TWI262214B - Process for determination of microbial contamination - Google Patents

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修正 本發明係指含有礦物及/或顏料及/或填充劑及/或選 擇丨生〃膠狀形式聚合物結合的纖維料，及/或膠狀形式聚 合物之含水懸浮體、乳化體或分散體的微生物污染定量 及/或定性測定法。 利用傳統方法對懸浮體所進行的細菌污染測定及衛生 控制’貫質是依賴所要檢測之微生物的繁殖能力。進行這 ，方^所需的時間從24小時到幾天不等。對許多問題來° 說’足些時間太長，獲得的結果也因太遲而無法引介一種 有關生產過程的指導方式。 對需氧嗜常溫細菌所採行的各種習用微生物分析法， 例如平皿5十數（Plate Count)或Easicult，其主要問題在 ，培養時間長達48小時，除非等兩天過去，否則無法取得 平 口而也無法k早測定細菌計數。此外，其它幾種效 應，像培養基、氧氣的分壓（需氧/厭氧）、選擇性及酸鹼 值（pH )等等，都必須列入考慮。 乂因=，像顏料漿之類的產品，往往無法在裝運給客戶 之箾測疋細菌計數，及引介一種添加殺菌物質的指導方 式二由於海運或鐵路運輸所需的時間長達6星期，顏料漿 可能^變質或變得無用。白色顏料漿可能逐漸變成灰色及 ，始，臭。目前，在顏料漿中預防性地添加超量殺菌物 夤1 ?避免損壞的唯一可能辦法，但它的成本相當高昂， 可j =浪費貧源且對生態不利。此外，就需氧嗜常溫細菌 及徽菌這二者來說，還需用兩種不同的方法進行分析。再 者’尚需準備連續稀釋，以致使分析次數增多。 舉例來說’ 「Schweizerisches Lebensmittelbuch

1262214 案说 89101541 年_月’日 修正 __ 五、發明說明（2) 1985年版及1988年修訂版第56章7. 01節 「Best i mmung von a e r o b e η B a k t e r i e n u n d K e i m e n」，及 「Schweizerisches Lebensmittelbuch」1985 年版及1988 年修叮版第56章7.22節「Bestimmu ng von Pilzen」的内 容’均曾描述紙及顏料工業檢測細菌的習用方法。大體 上’各案件進行檢測之前的培養時間約為4 8小時。 微生物系統公司（Microbial Systems Company， L t d ·)宫開發出c e i i ρ a c t s粒子分析器及方法。相關詳情可 ^Labor flash 9/96, Zeitung mit Leserdienst fur

Labor und Forschung, Ott Verlag + Druck AG, Ch- 3607 Thun，Switzerland (瑞士）取得。曾有人表示

Cel 1 Facts分析器亦可用來檢測碳酸鈣漿料的細菌計數。 ;、、〈、而、、、工本申请人之貫驗室完成的實驗顯示，以該制、皮^ 商所述方式進行的這種檢測，不是無法測定姓^/ 確。 &禾不正 中屬 先間 量測 測定 菌、 於所 重量 生物 即空;

第7頁 el lFacts分析器所進行的量測，其原理 於粒子形式之細菌、黴菌及酵母菌的量測冤每 隔培養樣品，然後再量測粒子計數的增加^ 土礎， 粒子數，另就指數生長而言，則以推斷到據以 。然而，這種量測原理亦能有效量測出在^、、方式來 黴菌及酵母菌相同或類似的「低」數量「里寸上與細 含「異物」，例如礦物、填充劑及/或顏料、物」。對 百分比小於1的懸浮體或乳化體而言，存右之比例在 相同，即0· 5-2 0 /zm的惰性「異物」時，其尺=與微 白值tG太高而不能利用培養器的繁殖，/、數量，亦 --------^小於1 〇小時 1262214 五 '發明說明（3) =時間内檢測細菌進一步的增加。是以，Cel 1Facts分析 二=做的1測無法十分正確，製造廠商須將起始液體 以確保適用性。 手 在空白值為1〇8粒子/ml時，無法利用CeUFacts分析哭 ”體檢測出103粒子/ml的增加情形。因為存昱 事的稀釋太高，以致必然用相同數量級加以稀釋」的生 生2，其稀釋便不再具有意義，而所獲得的結果也不正 ^舉例來說，「異物」可能是像碳酸舞之類的礦物性 聚笨乙稀丙烯酸(P〇lyStyrene acrylate)分散體 頰的合成、有機、聚合性質或㈣粉溶液、半纖維素 /姓或人纖維素纖維之類的中性、有機性質或前述各種粒子 的…3 ，例如紙廠生產週期所存在者。 定量的在於提供一種快速、強大及易於進行的 疋里及/或疋性測定法，以便對含有礦物及/或 項缺ΐ 了口以測疋，其中該方法免除了習用技藝的前述各 所、求發明’利用"請專利範圍第1項的—般部份 ,^ '，即可達成廷目的，其特徵在於先添加一種以 士可由微生物分解的有機物質後，另可選擇性的追加種‘ 離ίϊί之ϊ:便對懸浮體、乳化體或分散體的樣品進行 “處理，使微生物與礦物及/或填充 纖維料分離，並於一道以，心贏、广：1及飞顯枓及/或

