TWI300129B - - Google Patents

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1300129 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種核酸分析方法、分析裝置以及分析用 碟片’其使含有核酸之分析用試料流入溫度重複循環且圖 案產生變化之流路，光學檢測出藉由1>〇汉而於試料中得以 擴增之核酸濃度等。 【先前技術】 聚合酶連鎖反應（PCR)法，其係選擇性擴增微量存在於 試料中之特定DNA的方法，藉此所擴增之DNA係可作為化 學性單一物質而加以分析或利用。經此離析2Dna的分析 /利用技術，不僅可應用於科學研究或醫療領域，亦可廣 泛應用於全體產業界。 作為應用有PCR法之分析方法而眾所周知之同步pCR 法，其係藉由PCR選擇性擴增成為定量目的之DNA，根據 所獲得之擴增曲線間接測定包含於試料中之〇>1八初期量的 方法。忒方法亦可作為下述方法加以利用：伴隨藉由自含 有特定序列之RNA定量合成互補DNA之逆轉錄酶所產生之 反應，測定試料中之RN A量。 同步PCR法作為具有再現性且可提高定量性之測定法， 並且又作為無需煩雜操作之簡單DNA或RNA之定量法而得 以通用。其應用領誓並非限定於核酸濃度測定法，亦可作 為下述方法加以應用：有效檢測/鑒定作為人類基因之單 鹼基多型（Single Nucleotide Polymorphism，單一核苷酸多 型性；SNP)而眾所周知且對於關聯疾病之基因功能賦與^ 99041.doc 1300129 體差異之基因多型。 並非僅限定於PCR，較慢之反應係可藉由初步方法經時 追縱八進行過权。βρ ’於反應途中自反應容器内取樣一部 刀’逐-分析_取樣之試料，藉此追蹤該反應之進行過 程之方法’或者將同_反應溶液分注於複數個反應容器 :，將該複數個反應容器分別置於同_反應條件下，以特 疋時間逐如止各反應容器内之反應，藉此可獲得同一反 應之時間系、列試料，藉由個別分析該時間系列試料，追縱 ，亥反應進行過程之方法。然而，前者方法中必要的是取 樣，後者方法無法實行同一容器内之分才斤，兩纟均無法設 為可關閉自初期延續至終期之全反應過程的系統。又，經 取樣測定之試料無助於其後之反應，故而造成浪費。 為於同步PCR法中定量獲得必要之DNA擴增曲線，必須

