KR20030040352A - 다수 유전자좌에서 다수 샘플을 유전자형결정하는마이크로어레이 방법 - Google Patents

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Abstract

단일 검정으로 다수 유전자좌에서 다수 샘플을 유저자형 결정하는 방법이 제공된다. 구별되는 유전자좌를 나타내는 게놈 단편의 마이크로어레이가 형성되고, 게놈 단편에 대하여 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물로 혼성화된다. 유전자형결정 전보는 마이크로어레이 신호를 판독함에 의하여 추론된다. 방법은 다양한 생물학적 기원으로부터의 샘플을 특정결정하거나 다양한 응용을 위하여 사용될 수 있다.

Description

다수 유전자좌에서 다수 샘플을 유전자형결정하는 마이크로어레이 방법 {MICROARRAY METHOD OF GENOTYPING MULTIPLE SAMPLES AT MULTIPLE LOCI}
인간, 동물 및 식물의 다수의 병리학적 상태가 현재 유전적 수준에서 이해되고 있다. 인간 게놈의 지도화의 완성이 선언됨에 따라, 훨씬 많은 인간 질병의 유전적 기초가 다가오는 몇년 내에 동정될 것으로 예상된다. 따라서, 원칙적으로 개인 유래 DNA의 분석은 유전적으로 기초한 상태가 명백한 증상 없이도 진단되거나 확인되도록 할 수 있다. 이것은 조기 진단이 일생 중 나중에 중증의 임상적 합병증을 예방할 수 있는 대사 이상 같은 다수의 상태에 대하여 유리하다.
일반적으로 유전자형결정으로서 종종 지칭되는, DNA 서열을 분석하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 매우 일반적인 용어로 설명하면, 샘플의 DNA가 유전 서열이 알려진 특정 질병 상태에 대응하는지 결정하기 위하여, 혼성화를 허용하는 조건 하에서 샘플을 그 질병이 관련된 핵산 프로브에 노출시킨다. 프로브가 DNA 샘플에 혼성화되는지 결정하는 것이 가능하도록 핵산 프로브가 표지된다. 한 기술에서, 프로브는 칩 상에 어레이로 정돈되어 각 프로브는 특정 유전자좌를 나타낸다. 어레이를표지된 DNA 샘플에 노출시킨 후, 스캔 장치가 어레이내의 각 위치를 시험하여 표적 분자가 그 위치에서 프로브와 상호작용하였는지 결정할 수 있다. 어레이 칩은 예를 들어 Affymetrix (Santa Clara, CA)에 의하여 시중 제공되고 Affymetrix에 의한 특허 (예를 들어, 미국 특허 6,045,996, 5,858,659, 및 5,925,525, 및 그것의 참고문헌)에서 기술된다. 어레이는 또한, 예를 들어, 미국 특허 6,025,136, 6,018,041, 5,525,464, 및 5,202,231에서 기재된 혼성화 접근법에 의한 서열결정 같은 DNA 서열결정 응용에 사용되었다.
질병 진단학을 위한 유전자형결정의 방법은 이용가능하지만, 그 방법이 공중위생 세팅에서 유용하기 위하여는 그것이 비용면에서 합리적일 필요가 있다. 예를 들어, 적당한 유전적 검정이 알려져 있지만, 주로 비용적 고려 때문에 신생아 스크리닝이 질량분석 방법에 의하여 행하여진다. 둘째로, 공중위생 세팅에서의 DNA 진단학은 다수 샘플에 대한, 및 질량분석적 방법이 어렵거나 불가능한 유전적 상태에 대한 응용에 대하여 실용적일 필요가 있다. 다수 샘플의 필요성은, 동시에 처리되는 다중 어레이 칩을 사용함으로써 해결될 수 있다. 미국 특허 5,545,531, Rava et al.에 기재된 바와 같이, 각 웰의 바닥에 어레이 칩을 함유하는 표준 96-웰 마이크로적정 플레이트를 포함하는 판형이 사용될 수 있다. 동일한 시험을 다수의 환자 샘플에 수행하기 위하여, 용액상의 각 환자 샘플은 표지되고, 각각이 동일한 어레이 칩을 갖는 상이한 웰 내로 도입된다. 그러므로, 이 방법에서는 각 샘플에 대하여 분리된 어레이 칩이 사용되며, 이는 환자당 어레이, 시약, 샘플 처리 등의 고정된 비용 때문에 범용하기에는 비용이 많이 든다.
미국 특허 5,807,522, Brown et al.은 환자의 게놈 DNA와 주어진 유전자의 모든 알려진 돌연변이를 나타내는 프로브 DNA 단편의 다중 마이크로어레이를 사용하여 질병 유전자에서의 알려진 돌연변이에 대한 다수 환자 스크리닝 방법을 기술한다. 마이크로어레이는 플라스틱-지지 니트로셀룰로스 박판 상에 건조되는데, 교차 오염을 방지하기 위하여 실리콘 고무 장별 성분을 각 어레이 사이에 갖는다. 모든 마이크로어레이는 물질의 단일 박판으로서 처리된다. 그러나, Brown et al. 의 방법은 각 돌연변이된 대립 유전자나 스크리닝된 유전자 마커에 대하여 별개의 마이크로어레이를 사용한다.
그러므로, 비용지불가능하며 대규모 사용을 위한 충분한 효율을 제공하는, 진단 용도를 위한 충분한 정확도를 갖는 유전자형결정 방법의 필요가 있다. 이상적으로는, 이 같은 방법은 다수 환자가 다수 질병에 대하여 단일 검정에서 스크리닝되도록 한다. 더 일반적으로, 방법은 인간, 동물, 식물, 또는 미생물 물질의 어떤 기원으로 부터의 다수 샘플을 다수 유전자좌에서 단일 검정으로 대립유전자에 대하여 스크리닝되도록 할 것이다.
(발명의 개요)
본 발명은 단일 검정으로 다수 유전자좌에서 다수 샘플을 유전자형결정하기 위한 방법을 제공한다. 방법에 따르면, 다수 샘플로부터의 게놈 단편은 중합효소연쇄반응 프라이머를 사용하여 증폭되는데, 여기서 각 게놈 단편은 유전자좌, 즉 관심의 DNA 마커를 함유한다. 게놈 단편은, 각 표면 위치에서의 물질이 단일 샘플로부터의 단일 게놈 단편에 본질적으로 대응하는 표면상에서 마이크로어레이로 형성된다. 마이크로어레이는 마이크로어레이 상의 게놈 단편에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물과 혼성화된다. 그 후, 다수 샘플에 대한 유전자형결정 정보는 마이크로어레이 신호를 판독함으로써 동시에 유추된다. 방법은 질병 진단에 대하여, 또는 어떤 식물이나 동물 시료로부터의 대립 유전자에 대하여 스크리닝하는데 사용되어 광범위하고 다양한 응용에 사용될 수 있다.