迢以上的培養過後，即可測定上清液 (aqueous supernatant phase)之物的 尺寸及/或型式。 双里汉/ A 1262214 ^^案號 89101541 五、發明說明（4) 年 曰 修正 自幾年前起，微生物的定量 為。然而，待調查樣品中如存f疋性測定均屬於習用技 :如礦物、顏料、物丨及/或有=度的其，固體粒子， 更十分難測定。因為這些「昱.、准料等，微生物的巧染 ，相同，大體上，只能二言;;=」具有的尺寸往往跟微生 夏減至最低。然而，經過：：二稀釋將該#「異物」的數 與不可避免的情形，便是、；稀釋步驟後，隨之而來 低，而運用繁殖以求達^:八倣生物的數量也跟著降 报長的培養期始能增加微：：=f測的程度時’同樣需要 於開頭所述那種型式的新;的數量。因&，需要-種屬 内，就所要調查之微生物數：以便能在相當短的時間 複製與可靠的結果。 的數1、尺寸及/或型式提供可 令人意外的是，現p恭 隨後再進行離心處理，使2只要對樣品添加有機物質， 開。通常，微生物較喜歡^微生物與惰性材料（異物）分 或纖維料的表面上，使复雜者到礦物、顏料、填充劑及/ 單的離心步驟就可讓這；這表面分開。•然-道簡 歡附著到那些粒子上，二，、物」沉澱，但因微生物較直 留在上清液中的微生物=二也會連帶被吸成團粒，以致; 供不正確的數值。 々，就會對微生物的污染程度提 現已證明，若是添力^ -一次能在不影生Μ

人意外地讓微生物與礦物可^物分解的有機物質，便可令 開。能被微生物分解的有f料、填充劑及/或纖維料分 用的一種培養基。令人驚*勿質宜為培養該等微生物所羽 ㈣4物之間的分離劑:、：的是，這種培養基可當作微： 的有機物 之目的。 減少了分 白值較高 始數量可 子也較少 本發明所 、填充劑 含有聚合 的含水懸 苯乙烯丁 5殿粉、幾^ 其它的使 發明，先 的方法 且能將 分離作 殖所用 特別適 母菌的 被微生 質，然 因為待 析時間 ，gp厂 以較少 1262214 SS^891〇154^ 五、發明說明（5) 析之其它步驟的情况 或難以生物分解的物 同時，該等物質亦會 果不正確的風險。 在如本發明所述 驟，即稀釋步驟，而 加的分離劑不只具有 調查微生物最適宜繁 佳實施例中，係選用 例如細菌、黴菌或酵 只要添加一種可 培養基形式 本發明所述 較少，所以 外，若與空 所使用的起 的微生物粒 利用如 礦物、顏料 另可選擇性 合成聚合物 的範例為： 尿酸樹脂、 工業取得， 依據本 修正 且宜屬於培養溶液或 離心步驟，便可達成 所含的「異物」數量 能根本不用分析。此 置較鬲的樣品相比， 一段時間之後所增加

第10頁 下，將這二者予以分離及區別。不能 質，會有在微生物與惰性粒子分離的 當作微生物生長抑制劑，因而導致結 中，不但 培養期大 用，亦可 的培養溶 可省略一個過程步 幅縮短。此外，所添 同時當作一種可供待 液，而在所舉的一較 宜某一待測試微生物之型式， 分離劑。 物分解、 後再採用 測試樣品 ，甚或可 異物」數 ’而經過 述的方法，可調查各種，尤其是含有 及/或像纖維素纖維之類的纖維料， 物，例如膠狀形式之天然、合成或半 t體、乳化體及分散體。該等聚合物 :苯乙烯丙烯酸、蜜胺樹脂、月 =纖維素。待測試的樣品宜從紙 圍是顏料業及金屬加工業。 —測試微生物j染之懸浮體、