經時追蹤反應之進行過程且獲得關於反應試料液中之dn A i之> Λ，但6亥情形時，為提高定量性或反應系之穩定 性、測定機構之簡易性等，較好是於全反應過程中保持反 應系之同一性/同質性，又，較好是必要之反應試料溶液 量應為少量。 夂而業者期望無需根據上述初步方法而可設為關閉自 初期延績至終期之全反應過程的系，但關於如此之問題， 例如於專利文獻1以及2中，作為用以使用螢光監測DNA擴 增之系統與方法，揭示有可監測反應之進行過程且可迅速 控制P C R試料之裝置。 又，根據PCR法之原理，可將pcR全反應之一個過程分 99041.doc 1300129 為三個階段加以說明。即，可分為下述三個階段··作為目 的之模板DNA解離為單鏈DN.A之過程，其單鏈DNA與模板 DNA上所選擇之特定序列中具有雙鏈形成能之寡核苷酸 (引子DNA)的雙鏈形成過程，進而將經過雙鏈形成之引子 DNA末端部分設為開始點之DNA延伸反應過程。該三個p皆 段之依次反應，其係藉由將反應試料溶液分別暴露於反應 過程之最佳溫度下實行，亦可將其溫度循環定義為PCR溫 度循環。藉由重複PCR溫度循環，可進rdna之複製性合 成，作為目的之DNA會指數函數性地擴增。因此，為使 PCR產物之擴增傾向特性與包含於試料中之dna初期量密 切相關，較好是於每個上述PCR溫度循環時到達反應平穩 階段後測定。 關於如此之問題，例如除專利文獻丨以及2以外，專利文 獻3中亦揭不有一種裝置，其可向使用空氣作為熱傳導媒 體之迅速熱循環供給生物學試料。 另一方面，於專利文獻4中揭示有流動系PCR方法以及 裝置。 於通常方法之PCR中，反應試料液固定於一個反廡容器 中且暴露於料性PCR溫度循環下。對此，於流動iPC°R 方法中’反應試料液沿著流路於毛細管内移動，另一方 面’以沿著流路重複循環且物理性接觸不同溫度之熱傳導 =體之方式配置此毛細管。即，藉由毛細管沿著流路重 ^盾環且物理性接觸不同溫度之熱傳導作用體，對於根據 所限制之流速空間性聽私爆 移動於毛細管内之反應試料液依據用 99041.doc 1300129 以移動之經過時間賦與PCR所需之溫度循環。 义士此之方式’於流動系PCR中，因對於反應試料液賦 與二CR溫度循環之方法與先前有所不同，故而由於應用有 先前PCR之裝置而無法構築其裝置之基本構造。故而，業 者期待可提供—種流動系pCR裝置，其產業成本較低並且 可靠性較高。 人述"IL動系PCR-才袠，為將毛細管作為反應管之反應 測定裝置設為密集化構造，較好是將反應管固定於任一基 板上，又’業者期望如此之毛細管内反應系與檢測系一併 構成，該檢測系可藉由光學檢測機構直接觀察包含於反應 試料液中之物質量的變化。 作為如此之構造，於專利文獻5中揭示有一種構造，其 於碟片狀基板上自該碟片中心形成放射狀之複數個流路， 藉由疑轉该碟片而依次以一個檢測系測定該形成為放射狀 之複數個流路。 進而，又於專利文獻6中揭示有一種裝置以及方法，其 於具備搭載於機内之資訊科學的超微量液體元件工學系統 中’為推進液體移動而使用向心性加速。 [專利文獻1]日本專利特表2000-5 12138號公報 [專利文獻2]日本專利特表2〇〇〇_5〇96〇8號公報 [專利文獻3]曰本專利特表2000-5 11435號公報 [專利文獻4]曰本專利特開平6-30776號公報 [專利文獻5]曰本專利特表2003-149253號公報 [專利文獻6]日本專利特表2002-503331號公報 99041.doc 1300129 [發明所欲解決之問題] . 如上說明，於先前之PCR法中，反應試料液固定於一個 • 反應容器中，暴露於經時性重複之pCR溫度循環下。該情 形時，於逐步經時性進行之反應過程中，藉由觀察到達^ 應後期階段之同反應系，無法獲得反應初期階段中所觀察 到之資訊。因此，於先前之同步pCR法中可採用下述方 法：藉由與其反應系進行同步發揮功能之檢測系，測定反 _ 應進行途中關於反應試料液中之DNA量的資訊。 通常，於如此之檢測系中，藉由與雙鏈DNA之結合而增 大螢光強度之螢光色素，其作為預先混合於反應試料溶液 中且於PCR進行途中顯示直接或迅速應答之檢測用試劑加 以利用，但相反地，較難利用應答係間接或緩慢之該檢測 用試劑。 、 又，於PCR法中，於上述所說明之每個pCR溫度循環時 複製DNA，但為實行可忠實反映其擴增效率之測定，重要 _ 的是以最佳時點檢測出P C R溫度循環中動力學形成之雙鏈 DNA-螢光色素複合體。可認為最佳時點係根據試料、模 板DNA量、引子、溫度循環等之pCR設定條件而有所不 Π 又，亦根據母個P C R溫度循環而有所不同，但於先前 之PCR中，由於如上所述逐次經時性進行之反應系，故而 無法將所獲得之資訊反饋利用於反應系或檢測系。又，亦 無法測定反應進行後會出現幾個不同性質。 關於上述專利文獻1、專利文獻2、專利文獻3中揭示之 同步PCR的方法以及裝置，其係利用先前之pCR法者，並 99041.doc 1300129 非本質上可解決上述問題之技術。 對此，於流動系PCR方法中，如上說明，反應試料液於 流路内空間性移動，依據用以移動之經過時間賦與PCR溫 度循環。該情形時，自流路之始點至終點之分別位於不同 距離之反應試料液，其對應於該距離，成為自pCR全反應 過程之初期至後期之分別處於不同反應階段之反應試料 液。故而，藉由於複數個部位觀察定常性移動之PCR反應 試料液’可暫時觀察到流路内進行之PCR反應過程。 藉由利用於同步PCR中採納具有如此特徵之流動系pcr 方法的流動系同步PCR，則無需藉由與其反應系進行同步 發揮功能之檢測系而測定有關於反應進行途中反應試料液 中之DNA量的資訊，從而可消除如上說明之不利因素。 又’作為測定裝置使用時，反應系、檢測系以及連結該 等之控制系之幾個功能於反應過程中產生不合格之情形 時’不得不中斷操作，又，於檢測系中產生不合格之狀態 下依舊進行溫度循環之情形時，因已丟失有關於其間反應 之資訊故而無法恢復。又，通常檢測系根據時間而變化輸 出或$敏度’故而起動裝置時輸出或靈敏度之變化較為顯 著’即使裝置穩定後輸出或靈敏度之變動亦並非不完全， 但經常引起輸出或靈敏度之漂移現象。 根據流動系同步PCR法，可同時連續進行欲比較之測 定’從而可節省如上所述之裝置系費事所引起之測定時間 的浪費。 以如此之方式將流動系PCR法之原理利用於同步PCR中 99041.doc -10· j3〇〇1^9 之優點較多，但有關於該技術之報告較少，業者尤其期望 於流路之複數個部位之禮 … 一“ e 1位之正確位置中可有效測定有關於移動 於抓路内之反應試料液中之DN 轨 .纟前技術。 但缺乏如此之 於上述專利讀4中揭示有可藉由紫外線照射等檢測毛 細官内之反應進行，但未明示於毛細管之哪個部位加以測 定’或測定-個部位還是測定複數個部位，而且未揭示出 芳需測定反應時該如何解決等問題。又，於上述專利文獻 # 5中揭示有藉由一個檢測系檢測複數個流路之方法，但未 揭示有於複數個部位上測定同一流路之技術。又，並未成 為用以適應流動系PCR法之構造。 又’用於流動系反應之裝置中，用以產生怪定流動之反 應試料液之送液系為不可或缺，但為實現測定裝置之密集 化，較好是不使用送液泵等裝置。 於上述專利文獻6中揭示有一種關於超微量液體元件工 學系統之技術，該超微量液體元件工學系統係於旋轉之碟 片基板上配置毛細管，為推進液體移動而使用向心性加 速。然而，主要為推進液體移動至反應液儲存處而利用向 心性加速，未揭示有為了產生反應試料液之恆定流動而利 用向心性加速之技術。又，亦未揭示有沿著流動系反應之 流路貫行光學測定之方法，亦未揭示有用以適應利用有向 心性加速之流動系PCR的構造。又，熱源係配置於基板 上。 故而’本發明之目的在於提供一種方法或構造體，其於 99041.doc 11 1300129 依據用以移動之經過時間進行反應的流動系反應中，於流 路之複數個測定點上同時連續且繼續地光學測定反應試料 液之狀態變化；本發明之目的亦在於提供一種核酸分析方 法、分析裝置以及分析用碟片，其可更簡單且於短時間内 進行用以追蹤反應進行過程之分析作業。 【發明内容】 為達成上述目的，本發明之核酸分析方法，其特徵在 Φ 於：使含有核酸之分析用試料流入溫度重複循環且圖案產 生變化之流路，於上述流路之複數個部位進行光學檢測。 根據本發明之核酸分析方法，可於依所限制之流速於流 路内移動且含有核酸之分析用試料，依據用以移動之經過 時間賦與溫度變化，賦與反應試料溶液所需之溫度循環。 進而，根據本發明之核酸分析方法，於上述流路内藉由 合有核酸之分析用試料進行PCR反應時，於上述流路之複 數個部位進行光學性檢測，藉此例如流路開始部分表現出 41 匚尺循環數較少狀態下之擴增狀態，流路結束部分表現出 PCR循環數較多狀態下之擴增狀態，因此一次進行該等各 邛位之铋測，將該等檢測結果看作由一個樣品所產生之 PCRI時性過程中之檢測結果，藉此可以一個樣品大致同 時檢測出DNA之擴增過程。 其結果為，即使於以同步PCR之方式必須正確求得擴增 傾向之情形時，亦無需隨著反應經過進行經時性測定，亦 「、而夕數個取樣。X ’由於同時檢測，因此測定條件亦設 為固疋，可提高測定精度。進而’藉由固定各循環之測定 99041.doc 12 1300129 ”占即使於未到達平穩階段之狀態下，亦可固定各循環之 • 條件，可正確求得擴增傾向。當然，藉由預先求得到達各 ’ ，之平穩階段之位置，亦可於到達平穩階段之狀態下測 定各循％之測定點，藉此可進一步正確求得擴增傾向。 又，亦可使用應答緩慢之試劑作為上述檢測用試劑，該情 形時，結束PCR，進而經過該檢測用試劑之應答時間後進 行光學測疋，藉此可獲得平穩階段狀態之結果。 • 於本發明之分析方法中，含有上述核酸之分析用試料， 較好是含有DNA聚合酶、引子DNA以及dNTp，亦可根據 需要添加模板DNA、檢體。據此，藉由移動於上述流路内 之該試料通過以特定重複圖案變化溫度之流路，依次賦與 用於解離過程之高溫狀態、適於雙鏈形成過程以及dna延 伸反應過程之低溫狀態以及PCR之溫度循環。進而，可藉 由將微小毛細管設為PCR之反應管，充分增大熱傳導作用 體與反應液之熱容量比，使反應液迅速變化溫度。 • 又’於本發明之分析方法中，藉由光學檢測於 上述流路 之複數個部位上所產生之PCR產物，可獲得有關於依據移 動之經過距離而依次賦與之每個溫度循環之DNA量的資 訊。藉此，可求得藉由PCR所合成之DNA之擴增曲線， 又’可根據使用已知量之模板DNA而作成之對照檢量線， 求得試料中之DNA初期濃度。 又，上述光學性檢測，較好是藉由對上述流路中應檢測 部位照射光線，檢測由所照射之光線產生之透過光、反射 光或發光。藉此，可使用較簡單之方法迅速加以檢測。 99041.doc -13 - 1300129 又’較好是於上述分析用試料通過上述溫度不高部分之 . σ卩位上檢測上述複數個部位。據此，亦可於例如未將使用 -有力入&劑等之向溫設為最佳溫度時進行檢測。 進而，較好是上述流路至少部分具有ζ形圖案，該2形圖 案之彎折部至下一個彎折部之流路形成為可通過不同溫度 二、或藉此，可以特定重複圖案使含有上述核酸之分析用 忒料之溫度產生變化，以此方式易於形成通過區域。 進而’較好是上述流路形成於經旋轉驅動之 碟片卜一 、 丄口次 尚溫區域與低溫區域形成為同心圓狀，使彎折部至 ^個彎折部之流路通過形成為同心圓狀之上述高溫區域 禾;上錢溫區域’以此方式形成前期ζ形圖案。藉此，可 使：稭由碟片旋轉所產生之離心力使試料流入流路，並且 μ 4料易於沿著流路重複通過低溫區域與高溫區域。 又叙好疋於上述碟片上設置資訊記錄區域與試料 用上述資訊記錄區域讀取或寫入資訊，= 此，可域中，免置上述流路從而進行光學性檢測。藉 等，又取記錄於資訊記錄區域之資訊且控制分析條件 、 可將分析結果等記錄於資訊記錄區域。 讀=寫::好是介以上述碟片自相互對向之方向，分別 一 ”·、 、·十對於上述資訊記錄區域之資吨，i 4+ 述試料分鉍r丄 Λ心貝巩，且針對於上 之方h 進行光學性檢測。藉此，由於以夾住碟片 機構針對於資訊記錄區域之資訊讀取或寫入 99041.doc 易於構成穿置：4料分析區域之光學檢挪機構，因此可 置’並且可採用現有光資訊記錄媒體之驅動構 • 14. 1300129 仏作為針對於資訊記錄區域之資訊讀取或寫人機構 可降低製造成本。

