TWI280282B - Microarray method of genotyping multiple samples at multiple loci - Google Patents

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TWI280282B
TWI280282B TW090116726A TW90116726A TWI280282B TW I280282 B TWI280282 B TW I280282B TW 090116726 A TW090116726 A TW 090116726A TW 90116726 A TW90116726 A TW 90116726A TW I280282 B TWI280282 B TW I280282B
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hybridization
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Mark A Schena
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Telechem Internat Inc
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Description

1280282 A7 "----- -B7____ 五、發明説明（Γ7 — 發明領域. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係大致關於基因型鑑定法，特別是關於用以疾 病診斷之基因型鑑定法。 背景 在人類、動物及植物體内的許多病理狀態現今已在基 因層級上獲得瞭解。隨著人類基因體圖譜的發表完成，可 預期到在未來數年内會有更多人類疾病的遺傳基礎將被鑑 疋出。因此’源自於一個體之Dna的分析原則上可使得遺 傳性病狀能在沒有明顯症狀下被診斷或鑑定出。此對於諸 如代謝性疾病的許多疾病而言是有好處的，因為早期診斷 可避免往後的嚴重醫藥複雜性。 通常被通稱為基因型鑑定法的DNΑ序列分析法係為此 藝所習知。一般而言，為了測定樣品内之DNA是否對應於 具有已知基因序列的特定疾病狀態，可在容許進行雜交作 用的條件下’令樣品暴露於與該疾病相關的核酸探針。核 酸探針係經標示，俾其可以偵測該等探針是否已與dna樣 品相雜交。在一技術中，該等探針係被排列在一位於晶片 上之陣列内，並將各個禪針分配在特定位置處。將該陣列 暴露於經標示的DNA樣品中之後，掃描裝置可檢測陣列中 之各個位置’並測定一標的分子是否與位在該位置之探針 進行交互作用。陣列晶片係在商業上由諸如Affymetrix (3&1^(：1&%〇八)所提供，且被描述於授予人££711^1^的數 件專利中（參見諸如美國專利第6,045,996號、第5,858,659 號及第5,925,525號以及本案所列參考文獻陣列已供用於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚） !280282 B7 五、發明説明（2 ) 峨定序之應m述於美國專利第6，G25，u6號 號、第5,525‘號及以，搬，231號中之雜交式定 序法。 雖然用於疾病診斷的基因鑑定法已屬可得者，但為使 該等方法可供用於公共衛生設備，其在價格上必須人理 例如，雖然相關基因分析係為已知者，但新生兒筛檢則主 ►要因為價格因素至今才藉由質譜法來完成。再者，公共衛 生設備内之DNA診斷必須可實際應用於多個 月、 譜法不易或難以處理的遺傳狀態。對於多個樣^需求可 猎由利關時進行處理的數個陣列晶片來解決。如頒予 Rava W α/.的美國專利第5,545,5S1號中所述者，可利用— 個包括-標準96-井微滴定盤的型式，該微滴定盤在各個井 之底部含有一陣列晶片。為了在多個病人之樣品中展現出 相同的試驗，可將位於溶液内之各個病人樣品予以標示並 導入不同的井内，且各個井均具有一個相同的陣列晶片。 因此’在此方法中’個別的陣列晶片係分別供用於各樣品， 基於每位病人在陣列、試劑與樣品處理等方面的成本， 泛使用可能會花費不庇。 頒予Brown以以的美國專利第5,8〇7,522號述及一 針對一疾病基因之已知突變來篩選多個病人，其係利用— 病人體基因DNA與代表一特定基因之所有已知突變的探 針DNA片段所構成之複數微陣列。該等微陣列被製造在一 背覆有塑膠之靖基纖維素片體上，且在個別陣列之間具有 石夕酮橡膠障壁元件’以避免交叉感染。所有的微陣列均被 廣 種由 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐）
-------------------……^—— C請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂----- :線丨 1280282 A7 B7 五、發明説明（ 加工成為單一片材。但是，Brown ei'a/.之方法對於各個突 變對偶基因或被篩選之遺傳標誌係採用個別的微陣列。 !……-:L. 裝…： (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此，需要一種具有足夠準確性的基因鑑定法供診斷 之用，該方法所費不多且提供可經大規模應用之足夠處理 量。理想上，此一方法容許在單一分析中就多種疾病對於 多個病人進行篩選。一般而言，該方法容許在單一分析中 就位於多個遺傳位址的對偶基因來篩選源自於人類、動 物、植物或微生物材料中之任一來源的多個樣品。 概述