본 발명은 일반적으로 유전자형결정하는 것, 더 구체적으로는 질병 진단을 위하여 유전자형결정하는 것에 관한 것이다.
본 특허 출원은 적어도 하나의 컬러 도면을 함유한다. 이 특허출원의 컬러도면 사본은 요구와 필요한 요금의 지불에 따라 특허상표청으로부터 제공될 것이다.
도 1은 본 발명의 구체예에 따라서 동시에 다수 유전자좌에서 다수 샘플을 유전자형결정하는 방법의 플로챠트이다.
도 2는 본 발명의 구체예에 따르는 마이크로어레이의 작은 일부분의 도식적 표현이다.
도 3A 와 3B는 하기 실시예에서 기재된 바와 같은 본 발명의 구체예에 따라 72 가지의 상이한 환자 샘플로부터 준비된 576 양태의 마이크로어레이로부터 Cy3과 Cy5 방사로부터 검출되는 각각의 직접 형광 신호를 나타낸다. 마이크로어레이 신호는 100 % 광증폭기 튜브(PMT)와 80 % 레이저 세팅에서 공초점 스캐너로 판독되었다. 적색이 가장 강도가 세고 검정색이 가장 강도가 약한, 종래 무지개 코드가 사용된다.
도 4A 와 4B는 각각 도 3A 와 3B의 데이터에 대한 부분 확대도이다. 문자 (a-c)와 숫자 (1-28)은 다음과 같이 상이한 환자 샘플 각각의 위치를 선으로 구획한다: alO-12, 샘플 1 (S/S) ; al3-15, 샘플 2 (A/S); al6-18, 샘플 3 (S/C); al9-21, 샘플 4 (C/C); a22-24, 샘플 5 (A/C); a25-27, 샘플 6 (A/A); bl-3, 샘플 7 (E/E); b4-6, 샘플 8 (A/E); b7-9, 샘플 9 (A/A); blO-12, 샘플 10 (야생형) ; bl3-15, 샘플 11 (이형); bl6-18, 샘플 12 (동형) ; bl9-21, 샘플 13 (야생형) ; b22-24, 샘플 14 (이형); b2527, 샘플 15 (동형). 네거티브 대조표준 인쇄 완충액(a28-30)으로부터의 신호를 사용하여 백그라운드 제거가 수행되었다. 포지티브 혼성화 대조표준 (b28-30, c1-3, c4-6, c7-9, 및 c10-12) 또한 나타낸다. 간격 막대는 1.0 mm에 대응한다.
도 5는 도 4A의 무지개 코드로부터 나타나는 신호의 정량적 값을 나타낸다. 세 차례 반복 측정값을 배경 제거 후 평균을 취하였다. 각 환자 샘플의 유전자형은 상기 및 하기 그래프와 같이 주어진다.
도 6A와 6B는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 본 발명의 구체예에 따라서 각각 도 3A와 3B에서와 같은 환자 샘플의 동일한 세트로부터의 간접 표지 방법으로 준비된 마이크로어레이로부터의 Cy3 과 Cy5 방사로부터 검출되는 신호를 나타낸다. 신호는 도 3A와 3B에 대하여 기재된 바와 같이 검출하였다.
유전자형결정 방법은 다수 질병 유전자좌에서 동시에 다수 개체에 대한 정보를 얻는다. 여기에서 사용될 때, 유전자형결정은 단일 뉴클레오티드 분해능에서 주어진 유전자좌에서의 대립 유전자를 구별하는 것으로서 구체적으로 정의된다. 유전자좌(복수 유전자좌들)는 유전적 또는 DNA 마커의 염색체상 위치로서 정의된다. 그러므로, 본 발명에 따르는 방법은, 의학적 결정을 위한 기초로서 사용될 수 있는, 개체에 대한 스크리닝과 진단적 정보를 제공하는데 요구되는 정확도를 갖는다.
방법의 개관은 도 1에 도식적으로 도시된다. 첫째로, 단계 10에서, 게놈 DNA의 샘플이 생물학적 시료로부터 분리된다. 시료는 박테리아, 효모, 식물 또는 동물을 포함하는 어떤 기원으로부터일 수 있다. DNA를 함유하는 어떤 생체도 이 방법으로 다룰 수 있다. 인간 질병 진단에 대한 응용을 위하여, 생물학적 시료는, 예를 들어 혈, 양수, 신생아 혈 카드, 타액, 정액, 상피 찰과표본, 및 주사 생검으로부터 얻는다. 어떤 생체에 대하여는, 생물학적 시료는 DNA가 아닌 RNA를 함유한다. 샘플은 표준 과정에 따라 분리되고 정제된다.
그 후, 샘플 DNA는 단계 12에서 중합효소 연쇄반응 (PCR)의 사용에 의하여 유전자-특이적 프라이머로 증폭되어 소위 앰플리콘을 생성한다. PCR 방법은 당업계에서 광범위하게 사용되고 충분히 기재되었다 (예를 들어, 미국 특허 4,683,202, 4,683,195, 4,800,159, 4,965,188 및 5,333,675, 및 그것의 참고문헌 참조). 관심의 각 게놈 단편, 즉, 기지의 잠재적 돌연변이나 관심의 다른 DNA 변형을 함유하는 각 게놈 단편에 대하여 특이적인 프라이머의 짝이 사용된다. 그러므로, 방법은 DNA 마커로 확인되는 어떤 질병에도 응용된다. 이 같은 질병은 그 중 극소수를 들자면, 예를 들어, 낭성섬유증, 티로신혈증, 단풍시럽뇨병, α-1-항트립신 결핍증, 글루타르산뇨증 타입 I, 유전난청, β-지중해빈혈증, 장쇄 3-히드록실 아실 CoA 탈수소효소 결핍증, 중쇄 아실 CoA 탈수소효소 결핍증을 포함한다. 이 방법은 잘 연구된 단일 유전자에서의 단일 돌연변이가 질병 표현형을 유발할 수 있는 낫적혈구 빈혈증과 갈락토스혈증 같은 질병에 특히 유용하다. DNA 마커는 돌연변이, 단일 뉴클레오티드 다형현상, 작은 결실 등을 포함하는 어떤 알려진 유형의 DNA 변형을 나타낼 수 있다. 유일한 필요조건은 관심의 DNA 변형은 앰플리콘을 생성하는데 사용되는 프라이머 짝 이내에 있어야 한다는 것이다. 이는 주어진 위치에서 동형, 이형 및 정상 개체로부터의 시료를 포함하는 시료의 전체로부터 생성되는 앰플리콘은 거의 동등한 효율로 증폭되는 것을 보증한다.