_Ά 曰 修正 礼化體或分散體的樣品。大致上，取得的樣品量為0 · 5 - 2 0 士 & ^，此外，取得之樣品量的 ^，但樣品量少或多一點亦無妨 夕少對本發明之方法的成功與否並不重要 ^將取得的樣品添加到可由微生物分解的有機物質並與 其接混。添加到樣品中之可生物分解有機物質的數量為每 ml樣品添加0 · 5-50ml的可生物分解物質。 、曲樣π口里與可生物分解物質量之比，取決於樣品的原始 及溶液中之可生物分解物質的濃度而定。將這比率 ;;至:分解物質量大得足以能使微生物與礦物、填 式聚合物分離=纖二料分離，以及亦能選擇性與膠狀形 分解物質量必須依個案決定的樣品量與可生物 予以決定。、取率，可由嫻热本技藝者利用人工實驗 通常，對冬古-r ,、 是以樣品溶液盥人；叮分解物質之溶夜所選用的濃度， 1]00的比率為/目丨有可生物分解物質之H達到 別樣品溶液的濃佳的比率在相f的程度上是依個 稀釋，其中較吉 · i D的比率予以 常是以卜0. 1到1 . i的：為1 :3。如果固體含量小於65%，通 是在預期的污予以稀釋…些情況下，尤其 中列入考慮'，或：=的稀釋因數必須在後續的污染評估 ^ ^ A必須在結果中具體指出。 t ^ i 2分解有機物質尤其包括準備測試t ^ «

二=7-^11級。同時培養基宜含有瑞、氮、磁 第11頁 J91Q1541 —*修正 發明說明（7) /的來源，以及選擇性的各錄^^^~—— 養基 $生物取佳成長所需的戈生長因素及/或 後文將說明依本發 /、匕物 > ，亦可添加 所可使用的較佳培養 以增：:;養基後’可選擇性的執r 加樣品中的微生物數 ^仃—道以上的培養步 時間:然而，在本發明所舉的後續的定性分析 妙、已於離心處理之前省略ϋ&例中，為求大幅 紅添加培養基及執扞&遭押略裢道培養步驟。 離心處理而使微生物^物性的後續培養步驟後，便 料分離。離心步驟的進;;填充劑、顏料及/或纖 50%以上能與「異物」，即式疋以大部份的微生物，即 .分離為原則。離心處理必須At二真s充劑、顏料及/或纖維 ^ ^ ^ ^ ,i(upper Pha：) 尤以最宜。至於處重理力’^以200到L為宜， ..礦物、填充劑、顏料及纖維料：定備分離 物而定。 再卄而疋，或視準備分離的微 —，，7 此 5 時間可由嫻熟本技藝| 就礦物及/或填充劑及/或顏料而言，宜採用：含有一 素周期系統中第一及/或第三主群組及/或第四主群組及/ 或第四副群組之各元素，尤其是鈣及/或矽及/或鋁及/或

”沉澱指數可由嫻熟本技藝者利用實驗 本身的進行時間為lmo分鐘，但以2到15分鐘為。 尤以5到10分鐘最宜。最佳的離心時間可由嫻熟本技蓺J 根據實驗室實驗決定 第12頁 案號 8910]M1 1262214

五 '發明說明（8) 欽及/或鎖及/或有機顏料的化合物。 就礦物及/或填充劑及/或顏料而言，宜採用含 ^ 土及/或氮氧化銘及/或氫氧化鈦及/或硫酸鋇及/或=， 烯空心球及/或甲醛樹脂及或碳酸鈣，尤其是天然酸 鈣，及/或大理石及/或石灰及/或白雲石，及/或含 石的碳酸鈣，及/或合成配製的碳酸鈣，即所 酽,去 鈣的礦物及/或填充劑及/或顏料。 从厌-夂 將^有微生物的上清液取出，即可直接用 染的定置及/或定性測定。此舉之後宜進行—道以上物與π 養步驟’以增加上清液中之微生物的數量、' 在有利於培養微生物的溫度條件下進行 ： = 殖之微生物的型式而定。所舉的培養溫度在3看=1 間，但以28到34t：之間為宜，尤以315到32 熟本技藝者均知每一個案所需 取 嫻 士 ，丄 而的培養時間，該時間亦可從 各專題論文中查明，或可經實驗確定。 在培養溫度為30 t的條件下，樣品 時以下；樣品中的污染如高於1〇5但低於1〇6細菌數/公撮 時’總時間在6小時以下；另以重量為準，就原始固體含 量，6"°%，且污染高於105細菌數/公撮的懸浮體而言， 總時間則在3小時以下（使用騰蛋白酵素豆羹壤脂）。

