%、3.5%至10%、3.5%至8%、3.5%至6%、3.5%至5%、3.5%至4%之多醣；較佳地，該靈芝為松杉靈芝。更佳地，該靈芝萃取物至少包含以重量計約1.96%之三萜類及/或以重量計約3.93%之多醣；較佳地，該靈芝為松杉靈芝。

本發明靈芝萃取物可單獨或將其與適合的載劑和賦形劑混合成醫藥組成物投予病患。該靈芝萃取物可以非經腸給藥，例如以靜脈注射或輸液、腹膜內注射、皮下注射或肌肉內注射。該靈芝萃取物可經由與載劑和賦形劑形成錠劑、片劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及其類似物等適當的調配物，以口服或直腸給藥。該靈芝萃取物可局部給藥，例如以皮膚貼片。該靈芝萃取物可調配成適合局部施用於皮膚或黏膜表面之乳膏、皮膚或黏膜貼片、液體或凝膠。該靈芝萃取物可以吸入器投藥至呼吸道中供局部或全身性治療癌症。在一實施例中，所投予的靈芝萃取物量之範圍可從0.1g至50g之範圍內；較佳為0.5g至40g、30g、20g、10g或5g之範圍內；或1g至10g的範圍內。

適合用於本發明之靈芝萃取物劑量可由熟習本項技術者依照前述本文之揭示來決定。該藥品將含有一有效劑量的靈芝萃取物(依照給藥路徑和活性藥劑之藥物動力學而定)及適合特定調配物給藥路徑(亦即，口服、非經腸、局部或吸入)之適合的醫藥載劑和賦形劑。該靈芝萃取物係藉由混合、溶解、造粒、製成糖衣錠、乳化、包膠、包埋或凍乾程序混合成醫藥調配物。供經腸或非經腸給藥之醫藥調配物包括水溶或有機溶劑性形式之本發明靈芝萃取物的液體溶液。此外，本發明靈芝萃取物之懸浮液可製備成供經腸或非經腸給藥之油質懸浮液。適合的親脂性溶劑或媒劑包括油脂例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或三酸甘油酯或脂質體。水性的供經腸或非經腸給藥之可 含有水或增加懸浮液黏度之物質例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。懸浮液可視需要含有安定劑或增加複合物或組合物溶解度，使溶液濃度更高之試劑。

實施例

材料及方法

松杉靈芝萃取。松杉靈芝由立康生物科技有限公司萃取(Li-Kang Biotechnical Co.,Ltd)(台南)。以熱水(GTHE)或酒精(GTEE)自松杉靈芝子實體中萃取松杉靈芝，或以熱水或酒精自松杉靈芝子實體中萃取松杉靈芝，再接著經二甲基亞碸(DMSO)沉澱、逆透析(reverse dialysis)及去除蛋白質(protein depletion)之步驟(GTDE)。該GTDE粗萃混合物包含1.96%之三萜類及3.93%之多醣。

PM _2.5 製備及大小檢測。將購買自西格瑪奧瑞奇(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)之PM _2.5 (CRM558)於含有0.05%聚山梨醇酯-80(Tween-80)之磷酸鹽緩衝液(PBS)中稀釋。此PM _2.5 之製備與先前文獻(Chao,M.W.,et al.Diesel exhaust particle exposure causes redistribution of endothelial tube VE-cadherin.Toxicology 279：73-84,2011)所載之流程相同。粒子大小分佈係經由ZetaPlus光散射及粒子大小區分軟體(Particle Sizing Software，版本3.48)量測。

細胞培養。將得自生物資源保存及研究中心(BCRC，台灣新竹)之人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)培養於Ham's F-12K(Sigma-Aldrich)培養基中，該培養基含有內皮細胞生長補充物(Millipore)、肝素、碳酸氫鈉(2.2mg/mL)及10%胎牛血清(Gibco)。於本申請案中使用之HUVEC代數介於5至15代。細胞於含有5%二氧化碳之37℃環境中生長。為實驗所需，HUVEC經100μg/mL松杉靈芝DMSO萃取物(GTDE)長期預處理至最多4週後，再暴露於PM _2.5 (500及1000μg/mL)中24小時。

細胞存活率試驗。PM_2.5對於之HUVEC之細胞毒性係經由購自Promega(Madison,WI)之市售MTS試驗偵測，其係藉由MTS及吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate)轉換為甲(formazan)以量測粒線體琥珀酸脫氫酶之活性。經處理後，細胞以磷酸鹽緩衝液潤洗三次，接著將10μL之水可溶之套組試劑與190μL之新鮮培養液混勻後加入盤孔中，於37℃避光反應1小時。收集上清液(每盤孔100μL)，並以微孔盤讀取儀量測所產生之甲之490nm之吸光值。