•訂I ·線丨 本發明係提供一種用於在單一分析中測定數個樣品在 數個遺傳位址之基因型的方法。依據該方法，源自於數個 樣品之體基因片段係利用聚合酶鏈鎖反應引子進行擴增， 其中各個體基因片段含有一遺傳位址，亦即，相關的1)^^八 標誌。該等體基因片段被形成於一個位在一表面上之微陣 列内’其中位在該表面上之各個位置處的材料係基本上對 應於源自於單一樣品的單一體基因片段。該微陣列與一互 補於微陣列上之體基因片段的合成寡核苷酸混合物相雜 交。隨後，藉由讀取微陣列訊號來同時推導出該等樣品的 基因型鑑定資訊。該方法可供用於疾病診斷，或篩選源自 於植物或動物物種的對偶基因，因而可供廣泛應用。 麗式簡要說明 本案文件含有至少一個彩色圖式。具有該（等）彩色圖 式的本案影本可在付出必要費用後向美國專利商標局取 得0 1280282
t1圖為依據本發明之-具體例之-種用於同時測定 數個樣品在數個遺傳位址之基因型的方法之流程圖。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第2圖為依據本發明之一具體例之微陣列的一小部分 之概圖。 第3A至3BSI顯示出依據本發明之—具體例（如後述實 例中所述），從72個不同病人樣品所製備出之具有576個特 徵位點的微陣列而分別由Cy3與Cy5放射所測得的直接螢 光訊號。該等微陣列訊號係利用一具共焦式掃描器在ι〇〇% 之光學放大管（PMT)及80%之雷射設備下讀取。使用一種傳 統之虹色碼，其中紅色為強度最高者，而黑色為強度最低 者。 第4A至4B圖分別為第3A至3B圖所示數據的放大部 分。字母（a-c)及數字（1-28)係將各個不同病人樣品的位置 劃定如下· alO-12，樣品 1 (S/S) ; al3-15，樣品 2 (A/S); al6-18，樣品 3 (S/C) ; al9-21，樣品 4 (C/C) ; a22-24，樣 品 5 (A/C); a25-27，樣品 6 (A/A) ; bl-3，樣品 7 (E/E) ; b4-6， 樣品8 (A/E) ; b7-9，樣品9 (A/A) ; blO-12，樣品 10 (野生 型）；bl3-15 ’樣品11 (昇合子型）；bl6-18，樣品12 (同合 子型）；bl9-21 ’樣品13 (野生型）；b22-24，樣品14 (異合 子型）；b2 5-27,樣品15 (同合子型）。陽性雜交對照組（μ 8-30, cl-3，c4-6，c7-9及cl(M2)亦被示出。空白鍵尺對應於 mm ° 第5圖係顯示第4 A圖中之虹色碼所代表的訊號定量 值。在減除背景後將三次重覆測量予以平均。各個病人樣 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 1280282 A7 j_______B7 __ 五、發明説明（5 ) 品的基因型示於圖式上方與下方。 第6A及6B圖顯示出依據f發明之一具體例（如後述實 例中所述），以間接標示法從與第3人及33圖同組之病人樣 品所製備出之一微陣列，而分別由Cy3與Cy5放射所測得的 訊號。，訊號係如第3 A及3B圖中所述者來檢測。 詳細敘述 一種基因鑑定法能同時獲得多個個體在多個疾病位址 的資料。如本案發明說明.書所述，基因鑑定係特定地定義 為在特定遺傳位址處呈單一核菩酸解析層級的區別性對偶 基因。一遺傳位址被定義為一基因或DNA標誌的染色體位 置。因此，依據本發明之方法具有提供個體之篩選及診斷 資料所需要的準確性，該等資料可供用於醫學判定的基礎。 該方法之概括程式係繪示於第丨圖中。首先，在步驟1〇 I 中從生物性樣品中早離出體基因DNA樣品。該等樣品可 具有包括細菌、酵母菌、植物或動物之任何來源。含有DNA 的任何生物體均可接受該方法。為了應用於人類疾病之診 斷，可從諸如血液、羊水、新生兒血卡、唾液、精液、上 皮刮離物及活體針檢物等獲得生物性樣品。對某些生物體 而言，生物性樣品可含有RNA但無DNA。該等樣品係利用 標準流程來皐離並純化。 隨後，在步驟！2中，以基因專一性引子並利用聚合酶 鏈鎖反應（PCR)來擴增樣品DNA，俾生成所謂的擴增片 | 段。PCR法被廣泛應用且被泛述於此藝中（請參見諸如美國 專利第 4,683,202 號、第 4,683，195 號、第 4,800，159 號、第 *_丨丨丨丨 ........... 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐) ^ -
(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂— 丨威------ 1280282 A7 ” _______B7_ -五、發明説明（6 ). 4,965，188號、第5,333,675號以及本案發明說明書中所列資 考文獻）。一特定引子對可供用於相關的各個體基因片段， 亦即，供用於含有已知潛在性突變或其他相關DNA變異的 各個體基因片段。因此，該方法可應用於任何能以〇1^八標 5患所鐘定出的疾病上。此等疾病包括諸如纖維性囊腫、酪 胺酉文血症、楓糖漿尿症、抗胰蛋白酶缺乏症、戊二酸 • 尿症第I型、遺傳性聽覺喪失、β型地中海貧血症、長鏈 3-羥基醯基CoA去氫酶缺乏症以及中鏈弘羥基醯基c〇A去 氫酶缺乏症。該方法特別適用於諸如鎌形細胞貧血症及半 乳糖血症等疾病，在該等疾病中，經詳細研究之位在單一 基因的單一突變可產生疾病表現型。DNA標誌可代表任何 已知形式之DNA變異，包括突變、單一核苷酸多形性及小 型刪除等。唯一的要求在於，相關DNA變異必須位於供用 以生成擴增片段的引子對内。此可確保從所有樣品（包括同 • 合子、異合子及正常個體）在一特定位址所產生的擴增片段 係以近乎等同之效率來擴增。 以多個引子對分別地處理各個生物性樣品，俾生成各 個個體的多個擴增片段，各個擴增片段與特定個體之特定 體基因片段有關，而各體基因片段含有一相關遺傳位址。 雖然該方法可應用於位在約4〇至1〇〇〇個鹼基對之範圍内的 擴增片段，但在目前所實施的方法中，各個擴增片段之長 度為約60個鹼基對。如目前所經常實施者，各個pcR反應 的總體積為約50 μΐ。可預見進一步的最佳化可將最低體積 減少至5-10 μΐ，而容許該方法藉由將樣品製備所使用之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚）