각 생물학적 샘플은 다수 프라이머 짝으로 별도로 처리되어 각 개인, 각 구체적 개체로부터의 구체적 게놈 단편이 연결된 각 앰플리콘, 관심의 유전자좌를 함유하는 각 게놈 단편에 대하여 다중 앰플리콘을 생성한다. 각 앰플리콘의 길이는, 방법은 약 40 내지 1000 염기짝의 범위의 앰플리콘에 적용되지만, 이 방법이 현재 실시될 때 약 60 염기짝이다. 각 PCR 반응물의 전체 부피는 현재 전형적으로 수행될 때 약 50 ㎕이다. 더 나아간 최적화는 최소 부피를 5-10 ㎕로 감소시킬 것으로 기대되는데, 이는 PCR 증폭과 샘플 제조에 사용되는 정제시약의 양을 최소화함으로써, 이 방법이 추가적 비용절약을 제공하도록 한다.
게놈 단편은, 마이크로어레이 인쇄, 부착 또는 혼성화를 방해할 수 있는 뉴클레오티드, 효소, 프라이머 및 다른 물질 같은 오염물을 제거하기 위하여 정제된다. PCR 앰플리콘 정제를 위한 방법은 TeleChem (Sunnyvale, CA)과 Qiagen (Valencia, CA)을 포함하는 시중 공급자로부터 구입가능하다. 정제된 앰플리콘은 염화나트륨과 시트르산 나트륨(SSC) 용액, 디메틸 술폭시드 (DMSO) 용액, 염화나트륨, 인산 나트륨 및 에틸렌 디아민 테트라아세테이트 (SSPE) 용액 또는 다른 표준시약 같은 완충액에 현탁한다. 완충화된 앰플리콘은 단계 14에서, 웰당 한 앰플리콘 용액으로 표준 96-웰 또는 384 웰 마이크로플레이트에 어레이된다. 산물 부피는 2-20 ㎕ 범위가 마이크로어레이의 형성에 충분하지만, 정제된 산물의 전형적 부피는 어레이 단계에서 웰당 약 3-4 ㎕이다.
DNA 분리와 PCR 과정은 96-웰 또는 384-웰에서 대규모화가 용이하여 하루에 >10,000 샘플이 자동화 실험실 세팅에서 달성될 수 있다. 이 효율은 240,000 명 환자로부터 매년 10 유전자좌의 증폭을 허용한다. 그러므로, 이 방법은 집단의 광범위한 스크리닝 뿐 아니라 농업에서 작물 교배 같은 고-효율 응용, 법적, 군사적 응용 등을 가능케한다.
단계 16에서, 마이크로플레이트에서의 게놈 단편의 고밀도 마이크로어레이는 기질상에서 형성되는데, 전형적으로 표준 25 mm x 76 mm 현미경 슬라이드의 크기인 기질상에 현재 마이크로어레이의 크기는 약 1.0 cm2를 차지한다. 각 스폿이 기질 상에서 구별되고 별개의 위치에서 형성되도록 하기 위한 전형적인 스폿 지름은 약 140 ㎛의 중심-대-중심 간격에 위치하는 약 100 ㎛이다. 하기 실시예에서 기재된 실험에서의 스폿의 전체 수는 1.0 cm2인쇄면적에 576 스폿이지만, 마이크로-스파팅 기술의 현재 가능성과 결합한 샘플의 대규모화는 cm2당 1,000 개가 넘는 스폿을 허용할 것이고, 이는 제조되는 18 mm x 72 mm 마이크로어레이가 25 mm x 76 mm 마이크로어레이 슬라이드당 약 82,944 개의 스폿을 함유하도록 cm2당 5,184 개 스폿이추산된다. 그러므로, 본 발명의 방법은 유전자형결정 정보가 다수 개체로부터 동시에, 즉 적어도 10, 적어도 60, 적어도 5,000 개체로부터 동시에 얻어질 수 있도록 한다. 원칙적으로, 모든 시민의 마이크로어레이는 집단내 모든 사람의 영구적 유전적 기록을 제공할 수 있다.
마이크로어레이의 각 스폿은 PCR 과정의 정확도 내에서 단일 개체로부터의 단일 앰플리콘에 본질적으로 대응한다. 샘플은 현재 140 ㎛ 간격에서 삼중 복제수로 인쇄된다. 삼중복제 스폿은 결과의 신뢰도를 증가시키고, 예로서 도 2에 도식적으로 나타낸다. 최초 26 열은 좌측에서 우측 방향으로, 세 스폿은 1A로 표시되는 PCR 프라이머짝 A로 처리된 개인 번호 1로부터, 그 다음 세 스폿은 PCR 프라이머짝 B로 처리된 개인 번호 1로부터 등등의 앰플리콘을 함유한다. 도 2에서, 제 28 열은 PCR 프라이머짝 A, B 및 C로 처리된 개인 번호 2로부터의 앰플리콘을 나타낸다. 그러나, 상이한 앰플리콘 용액으로부터의 스폿은 구별되는 위치에 위치되어야 하지만, 상이한 샘플로부터의 스폿은 상이한 열에 위치하여야 한다는 필요조건은 없다. 또한, 신뢰성있는 유전자형결정 정보를 제조하기 위하여 삼중복제 스폿 어레이 자체에 대한 필요성이 있는 것은 아니며, 단독, 이중 또는 사중 또는 다른 패턴이 사용될 수 있다.