鹼性彗星試驗(Alkaline comet assay)。鹼性彗星試驗係用於偵測總DNA鏈之斷裂。實驗流程於先前文獻中(Wood,D.K.,et al.Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.Proc Natl Acaf Sci USA 107：10008-10013,2010)所描述。經24小時處理後，將50μL之HUVEC(10⁵細胞/mL)分注至各瓊脂糖中。載玻片上覆蓋有1%低熔點瓊脂糖。經2小時裂解後，將彗星試驗載玻片置於填充有解旋緩衝液(unwinding buffer,0.2M氫氧化鈉及1mM EDTA)之盒中於室溫反應20分鐘。電泳於4℃之電泳緩衝液中進行30分鐘，條件為1V/cm、電流300mA。電泳後，依據製造商之操作指示將彗星試驗載玻片以SYBR Green染色以用於螢光呈像。呈像係由Olympus IX51直立顯微鏡及自動掃描平台截取，並以Image J.軟體分析。由軟體產生之結果顯示尾部DNA之比例，其代表DNA損傷之程度及尾部動量(olive tail moment,OTM，彗星長度與尾部強度之乘積)。以100μM雙氧水處理之細胞作為正對照組。每一處理組別中，收集100至150張慧星試驗呈像圖並進行分析。

通透性試驗(Permeability assay)。以單層培養之HUVEC而言，將GTED預處理之細胞播種於Transwell®單位盤孔(24mm，0.4μm孔徑，Corning Costar,Cambridge,USA)中(每一盤孔10⁵細胞)，並使其生長至滿盤(confluence)。上層盤之培養基體積為1.5mL，下層之培 養基體積為2.5mL。當培養至滿盤(3至5天)，將上層細胞暴露於不同濃度之PM_2.5(500及1000μg/mL)中，於37℃中培養24小時。接著，將接有FITC之葡聚糖(FITC-dextran，分子量70kDa,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)加入，並等待時間使其穿透至下層盤孔。在初始實驗中，使用未暴露之滿盤單層細胞以得知任一FITC-dextran分子到達下層培養液中所需之時間。在持續培養於37℃之過程中，每2小時間隔收集等量之培養液(每盤孔100μL)。少量之螢光葡聚糖(以490nm偵測)可於1至2小時穿透滿盤之單層細胞到達下層。因目前並無於體外評估內皮管通透性之方法，可理解為若PM_2.5造成類微血管結構之漏隙，葡聚糖則因缺乏血流而能進入類微血管結構中具有漏隙之細胞中。

統計。關於統計分析，每個實驗為包含三重複之三次實驗。三個獨立實驗之結果以平均值±標準差表示，組別之差異則以學生t檢驗及GraphPad統計軟體分析。

實例1 細胞毒性分析

利用MTS檢測試劑分析細胞存活率(Gauduchon,J.,Gouilleux,F.,Maillard,S.,Marsaud,V.,Renoir,J.M.,and Sola,B.(2005).4-Hydroxytamoxifen inhibits proliferation of multiplemyeloma cells in vitro through down-regulation of c-Myc,up-regulation of p27Kip1,and modulation of Bcl-2 family members.Clinical cancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research11,2345-2354)。使用PM_2.5懸浮粒子(0-100mg/mL)與靈芝水萃物(100mg/mL)為作用濃度。如圖1所示，我們首先比較靈芝萃取物溶於三種不同溶劑(水(GTHE)、酒精(GTEE)、DMSO(GTDE))之後對於抵抗PM_2.5懸浮粒子所造成的細胞毒性分析，結果發現，溶於DMSO的靈芝萃取物對於PM_2.5懸浮粒子所造成的傷害有相對較高的保護能力，水次之，酒精又次之。將水與酒精的結果抽離，只著重在溶於DMSO的部分， 如圖2所示，可以發現細胞若沒有靈芝的保護之下，PM_2.5懸浮粒子在25μg/mL就已達到細胞的抑制生長濃度50%(IC50)，加入靈芝萃取物之後，細胞存活率大幅提高，IC50延遲至100μg/mL才出現。

實例2 GTDE於低劑量時對HUVEC無細胞毒性

以MTS方法測定細胞存活率，以測定GTDE是否對於PM_2.5誘導之細胞毒性具有保護作用，使用低劑量之松杉靈芝DMSO萃取物(GTDE)處理24小時後顯示並無顯著之細胞存活率降低；100μL/mL之GTDE並未對HUVEC之培養產生細胞毒性(圖3)。因此，所有後續之實驗皆使用100μL/mL之GTDE。