ρΪ培養脖溫度為3〇。〇的條件下，樣品中的污染如低於105 細囷數/么裇（germs/ml)時，各培養步驟的時間到12小 時；樣品中的污染如高於1〇5但低於1〇6細菌數〆公振時，時 間為1MM、日夺重量為1，就原始固體含量為6〇_ 1262214

五、發明說明（9) 修正 8 0%，且污染高於1 〇5細菌數/公撮的懸浮體而言，時間則為 1到2小時（使用胰蛋白酵素豆羹瓊脂）。 對於因而獲得的微生物，已知可採取若干習用方法進 行定量或定性測定。如本發明所舉出者，尤指C e 11 F a c t s 分析或ATP方法。此外，尚有其它可資使用並為嫻熟本技 勢者所知的方法。關於所舉出的方法，將在下列的各範例 中予以洋細說明。 實施如本發明所述之方法後，即可進行微生物污染的 疋性及/或定量測定。首先，定性測定係指黴菌、酵母菌 及細菌等群組之間的大體鑑別。如果Cel 1 Facts分析經校 準為專供分析特定微生物，例如某些特定細菌，那麼亦可 在某些個別的亞型範圍内作進一步的規範。以CeiiFacts 方法為例，利用該方法所進行的定性分析，是以單一細胞 的尺寸或體積的大體鑑別作為基礎。 繁殖的彳^尤其要根據準備分離或 測定的細菌生長，另如可能時 ：注：便旱備 細菌的生長。依本發明可 ρ匕二=通疋之 件載有培養基的成分。 曰為且。本專利說明的附 伸以2以到重5。/\為·’微生物培養基的濃度在〇. 1到10%之門 仁以Ζ引5/。為宜，約3%時最佳。 uu/o之間 菌，黴菌及酵母菌。在所舉 '，也能定量測定細 ----施例中，是以一道步馬

第14頁 如本發明所述之方法不但 1262214 89101541

五 、發明說明（10) 進行运分析。 使彳政生物與礦物、填充劑、顏 「異物」分離後，即執行一道以上：i心戴維料’即 養步驟，以求增加樣品上清液中所二至五道的培 分間隔從事多次培養，亦即每一個案，=物的數量。 之後重複量測污染情形。此舉能限制培；=-段時間t0+x 隔。當觀察到指數生長時，便可進行^斷^ B，培養間 to。於是’高度的原始污染度就會導致：算到時間 及算出的生長，因而可省略後續的培養間隔Μ皮即早觀察 ' 在樣品中的污染如低於1 〇5細菌數/公插"1 j 為12小時以下；污染如低於1 〇6細菌數/公插01，培養時間 時以下；另以重量為準，就原始固體 守，時間為6小 染高於105細菌數/公撮的懸浮體而言，^為0-80%，且污 中在最後個案中宜使用胰蛋白酵素豆炉小時以下，其 污染度而選用的培養時m嫻孰本根據微生物 工貫驗予以確定。#品中的原始微生物污；：j間早的人 量，對培養時間並無直接影響。體中的原始固體含 後文將以對照範例及實施範例詳細 本技藝者舉凡不違本發明精神所從事的種明。嫻熟 發明申請專利範圍。 種G改，倶屬本 子計數器 依據本發明，可利用真空而從一個具右一〜 ，3〇·)施加電壓(伏特中的微生物。對 --—--!_llZz_0 因為在第一