另一方面，本發明之核酸分淅裝置，其特徵在於如下構 成：具備溫度控制機構’其於含有上述核酸之分析用試料 流入流路時’使溫度重複循環且圖案產生變化，以此方式 控制通過區域之溫度；以及光檢測機構，其光學檢測流過 上述流路且含有上述核酸之分析用試料；於上述流路之複 數個。卩位上進行由上述光檢測機構所實施之檢測。 根據本發明之核酸分析裝4，可使含有核酸之分析用試 料流入上述流路，通過藉由上述溫度控制機構所形成之溫 度控制區域’於上述流路之複數個部位處分析流過該流： 且含有核酸之分析用試料。 於本發明之核酸分析裝置中’較好是上述光檢測機構具 有對上述流路之應檢測部位照射光線之光射出機構，以及 檢測由所照射之光線產生之透過光、反射光或發光之受光 機構。藉此，可使用比較簡單之方法迅速檢測。 、又，較#是構成如下··於含有±述核酸之分析用試料通 過上述溫度不高部分之部位’進行上述複數個部位之檢 測。藉此，亦可於例如未將❹有欲合劑等之高溫設為最 佳溫度時實行檢測。 進而，較好是構成如下：上述流路至少部分具有2形圖 案，藉由上述溫度控制機構，使該z形圖案之彎折部至下 一個彎折部之流路通過藉由上述溫度控制機構所形成之溫 度控制區域。藉此，可以特定重複圖案變化溫度，以此方 99041.doc -15- 1300129 式易於形成通過區域。 碟較好是上述流路形成於經旋轉驅動之碟片上，該 下、一個：Γ區域與低溫區域形成為同心圓狀，使弯折部至 與上述低^ 广成為〜®狀之上述高溫區域 利用藉由碟片旋轉所產生之 糟此了 、、JL H ^刀便5式科流入流路，並且 路易於重複形成低溫區域與高溫區域。 八又較好是於上述碟片上設置資訊記錄區域與試料 刀£域，於上速資訊記錄區域對置有用 訊的光資訊記錄媒體之讀取或寫入機構，於上述=分： 區=置有對上述流路之特定部位照射光線且用以檢測其 ;、反射光或發光之上述光檢測機構。藉此，可讀取 吞己錄於資訊記錄區域之資訊且可控制分析條件等，又，可 將分析結果記錄於資訊記錄區域。 進而’又較好是構成如下：介以上述碟片，以相互對向 之方式讀取或寫入針對於上述資訊記錄區域之資訊，對於 上述4料分析區域進行光檢測。藉此，可易於構成裝置， 並且可採用現有光f訊記錄媒體之驅動構造作為針對於資 訊記錄區域之資訊讀取或寫入機構，因此可降低製造成 本0 又，本發明之核酸分析用碟片，其特徵在於如下構成： 於經旋轉驅動之碟片上設置有用以讀取或寫人資訊之資訊 記錄區域，以及形成有含有核酸之分㈣試料所流經之流 路的㈣分析區域；使針對於上述資訊記錄區域之資訊讀 99041.doc -16- 灣129 5乂馬入方向與針對於 以失住上述碟片之方料分析區域之光檢測方向， 根據本發明之核酸分析 區域之資訊且可控制分讀， 於資訊記錄區域。又^ 可將刀析結果S己錄

置：以夹住上述碟片之二t下構成，可易於構成分析裝 資訊讀取或寫入方向”;於上述資訊記錄區域之 方向相對。 〃 f於上述試料分析區域之光檢測 於本發明之核酸合士 ^刀析用碟片中’較好是構成如下 〜路至少部分具有沿著上 案，藉由配置於碑月夕Μβ 方向订進之z形圖 ⑽⑽內… 溫度控制機構，沿著位於上述 案内周側之弯折部之列或位於外周側之彎折部之列 任二方形成有高溫區域，沿著任—他方形成有低溫區 域:错此：可利用藉由碟片旋轉所產生之離心力使試料流 ::路’並且沿著流路易於重複形成低溫區域與高溫區 又’較好是於上述流路之一部分上分別形成有供給用液 體储存部與容㈣液體儲存部，上述供給用㈣儲存部愈 上述容納用液體健存部以及具有上述z形圖案之流路相比 更位於内周側。藉此’可藉由旋轉碟片時產生之離心力， 使自注入口注入上述供給用液體錯存部之試料沿著流路流 動’通過具有上述Z形圖案之流路流入上述容納用液體儲 存部。 又較好疋上述資訊記錄區域具有光資訊記錄媒體之記 99041.doc 1300129 =構造。藉此，由於可採用現有光資訊記錄媒體之驅動構 造作為針對於資訊記錄區域之資訊讀取或寫入機構，因此 可降低製造成本。 進而，較好是上述資訊記錄區域具有記錄層與位於其背 反射層，上述试料分析區域具有上述流路與位於其 月面側之反射層，對於所對應之反射層，上述記錄層與上 述机路位於相反側。藉此，由於藉由所對應之反射層反射 自項取或寫入機構、上述光檢測機構分別出射之光線，可 以各自機構分別受光，因此可易於構成裝置。 進而，較好是上述資訊記錄區域設置於内周側，上述試 料刀析區域設置於外周側。藉此，可直接使用現行光資訊 記錄媒體之驅動器。 進而&好疋於上述資訊記錄區域中與前群形成面相同 之平面上形成有上述流路之凹部，該凹部之開口部使用密 子構件氆封而形成有上述流路。藉此，因於碟片上形成前 :時’可同時形成流路之凹部，&而可實現製造步驟之簡 單化。 或者，較好是上述碟片具有上述資訊記錄區域之前群、 口己錄層與反射層形成於單面之基板，以及於該基板之上述 反射層形成面上直接或介以保護層所形成之密封構件，於 。亥在封構件内面形成有上述流路之凹部。藉此，即使碟片 基板之形狀相同，亦可僅改變密封構件之形狀，即可變更 流路形狀，因此可根據用途便於製造多種分析用碟片。 或者，較好是於上述試料分析區域設置有用以記錄藉由 99041.doc 1300129 則機構可讀取之資訊的預製訊坑或前群。據此， t;料浐/Η幾構等讀取預製訊坑或前群，藉此可實行例如 ::敗：入口或分析部位之位置對準，可確認設置有複數個 •、之流路編f虎，或可檢測碟片_速度等。 [發明之效果] 據本t明，可發揮流動系反應之流路保存反應歷程之 同時連績且繼續以光學檢測系掃描保存於流路内之 反應歷程’藉此可暫時加以敎。故而，&需採用藉由與 反：：進行同步發揮功能之檢測系加以測定之方法，可複 只行光子測疋，可貫行提高精度或變更光學條件之測 定。 、方將本發明利用於核酸分析，則可簡化pCR動力學解析 ，反應開始時之模板DNA濃度定量。gp，藉由縮短光學測 定自開始至結束為止之時間’可緩和光學檢測系之穩定性 要求。進而，可以一個光學檢測系實行複數個條件之光學 測定。進而，又可使用相對於pCR進行而應答緩慢之檢測 用試劑，可更加靈活地選擇檢測用試劑、光學測定。 又，利用本發明之核酸分析用碟片之情形時，可藉由於 將基板旋轉中心與中心設為同一點之圓的圓周上存有一個 連績流路上之複數個測定點，藉由基板旋轉固定該光學檢 測系，於該狀態下連續測定一個連續流路上之複數個測定 點。進而，可觀察到藉由基板旋轉固定光學檢測系之定 點。 故而，根據本發明，可直接利用現行光資訊記錄媒體之 99041.doc -19- 1300129 .驅動器或檢測系構造之-部分，可設為用以實施上述方法 之核酸分析裝置或核酸分析用碟片之構造。 【實施方式】 於本發明之含有核酸之分析用試料中， 之核酸分析用試劑。藉此，為藉由上述PCR實二:: 析’亦可含有通常使用之PCR用試劑，具體的是於水溶液 ::合有成為擴增目的之模板舰’具有將最佳溫度設為 =溫=特徵且作為合成模板互補DNA之酶的熱抵抗性腿 聚合酶，於上述模板DNA上所選擇之兩處特定序列中分別 具有雙鏈形成能之兩種引子DNA’以及成為〇财聚合酶之 基質的核苷酸。 又，於藉由本發明之核酸分析方法實行同步pCR之情形 時，作為含有核酸之分析用試料，可進而含有由於與雙鏈 &而增大螢光強度之色素（螢光色素），以將色素/猝 滅d配置於附近且藉由DNA延伸反應引起色素/猝滅劑解 離之方式設計的核酸探針，以於分別附加有供體色素與受 體色素之兩種核酸探針所鄰接之區域中由於雜交引起色素 間螢光共振能量移動現象之方式設計的核酸探針。對於混 合於含有核酸之分析用試料中之螢光色素或核酸探針，不 會加以特別限制，可根據用途選擇。例如，作為螢光色 素可較好地例示有 SYBR Green i(Moleculai* Probes)。 又，作為上述核酸探針，可較好地例示有具有任意序列之 T叫Man 探針（Roche)、雜化探針（Hybridizati〇n