마이크로어레이를 형성하기 위해 현재 이용가능한 기술은 접촉 및 비접촉 인쇄기술을 포함한다. 한 예는 TeleChem (Sunnyvale, CA)으로부터의 Stealth 마이크로-스폿팅 인쇄헤드를 끼운 Cartesian Technologies (Irvine, CA)로부터의 PixSys 5500 이동제어 시스템이다. 접촉 인쇄 기술은 솔리드 핀, 스플릿 핀, 핀셋, 마이크로-스폿팅 핀 및 핌과 링을 사용하는 기계적 장치를 포함한다. 접촉 인쇄 기술은 BioRobotics (Boston, MA), Genetix (Christchurch, United Kingdom), Incyte (Palo Alto, CA), Genetic MicroSystems (Santa Clara, CA), Affymetrix (Santa Clara, CA), Synteni (Fremont, CA), Cartesian Technologies (Irvine, CA) 등을 포함하는 다수의 공급자로부터 시중구입가능하다. 비접촉 인쇄 기술은 압전기, 버블젯. 마이크로솔레노이드 밸브, 주입기 펌프 등을 채용하는 것 같은 "잉크-젯" 유형 장치를 포함한다. 비접촉 인쇄 기술의 판매자는 Packard Instruments (Meriden, CT), Agilent (Palo Alto, CA), Rosetta (Kirkland, WA), Cartesian Technologies (Irvine, CA), Protogene (Palo Alto, CA) 등을 포함한다. 접촉 및 비접촉 장치 모두는 3차원적 이동이 가능한 수공업적 또는 상업적 장치에서 사용될 수 있다. Engineering Services Incorporated (Toronto, Canada), Intelligent Automation Systems (Cambridge, MA), GeneMachines (San Carlos, CA), Cartesian Technologies (Irvine, CA), Genetix (Christchurch, United Kingdom) 등으로 부터의 이동 제어 장치가 또한 본 발명에 따른 마이크로어레이 제조에 적당할 것이다.
본 방법에서 PCR 반응에서 사용되는 프라이머짝은 화학적으로 처리될 수 있는 마이크로어레이 기질, 예를 들어 유리기질에 대한 앰플리콘의 특이적 부착을 허용하는 알킬아민기 같은 반응성 기를 전형적으로 함유한다. 예를 들어, 기질은 쉬프 염기를 통하여 반응산물로서 생산되는 아미노-결합 PCT 산물의 말단-부착을 허용하는 반응성 알데히드기를 함유한다. 부착 반응은 탈수소화 반응에 의하여 진행된다. 샘플 퍼짐을 방지하여 더 작은 스폿 크기와 더 큰 마이크로어레이 밀도를 가능케하는데, 반응성 알데히드기를 함유하는 것과 같은 소수성 인쇄 표면이 유용하다. 반응성 알데히드기를 갖는 마이크로어레이 기질은 TeleChem (Sunnyvale, CA)과 CEL Associates (Houston, TX)를 포함하는 다수의 판매자로부터 구입가능하다. 그러나, 폴리-리신, 올가노실란, 에폭시실란, 반응성 카르복실기, 겔 패드 물질, 니트로셀룰로스-피복 유리 등의 물질의 피복 또는 처리를 함유하는 것을 포함하는 어떤 다수의 추가적 마이크로어레이 표면과 부착 화학 또한 채용될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 말단-부착 전략에 추가하여, 기질에 대한 자외선 또는 열에 의한 가교, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용 및 다른 수단을 포함하는 다수의 비특이적 전략이 대안적으로 사용될 수 있음이 또한 명백할 것이다.
단계 18 에서, 마이크로어레이는 처리되고, 표지된 합성 올리고뉴클레오티드 혼합물과 혼성화된다. 마이크로어레이는 미결합 DNA 물질, 비활성 미반응 알데히드기를 제거하고 마이크로어레이의 혼성화 전에 인쇄된 PCR 단편을 변성하기 위하여 종래 프로토콜을 사용하여 처리된다 (예를 들어 Schena et al., PNAS 93,10614-10619, 1996 참조). 일반적으로, 혼성화 반응은 합성 올리고뉴클레오티드의 융점인 Tm의 10 ℃ 이하에서 염과 계면활성제를 함유하는 수성 용액에서 수행된다. 혼성화 혼합물은 마이크로어레이 상의 앰플리콘에 존재하는 대립 유전자에 대하여 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 구성된다. 즉, 혼합물 내의 각 합성 올리고뉴클레오티드는 PCR 프라이머짝에 의하여 선택되는 유전자좌에 대응한다. 방법에 따르면, 어떤 핵산-함유 생체로부터 관심의 앰플리콘에서 대립유전자를 검출하기 위하여 실질적으로 무제한적 수의 상이한 혼성화 혼합물이 제조될 수 있다. 수십, 수백, 또는 가능하게는 수천 개의 상이한 올리고뉴클레오티드를 함유하는 혼합물이 다수의 상이한 관심의 대립 유전자를, 따라서 다수의 상이한 질병이 동시에 시험하는데 사용될 수 있도록 방법이 대규모화될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 유일한 필요조건은 야생형과 대안적 대립 유전자에 대하여 이용가능한 서열 정보를 갖는 것 뿐 아니라, 각 PCR 프라이머짝에 상보적인 유전자 서열을 광범위화하는 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 EOS Biotechnology (South San Francisco, CA) 와 Operon Technologies (Alameda, CA)를 포함하는 다수의 판매자로부터 널리 구입가능하다.
앰플리콘 내의 단일 뉴클레오티드 변이를 구별하기 위한 능력을 최대화하기 위하여, 혼합물 내의 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 약 10 내지 30 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 관심의 대립 유전자가 15-원소체에 상대적으로 중심 위치(위치 8)에 위치한 경우 15 뉴클레오티드이다. 혼합물 내의 합성 올리고뉴클레오티드는 표지되고 표지는 5' 또는 3' 말단 또는 양쪽에서의 표지가 기재된 방법 내에서 작동할 것이지만, 예를 들어, 각 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치한다. 당업계에 직접 및 간접 모두의 표지 방법이 알려져 있다. 직접 표지에서 사용되는 일반적 형광 태그는 각각 약 550 nm와 650 nm에서 형광을 띠는 Cy3과 Cy5로 표시되는 염료를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 혼합물은 다수 파장에서 다수 형광 태그를 함유할 수 있다. Cy3과 Cy5 태그에 대신하여 어떤 수의 상이한 유형의 형광 태그가 사용되어 하나 이상의 상이한 색상의 검출을 허용할 수 있다. 다수-색상 접근법은, 예를 들어, 양생형 대립유전자가 한 색상에서 최대 효율로 검출되고 돌연변이 대립유전자가 다른 색상에서 최대 효율로 검출되게 함으로써 유용한 것으로 기대될 것이다. 다른 유형의 표지는 Alexa, 플로레신, 로드아민, FAM, TAMRA, Joe, ROX, 텍사스 레드, BODIPY, FITC, 오레곤 그린, 리스아민 등으로 표시되는 것 같은 다양한 시중 염료와 염료 유도체를 포함할 것이다. 이들 염료와 유도체 중 다수는 Molecular Probes (Eugene, OR), Amersham Pharmacia (Bucks, United Kingdom) 및 Glen Research (Sterling, VT) 같은 시중 판매자로부터 구입할 수 있다.