第15頁 測孔抽吸懸浮體及/或乳化體及/或分散體I定直徑的量 1262214 修正 月 ^^89101541 五、發明說明（11) 次概异日守’可將完整的細胞視為絕緣體，所以等某個細胞 通過ΐ測孔時，就會觀察到一種可量測的電阻增加情形， 且逆增加數值視細胞體積而定。電流脈衝與這體積具有直 接關係。藉著樣品的培養，就可量測細胞生長方面的微小 差異’亦即細胞分裂會使粒子數成比例的增加，並因細胞 生長函數屬於指數式，所以能利用推斷法計算出初始濃 度。此外’因為樣品是依本發明及採用前述方法予以製 備’所以碳酸鈣’滑石及高嶺土漿料以及其它材料（例如 冷卻劑、白浪、膠狀懸浮澱粉等）的測定時間只要2到i 2小 時，而非習用技藝的24-48小時。 此舉能在貨品遭受高度污染及/或損壞之前，運用防 腐劑即時介入。 習用技藝的範例 範例1)碳酸鈣漿料 A)按照「Schweizerisches Lebensmittelbuch」1985 年 版及1 988年修訂版第56章7.01節「Besti mmung von aeroben Bakterien und Keimen」，及按照 「Schweizerisches Lebensm i 11 e 1 buch」1 9 8 5 年版及 1 9 8 8 年修訂版第56章7·22節「Bestimmung von Pilzen」内容 所從事的細菌計數測定。 處理過程 以重量為準，將3公撮77· 5%產自挪威的天然大理石粉含水 漿料（9 0 %小於2 # m的粒子，6 5 %小於1 v m的粒子）以〇 · 6 5 % 的商用聚丙坤酸納予以分散’再按照「S c h w e i z e r i s c h e s 1^匕6]1811111^611311(311」1985 年版及1988 年修訂版第56章7.01

第16頁 1262214 1 案號 89101541 五、發明說明（12) 年.月 日… 修正 節「Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen 所述之方法進行分析。 結果： 經48小時的培養期之後，所測定的細菌計數為：懸浮體中 存有3 · 0 X 1 〇6的需氧嗜常溫細囷/公撮。至於嗜常溫細菌所 用的培養基中，則未發現酵母菌。按照 「Schweizerisches Lebensmittelbuch」1985 年版及1988 年修訂版第56章7.22節「Bestimmung von Piizen」所述 之方法’檢測出小於1 〇 2徽菌數/公撮。 B)利用C e 1 1 F a c t s R粒子計數器測定細菌計數 處理過程 以重1為準’將3公撮7 7 · 5 %產自挪威的天然大理石粉含水 漿料（9 0 %小於2 // m的粒子，6 5 %小於1 // m的粒子）以範例 1A)所用之0.65%的商用聚丙烯酸鈉予以分散，再用吸量管 吸入一個無菌燒杯中。以重量為準，對這樣品加入3公撮 TAT肉羹基質/Tween 20滋養溶液，並利用CeliFacts予以 分析。這分析是以立即試圖量測Ce丨1Facts儀器中之粒子 數（時間tGh )的方式進行。由於粒子數太高，所以儀器需要 把，品稀釋。等按照1:1 0 0 0的比率稀釋後，粒子濃度即被 儀士器接受，並可確定空白值（時間tGh)。等分別經過2小時 (時間U)，4小時（時間^)，6小時（時間d及12小時（時 間kh)的培養時間後，再次測定Cel iFacts儀器中的粒子 數。培養溫度為3 0 ° C。繪出粒子數對粒子直徑的圖表，即 叮在特疋ίσ養日才間過後測定清澈相位（c 1 e a r p h a s e )所存 在的/舌細胞（「峰值放大（peak enl ar泛ement ) ,

第17頁 1262214 案號 89101541 五、發明說明（13)

微生物的型式’例如細菌、酵母菌或微菌（平均粒子直 徑，X軸）。 經過12小時的培養時間後，以反推到時間（tQh)的方式評估 懸浮體的原始污染。範例1A)，即按照Schweizerisches Lebensmi ttelbuch所從事的細菌計數測定，其結果被用來 作為參考（Schweizerisches Lebensmittelbuch 1985 年版 及 1988 年修 §丁版第 56 章 7·〇1 節「Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen」）〇 結果： 懸浮體中之需氧嗜常溫 細菌數/公撮（粒子直徑 為1-2.5 //m時的最大峰 值） 利用Cel 1 Facts粒子計數器測定細菌計數 1 ·騰蛋白酵素豆羹瓊脂 樣品 萃取劑 測定時間 (小時） 小於1 02 胰蛋白酵素 豆羹瓊脂 樣品 萃取齊丨 ^ 測疋時間 懸浮體中之黴菌數/公撮 (小時） （粒子直控為5 - 9 // m時 的最大峰值）