------------------------裝—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) :線丨 1280282 A7 ^ __________B7__ 五、發明説明（7 ) PCR擴增與純化試劑的用量降至最低，以獲致額外的成本 降低。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將擴增片段予以純化，以移除諸如核苷酸、酵素、引 子及會干擾微陣列之轉印、接合與雜交的其他物質等污 染。PCR擴增片段之純化方法可得自於許多廠商，包括 TeleChem (Sunnyvale，CA)及Qiagen (Valencia，CA)。經純 化之擴增片段被懸浮在緩衝液内，例如由氯化鈉與檸檬酸 鈉所構成之溶液（SSC)、二曱亞ZZl(DMSO)溶液、由氯化 鈉、磷酸鈉與乙二胺四乙酸鹽所構成之溶液（SSPE)或其他 標準試劑。在步驟14中，緩衝化之擴增片段被排列在標準 的96-井或384-井微滴定盤内，即每一井含有一種擴增片 段。雖然位在2-20 μΐ之範圍内的產物體積係足可形成微陣 列，但對於排列步驟而言，經純化產物的典型體積為約3-4 μΐ/井。 在96-井或384-井的規格下，DNA單離及PCR處理可容 易地變化規模，以使得在自動化實驗設備中能達成每曰 >10,000個樣品。此一處理量可容許每年擴增240,000個病 人的10個位址。因此，譚方法能達致族群的廣泛篩選以及 諸如農業上之作物繁殖、法醫學與軍事用途等所需的其他 高處理量應用。 在步驟16中，位在微滴定盤内的體基因片段之高密度 微陣列係被形成在一基材上，而微陣列之目前尺寸在通常 呈25 mmX 76 mm顯微玻片之標準尺寸的基材上佔約1.0 cm2。一典型之位點直徑為約100 μχη，且以約140 μιη的中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) Α4規格（210X297公釐） 1280282
發明説明 心對中心間隔來設置，俾在基材上之區別性分開位置處形 成各位點。後列實例所述實施中的位點總數係在1〇 之 轉印面積内為576個位點，而樣品的規模增大與微點印技術 的當前能力能獲致每cm2内超過1，〇〇〇個位點，估計為5 }料 個位點/cm2 ’以使得所形成之18 mmX 72 mm微陣列含有約 82,944個位點/25 mmX76 mm顯微玻片。因此，本發明尤方 法各許同時從多個個體，亦即至少1 〇個、至少6〇個或至少 5,000個個體獲得基因鑑定資料。理論上，每位公民的微陣 列可提供族群中每個人的永久基因檔案。 在微陣列上之各位點基本上對應於源自於單一個體之 單一擴增片段，此係落在PCR法的準確性内。在此，樣品 被轉印三次，彼此呈140 μηι的間距。三次重覆之點印增加 了結果的可信度，其被概示於諸如第2圖中。第一列26從左 至右含有三個位點，該等位點對應於被PCR引子對a所處 理之源自於個體號碼1的擴增片段，而被編號為1A，其接 續以被PCR引子對B所處理之源自於個體1的三個位點等 等。在第2圖中，列28係顯示源自於個體2的擴增片段，其 被PCR引子對A、B與C所處理。雖然源自於不同擴增片段 溶液的位點確須置於不同位置，但並非一定需要將源自於 不同樣品的位點設置在不同的列中。三次點印之形式本身 亦非必須，一次、二次、四次或其他形式亦可供用於生成 可信賴的基因鑑定資料。 用以形成微陣列之現行技術包括接觸或非接觸式轉印 技術。一個例子為Cartesian Technologies (Irvine，CA)的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（21〇x297公I) ------、------------------裝------------------訂------------------線· (請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 11 1280282 A7 - _____B7_ 五、發明説明（9 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ?118)^ 5500運動控制系統，其配備有丁616〇^1]1(3111111}^&16, CA)的Stealth微點印列印頭。接觸式點印技術包括利用實 體針（solid pins)、開口針（split pins)、鑷型針、微型點印針 以及針環（pin and ring)等機械裝置。接觸式轉印技術在商 業上可得自於數個廢商，包括BioRobotics (Boston，MA)、 Genetix (Christchurch，United Kingdom)、Incyte (Palo Alto, CA)、Genetic Microsystems (Santa Clara，CA)、Affymetrix (Santa Clara, CA) ' Synteni (Fremont, CA) ' Cartesian Technologies (Irvine，CA)及其他。非接觸式轉印技術包括 「喷墨」式裝置，諸如利用壓電式噴霧器、氣泡-噴霧器、 微型螺管閥及注筒泵等。非接觸式轉印技術的廠商包括 Packard Instruments (Meriden, CT) ' Agilent (Palo Alto, CA)、Rosetta (Kirkland, WA)、Cartesian Technologies (Irvine，CA)、Protogene (Palo Alto, CA)及其他。