實例3 PM _2.5 造成HUVEC之DNA損傷

使用彗星試驗評估ROS產生之對於DNA鏈斷裂之影響。代表圖顯示「慧星」現象在經PM _2.5 處理後出現(圖4A)。GTDE處理(1週及2週)使彗星尾部、彗星尾部強度、尾部動量及慧星尾部長度減少(圖4A及4B)。慧星尾部長度係量測自頭部區域之右界至尾部末端。在經PM _2.5 處理後，可偵測到顯著之DNA損傷。與未處理之控制組相比，以GTDE預處理可顯著降低DNA鏈斷裂。GTDE預處理可降低ROS誘導之DNA鏈斷裂。

實例4 GTDE處理1週及2週可顯著改善由PM _2.5 誘導之血管通透性

假設內皮管結構未完全覆蓋細胞培養皿，以實驗評估PM_2.5是否誘導內皮之通透性，第一次先使用滿盤單層細胞評估於PM_2.5中暴露24小時後及GTDE預處理後(1週及2週)之通透性。結果指出GTDE可保護由PM_2.5誘導之血管系統改變(圖5A)。HO-1可誘導VPF/VEGFA分泌(Lin,H.H.,et al.Heme oxygenase-1 promotes neovascularization in ischemic heart by coinduction of VEGF and SDF-1.Journal of molecular and cellular cardiology 45：44-55,2008)。先前文獻顯示柴油廢氣微粒 可於培養基中正向調節HO-1並刺激VEGFA分泌(Chao,M.w.,et al.DEP induction of ROS in capillary-like endothelial tubes leads to VEGF-A expression.Toxicology 297：34-46,2012)。關於PM_2.5是否藉由直接影響VEGFA表現量改變血管通透性。本實例發現暴露於PM_2.5 24小時使VEGFA以具劑量關係之方式增加(圖5B)。有趣的是，使用GTDE預處理1週並未改變VEGFA之分泌量，但預處理2週則可顯著降低因PM_2.5而增加之VEGFA。此外，本實例也定量並比較本研究中遷移之細胞數目。隨著PM_2.5濃度增加，遷移之細胞可到達下層盤孔中，但在加入GTDE後，因PM_2.5造成之單層血管通透性增加又因此而恢復。此外，PM_2.5與GTDE同時處理2週後可顯著降低細胞遷移之能力(圖5C)。

Claims (12)

1. 一種靈芝(Ganoderma)萃取物之用途，其用於製造用於抑制或降低PM_2.5細懸浮微粒引發的細胞毒性之藥劑，其中該靈芝萃取物至少包含以重量計0.5%至5%之三萜類(triterpenes)及至少以重量計1.5%至10%之多醣(polysaccharides)；且其中該靈芝為松杉靈芝(Ganoderma tsugae)、赤芝(Ganoderma lucidum)或紫芝(Ganoderma sinensis)。
2. 如請求項1之用途，其中該靈芝萃取物可抑制血管通透並降低PM_2.5細懸浮微粒穿透血管壁。
3. 如請求項1之用途，其中該靈芝萃取物可降低DNA的傷害。
4. 如請求項1之用途，其中該靈芝萃取物為有機溶劑萃取物或水萃取物。
5. 如請求項4之用途，其中該有機溶劑萃取物或水萃取物為高溫下得到的有機溶劑萃取物或水萃取物。
6. 如請求項4之用途，其中該靈芝萃取物為以沸水得到的靈芝含水萃取物。
7. 如請求項4之用途，其中該靈芝萃取物為靈芝和水以1：10至1：50的比例的溶液通過煮沸而獲得的含水萃取物。
8. 如請求項4之用途，其中該有機溶劑為乙醇或DMSO。
9. 如請求項1之用途，其中該靈芝萃取物至少包含以重量計1.0%至3%之三萜類及至少以重量計3.0%至5%之多醣。
10. 如請求項1之用途，其中該靈芝萃取物至少包含以重量計約1.96%之三萜類及以重量計約3.93%之多醣。
11. 如請求項1之用途，其中該藥劑可為注射劑、凝膠、口服液、貼片、擦劑、吸入劑、乳劑、乳膏、粉末、膠囊、口含片或錠劑形式。
12. 如請求項11之用途，其中該貼片為黏膜貼片或皮膚貼片。