第18頁 1262214

豆羹瓊脂 從範例1A)及1B)顯然可知，以習用技藝的方式益法利用 C^UFacJs儀器來測定前述料體_的㈣、黴a及酵母 :丄尤其f小於102細菌數/公撮的情況下，所獲得的結果 元王不正確。此外，按照Schweizerisches L e b e n s m i 11 e 1 b u c h之方法所從事的測定 間。 需化4 8小時的時 可想而知，根據Cel 1 Facts儀器所需的樣品稀釋，也會使 存於其中的微生物被稀釋到檢測限值以下。 曰 按照Schweizerisches Lebensmittelbuch 之方法所從事的 測定，分析時間為4 8小時。 、 C)利用ATP量測來測定細菌計數 處理過程 以重量為準’將3公撮如範例1 A)的樣品，即7 7 · 5 %產自挪 威的天然大理石粉含水漿料（90%小於2 的粒子，65%小 於1 #πι的粒子）以〇. 65%的商用聚丙烯酸鈉予以分散，°再、 用吸量管吸入一個無菌燒杯中。以重量為準，對這 〜I U口加 入3公撮TAT肉羹基質/ Tween 20滋養溶液，並利用 BioOrbit亮度計1253予以分析。這分析是以立即試圖量 BioOrbit亮度計1 2 53中由ATP釋放之光量的方式進行（日^列 t0h)。此外，樣品係按照1 ·· 1 〇，0 0 0的比率予以稀釋後進^間 量測。利用此法，便可確定每個案例的空白值（t )。 # 寻叙

過4小時（時間t4h)，7小時（時間t7h)及17小時（時間t X 川）的 培養時間後，分別量測BioOrbit亮度計1 2 5 3的光強度。$

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養溫度為30。C。在各培養時間繪出光強度對這培養時 圖表’即可測定所存在的活細胞（光強度隨著時間而增勺 強）。等達到與指數生長差不多的培養時間後，便比較個 別樣品的曲線進展，就可從比較中測定懸浮體的污染忾 形。利用這方式，可在「無生長」，「弱生長」及「' ^ 長」之間作成半定量的鑑別。 生 光度計1 2 5 3之量測的處理過程 a)開始時先按照前述方式製備若干件各為丨〇 〇公撮的樣 品，再用吸量管將其吸入一個光度計比色杯（cuveUe) 内0 b)這時，添加1〇〇公撮的ATP釋離試劑，經充分搖動後等一 分鐘，以便利用萃取法將ATP取出。 c )其後，添加5 0 0公撮的AMR試劑，並搖動使其摻混。 d)接著’可將比色杯導入量測室（measurement cell)，進 行射光讀數的讀取。 參考資料：設址於FIN 2 0 52 1 Turku, Finland (芬蘭）之 BioOrbit ΟΥ公司於1 995年5月發行的BioOrbit光度計第 3 · 0版使用手冊，以及應用說明第2 0項。 結果： 培養時間 樣品在LCD顯示器 以1 : 1 0，0 0 0稀釋過之樣 (小時） 上的光強度[RLU] 品在LCD顯示器上的光強 度[RLU]

0.001 0. 000 0. 002 0.001

第20頁 1262214 案號 89101541 年· 五、發明說明（16) 7 0. 002 17 0.001

0. 002 〇. 001 用這種習用方法並不能觀察出各個培養 日守間的至異，亦即必須假設這漿料未a、、—汰。 | ^ m ^ f ^ LI1A) t ^ ^ A^Schwe/Iz"eris!hl，