Pr〇bes)(Roche)等。對於藉由本發明之核酸分析方法成為 99041.doc -20- 1300129 定量目的之模板DNA由來或鹼基序列，不會加以特別P艮 制，亦可源自人類血液、尿液、唾液、精液以及乳汁等， 又，亦可源自人類以外之生物。 對於混合於本發明之含有核酸之分析用試料中的熱抵抗 性DNA聚合酶，不會加以特別限制，可根據用途使用各種 熱抵抗性DNA聚合酶。例如，經擴增之DNA未滿3k鹼基之 情形時，作為標準pol I型Taq DNA聚合酶，較好是TaKaRa Taq(TaKaRa)、Gene Taq(NIPPONGENE)等。又，於實行正 確PCR之情形時，可較好地例示有oc型DNA聚合酶之KOD plus、Pfu DNA 聚合酶、Pfu Turbo DNA 聚合酶 (TOYOBO)、PLATINUM Pfx DNA 聚合酶（Invitrogen)、 Pyrobest DNA 聚合酶（TaKaRa)、ProofStart DNA 聚合酶 (Qiagen)、Pwo DNA 聚合酶（Roche)以及 Advantage HF2(Clontech)等。進而，又於擴增超過20k鹼基之長DNA 之情形時，一併使用Taq DNA聚合酶與具有3’—5’核酸外 切酶活性之熱抵抗性DNA聚合酶，或使緩衝劑最適於GC 豐富之序列擴增，藉此可使用可擴增長DNA之製品；可較 好地例示有KOD Dash、EXL DNA聚合酶（TOYOBO)、 Expand 20kb PCR System(Roche)、PLATINUM Taq DNA聚 合酶 High Fidelity、Elongase Enzyme Mix、ThermalAce DNA 聚合酶（Invitrogen)、Advantage Genomic and-GC Genomic (Clontech)以及 TaKaRa LA Taq with GC buffer(TaKaRa)等。 作為DNA之光檢測方法，可採用下述方法。 99041.doc -21 - 1300129 例1 :使用由於與雙鏈結合而可增大螢光之色素的方法 PCR試劑可使用例如Roche · Diagnostics公司之PCR套組 (商品名「LC DNA Master SYBR Green I套組」）。該套組 含有Taq DNA聚合酶、反應缓衝液以及dNTP，又含有 SYBR Green I作為檢測試劑。將該套組濃縮10倍，例如於 PCR溶液之全量為20 μΐ時，亦可添加2 μΐ。例如PCR溶液 之全量為20 μΐ時，亦可含有10〜100 ng之模板DNA，亦可 以最終濃度成為〇·1〜1 μΜ之方式調整引子DNA。又，亦可 藉由PCR使模板DNA内之擴增區域處於50〜1000鹼基間， 以此方式設計引子DNA。進而，亦可使用該套組附屬之 MgCl2儲料，將MgCl2濃度調整為1〜5 mM，最終以純水調 整溶液之全量。 使用送液機構，將以如上方式調整之反應溶液送入流 路。流路與溫度設定較好是使用揭示於Kopp等文獻 (Science 280，1046-1048(1998))中之形式。有時送液之最佳 流速會根據流路内徑等有所不同，但較好是經過10秒〜1分 鐘通過一個溫度循環。 上述高溫區域之設定溫度係根據模板DNA長度或序列有 所不同，但通常於數百鹼基之模板DNA之情形時，加熱至 90〜99°C，較好是加熱至92〜97°C。另一方面，上述兩個低 溫區域内一個低溫區域B 1之設定溫度，其根據與引子DNA 之解離溫度有所不同，於使用有15〜30個鹼基之引子DNA 之情形時為55〜70°C。另一個低溫區域B2之設定溫度，其 較好是設定為聚合酶之最佳溫度，即設定為70°C〜75 °C。 99041.doc -22- 1300129 於本發明中’較好是使移動於流路内之反應液加熱至上述 DNA之解離溫度以上，於該流路外部設置加熱機構，藉此 形成上述高溫區域；較好是使移動於流路内之反應液控制 為上述DNA之解離溫度以下，於該流路外部設置溫度控制 機構藉此形成上述低溫區域B1、B2。並且，通過各設 疋溫度區域之時間，較好是其比值係高溫區域：低溫區域 成為1 : 2〜1 : 3，較妤是於低溫區域内進而兩個溫度設定 區域Bl、B2之比值B1 : B2成為丨·· 24 ·· 3。 藉由上述條件實行PCR後，可藉由螢光測定實行檢測。 激發波長較好是SYBR Green I具有吸收之波長，亦可使用 LED(47G )，亦可使用稜鏡等自白色光源中取出光線， 又，檢測波長較好是5 10〜55G nm。作為光源，藉由選擇螢 光色素，不僅可使用LED而且亦可使用青紫色lD(4〇5 nm)、紅色 LD(635 nm )等。 藉由上述基板旋轉機構旋轉基板，並且對流路上之測定 點照射激發光，藉由檢測機構檢測所放射之螢光，藉此可 測定位於流路上之PCR反應歷程。流路上之測定點只要係 一個循環中之低溫區域，即可為任何一處。但是，較好是 全部循環結束後，停止送液後，經過與反應溶液至少通過 高溫區域-低溫區域之一個循環時間相同時間之培育後再 貫行測定。 例 2 ·· TaqMan法

4劑可使用PCR用套組（商品名rTaqMan Universal pCR

Master MixHybridization Probes套組」；R〇che.Diagn〇stics 99041.doc -23- 1300129 公司製造），檢測試劑中使用TaqMan Probe，可根據套組 附屬之協議調整試劑。反應條件與例丨相同。可藉由螢光 測定實行檢測’具體是可使用與例1相同之方法檢測。 又，本例中藉由使用序列與色素不同之幾個Taq]y[an Probes，同時進行複數個反應且實行檢測。結合於TaqMan Probes之色素，其可自眾所周知之例如FAM、Cy3、Texas Red以及Cy5中選擇，激發波長分別為45〇〜495 nm、 500〜5 5 0 nm、565〜590 nm、630〜65 0 nm，檢測波長分別為 510〜527 nm、565〜590 nm、606〜650 nm、670〜750 nm。激 發光亦可使用分別對應於波長之LED，亦可使用稜鏡等自 白色光源中取出光線。於進行激發、檢測波長不同之複數 次測定之情形時，可改變檢測系設定並且多次實行下述方 法·藉由上述基板旋轉機構旋轉基板，並且對流路上之測 定點照射激發光，藉由檢測機構檢測所放射之螢光。 於本發明之核酸分析方法中，使含有上述核酸之分析用 試料流入交替重複通過高溫區域與低溫區域之流路。作為 邊流路’例如圖1 (a)所示，可採用下述構成：設置有彎折 為Z字形狀之流路1 〇，沿著該流路丨〇之一方彎折部} 〇a之列 没置有高溫區域A，沿著另一方彎折部1⑽之列設置有低溫 區域B。但是，如圖i(b)所示，例如亦可於延伸為直線狀 之流路10中交替形成高溫區域A與低溫區域b。 该情形時，較好是將流路之高溫區域A設定為9〇〜99°C。 較好是將低溫區域B設定為50〜80°C，更好是設定為55〜60 °C與65°C〜75°C之兩個溫度。 99041.doc •24- 1300129 机路進而亦可分為三個或四個以上之溫度區域。 進而，又流路亦可藉由通過時間性升降溫度之區域，承 受溫度循環。 由於使含有上述核酸之分析用試料經由上述流路，於高 溫區域中引起雙鏈0>|人之解離，於低溫區域中引起藉由單 鏈模板DNA與引子之結合以及模板DNA與來自引子複合體 之引子3’末端之DNA聚合酶所產生之延伸反應。 並且，例如沿著通過圖2之各循環之低温區域b之線 L1藉由光檢測機構2 0檢測上述流路之複數個部位，藉此 可連續檢測出位於上述流路内且含有上述核酸之分析用試 料的反應進行過程。 又’亦可沿著圖2中自上述流路之高溫區域a移動至低溫 區域B，或自低溫區域b移動至高溫區域a之線[2，以特定 間隔It由光檢測機構2 0檢測複數個部位，該情形時，流路 内含有上述核酸之分析用試料成為高溫，並且可檢測出解 離DNA之狀況，可調查出由PCR所擴增之dNA溫度曲線。 光學檢測系較好是藉由與一般吸光光度計、螢光光度計 相同之光學系加以檢測，進而亦可例示有藉由雷射讀取頭 所實行之檢測。作為光學系之光源，可例示有氘氣燈、鹵 素燈以及半導體雷射。又，作為光學系之受光器，可例示 有光電子增倍管或CCD、光電二極體等。分光機構具備稜 鏡或滤波器、光柵、狹縫、光束分光器、透鏡以及鏡子 等。測定吸光度時亦可於測定點處通過或反射光線。檢測 螢光時，較好是於檢測效率良好之任意地方配置受光器。 99041.doc -25- 1300129 測定濁度時基本上與吸光度之測定相同。 再者，試料通過-個循環之高溫區域與低溫區域之時 較好是將各循環之反應調整至料平穩階段為止。可 藉由改變試料流速或流路長度，實行該調整。X，亦可監 控各循環之反應狀態，從而控制上述試料之流速。 由於流路通過光學檢測系之下部故而可實行複數個點之 測定，為此可列舉出使形成有該流路之毛細管或基板移動 之方法以及使光學檢測系移動之方法，亦可使用其中任何 一者或兩者之方法。 作為該流路之移動機構’可例示出使用有馬達與螺旋或 馬達與傳動帶之極普通之搬送機構。更好是可藉由旋轉流 路實行該複數個點之測定’作為旋轉機構，可例示出使用 於步進馬達或光碟驅動之絲舰機構。於使用光碟驅動 之主軸伺服機構之情形時，必須使用形成有用以施加伺服 之循軌的基板1成有該循軌之基板，其可與形成有流路 之基板相|5] ’亦可不同。通常’較難移動光學檢測系，但 於光學檢測系非常小之情形時可以一般使用之搬送機構加 、洋夕動作為較小之光學檢測系，可較好地例示有光碟驅 動之雷射讀取頭。 本發明之核酸分析方法，可利用於例如環境檢查、食物 檢查、農業檢查、法醫學、個人識別檢查以及動物識別檢 查等之用途。 圖3係表示用以實施本發明核酸分析方法之分析裝置之 一例的概略構成圖。如同圖（a)所示，該分析裝置3〇具備有 99041.doc -26- 1300129 旋轉機構40，藉由該旋轉機構40旋轉驅動之碟片5〇，配置 於忒碟片50上方且用以形成高溫區域以及低溫區域之溫度 控制機構70，配置於上述碟片50下方之内周附近的光資訊 記錄媒體之讀取或寫入機構9〇以及配置於上述碟片5〇上方 之外周附近之光檢測機構20。 如同圖（b)所示，溫度控制機構7〇具有高溫加熱部”與 低溫加熱部72。高溫加熱部71與低溫加熱部72以高溫加熱 部71位於内周，低溫加熱部72位於外周之方式配置為同心 圓狀。作為溫度控制機構70，可較好地使用例如電熱線、 珀爾帖元件以及燈加熱器等。 於圖4中揭示有碟片50之一例。該碟片5〇於中心具有旋 轉軸之插通孔51，於内周側設置有資訊記錄區域52，於外 周側設置有試料分析區域53。於試料分析區域53中形成有 複數個流路10。該實施形態中，合計15個流路1〇排列形成 為放射狀，對於各流路附加1]0號卜15，目測該⑴號卜。， 可分別對應於各流路注入各試料。再者，為光檢測機構2〇 可識別上述複數個流路之1]3號，以大於其他流路間之間隔 分離ID號15之流路1〇、10號1之流路1〇。又，對於碟片 附加有碟片之識別號54。 如圖5所示，各流路1〇具有設置於其一端之試料注入口 11，供給用液體儲存部12，沿著碟片5〇之半徑方向且複數 次來回於内側與外側之2形部13，容納用液體儲存部“以 及設置於他端之空氣出口 15。注入DU以及供給用液體儲 存部12，其與容納用液體儲存部14相比更加位於内周侧。 99041.doc -27· 1300129 ^。圖5中’將上述空氣出σ 15設置於與試料注入口 u 同一圓周±，但亦可魅人ση相比更加位於内側。 」且，若旋轉碟片50,則自注入口 η注入至供給用液體 :^ 12之忒料，其以離心力作用流過流路10之Ζ形部 机入谷納用液體儲存部14。可藉由控制碟片5〇之旋轉 速度或改變流路_狀之方式，調整其流速。例如，藉由 :流路之Ζ形部13之彎折部分剖面積設定為大於其他部