간접적 표지 방법은, 예를 들어, 그 자신은 형광이 없지만 부착된 형광기를 함유하는 항체 융합체에 대하여 반응성인 유기 분자인 비오틴이나 디니트로페놀로의 표지를 포함한다. 그러므로, 비오틴과 디니트로페놀 같은 표지, 헵튼 또는 에피토프는 각 스폿에서의 형광은 비형광 표지와의 상호작용을 통하여 마이크로어레이과 상화작용하는 항체 융합체에 의하여 기여되므로, 소위 간접적 수단에 의하여 형광 검출을 허용한다. 특정 항체 융합체는, 마이크로어레이 표면에 부착된 단백질의 티로신 부분에 대한 단기-지속 티르아미드 자유 라디칼의 부착을 촉매하는 고추냉이 페르옥시다제 같은 효소를 함유한다. 티르아미드를 다양한 형광 부분에 결합함으로써, 비오틴과 디니트로페놀 표지, 항체-고추냉이 페르옥시다제 접합체 및 티르아미드-Cy3 및 티르아미드-Cy5 유도체가 관련된 간접적 수단에 의하여 혼성화된 산물을 검출하는 것이 가능하다. 그러나, 형광 및 비형광 접근법 모두를 포함하는 검출에, 어떤 수의 직접 및 간접 표지 전략이 사용 될 수 있다는 것이 당업계 숙련자에게 이해될 것이다. 한 대안적 형광 접근법은 Genisphere (Oakland, NJ)에 의하여기술된 덴드리머(Dendrimer) 기술을 사용할 것이다. 한 대안적 비형광 접근법은 Genicon (San Diego, CA)에 의하여 Resonance Light Scattering (RLS) 입자와 함께 기술된 바와 같은 비드와 입자를 사용할 것이다.
표지된 합성 올리고뉴클레오티드 혼합물과 혼성화 후, 마이크로어레이는 단계 20에서 기지 방법에 의하여스캔되거나 판독되어 유전자형결정 정보를 검출한다. 검출은, 예를 들어 GSI Lumonics (Bellerica, MA)에 의하여 제조된 ScanArray 3000 같은 레이저 여기 및 광증폭기 튜브 검출을 갖는 공초점 스캔 기구를 사용하여 수행될 수 있다. 대안으로, Axon Instruments (Foster City, CA), Genetic MicroSystems (Santa Clara, CA), Molecular Dynamics (Sunnyvale, CA) 및 Virtek (Woburn, MA)에 의하여 제공되는 것 같은 다수의 상이한 유형의 공초점 및 비공초점 형광 검출 시스템이 벙법을 수행하기 위하여 사용될 수 있다. 대안적 검출 시스템은 기체, 다이오드 및 고체 상태 레이저를 사용하는 스캔 시스템 뿐 아니라, 제논과 할로겐 전구 같은 다양한 다른 유형의 광원을 사용하는 것을 포함한다. 광증폭기 튜브에 추가하여, 검출기는 전하 결합 장치(CCD)와 상보적 금속 옥시드 실리콘(CMOS) 칩을 사용하는 카메라를 포함할 수 있다.
혼성화에 직접표지된 올리고뉴클레오티드가 사용되든 간접 표지된 올리고뉴클레오티드가 사용되든지, 주어진 마이크로어레이 스폿으로부터 검출되는 신호는 혼합물 중 올리고뉴클레오티드의 주어진 스폿에서 게놈 단편에 대한 혼성화도에 직접 비례한다. 올리고뉴클레오티드 혼합물은 야생형 또는 돌연변이 대립유전자에 상보적인 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 따라서 혼성화 혼합물이 어떻게 제조되었느냐에 따라 야생형 또는 돌연변이 게놈 단편이 검출될 수 있다. 예를 들어, 도 2에서 1A로 표지된 세 개의 스폿으로부터의 동일한 마이크로어레이 스폿으로부터의 신호가 정확도의 증가를 위하여 평균내어지고, 따라서 작은 편차계수(CVs)를 제공한다.
유전자형결정 정보를 얻고 평가하기 위하여 다양한 수단이 사용될 수 있다. 상기된 바와 같이, 주어진 앰플리콘의 대립 유전자 조성물을 결정하기 위하여 절대 형광 신호가 사용될 수 있다. 대안으로, 또한 두가지 이상의 색상을 갖는 올리고뉴클레오티드 혼합물을 사용할 수도 있는데, 야생형은 녹색 형광으로서 및 돌연변이 대립 유전자는 적색 형광으로서와 같이, 주어진 색상은 주어진 대립유전자를 전담하도록 한다. 각 스폿의 DNA 내용물을 평가하기 위하여 형광 염색 같은 직접 표지와 결합하여 다양한 추가적 전략이 또한 사용될 수 있다. Molecular Probes (Eugene, OR)로부터 구입가능한 SYBR 그린 염료는 플로레신 이소티오시아네이트 (FITC) 염료의 파장 범위에서 염색된 DNA의 검출을 허용한다.
본 발명의 특징과 잇점은, 신생아 혈 샘플을 낫적혈구 빈혈증과 갈락토스혈증의 다양한 대립유전자에 대하여 스크리닝한 하기 실시예에 의하여 더 설명되지만 이에 제한되지는 않는다.
72 명의 상이한 신생아로부터의 신생아 혈 샘플을 분리하여 하기 표 1의 ARDC100-109로 표시된 유전자 특이적 프라이머로 증폭하였다. 이들 5 가지 프라이머짝은, 앰플리콘이 마이크로어레이 기질에 특이적으로 부착하도록 하는, GlenResearch (Sterling, VT)로부터의 C6 아미노 변형에 대응하는 반응성 아민기를 함유한다. 하기 표 1의 각 올리고뉴클레오티드 서열에서 "N" 위치는 C6 아미노 변형을 표시한다. 프라이머 짝은 총 세가지 인간 유전자: β-글로빈, CFTR 및 GALT 에 대응하는 다섯개의 구별되는 게놈 단편을 포괄한다. 인간에서 β-글로빈, CFTR 및 GALT 유전자와 연관되는 질병은 각각 낫적혈구 빈혈증, 낭성섬유증 및 갈락토스혈증이다. 이 세가지 유전자에서 게놈 단편은 다섯 가지 질병 유전자좌를 포괄하였고 각 앰플리콘의 대략적 크기는 60 염기짝이었다. 각 PCR 반응물의 전체 부피는 50 ㎕였다.