接觸式與 非接觸式裝置皆可供用於能進行三維運動的自製或商用裝 置上 〇 Engineering Services Incorporated (Toronto, Canada)、Intelligent Automation Systems (Cambridge， MA)、GeneMachines (San Carlos, CA) - Cartesian Technologies (Irvine，CA)、Genetix (Christchurch，United Kingdom)等之運動控制裝置亦適用於製造依據本發明之 微陣列。 用於本案方法的PCR反應中之引子對通常含有諸如烷 胺基團等反應性基團，其使得擴增片段能專一地接合至諸 如玻璃基材等可經化學處理的微陣列基材。例如，基材可 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） 1280282 A7 B7 五、發明説明 含有反應性酸基，而容許經由席夫鹼（Schiff’s base)終端接 合至接有胺基之PCR產物，從而生成反應產物。該接合反 應係藉由脫水反應來進行。諸如含有反應性醛基的疏水性 轉印表面可用以避免樣品分散，因而能獲致較小之位點尺 寸與較高之微陣列密度。具有反應性醛基之微陣列基材可 得自於數個廠商，包括TeleChem (Sunnyvale，CA)及CEL Associates (Houston，TX)。然而，顯然亦可使用許多其他 的微陣列表面與接合化學中之任一者，包括含有聚離胺 酸、有機矽烷、環氧矽烷、反應性羧基、膠墊材料、塗覆 有硝基纖維素之玻璃及其他物質的塗層或處理者。除了終 端接合流程以外，顯然亦可任擇地使用數種非專一性流 程，包括利用紫外線或熱、靜電交互作用、疏水性交互作 用及其他手段，而與基材交聯。 步驟18中，微陣列被加工並與經標示之合成寡核苷酸 混合物相雜交。利用習用流程將微陣列予以加工，俾移除 未結合之DNA材料、令未反應醛基失活以及在微陣列雜交 之前令被轉印的PCR片段變性（參見諸如Schena et al·， PNAS 93，10614-10619，1996)。一般而言，雜交反應係在 含有鹽與試劑的水性溶液中並於一較合成寡核苷酸之熔點 Tm低約10°c之溫度下進行。雜交混合物係由與位在微陣列 上之擴增片段中所存在的對偶基因互補的合成寡核苷酸所 構成。亦即，混合物中之各個合成寡核苷酸係對應於一為 PCR引子對所選定之基因位址。依據本方法，幾近無數的 不同雜交混合物可被製備出，供檢測位在源自於任何含核 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） ---------------------裝------------------、可------------------線. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 13 1280282 五、發明説明.（11 ) 一 酸生物體之相關擴增片段内的對偶基因。該方法顯然亦可 變化規模，以使得含有數打、數百甚或數千種不同合成募 核苷酸的混合物可供用以同時檢測許多不同的相關對偶基 因，從而檢測許多不同的疾病。唯一的要求在於，具有得 自於野生型與經改變之對偶基因的序列資料，以及界定互 補於各個PCR引子對的基因序列。合成募核苷酸可廣泛地 得自於許多廠商，包括£(^ Bi〇techn〇l〇gy (S〇uth San
Francisco, CA)以及 〇peron Technologies (Alameda，CA)。 混合物中之合成寡核苷酸通常為約i 〇至3〇個寡核苷酸 長，俾將區辨擴增片段内之單一核苷酸變異的能力提升最 咼。例如’該等寡核苷酸可為15個核苷酸長（丨5-聚體），其 中相關對偶基因位在相對於該15_聚體的中央位置（位置 8)。將混合物中之合成寡核苷酸予以標示，而標示物可位 在諸如各個募核苷酸之5,端，但可預期到位在5，或3,端甚 或此二者的標示物亦能在所述方法中運作。直接及間接標 示法均為此藝所熟知。用於直接法的通用螢光標籤物包括 編號為Cy3及Cy5的染料，該等染料係分別在約55〇 nm& 650 nm處發出螢光。寡核苷酸混合物可含有在多個波長處 發出螢光的多個螢光標籤物。任何不同種類之螢光標籤物 均可供用以取代Cy3及Cy5標籤物，以容許檢測一或多種不 同的顏色。可預期多色法是有用的，例如，其容許利用一 種顏色以最高效率檢測野生型對偶基因，而利用另一種顏 | 色以最高效率檢測突變型對偶基因。其他種類的標籤物包 括多種商用染料及染料衍生物，諸如被稱為Alexa、螢光 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格(210X297公楚) ' 1280282 12 A7 B7 五、發明説明（ 素、若丹明、FAM、TAMRA、Joe、ROX、德州紅、BODIPY、 FITC、奥利岡綠、Lissamine及其他。此等染料及衍生物中 之許多者可得自於諸如Molecular Probes (Eugene，OR)、 Amersham Pharmacia (Bucks，United Kingdom)及 Glen Research (Sterling，VT)等供應商。 間接標示法包括諸如以生物素或二硝基酚所標示者， > 該等標示物本身為不發螢光的有機分子，但對於含有接合 有螢光團的抗體綴合物具有反應性。因此，諸如生物素與 二硝基酚等標示物、輔抗原或抗原決定基容許藉由所謂的 間接手段進行螢光檢測，因為位於各個位點處的螢光係導 因於經由與非螢光性標示物進行交互作用而微陣列進行交 互作用的抗體綴合物。某些抗體綴合物含有諸如辣根過氧 化酶等酵素，辣根過氧化酶能催化短生期絡醯胺自由基接 合至附於微陣列表面之蛋白質的酪胺酸部分。藉由將酪醯 胺連結至各種螢光部分，可藉著涉及生物素及二硝基酚標 I 示物、抗體-辣根過氧化酶綴合物以及酪醯胺-Cy3與絡醯胺 -Cy5衍生物的間接手段來檢測經雜交之產物。然而，任一 位習於此藝者均會明暸，任何的直接或間接標示流程均可 供用於包括螢光或非螢光法的檢測。另一種螢光法係利用 Genisphere (Oakland，NJ)所述之樹狀聚體（Dendrimer)技 術。