刀則可實現順暢流動，或亦可以將一部分設定為小於其 他邛刀之方式設置開始流動之開端。並且，上述高溫區域 Α低溫區域B橫穿上述Z形部13之流路，對於基板旋轉中 心形成為同心圓狀。 如圖6所示，碟片5〇具有聚碳酸酯等之透明基板54。於 該基板54上之資訊記錄區域52上形成有前群兄，於試料分 析區域53上形成有流路1〇之凹部56。並且，於形成有前群 55以及凹部56之基板54表面，形成具有含有有機色素之感 光色素膜之光吸收層57。進而，於該光吸收層57上形成包 含Au等金屬膜之反射層58。並且，於資訊記錄區域52之全 面與試料分析區域53之凹部56以外之部分，形成包含紫外 線固化性樹脂等之頂層59。最後，覆蓋包含聚乙烯薄膜等 之密封構件60，使凹部56封閉而形成流路1 〇。 於上述碟片50中，資訊記錄區域52具有光資訊記錄媒體 之記錄構造，可藉由配置於碟片50下方之讀取或寫入機構 9〇，讀取或寫入資訊。又，可藉由光檢測機構2〇檢測流入 試料分析區域53之流路10内之試料。如此，由於資訊記錄 99041.doc -28- 1300129 &域5 2之項取、寫入方向與試料分析區域5 3之光檢測方向 以夾住反射層5 8之方式相對，因此可易於配置讀取或寫入 機構90以及光檢測機構20，因可利用眾所周知之光資訊記 錄媒體之驅動構造作為讀取或寫入機構9〇，故而可降低製 造成本。 於圖7中揭示有光檢測機構20之各種範例。圖7(a)之光檢 測機構2 0 a之構造如下··對於流路1 〇之測定點16，自碟片 _ 50單面介以分光機構22照射光源21之光線，將透過碟片5〇 相反面之光線介以分光機構23藉由檢測器24受光。 圖7(b)之光檢測機構20b之構造如下··自配置於碟片5〇 單面之光源2 1 ’經由分光機構22、光束分光器25，向流路 10之測定點16照射光線，使用光束分光器25於直角方向上 取出藉由形成於流路10背面側之反射層58所反射之光線， 經由分光機構23藉由檢測器24受光。 圖7(c)之光檢測機構2〇c之構造如下：自配置於碟片％單 • 面之光源21，經由分光機構22向流路1〇之測定點16照射光 線，接受該光線後試料中之特定成分會發光，使該發光通 過分光機構23，藉由檢測器24受光。 於圖8(a)中揭示有流路之檢測機構9〇之一例。於該流路 之檢測機構90中，藉由雷射驅動電路（無圖示）自635 波 長之雷射光源91出射雷射光，使該雷射光經由多透鏡％、 半鏡面9 3準直器（無圖示），進而經由接物鏡9 5，照射至 /瓜路（無圖不）之測定點16。因流路中有對於分析用試料溶 液添加修飾有螢光色素Cy5之TaqMan探針，故而若存在模 99041.doc •29· 1300129 板DNA，則藉由635 nm之雷射光可產生670-750 nm之螢 光。並且，將藉由設置於流路背面側之反射層（無圖示）所 反射之635 nm之原始雷射光與流路中產生之670-750 nm之 螢光’經由接物鏡95、準直器（無圖示）導向半鏡面93，以 半鏡面93經過90度反射後，將以繞射晶格1 〇 1齊聚相位之 635 nm之原始雷射光束分為複數個光束，將其藉由聚光透 鏡96聚光至光檢測元件97。