게놈 단편을 증폭한 후 오염물을 제거하기 위하여 정제하였다. TeleChem (Sunnyvale, CA)에 의한 384-웰 PCR 정제 키트를 제조자의 지시에 따라서 사용하였다. 정제 산물을 멸균 증류수 10 ㎕에 재현탁시키고 10 ㎕ 중 2 ㎕를 2 ㎕의 TeleChem (Sunnyvale, CA)에 의하여 제공되는 2X 마이크로스폿 용액에 혼합하여 전체 4 ㎕의 인쇄용 샘플을 제조하였다. 샘플 플레이트내 각 PCR 앰플리콘의 농도는 100 ㎍/㎕였다. 인쇄 완충액 단독 또는 합성 올리고뉴클레오티드를 함유하는 대조표준 샘플 전체 24개와 함께, 4 ㎕의 72 개의 샘플 각각을 384-웰 플레이트의 인접 웰에 위치시켰다. 24 개의 대조표준 샘플은 실험에서의 포지티브 및 네거티브 대조표준 모두를 제공하였다. 전체 96 샘플(72 개의 신생아 앰플리콘과 24 개의 대조표준)을 각각 4 ㎕의 샘플을 함유하는 모든 웰이 최초 4 열(A1-24 내지 D1-24)에 있도록 위치시켰다. Coming Costar (Corning, NY)로부터의 폴리프로필렌 384-웰 마이크로플레이트를 사용하였지만, Whatman Polyfiltronics (Rockland, MA)와 같은 다른 판매자로부터의 플레이트도 대안으로 사용할 수 있었다. 다양한 상이한 유형의 마이크로플레이트가 샘플 보유에 충분하지만, 폴리스티렌 같은 재료의 마이크로플레이트에 함유된 샘플과 비교할 때 약간 개선된 로딩 및 인쇄 효율을 갖는 경향이 있는 소수성 재료는 볼록한 샘플 방울을 생성한다.
TeleChem (Sunnyvale, CA)으로부터의 Stealth Micro-Spotting Technology로 적합화된 Cartesian Technologies (Irvine, CA)으로부터의 PixSys 5500 이동 제어 시스템을 사용하여 72 개 신생아 샘플 더하기 24 개의 대조 표준 샘플의 마이크로어레이를 한 마이크로어레이로 제조하였다. Stealth 인쇄헤드는 4.5 mm 중심-대 중심 간격에서 2 x 2 배치로 정돈된 전체 4 인쇄 핀을 함유하였다. 384-웰 마이크로플레이트로부터 한 차례에 4 샘플을 로딩하고 인쇄하기 위하여 4 핀의 한 세트를 사용하였다. 72 개 신생아 샘플 더하기 24 개의 대조 표준을 인쇄하기 위하여 전체 24 인쇄 주기(96 샘플을 4 핀으로 나눈 수)를 사용하였다. 전체 인쇄 시간은 약 48 분이었다.
4 개의 핀 각각이 72 개(288 전체 스폿을 4 핀으로 나눈 수) 개별 마이크로어레이 스폿을 함유하는 마이크로어레이 하위격자를 제조하도록, 모든 96 샘플을 삼중복제수로 140 ㎛ 스폿 간격에 100 ㎛ 스폿으로 인쇄하였다. 그 후, 모든 96 샘플에 대하여 스폿의 이중복제 세트(288개의 추가적 샘플)를 제공하기 위하여, 제 1의 마이크로어레이에 상대적으로 2 mm 오프셋에서 삼중복제수로 모든 96 샘플을 재인쇄하였다. 최종 마이크로어레이는 약 1.0 cm2의 전체 면적에 각각이 전체 576 개의 마이크로어레이 스폿(288 더하기 288)을 함유하였다. 제조자의 지시에 따라서 전체 30 마이크로어레이를 TeleChem (Sunnyvale, CA)로부터의 SuperAldehyde Microarray Substrates 30 개 상에 인쇄하여, 다양한 상이한 혼성화 혼합물과 수행될 최적화를 허용하였다. 이 실시예에서는 30 개의 마이크로어레이 기질이 인쇄되었지만, ESI (Toronto, Canada)로부터의 기술을 포함하는 시중 인쇄 시스템의 몇몇은 120 개 기질까지 단일 작동에 인쇄하도록 함을 주목하여야 한다. 단일 마이크로어레이는 단일 혼성화 혼합물로 유전자형결정 정보를 산출하는데 충분하고, 다중 마이크로어레이는 주어진 세트의 샘플이 상이한 혼성화 혼합물로 분석되도록 한다.
인쇄 단계 후, 마이크로어레이는 마이크로어레이 장치의 플레이트 상에서 실온에서 하룻밤 건조되도록한 후 미결합 DNA 물질, 불활성 비반응 알데히드기를 제거하고 마이크로어레이 혼성화 전에 인쇄된 PCR 단편을 변성하기 위하여 처리한다. 처리 단계는 다음과 같다: 실온에서 진탕하여 두차례 0.2 % SDS 에서 2 분간 적시고, 실온에서 진탕하여 두차례 증류수에서 2 분간 적시고, 기질을 2 분간 증류수로 100 ℃에서 처리하여 DNA가 변성되도록 하고, 기질을 실온에서 5 분 동안 기중 건조되도록 하고, 1.2 g NaBH4를 330 ml 인산완충 식염수(PBS)에 용해시켜 제조된 소듐 보로하이드리드 용액에서 기질을 5 분 동안 처리하고, 120 ml의 100 % 에탄올을 첨가하여 거품을 감소시키고, 기질을 각 1 분씩 세차례 실온에서 0.2 % SDS로 헹군 후, 기질을 한차례 실온에서 증류수로 1 분 동안 헹구고, 슬라이드를 증류수로 100 ℃에서 5 초 동안 적시고, 슬라이드를 기중 건조되도록 한 후 실온에서 어두운 곳에 보관한다. 소듐 보로하이드리드 용액은 고도로 반응성인 환원제이므로, 기질상의 비반응 알데히드기가 고효율로 환원되는 것을 보장하기 위하여는 사용 직전에 신선하게 제조되어야 한다는 점을 주의하여야 한다.