另一種非螢光法係利用珠粒與粒子，諸如Genicon (San Diego, CA)所述之共振光散射（RLS)粒子。 與經標示之合成寡核苷酸混合物相雜交之後，在步驟 20中，藉由習用方法來掃描或讀取微陣列，俾以測得基因 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公楚） ------------------------裝------------------訂-----------------線· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 15 1280282 A7 - __B7_ 五、發明説明（13 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 鑑資料。例如，利用一具有雷射激發與光學放大管檢測的 共焦式掃描設備’諸如GSI Lumonics (Bellerica，MA)所供 應的ScanArray 3000。任擇地，許多不同種類的共焦與非 共焦式螢光檢測系統可供用以實施該方法，諸如Axon Instruments (Foster City， CA)、Genetic Microsystems (Santa Clara，CA)、Molecular Dynamics (Sunnyvale，CA)及 Virtek (Woburn，MA)所供應者。替代性之檢測系統包括利 用氣體、二極體與固態雷射以及利用諸如氙或鹵素燈泡等 其他不同種類之放射源的掃描系統。除了光學放大管以 外，檢測器可包括利用電耦裝置（CCD)與矽化互補金屬氧 化物半導體（CMOS)晶片的照像機。 無論是將經直接標示或是經間接標示的寡核苷酸用於 雜交作用，一特定微陣列位點所測得之訊號強度係與混合 物中之募核苷酸與特定位點處之體基因片段的雜交程度直 接成比例。募核苷酸混合物可含有互補於野生型或突變型 對偶基因的核苷酸，故依雜交混合物如何製備而定，可測 得野生型或突變型體基因片段。將來自於相同微陣列位點 的訊號（諸如來自於第2圖中標示為1A的三個位點者）予以 平均，俾增加準確性，從而提供微小的變動係數（CVs)。 許多手段可供用於獲取並評估基因鑑定資料。如前所 述，絕對螢光訊號可供用於測定特定擴增片段之對偶基因 總成。任擇地，亦可利用具有二或多種顏色的寡核苷酸混 合物，而將特定的顏色賦予給特定的對偶基因，例如，野 生型為綠螢光，而突變型對偶基因為紅螢光。許多其他的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公釐） 16 I280282 A7 B7 五、發明説明（14 ) 流程亦可與直接標示法共同使用，諸如螢光染色以評估各 個位點的DNA含量。可得自於Molecular Probes (Eugene， 〇R)的SYBR綠色染料容許在螢光素異硫氰酸鹽（FITC)染 料的波長範圍内測得被染色之DNA。 本發明之特徵與優點係進一步地藉由下列實例來例示 而非限制，其中針對鐮形細胞貧血症與半乳糖血症來篩選 > 新生兒血液樣品。 實例 將來自於72個不同新生兒的新生兒血液樣品予以單 離，並利用下表1中被編號為ARDC 100-1〇9的基因專一性 引子來擴增。此五個引子對含有對應於Glen Research (Sterling，VT)之C6胺基修飾的反應性胺基，其使擴增片段 得以專一性地接合至微陣列基材。在下表1中，各個寡核奋 酸序列中之「N」位置係標出C6胺基修娜。該等引子對包 括對應於總共三種人類基因的5個不同體基因片段·· β_球蛋 灸白、CFTR與GALT。在人體中，與β-ί求蛋白、CFTR與GALT 基因有關的疾病分別為鐮形細胞貧血症、纖維性囊腫與半 乳糖血症。體基因片段包括位在三個基因内的五個疾病位 址’各個擴增片段的概略尺寸為60個驗基。各個pcR反應 的總體積為50 μΐ。 體基因片段予以擴增’隨後加以純化以移除污染物。 依據製造商之指南來使用一個由TeleChem (Sunnyvale，CA) 所出品之3 84井PCR純化套組。將經純化之產物再轉浮於1 〇 μΐ之無菌蒸餾水内，並將1〇 μΐ中之2 μΐ與2 μ1*Τβΐ6αιβηι 本紙張尺度適用中國國家標準（0^) Α4規格（210Χ297公I) -----------------------裝------------------、訂------------------線. (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 17 1280282 - A7 ___B7_ 五、發明説明（15 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (Sunnyvale，CA)所提供之2X微點印溶液，俾獲致總共為4 μΐ之樣品以供轉印之用。各個擴增片段在樣品平盤中之濃 度為100 eg/μΙ。將各為4 μΐ的72個樣品與總共24個僅含有 點印緩衝液或含有合成寡核苷酸之對照組樣品共同置入 384-井平盤之相鄰井内。在實驗中，該24個對照組樣品係 提供陽性與陰性雜交對照組。將總共96個樣品（72個新生兒 擴增片段與24個對照組）置入384-井微滴定盤，以使得位於 首四列的所有井（Α1-24至D1-24)各含有4 μΐ之樣品。可使用 Corning Costar (Corning，ΝΥ)之聚丙烯384-井微滴定盤，但 來自於諸如 Whatman Polyfiltronics (Rockland，MA)等其他 販售商之平盤亦可替代使用。該疏水性材料會產生凸狀樣 品小滴，相較於被含納於諸如聚苯乙烯等材料之微滴定盤 内的樣品，其易於具有略為增進之裝載與轉印效率，惟許 多不同種類的微滴定盤均足可固持樣品。 表1.供用於擴增體基因片段之PCR引子 引子編號 描述 序列 ARDC-100 鐮形細胞C對偶基 因5’ 5, N—AAACAGACACCATGGTGCAC 3, "Trdc-ioi 鐮形細胞C對偶基 因3,. 