於圖8(b)中揭示有成像於光檢測元件97上之主光束1 〇2 以及藉由繞射晶格1 〇 1繞射而作成之繞射光束丨之圖像。 主光束圖像中，成像有635 nm之原始雷射光與67〇_75() nm 之螢光之混合光。於一方繞射光束中，僅成像有635 nm之 原始雷射光。因主光束成像之位置處，將無法透過65〇打⑺ 以下光線之截止濾波器104置於光檢測元件前部，故而於 主光束成像之點上僅可檢測出螢光之光量。 並且，將以光檢測元件97所獲得之主光束/繞射光束之 光量變換為電氣信號，藉由擴增電路（無圖示）擴增後，以 來自主光束之信號測^螢光量，有效利用來自繞射光束之 信號而實行聚焦/循軌等之祠服。根據如上所述之核酸分 析裝置30’將含有核酸之分析用試料注人碟片似各流路 U)之注人口 η，儲存於供給用液體料部叫，藉由旋轉 機構40旋轉碟片5〇,則試料自供給用液體儲存部12流入流 路1〇’試料經由Ζ形部13流動。此時，試料交替通過藉由 溫度控制機構70所形成之高溫區域Α與低溫區域Β，藉由 PCR實行DNA擴增。 99041.doc -30- 1300129 並且，若最初流入流路10之試料到達容納用液體儲存部 14，則可藉由光檢測機構2〇，沿著碟片5〇周緣之線c(參照 圖4)檢測DNA。光檢測機構2〇於通過高溫區域八與低溫區 域B之每一個循環時，於低溫區域B之特定部位實行dn a 之檢測，依據其數值藉由無圖示之電腦求得各測定點中之 DNA濃度。 其結果為，可求得重複通過高溫區域A與低溫區域3之 0 循環時之DNA擴增曲線。由於該擴增曲線中成為檢測對象 之DNA試料中之初期濃度越高則曲線之上升越早，因此藉 由解析上述擴增曲線，可求得試料中之對象DNA之初期濃 度，可定量對象DNA。 再者，讀取或寫入機構9〇有利於下述情形··讀取記錄於 資訊記錄區域52之資訊，正確算出試料注入口〗丨之位置， 或關聯於藉由光檢測機構2〇獲得之檢測值所對應之流路1〇 之ID號’或監控流路丨〇之各測定點中之測定值，計算碟片 φ 50之最佳旋轉數，將控制信號送入旋轉機構40。又，若各 流路10之每種試料結束DNA定量，則可將其結果寫入資訊 吕己錄區域5 2。 又’根據該分析裝置，可於試料流過流路10且流入容納 用液體儲存部14之時刻實行檢測，藉此可一次測定每個循 裱之DNA濃度，因此可有效實行測定作業。 於圖9中揭示有本發明中所使用之核酸分析用碟片之其 他例。 该碟片50a具有聚碳酸酯等之透明基板54。於該基板54 99041.doc -31 - 1300129 上之資§fU己錄區域52中形成有前群55，於試料分析區域53 中形成有流路10之凹部56。並且，於形成有前群55以及凹 部56之基板54表面’形成具有含有有機色素之感光色素膜 之光吸收層57。進而，於資訊記錄區域52中，於該光吸收 層57上形成包含Αιι等金屬膜之反射層58，於該反射層58上 形成頂層59。另一方面，於試料分析區域53中，覆蓋包含 聚乙烯薄膜等之密封構件60，使凹部56封閉從而形成流路 10。進而，於試料分析區域53之基板54之相反面側，形成 反射層5 8 a。 於上述碟片50a中’資訊記錄區域52具有光資訊記錄媒 體之記錄構造’藉由配置於碟片50a下方之讀取或寫入機 構90，讀取或寫入資訊。又，藉由光檢測機構2〇檢測流入 試料分析區域53之流路1〇之試料。以如此之方式，由於資 訊記錄區域52之讀取、寫入方向與試料分析區域53之光檢 測方向以夾住反射層5 8之方式相對，因此易於配置讀取或 寫入機構90以及光檢測機構2〇。 於圖10中進一步揭示有本發明中所使用之核酸分析用碟 片之其他例。 該碟片50b於透明基板54之大致全面上形成有前群55， 於形成有該前群55之表面上形成具有含有有機色素之感光 色素膜之光吸收層57。其次，於光吸收層57上形成反射層 58’於反射層58上形成頂層59。另一方面，準備由聚乙烯 薄膜等所成之密封構件60，其藉由層壓轉錄或壓花加工等 形成有凹部56。將該密封構件60熱封於頂層59上，從而形 99041.doc *32- 1300129 成流路1 〇。 根據該碟片50b，由於1g L ρ 於其以反㈣58且其下方成為資 吕fU己錄區域52，上方成Α外粗八2 r L 貝 成為4科刀析區域53，因此可擴大利 用Ή記㈣域52°又’僅改變形成於密封構件6G下面之 凹。Ρ56 ’即可變更試料分析區域53中流路w之形狀。 於圖U中進—步揭示有本發明中所使用之核酸分析用碟 片之其他例。 〃 該碟片^於透明基板54之大致全面上形成有前群55, 於形成有該前群55之表面上形成具有由有機色素之感光色 素膜所成之光吸收層57。其次，於光吸收層57上形成反射 於°亥反射層5 8上，形成藉由絲網印刷而具有孔部 6a之頂層59。進而’於其上部覆蓋由聚乙烯薄膜等所成 之密封構件6〇,使孔部56a封閉從而形成流路…再者， 亦可以旋塗法成膜保護層（無圖示），該保護層係於反射層 58與頂層59間用以保護反射層58。 根據该碟片 5 0 C，由；^ 盆 Αχ J± c 6 J. Θ. r* o Jj· 二 田於具夾住反射層58且其下方成為資 訊記錄區域52’上方成為試料分析區域53，因此可擴大利 用資訊記錄區域52。又，僅變更於絲網上所形成之流路圖 案，即可變更試料分析區域53中流路10之形狀，因此可降 低成本。 於圖12中進而一併揭示有本發明中所使用之核酸分析用 碟片之其他例與其製造步驟。圖中左側係製造步驟之流程 圖’右側係碟片之剖面模式圖。 "T先，以與上述圖6所示之例子相同之方式，於基板54 99041.do, -33- 1300129 單面上形成前群55以及凹部36，於其上部形成光吸收層 57(步驟 S1)。 接著’濺鍍Au後形成反射層58(步驟S2)。 並且，於資訊記錄區域52上，絲網印刷頂層59(步驟 S3) ’以照射紫外線之方式加以固化（步驟S4)。 其次，於PET薄膜内面覆蓋聚乙烯層經過層壓之聚乙烯 層壓薄膜61，其後加以熱封（步驟S5)。其結果為，封閉凹 邛5 6之開口從而形成流路1〇。再者，於聚乙烯層壓薄膜61 上形成有注入口等之孔6丨a。再者，作為上述層壓薄膜， 亦可使用聚碳酸酯薄膜等。 於圖13中進而一併揭示有本發明中所使用之核酸分析用 碟片之其他例與其製造步驟。圖中左側係製造步驟之流程 圖’右側係碟片之剖面模式圖。 首先，以與上述圖10以及圖u所示之例子相同之方式， 於基板54之全面上形成前群55 ’於其上部形成光吸收層 57(步驟 S1)。 接著’錢鑛Αιι後形成反射層58(步驟S2)。 並且，絲網印刷頂層59(步驟S3)，照射紫外線使立固化 (步驟叫。此時，藉由頂層59之未塗敷部分而形成流路1〇 之凹部56。 &乙烯層壓薄膜 封閉凹部56之開 薄膜61上形成有 其次，於頂層59上覆蓋與上述相同之 61，其後加以熱封（步驟S5)。其結果為， 口從而形成流路1〇。再者，於聚乙烯層壓 注入口等之孔61 a。 99041.doc -34- 1300129 於圖14中進而一併揭示有本發明中所使用之核酸分析甩 碟片之其他例與其製造步驟。圖中左側係製造步驟之流程 圖，右側係碟片之剖面模式圖。 首先，以與上述圖10以及圖11所示之例子相同之方式， 於基板54之全面上形成前群55，於其上部形成光吸收層 57(步驟 S1)。 接著，濺鍍Au後形成反射層58(步驟S2)。