시중 판매자 EOS Biotechnology (South San Francisco, CA)에 의하여 제조되는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 혼성화 혼합물을 제조하였다. 각 합성 올리고뉴클레오티드는 특이적 앰플리콘에 존재하는 대립 유전자에 상보적이었다. 신생아 실시예에 대한 대립 유전자는 관심의 질병 유전자좌에 대응하였다. 직접 검출을 설명하기 위하여, 하기 표 2에서 혼합물 1로 표시되는 Cy3 또는 Cy5 표지를 함유하는 15원소체의 혼합물을 사용하였다. 표 2의 혼합물 1의 Cy3과 Cy5 표지는 각각 각 올리고뉴클레오티드 서열에서 수자 "3"과 "5"로 표시된다. 간접 검출을 설명하기 위하여, 하기 표 2에서 혼합물 2로 표시되는 비오틴 또는 니트로페놀 표지를 함유하는 15원소체의 혼합물을 사용하였다. 표 2의 혼합물 2의 비오틴과 니트로페놀 표지는 각각 각 올리고뉴클레오티드 서열에서 문자 "B"와 "D"로 표시된다. 합성 규모는 표 2에 열거된 올리고뉴클레오티드에 대하여 10 nmole이었고, 각 올리고뉴클레오티드는 100 μM 농도로 사용직전에 증류수에 현탁하였다. 5X SSC (0.75M 염화나트륨, 0.075 M 시트르산나트륨) 및 0.2% SDS (소듐 도데실 술페이트) 완충액에 10 가지 올리고뉴클레오티드(표 2, ARDC110-119) 각각 2 μM을 함유하는 50 ㎕ 용액을 생성함으로써 혼합물 1을 제조하였다. 혼합물 2는 10 가지 올리고뉴클레오티드가 ARDC125-129 와 ARDC135-139 (표 2)였다는 점을 제외하고는 혼합물 1와 마찬가지 방법으로 제조하였다.
마이크로어레이 당 10 ㎕의 혼합물 1 또는 혼합물 2를 사용하여 혼성화 반응을 수행하였다. 18 mm x 18 mm x 0.2 mm 크기의 커버슬립 아래에 10 ㎕ 혼합물을 마이크로어레이에 적용하였다. 42 ℃에서 5.5 시간 동안 혼성화 카세트에서 제조자 TeleChem (Sunnyvale, CA)의 지시에 따라 혼성화를 수행하였다. 5.5 시간 혼성화 후, 비혼성화 물질을 제거하기 위하여 다음과 같이 마이크로어레이를 세척하였다: 2X SSC (0.3M 염화 나트륨, 0.030M 시트르산 나트륨) 및 0.2% SDS (소듐 도데실 술페이트)으로 25 ℃에서 5 분 동안 두 차례, 그리고 2X SSC (0.3M 염화 나트륨, 0.030M 시트르산 나트륨)로 25 ℃에서 1 분 동안 한 차례 세척하였다.
혼성화와 세척 단계 이후, 마이크로어레이를 유전자형결정 정보에 대하여 검출하였다. 혼합물 1이 관련된 직접 표지 실험을 위하여, 세척 단계 직후에 형광 방사에 대하여 마이크로어레이를 스켄함으로써 검출 단계를 수행하였다. GSI Lumonics (Bellerica, MA)로부터의 ScanArray 3000 공초점 스캔 기기를 광증폭기튜브 (PMT)에 대하여 100 % 및 레이저에 대하여 80 % 세팅으로 사용하여 검출을 수행하였다. 혼합물 1의 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 대응하는 Cy3과 Cy5 채널 모두의 형광 마이크로어레이 신호를 검출하기 위하여 스캐너의 2-색상 적응성을 사용하였다. 결과는 도 3A 및 3B에 나타나는데, 도 3A는 Cy3으로부터의 형광의 검출에 대응하고 도 3B는 Cy5로부터의 형광의 검출에 대응한다. 데이터는 종래 무지개 규모에 따라 나타내는데, 적색은 가장 강한 세기를 검정색은 가장 약한 세기를 나타내고; 간격 막대는 1.0 mm에 대응한다. 도 3A에서의 마이크로어레이의 부분 확대도가 도 4A에 나타난다. 각 증폭된 신생아 환자 샘플이나 대조표준 샘플이 인접 마이크로어레이 위치에서 세 차례 인쇄되었으므로 마이크로어레이 신호는 삼중 복제수로 나타난다. 마이크로어레이의 샘플 위치는 y 축(수직)을 따라 문자로 표시되고 x 축(수평)을 따라 수자로 표시된다. 형광 마이크로어레이 신호의 정량은 GSI Lumonics (Bellerica, MA)로부터의 ScanArray Software를 사용하여 수행하였다. 마이크로어레이 신호에 대응하는 값은 도 5에서 좌표로 나타낸다. 데이터는 야생형, 이형 및 동형이 낫적혈구와 갈락토스혈증 유전자좌로부터 시험된 모든 실시예에서 구별될 수 있음을 나타낸다. 편차계수(CVs)는 모든 삼중복제수 측정값에서 <10 % 였다.
β-글로빈 위치 232에서 상이한 개인 세명의 세개의 샘플로부터의 게놈 단편을, 예를 들어, 각각 마이크로어레이 위치 bl-3 ; b4-6; 및 b7-9에 제시한다. 개인 세명은 유전자형 E/E, A/E 및 A/A로 각각 표시된다. E/E 신생아는 β-글로빈 위치 232에서 단일 뉴클레오티드가 G에서 A로 변화한 돌연변이 대립유전자에 대하여 동형이고, A/E 신생아는 위치 232에서 돌연변이 대립유전자 하나와 정상 대립유전자 하나를 갖고, 따라서 이형이며, A/A 신생아는 232에서 정상 대립유전자 둘을 갖는다(즉, 대립 유전자 둘 모두 β-글로빈 위치 232에서 G 잔기를 갖는다). 혼성화 혼합물(ARDC113, 표 1)의 대응하는 합성 올리고뉴클레오티드는 E/E 신생아의 두 대립유전자에 완벽하게 상보적이고, A/E 신생아의 한 대립유전자에 대하여는 완벽하게 상보적이면서 A/E 신생아의 다른 대립유전자에 대하여는 한개의 뉴클레오티드 미스매치를 함유하고, A/A 신생아의 대립유전자 둘 모두에 대하여 한개의 뉴클레오티드 미스매치를 함유한다. 예상되는 바와 같이, 위치 bl-3 ; b4-6; 및 b7-9에서의 마이크로어레이 신호 세기는각 마이크로어레이 위치에서 신생아 샘플의 유전자형에 일치하여 감소된 신호 세기를 나타낸다. 잔여 샘플에 대한 결과는 유사한 결과를 드러내고 도 5에서 일람표로 나타낸다.