5’ NCCCACAGGGCAGTAACGGCA 3’ ARDC-102 鐮形細胞E對偶基 因5’ 5, NGCAAGGTGAACGTGGATGAA 3, "^ARDC-103 鐮形細胞E對偶基 因3’ 5’ NGTAACCTTGATACCAACCTG 3’ ARDC-104 纖維性囊腫AF508 對偶基因5’ 5’ NCTGGCACCATTAAAGAAAAT 3’ ARDC-105 纖維性囊腫AF508 對偶基因3’ 5, NTTCTGTATCTATATTCATCA 3’ ARDC-106 GALT Q188R 5’ 5, NTGGGCTGTTCTAACCCCCAC 3, ARDC-107 GALT Q188R 3’ 5, NAACCCACTGGAGCCCCTGAC 3, ^^RDC-108 GALT N314D 5’ 5, NCCACAGGATCAGAGGCTGGG 3, ^ARDC-109 GALT N314D 3’ 5, NGGTAGTAATGAGCGTGCAGC 3, 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4规格（210X297公釐） !28〇282 Α7 Β7 五、發明說明（16) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 利用一具配備有 TeleChem (Sunnyvale，CA)之 Stealth 微點印技術的 Cartesian Technologies (Irvine，CA)之PixSys 5500型動作控制系統，將由72個新生兒樣品加上24個對照 組樣品所構成的微陣列製成一微陣列。Stealth列印頭含有 總共4個以4.5 mm中心對中心之間隔被排設成2 X 2構形的 轉印針。該組4個針可供用於在384-井微滴定盤中一次裝載 並轉印4個樣品。使用總共24次轉印循環（96個樣品除以4 個針）來轉印72個新生兒樣品以及24個對照組。總轉印時間 為約48分鐘。 所有的96個樣品均被轉印三次（總共288個位點）而成 為呈140 μιη點距的100 μιη位點，以使得每4針均形成含有 72個個別微陣列位點（總共288個位點除以4個針）的微陣列 次格架。隨後，相對於第一陣列呈2微米偏位，將所有的96 個樣品再轉印二次’以提供所有9 6個樣品的二次重覆系列 位點（288個額外位點）。最終陣列各在約1.0 cm2之總面積下 含有總共576個微陣列位點（288加上288個）。依據製造商的 指南，將總共30個微陣列轉印在30個購自於TeleChem (Sunnyvale, CA)的 SuperAldehyde Microarray Substrates， 以容許許多不同的雜交混合物與最佳化的實施。雖然在本 實施例中有30個微陣列基材被轉印出，但應明暸數種商業 用轉印系統（包括源自於ESI(Toronto，Canada)的技術在内） 可容許在單次運作中轉印出高達120個基材。單一個微陣列 足以產生對於單一雜交混合物的基因型鑑定資訊，而多個 微陣列則容許一組給定樣品針對不同的雜交混合物進行分 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 19 1280282 B7 五、發明說明（17) 析。 II---·-裝 — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 树印步驟之後，令微陣列在室溫下於微陣列裝置之 平板上乾燥至隔夜，隨後加工以移除未結合之dna材料， 使未反應之輕基失活，並於微陣列雜交反應之前令被轉印 之PCR片段變性。加工步驟如下：在室溫下浸潤於〇 2%挪 中人各歷日卞一为釦，並施以劇烈振盪，在室溫下浸潤於 瘵餾水中二次各歷時二分鐘，並施以劇烈振盪，於1〇〇。〇下 於蒸餾水中處理基材歷時二分鐘，俾使DNA變性，在室溫 下將基材陰乾5分鐘，在氫化硼鈉溶液處理基材5分鐘，該 溶液係藉由將1.2g NaBHU溶於330 ml之磷酸鹽緩衝化生理 食鹽水（PBS)内來製備，添加12〇 ml21〇〇%乙醇以減低氣 泡，在室溫下將基材潤洗於蒸餾水中一次歷時一分鐘，在 100 C下將玻片浸沒於蒸餾水内歷時5秒，將玻片予以陰 乾，並於室溫下貯存在暗處。應明暸，因為氫化硼鈉溶液 為高度反應性還原劑，故於使用前才製備，以確保位於表 面上之未反應盤基被高效率地降低。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 雜交混合物係利用由商業供應商E〇S Biotechnology (South San Francisco，CA)所製造的合成募核苷酸來製 備。各個合成募核苷酸係互補於位在特定擴增片段内之對 偶基因。新生兒樣品之對偶基因對應於相關疾病位址。為 貫施直接檢測，故使用含有Cy3及Cy5標蕺物的15-聚體混 合物’即在下表2中被標示為混合物1者。在下表2的混合物 1中’ Cy3及Cy5標籤物在各個募核苷酸序列中被分別標示 為「3」與「5」。為實施直接檢測，故使用含有生物素及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 20 五、 128〇282 發明說明Γ is) 二确基紛標籤物的15-聚體混合物，即在下表2中被標示為 混合物2者。在下表2的混合物2中，生物素及二硝基酚標籤 物在各個寡核苷酸序列中被分別標示為「B」與「〇」。合 成規模是所有被列示於表2的募核苷酸均為1〇奈莫耳，並緊 接於使用前將各個募核苷酸以一為1〇〇 之濃度懸浮在 蒸鶴水内。混合物i係藉由製成一個含有濃度各為2 之 10種寡核苷酸（表 2，ARDC110-119)配於一由 5Χ SSC(0.75 Μ氣化鈉，0.075 Μ檸檬酸鈉）與0.2% SDS(十二烷醯硫酸鈉） 所構成之緩衝液内的50 μΐ溶液而製備出。