並且，於資訊記錄區域52上絲網印刷頂層59(步驟s3)， 照射紫外線使其固化（步驟S4)。 其次，於試料分析區域53上覆蓋與上述相同之聚乙烯層 壓薄膜61，其後加以熱封（步驟S5)。此時，於聚乙烯層壓 :專膜61之内面側形成有凹部56’熱封聚乙烯層壓薄膜6ι， 藉此形成有流路10。再者，於聚乙烯層壓薄膜“上形成有 注入口等之孔61 a。 於圖15中’作為本發明中所使用之核酸分析用碟片之其 他例，進而揭示有對於形成有流㈣之試料分析區域53賦 與預製訊坑資訊之例。該預製訊坑62亦可與流路10重疊， 亦可不相重疊，預掣^ 、Λ几62之列係以同心圓狀而非螺旋 狀，設置有複數個相同信號之執道。 藉由設置如此之預萝邙ρ次 仏… 表aTU几貝訊，可將藉由光檢測機構20 所得之讀取頭之循軌/中隹 ^ 專之伺服，或流路資訊（每個流 路之剖面構造/彎折次I / ^ 斤人數Λ主入體積等之資訊），或注意事項 等傳至驅動器。 又 亦 可於形成机路之步驟中同時形成條形碼資訊 取 99041.doc * 35 - 1300129 得與該流路資訊之整合，藉此實行雙重校對。 再者，亦可代替預製訊坑62而設置前群。 於圖16中，作為本發明中所使用之核酸分析用碟片之其 他例，進而揭示有每個流路丨〇中設置有位置對準用伺服作 號63之例。可於形成流路10之步驟中同時形成該位置對準 用伺服信號63。並且，可藉由光電耦合器等讀取位置對準 用伺服信號63。 [實施例] 以下列舉實施例具體說明本發明，但該等實施例並非用 以限定本發明之範圍。 [實施例1] 以下述條件製造出上述圖4以及圖6中揭示之碟片。 碟片直徑自46 mm至76 mm，於其表面形成寬度〇·8 μ m、深度〇·〇8 μΓη、間距16 μιη之螺旋狀資料記錄用前群 55 ’於其外周部藉由射出成形法成形如圖4、圖6中所示厚 度1·2 mm、外控12〇 、内徑15 mm([)之聚碳酸酯基板 1 ’其形成有流路1〇以及資訊信號/視覺顯示文字54。該聚 碳酸S旨基板1之羅克韋爾硬度ASTMD785，其與M75鉛筆硬 度HB同等’熱變形溫度aSTMd648係4.6kg/cm2、12TC。 作為用以形成光吸收層57之有機色素，將0.65 g之1，1， 二T基3,3,3’，3,四甲基4,5,4’，5，二苯并吲哚羰花青高氯酸鹽 (曰本感光色素研究所製造、產品號NK3219)溶解於10 cc 雙丙_醇溶劑中，將其藉由旋塗法塗敷於上述基板1之表 φ ’形成包含膜厚130 nm之感光色素膜之光吸收層2。以 99041.doc -36- 1300129 該光吸收層2之複折射率之實數部n abs、其膜厚d abs與再 生光之波長λ所得之p = n abs d abs/又為0.45，且上述複 折射率之虛數部k ab s為0 · 0 5。 其认’於5亥碟片直徑45〜118 ηιηιφ區域之全面上，藉由 /賤鍍法成膜膜厚80 nmi Au膜，形成反射層58。於該反射 層58上’自碟片直徑4〇 mni至80 mm為止絲網印刷紫外線 固化性樹脂，對其照射紫外線使其固化，形成膜厚1〇 μΓη 之頂層59。該頂層59固化後之羅克韋爾硬度ASTMD785為 M90 ’ 熱變形溫度 ASTMD648 為 4.6 kg/cm2、135 °C。進 而，於該頂層59與反射層58上，於14〇t下熱封聚乙烯層 壓薄膜61，作成混合碟片，該混合碟片於内周部具有藉由 雷射所形成之資訊記錄區域（CD_R區域）52且於外周部具有 流路10等之試料分析區域53 ;上述聚乙烯層壓薄膜6ι包含 附加有切割為環形狀之3〇 μηι層厚之聚乙烯層的5〇 _透明 PET薄膜。 流路於上述碟片射出成型時 μηι之凸部而形成於該碟片二 成之該檢查用流路，其具有 存部12，沿著碟κ ^ Λ 4 t 八人就上述檢查用流路10之形狀加以說明。該檢查用 ，藉由形成於模具上高度為50

99041.doc -37- 1300129 給用液體儲存部12以及容納用液體儲存部14均形成為直徑 10 mm之圓形狀，供給用液體儲存部12之中心形成於上述 基板之半徑40 mm位置，一方該容納用液體儲存部14之中 心形成於上述基板之半徑53 mm位置。又，z形部13係將 中心叹為上述基板之半徑53 mm位置，形成於縱向 mm(半徑方向）、橫向6·5 mm(圓周方向）之長方形範圍内。 Z形部13之流路1G亦包含與上述相同形狀之溝槽，形成為 於該長方形範圍内可於縱方向上來回3〇 5次。於直徑12〇 攀 mm之上述碟片之同一圓周上，於每次旋轉22·5。之位置上 形成有合計15個上述流路1〇。但是，流路1〇間之每一個部 位相隔45。，藉此可藉由光檢測機構2〇識別流路⑺之⑴。 其次，就上述檢查用流路之上述反應用蛇行流路中之溫 度分佈加以說明。藉由作為與上述基板同心圓之内徑％ mm、外徑no mm之環狀紅外線加熱器，將直接位於該環 狀紅外線加熱器下方之區域加熱至65〇c。進而，籍由作為 φ 與上述基板同心圓之内徑11 〇 mm、外徑π 6 mm之環狀紅 外線加熱器，將直接位於該環狀紅外線加熱器下方之區域 加熱至95°C。直接位於該兩個環狀紅外線加熱器下方之區 域中包含形成有該反應用蛇行流路之上述長方形範圍。 [實施例2] 於本實施例中，就上述檢查用流路中用以反應之試劑溶 液加以說明。 反應試劑： 聚合酶（0.05單位/μΐ TaqDNA聚合酶（商品名「ExTaq聚 99041.doc -38- 1300129 合酶」），反應緩衝液（商品名「2xExTaq緩衝劑」(均由 TAKARA公司製造）），PCR基質（1 μΜ正向（forward)引子 (GENEST 公司製造）、1 μΜ反向（reverse)引子（GENEST 公 司製造）、0.4 mM dNTP)，模板 DNA(10 ng/μΐ 質體

pUC(Promega公司製造）），螢光色素溶液（0.05 pg/ml SYBR

Green I(Molecular Probes公司製造）） 引子序列： 正向引子：序列號1 •反向引子··序列號2 使用吸管自上述試料注入口 11注入上述反應試劑4 μ1(以 模板DNA計為40 ng)，將該反應試劑填充於上述供給用液 體儲存部12中。其次，藉由上述兩個環狀紅外線加熱器， 將直接位於該兩個環狀紅外線加熱器下方之區域設為65 以及95°C。進而，又因將填充於供給用液體儲存部12之該 反應試劑送入通過上述Z形部13，故而旋轉上述基板而施 _ 加有離心力。將上述基板之旋轉數設為2500 rpm，藉此該 反應試劑經過2〇秒來回通過一次z形部13(流速：約每秒1 mm)。 以旋轉數2500 rpm旋轉20分鐘後，停止旋轉該基板3〇 移其後，以500 rPm旋轉數旋轉該基板，藉由上述光學 才双測糸測疋Z形部1 3之流路10每個來回之螢光強度。 又，用以比較，自上述反應試劑中去除模板DNA之情形 時，對於100倍稀釋模板DNA濃度之情形亦實行相同測 定。 99041.doc -39- 1300129 圖1 7係表示螢光強度與Z形部來回次數之關係曲線。該 結果為，可獲得與作為定量目的物之模板DNA量（0 ng、 〇·4 ng、40 ng)密切相關的dna擴增曲線。 再者’以下述數式1表示流體之一般流速與上述基板旋 轉數之關係式。 [數1]

u = P①1risriyirjL 上述數式1中之符號含義為如下所述。 u :流速 dH :水力直徑 P :密度 ω :角速度 r :平均半徑 △ r :流路始點與終點之半徑差 :黏度 L :流路全長 於上述說明中’所謂水力直徑係指適於矩形流路之流體 參數，可藉由下述數式2求得。 [數2] dH=2wd/(w+d) 上述數式2中之符號含義為如下所述。 W :流路寬度 d :流路深度 將以如此方式測定之結果示於圖17中。 99041.doc 1300129 「序列表FREE TEXT」

序列號1 :帛以擴增質體pUC上之特定序列的PCR用DNA 正向引子。 序列號2 ·用以擴增質體？11(：上之特定序列的用DNA 反向引子。 [產業上之可利用性] 根據本發明，可提供—種核酸分析方法，其可更加簡單 且於短時間内實行利用流動系反應之分析測定原理且用以 追蹤反應進行過程之分析作業；X，可提供一種核酸分析 裝置以及分析用碟片，盆衆隹於i ^ 乃具么集化具備檢測系、反應系、輸 出系以及驅動系且製造成本較低。 【圖式簡單說明】 圖1 a -圖1 b係表示本發明夕妨_八 、 不钐明之核酸分析方法中流路示例的 說明圖。 圖2係表示本發明之核酸分析方法中試料檢測部位之示

例的說明圖。 圖3a-圖3b係表示本發明夕 不知明之核酸分析裝置之一實施形態 之概略構成的說明圖。 之一實施形態的平 圖4係表示本發明之核酸分析用碟片 面圖 片中流路之放大說明圖 用碟片之剖面構造的模 於本發明之核酸分析裝 式圖。 置中之光 圖5係該核酸分析用碟 圖6係表示該核酸分析 圖7a-圖7c係表示使用 檢測機構之示例的說明圖 99041.doc 1300129 圖8a-圖8b係表示使用於本發明之核酸 路之檢測機構之一例的說明圖（a)與自正面 97之圖（b)。 分析裝置中之流 觀察光檢測元件 圖9係表示本發明之核酸分析用碟片 式圖。 之其他例的剖面模 圖10係進一步表示本發明之核酸分析用 别面模式圖。 碟片之其他例的 刹=:步表示本發明之核酸分析用碟片之其他例的 圖12係根據製造步驟進一步表示本發 片之其他例的說明圖。 圖13係根據製造步驟進一步表示本發 片之其他例的說明圖。 圖14係根據製造步驟進一步表示本發 片之其他例的說明圖。 圖1 5係表示本發明之核酸分 次 析用碟片中設置有預製訊坑 舅5孔之其他例的說明圖。 明之核酸分析用碟 明之核酸分析用碟 明之核酸分析用碟 圖1 6係表示本發明 之其他例的說明圖。 圖17係表示本發明之實施例 增質體DNA之特定序列且測定 【主要元件符號說明】 中，藉由流動系同步PCR擴 出肇光強度之結果的圖表。 流路 彎折部 10 l〇a，l〇b 99041.doc -42- 1300129