두번째 실험에서는, 혼합물 2 올리고뉴클레오티드를 사용하여 간접 표지 접근법을 설명하였다. 제조자 NEN Life Sciences (Boston, MA)의 지시에 따라 MICROMAX 염색 키트를 사용하여 마이크로어레이를 염색한 점을 제외하고는 혼합물 1이 관련된 직접 표지 실험에서와 동일하게 마이크로어레이를 혼성화하였고 세척하였다. 염색 키트는 비오틴과 디니트로페놀 에피토프를 독립적으로 인지하고, 고추냉이 페르옥시다제를 사용하여 마이크로어레이 표면상에 티르아미드 Cy3 및 티르아미드 Cy5의 침전을 촉매하는 항체 융합체를 사용한다. Cy3 와 Cy5 채널 모두에서 GSI Lumonics (Bellerica, MA)에 의한 ScanArray 3000를 사용하여 직접 표지 접근법에 대하여와 마찬가지로 검출을 수행하였다. 직접 표지 접근법 결과와 유사하게,간접 표지에 의한 방법은 정확한 유전자형결정 정보가 도출되는 마이크로어레이 신호를 도 6A, 6B 및 4B에서 도시된 바와 같이 나타냈다.
본 방법이 현행 벙법에 비하여 유의하게 개선된 유전자형결정의 신규 수단을 제공한다는 것은 상술한 바로부터 명백할 것이다. 방법은 최초로 단일 검정에서 다수 환자와 다수 유전자좌의 유전자형결정을 허용한다. 방법의 핵심적 특징은 각 마이크로어레이 스폿이 단일 환자로부터의 단일 유전자 단편 또는 유전자좌를 나타냄으로써 혼성화 혼합물 중 증폭 서열과 합성 올리고뉴클레오티드 사이의 높은 특이성을 허용한다는 것이다. 단일 마이크로어레이 단계에서 다수 질병에 대한 수천 또는 수만 환자를 시험할 수 있는 능력은, 예를 들어 시간과 비용의 유의한 절약을 가져와는 신생아 스크리닝 방법의 즉각적 사용을 제공한다. 방법은 질병 유전자좌당 10 달러 ($10 U.S.) 보다 적은 비용을 가능케할 것이고, 따라서 광범위한 상업적 응용이 즉시 가능할 것이다. 선천적 유전 질병에 대한 조기 스크리닝 능력은 인간 위생에 즉각적인 유리한 영향을 끼칠 것이다.
발명은 구체적 예에 관하여 기재되었지만, 기재는 본 출원 발명의 실시예일 뿐이고 제한으로 받아들여져서는 안된다. 개시된 실시예의 양태의 다양한 응용과 조합이 하기 청구범위에 의하여 정의되는 바와 같은 본 발명의 범위 안에 있다.

Claims (25)

  1. 다수의 중합효소연쇄반응 프라이머를 사용하여 다수의 샘플로부터, 각각 구별되는 유전자좌를 포함하는, 다수의 게놈 단편을 증폭시키는 단계;
    증폭된 게놈 단편으로부터 표면상에 마이크로어레이를 형성시키는 단계로서, 표면 상의 각 위치는 단일 샘플로부터 유래되고 단일 게놈 단편으로 본질적으로 구성된 증폭된 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 단계;
    마이크로어레이를 표지된 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물과 혼성화시키는 단계로서, 혼합물은 게놈 단편에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    혼성화된 마이크로어레이로부터 신호를 검출함에 의하여 동시에 다수의 유전자좌에서 다수 샘플에 대한 유전자형결정 정보를 이끌어냄으로써 다수 샘플을 유전자형 결정하는 단계를 포함하는, 동시에 다수 샘플을 유전자형 결정하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 다수의 샘플은 적어도 10 개의 구별되는 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 다수의 샘플은 적어도 5,000 개의 구별되는 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 게놈 단편은 인간 질병 유전자좌를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 샘플은 신생아 혈 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 유전자좌는 β-글로빈, CFTR, 및 GALT로 구성된 군으로부터 선택되는 인간 유전자와 연관된 유전자좌를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 표면상의 마이크로어레이의 밀도는 평방 센티미터당 적어도 1000 스폿인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 표지된 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 10 가지의 상이한 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 표지된 합성 올리고뉴클레오티드는 약 10 내지 30 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 게놈 단편은 각각 약 40 내지 약 1000 염기짝을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 혼성화는 염과 세제를 포함하는 수성 용액에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 혼성화는 표지된 합성 올리고뉴클레오티드의 융점보다 약 10 ℃ 낮은 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 표지된 합성 올리고뉴클레오티드는 형광 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 표지된 합성 올리고뉴클레오티드는 비형광 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 유전자형결정 정보는 특정 유전자좌에서의 동형접합체로부터의 샘플과 이형접합체로부터의 샘플을 구별시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 13 항에 있어서 신호는 표지된 합성 올리고뉴클레오티드로부터의 형광 방사에 의하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, 신호는 하나를 초과하는 수 파장광선의 형광 방사에 의하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 신호는 항체 염색 후 형광 방사에 의하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 14 항에 있어서, 신호는 항체 염색 후 하나를 초과하는 수의 파장광선의 형광 방사에 의하여 생성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 13 항에 있어서, 형광 표지는 덴드리머 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 표면은 유리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 증폭된 게놈 단편은 아미노 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 표면은 반응성 알데히드기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 마이크로어레이는 기계적 마이크로-스폿에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 중합효소연쇄반응 프라이머를 사용하여 다수의 샘플로부터의 유전자좌를 포함하는 게놈 단편을 증폭시키는 단계;
    증폭된 게놈 단편으로부터 표면상에 마이크로어레이를 형성시키는 단계로서, 표면 상의 각 위치는 단일 샘플로부터 유래된 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 단계;
    마이크로어레이를 표지된 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물과 혼성화시키는 단계로서, 혼합물은 게놈 단편에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 단계; 및
    혼성화된 마이크로어레이로부터 신호를 검출함에 의하여 동시에 다수 샘플에 대한 유전자형결정 정보를 이끌어냄으로써 다수 샘플을 유전자형 결정하는 단계를 포함하는, 동시에 다수 샘플을 유전자형 결정하는 방법.
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