混合物2係以相 同於混合物1的方式來製備，除了該丨〇種寡核苷酸為 ARDC125-129與ARDC135-139(表2)。 雜交反應係在每個微陣列中利用ίο μΐ之混合物丨或混 合物2來實施。1〇 μΐ之混合物被施加至微陣列，而位於測 量為18 mm X 18 mm X 2mm之蓋玻片下。雜交反應係依據 製造商TeleChem (Sunnyvale，CA)之指南，於42°C下在一雜 交反應匣内實施，歷時5.5小時。經過5·5小時的雜交反應 後，將微陣列洗滌如下，以移除未雜交物質：於25°C下在 2X SSC(0.3 Μ氯化納，0·030 Μ檸檬酸納）與0.2% SDS(十二 烧醯硫酸納）洗滌二次，各歷時5分鐘，以及於25°C下在2Χ SSC(0.3 Μ氣化鈉，0.030 Μ檸檬酸鈉）洗滌乙次，歷時5分 鐘。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
21 1280282 A7 B7 五、發明說明（D) 表2.合成募核苷酸之混合物 混合物 寡核苷酸辨識編號 募核苷酸序列* 1 ARDC-110 3GACTCCTG(A/T)GGAGAA ARDC-111 5GACTCCTA(A/T)GGAGAA ARDC-112 5TGGTGGTGAGGCCCT ARDC-113 3TGGTGGTAAGGCCCT ARDC-114 3ATCATCTTTGGTGTT ARDC-115 5TATCATCGGTGTTTC ARDC-116 5CACTGCCAGGTAAGG ARDC-117 3CACTGCCGGGTAAGG ARDC-118 3CAACTGGAACCATTG ARDC-119 5CAACTGGGACCATTG 2 ARDC-125 BGATTCCTG(A/T)GGAGAA ARDC-126 BTGGTGGTAAGGCCCT ARDC-127 BATCATCTTTGGTGTT ARDC-128 BCACTGCCGGGTAAGG ARDC-129 BCAACTGGAACCTTTG ARDC-135 DGACTCCTA(A/T)GGAGAA ARDC-136 DTGGTGGTGAGGCCCT ARDC-137 DTATCATCGGTGTTTC ARDC-138 DCACTGCCAGGTAAGG ARDC-139 DCAACTGGGACCATTG *所顯示的所有序列由左至右均為5’至3’。3代表Cy3 ; 5代表 Cy5 ; B代表生物素；D代表二硝基酚。 ------------· I Γ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 在雜交與洗滌步驟之後，將微陣列予以檢測以得基因 型鑑定資訊。對於涉及混合物1之直接標示實驗而言，檢測 步驟係藉由在洗滌步驟後立即掃描微陣列之螢光放射來進 行。檢測係利用一具由GSI Lumonics (Bellerica，MA)所供 應的ScanArray 3000共焦式掃描設備來進行，該設備具有 在100%之光學放大管（PMT)設備及80%之雷射設備下。應 用該掃描器之雙色效能，來檢測位在Cy3及Cy5此二通道中 對應於混合物1寡核苷酸之雜交反應的螢光微陣列訊號。結 果示於第3A與3B_，其中第3A圖係對應源自於Cy3之螢光 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 22 1280282 B7 -五、發明說明（20) 檢測’而第3B圖係對應源.自於Cy5之螢光檢測。該等數據 係以種傳統之虹色碼來顯示，其中紅色為強度最高者， 而…、色為強度最低者；空白鍵尺對應於1〇㈤瓜。第3人圖中 之微陣列的部分放大圖示於第4入圖。微陣列訊號係三次重 ，覆不出，因為各個經擴增之新生兒患者樣品或對照組樣品 勻在郴接微陣列位置被轉印三次。微陣列内之樣品位置係 ϋ 沿著}^軸（垂直方向）以字母標示，並沿著X軸（水平方向）以數
子“示之。螢光微陣列訊號的定量可利用來自於GSI
Lumonics (Bellerica，ΜΑ)的 ScanArray軟體進行。對應於微 陣列訊號的數值繪示於第5圖。該數據顯示出，在所有的受 測樣品中，野生型、異合子及同合子均從鎌形細胞及半乳 糖血症位址被輕易地區辨出。對於所有的三次重覆測量而 言，變動係數（CVs)均為<1〇%。 源自於三個體之三個樣品的體基因片段係分別存在於 _ 微陣列位置bl-3;b4-6;及b7-9處，該等片段在諸如卜球蛋白 基因位址232處具有差異。該三個體被分別標示為E/E、A/E 與A/Λ之基因型。E/E新生兒為突變株對偶基因同合子，其 係在β _球蛋白序列之位置2 3 2處由G至A的單一核苷酸變 化，A/E新生兒在位置232處具有為突變株對偶基因與一正 常對偶基因，因而為異合子，A/A新生兒在232處具有二個 正常對偶基因（亦即，此二個對偶基因在β_球蛋白之位置 232處均含有G殘基）。位於雜交反應混合物中之對應合成 寡核苷酸（ARDC113，表1)完美地互補於ε/Ε新生兒的二個 對偶基因，完美地互補於Α/Ε新生兒的一個對偶基因，且 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公髮） ^---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 23 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1280282 A7 _ ” _B7 _五、發明說明（21) 對於A/E新生兒之另一個對偶基因含有單一核苷酸之錯配 (one nucleotide mismatch)，以及對於位在A/A新生兒中之 二個對偶基因均含有單一核苷酸之錯配。如事先預期者， 位置bl-3;b4-6;及b7-9處的微陣列訊號之強度，展現出與位 在各個微陣列位置處的新生兒樣品之基因型相一致的漸弱 訊號強度。