11 12 13 14 15 16 20, 20a，20b，20c 21 22, 23 24 25 30 36 40 50，50a，50b，50c 51 52 53 54 55 56 57 58， 58a 59 注入口 供給用液體儲存部 Z形部 容納用液體儲存部 空氣出口 測定點 光檢測機構 光源 分光機構 檢測器 光束分光器 分析裝置 凹部 旋轉機構 碟片 插通孔 資訊記錄區域 試料分析區域 基板 前群 凹部 光吸收層 反射層 頂層 -43 - 99041.doc 1300129

60 61 62 63 70 71 72 90 91 92 93 95 96 97 101 102 103 104 A B 密封構件 聚乙烯層壓薄膜 預製訊坑 位置對準用伺服信號 溫度控制機構 而溫加熱部 低溫加熱部 流路之檢測機構 雷射光源 多透鏡 半鏡面 接物鏡 聚光透鏡 光檢測元件 繞射晶格 主光束 繞射光束 截止濾波器 南溫區域 低溫區域 99041.doc -44- 1300129 序列表 <*m〇>日商太陽誘電股份有限公司 <120〉核酸分析方法、分析裝置及分析用碟片 <130> JP03-0148 <140〉094111204 <141〉2005-04-08 <160> 2 <170> Pqitentln version 3.1

<210> 1 <211> 24 <212〉DMA <213> 寳體 pUC _ <220〉 <221 > mlsc.feature <222> (ΐμ24) <223〉PCR 引子 <400> cgcca

ttcccagtca cgac

<210> 2 <211> 24 <212> DNA <213〉質體 pUC <220> <221 > mlsc.feature <222〉（1M24) <223〉PCR 引子 <400> 2 cagtgggag$ tccttgaagg caat 99041.doc

Claims (1)

1. Ι300_29^ιΐ2〇4 f虎專利申請案 ^ 中文申請專利範圍替換本(97年4月） I 十、申請專利範圍： 1 ·種核酸分析方法’其特徵在於：使含有核酸之分析用 試料流入溫度重複循環且圖案·變化之流路，於上述流路 之複數個部位上實行光學性檢測。 2.如請求項1之核酸分析彳法，#中含有上述核酸之分析 用4料為含有DNA聚合酶、引子DNA以及dNTp，且含有 模板DN A或檢體作為任意成分者。 3·:明求項1或2之核酸分析方法，其中上述光學性檢測係 猎由向上述流路之應檢測部位照射光線且檢測由所照射 之光線產生之透過光、反射光或發光加以進實者。 4.如請求们之核酸分析方法，其中於含有上述核酸之分 析用試料通過溫度不高部分之部位進行上述複數個部位 之檢測。 5如π求項1之核酸分析方法’其中上述流路至少部分且 有Ζ形圖案，以使自該Ζ形圖案之彎折部至下一個彎折部 之流路通過溫度不同之區域的方式形成上述流路。 6·=請求項5之核酸分析方法，其中上述流路形成於經旋 動之碟片上，該碟片上高溫區域與低溫區域形成為 同心圓狀，使自彎折部至下一個彎折部之流路通過形成 為同心圓狀之上述高溫區域與上述低溫區域，以此方式 :成上述Ζ形圖案，藉由上述碟片旋轉所產生之離心力 I入上述流路且含有核酸之分析用試料進行送液。 .:請求項6之核酸分析方法，其中於上述碟片上 訊記錄區域與試料分析區域，利用上述資訊記 99041-970421.doc 1300129 、 取或寫入資訊，於上述試料分析區域中設置上述流路且 實行光學性檢測。 8 ·如請求項7之核酸分析方法，其中介以上述碟片，自所 對向之方向分別實行針對於上述資訊記錄區域之資訊讀 取或寫入以及針對於上述試料分析區域之光學性檢測。 9· 一種核酸分析裝置，其特徵在於：具備 流路，其中流有含有核酸之分析用試料， 溫度控制機構，其於含有上述核酸之分析用試料流過 上述流路時，使含有上述核酸之分析用試料之溫度根據 重複圖案加以變化，以此方式控制通過區域之溫度， 以及 光檢測機構，其光學性檢測流過上述流路且含有上述 核酸之分析用試料； 且於上述流路之複數個部位，藉由上述光檢測機構實 行檢測。 春10.如請求項9之核酸分析裝置，其中上述光檢測機構具有 對上述流路之應檢測部位照射光線之光射出機構，以及 檢測由所照射之光線產生之透過光、反射光或發光之受 光機構。 11. 如請求項9之核酸分析裝置，其具有於含有上述核酸之 分析用試料通過上述溫度不高部分之部位進行上述複數 個部位檢測之構成。 12. 如請求項9之核酸分析裝置，其構成為：上述流路至少 部分具有Z形圖案，自該2形圖案之彎折部至下一個彎折 99041-970421.doc 1300129 部之流路通過藉由上述溫度控制機構所形成之溫 區域。 工 13. 如請求項12之核酸分析裝置，其構成為：上述流路妒成 於經旋轉驅動之碟片上，該碟片上高溫區域與低溫區域 形成為同心圓狀，使自f折部至下一個彎折部之流路通 過形成為同心圓狀之上述高溫區域與上述低溫區域，以 此方式形成上述Z形圖案，藉由上述碟片旋轉所產生之 離心力對流人上錢路且含有核酸之分析用試料進行 液。 14. 如請求項13之核酸分析裝置，其中於上述碟片上設置有 資訊記錄區域與試料分析區域，於上述資訊記錄區域中 :置有用以讀取或寫入資訊的光資訊記錄媒體用讀取或 二機構：於上述試料分析區域中對置有對上述流路之 光線且檢測其透過光、反射光或發光的上 述光檢測機構。 15·Γ=Γ14之核酸分析裝置，其構成為：介以上述碟 »進仃針對上述資訊記錄區域之資 以及針對於上述試料分析區域之光檢測。 戈寫入 Α刀析用碟片’其特徵在於：於經旋轉驅動之 二二：置，讀取或寫入資訊之資訊記錄區域，以 析區域.含有核酸之分析用試料之流路的試料分 向盘針對於上述資訊記錄區域之資訊讀取或寫入方 碟片之方式相對。 η之先檢測方向以夾住上述 99041-970421.doc 1300129 17. 其中上述流路至少部分 圓周方向行進之Z形圖 如請求項16之核酸分析用碟片， 具有以Z形狀蛇行且沿著上述碟片 案0 18·如請求項16或17之核酸分析 啊用碟片，其中於上述流路之 一部分上分別形成有供給用、、戌 用液體儲存部與容納用液體儲 存部，上述供給用液體儲在加 A 者存。P，與上述容納用液體儲存 部以及具有上述Z形圖幸之、、六 系之机路相比，更加位於内周 側。

   其中上述資訊記錄區域 〇 其中上述資訊記錄區域 19 ·如請求項16之核酸分析用碟片， 具有光資訊記錄媒體之記錄構造 20·如請求項16之核酸分析用碟片， 具有記錄層以及位於其背面側之反射層，上述試料分析 區域具有上述流路以及位於其背面侧之反射層，對於所 對應之反射層’上述記錄層與上述流路位於相反側。 η.如請求項16之核酸分析用碟片，其中上述資訊記錄區域 設置於内周側’上述試料分析區域設置於外周侧。 22.如請求項16之核酸分析用碟片，其中於上述資訊記錄區 域中與前群形成面相同之平面上形成有上述流路之凹 邛該凹。卩之開口部藉由密封構件加以密封從而形成有 上述流路。 23·如請求項16之核酸分析用碟片，其中上述碟片具有上述 資訊記錄區域之前群、記錄層與反射層形成於單面上之 基板，以及於該基板之上述反射層形成面上直接或介以 保產層所形成之密封構件，於該密封構件内面形成有上 99041-970421.doc 1300129 I 述流路之凹部。 24.如請求項16之核酸分析用碟片，其中於上述試料分析區 域中設置有用以記錄藉由上述光檢測機構可讀取之資訊 的預製訊坑或前群。

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