其餘樣品之結果顯示出類似的結果，並表列於 第5圖中。 在第二個實驗中，利用混合物2寡核苷酸來進行間接標 示研究。以完全相同於涉及混合物1之直接標示實驗之方 式，將微陣列予以雜交並洗滌，除了該等微陣列係利用 MICROMAX染色套組並依據製造商NEN Life Sciences (Boston，ΜΑ)之指示來進行染色。該染色套組利用能分別 辨識生物素與二硝基酚決定基的抗體綴合物，並利用辣根 過氧化酶（HRP)來催化酪醯胺Cy3與酪醯胺Cy5在微陣列表 面的澱積。相同於直接標示研究，Cy3與Cy5通道中的檢測 係利用一具 GSI Lumonics (Bellerica，ΜΑ)的 ScanArray 3000來完成。類似於直接標示研究，由間接標示所實施的 方法顯示出數個微陣列訊號，而精確的基因型鑑定資訊可 從之推衍出，並繪示於第6A、6B及4B圖中。 從上述可顯見，本案方法提供一種基因型鑑定的新穎 方式，其相對於現今所使用之方法具有顯著的改良處。該 方法首先得以在單一分析中達成多個病人與多個位址的基 因型鑑定。本方法之關鍵特徵在於，各個微陣列位點展現 出源自於單一病人的單一遺傳片段或位址，從而獲致經擴 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _ -裝 訂-' 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 24 1280282 五、發明說明（22) 增序列與雜交反應混合物中之合成寡核奋酸間的高度專一 性。此種在[微陣列步驟中針對多㈤疾病來測試成千上 萬個病人的能力’使得本方法可立即應用於諸如新生兒筛 檢，且明顯地省時省錢。本案方法使新生兒篩檢的花費得 以低於10美元/疾病位址，因而可即時進入廣泛之商業化應 用。對於先天性遺傳疾病的早期篩檢能力亦對於人類健康 I 具有立即性的有益影響。 雖然本發明係運用特定實施例來閣述，但該閣述僅為 本發明之應用的範例，而不應被視為限制。如後列申 利範圍所界定者，本案所揭露之實 月 只1夕〗符徵的各種變化盥组 合係落在本發明之技術範疇中。 〃、
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 25

Claims (1)

  1. 、申請專利範圍 第90116726號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：94年9月 1· 一種用於在單回雜交中，同時鑑定數個樣品之基因型的 方法，該方法包含： 1)培育一得自複數個個體之聚核苷酸樣品的微陣列與 一已知序列之寡核苷酸的探針混合物，其中 a) 該微陣列含有複數個包含令人感興趣的基因 型之樣品，並且各個樣品位於分別的位置； b) 各個樣品有一聚核苷酸，該聚核苷酸包含一 含有標誌' 之已限定片段，該標|志係擇自一基 因之“ §志或是該基因之一或多個等位基因變 異體之標詰、； c) 於探針混合物中之該等募核苔酸，基本上係 由已知序列與長度之寡核苷酸構成，並且該 等募核苷酸具有數個序列係專一地互補於各 個基因型待決定之樣本的已限定片段中之聚 核苷酸序列，其中該等互補於該等聚苷核酸 之募核苷酸係擇自由下述所構成之群組··具 有可互補於一片段之序列的募核苷酸，該片 段含有對於（1) 一基因、（2)該基因之一或多個 等位基因變異體，以及（3)一基因與該基因之 一或多個等位變異體之標誌，以及 1280282 六、申請專利範圍 d) 该培育形成微陣列之聚核苷酸與互補寡核誓 酸的雜合物，並容許單一核苔酸解析度之識 別；以及 2)於單回雜交之後，檢測在該微陣列上的分別位置， 穩定的雜合物於培育期間形成，其中一雜交訊號指 出一雜合物的形成或是缺乏一雜合物的形成，且該 雜交訊號指出該個體之基因型。 2. 如申明專利範圍第丨項之方法，其中該微陣列之聚核苷 酸樣品為擴增產物。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該擴增產物係由聚 合酶鏈鎖反應（PCR)方法所產製。 4. 如申請專利範圍第3項之方法’其中該等複數個樣品包 含至少10個不同的聚核誓樣品。 其中該基因之等位基因 其中該疾病為一人類疾 5·如申請專利範圍第1項之方法 係有關一疾病。 6·如申請專利範圍第5項之方法 病。 其中該等基因為人類基 7 ·如申請專利範圍第5項之方法 因，且係擇自下述所構成之群組：β_球蛋白、，囊性纖: 變性跨膜電導調節蛋白（CFTR)與半乳糖小鱗酸尿㈣ 轉移酶（Gal-1-PIJ) 〇 8·如申請專利範圍第1項之方法，其中該微陣列係一密度 為至少1000個位點/平方公分之表面。 -29- 1280282 六、申請專利範圍 9·如申請專利範圍第1項之方法，其中該由已知序列的寡 核苔酸所構成之混合物包含顧不同的募核㈣序列。 10.如申請專利範圍第1項之方法，其中該等混合物中之募 核苔酸具有介於約1G至約3G個核^:酸之間的長度。 11·如申請專利範圍第㈣之方法，其中該等分別片段為介 於約40至約1〇〇〇個核苷酸。 12.如申請專利範圍第！項之方法，其中該培育係在一包含 鹽類與清潔劑的水溶液内進行。 13·如中w月專利圍第j項之方法’其中該雜交反應係在一 比4 L定的雜合物的解鏈溫度（⑽出叩她perature)低 約10°C之溫度下進行。 14. 如申巧專利範圍第丨項之方法，其中該等已知序列之寡 核苷酸係經標示。 15. 如申請專利範圍第14項之方法，*中該標示為螢光標 示。 16·如申請專利範圍第巧之方法，其中源自於同型合子之 樣品與源自於異型合子之樣品係可區辨者。 17·如申明專利犯圍第！項之方法，其中該等複數個聚核苷 酸之樣品至少為5〇〇〇。 18.如申,月專利範圍第!項之方法，其中該個體樣品為新生 兒血液樣品。 19· 士申明專利範圍第!項之方法，其中該個體為人類。
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