Lebensmittelbuch 之方法），且这 X 1 06細菌數/公撮的結果，所以鳍:用二适方法得出3 果必定錯誤。實際上，此舉將會本/“列1C)的結 物中毒或貨品損壞。 曰…大的後果’例如食 使用這種習用方法時，無法測定前 菌及酵母菌。 〗述心子體中的細菌、黴 可想而知’懸浮體原始濃度中的高粒子濃度， 懸夺體中所釋放的光量完全吸收掉，而這種方法= :稀釋’ A會使存於其中的微生物被稀釋到檢測限：/ 本發明的各範例： J例…料，分析 處理過程 q π i ir dCτ S里測儀器 以重量為準，將若干各為3 石粉含水漿料（9 0 %小於2 " · 5 %產生挪威的天然大理 子）以0· 65%的商用聚丙烯楚的^子，65%小於1 /zm的粒 -個無菌燒杯中予以分散，再用吸量管吸入 撮TAT肉羹基質/Tween 2〇滋|二對其中一件樣品加入3公 二件樣品加入 1262214 ----年月日.修正 · 五、發明說明（17) ' ------ 3 口 Λ撮3/^的胰蛋白酵素豆羹滋養溶液。其後，把這兩件樣 =充分#混20秒鐘，然後進行離心處理。在8〇〇 g條件下 離心1 0分鐘後’清激的上清液相位即被隔離出來並利用 fel 1 Facts予以分析。這分析是分別在經過離心（時間、） 後’以及經過2小時（時間U)，4小時（時間及6小時^(時 間hh)的培養時間後，以立即量測Cel 1Facts儀器中之粒子 數的方式進行。培養溫度為3 0。C。繪出粒子數對粒子直徑 的圖表’即可在特定培養時間過後測定清澈相位所存在的 活細胞（峰值放大）及微生物的型式（細菌、酵母菌或黴 菌）。等具有指數生長的培養時間過後，以反推到時間 (tQh)的方式測定懸浮體的原始污染。另外，按照

Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計數的測 疋’以供比較。（Schweizerisches Lebensmittelbuch 1 985年版及1 988年修訂版第56章7.01節rBestimmung v〇n aeroben Bakterien und Keimen」）。 結果： 按照Schweizerisches Lebensmittelbuch 從事細菌計數的 測定 經過48小時後的細菌計數測定顯示：懸浮體中有3. 〇 χ 1 〇6 需氧嗜常溫細菌數/公撮。 利用Cel lFacts粒子計數器測定細菌計數 1. TAT肉羹基質/Tween 20 (聚氧化乙烯單月桂酸山梨糖） 2. 胰蛋白酵素豆羹瓊脂

1262214 案號 89101541 月 曰 丄修正 五、發明說明（18) 樣品萃取劑 所需測定時間 (小時） 懸洋體中之需氧嗜常 溫細菌數/公撮（粒子 直傻為1-2.5 //m時 的最大峰值） TAT肉羹基 質/Tween20 1 · 25 X 1 〇6 胰蛋白酵素 豆羹瓊脂 4 3.14 X ι〇6 樣品 萃取劑 測定時間 (小時） 懸浮體中之黴菌數/公撮 (粒子直径為5-9 //m時 的最大峰值） 2 胰蛋白酵素 豆羹瓊脂 12 小於1 02 按照本發明所述方法予以分析的樣品，與按照

Schweizerisches Lebensmittelbuch 之方法經48 小時後所 測定之細菌數的測定極為相符。 的細菌計數比較，兩種樣品均在可信限值内。

第23頁 1262214 _.案號89101541_1年 月 曰_修正 _ 五、發明說明（19) 此處所稱可信限值（C ο n f i d e n c e 1 i m i t s )係指依據設址於 61 Col indale Avenue, London NW9 5HT，UK (英國）之 PHLS 中央公共衛生實驗室（phls Central Public Health Laboratory)發行的0 70刊物中第6及7頁以及附件1，發行 曰期為1998年11月16曰，及報告曰期為1998年12月30日所 確立的5吳差標準’即個別細菌計數測定在土 〇. 5 1 〇 g 1 〇 者。 範例3 )峡酸齊漿料，分析裝置為B r丨〇 〇 r匕丨t 1 2 5 3光度計 處理過程 又0 以重量為準，將若干各為5 0 0公撮715%的天然大理石粉 (90%小於2㈣的粒子，65%小於！㈣的粒子）以〇5%的 用聚丙烯酸鈉予以分散，再裝入一個玻璃燒杯中。其中二 件樣品係在5。C的溫度條件下儲放3日（樣品A)，另二 品則在30。C的溫度條件下儲放3日（樣。 羨 樣品弄到2〇。C的溫度，再將各3公撮的樣品與3公振：：些 ”燒杯中充分摻混。等在6〇〇 "条件下離八：取 目位即被隔離出來並利用Βι。0心 253先度计對射光進行分析。這分析是分別在經、 (時間tQh)後，以及經過4小時（時間y，7小時（時二 ! 275];ΓΑ間中 培養時， 53先度a十中之光強度的方式進行。培 ”養時間後1出光強度對這培養時間。表C。於 疋、;月澈相位所存在的活細胞（光強 P:測 到與指數生長差不多的培養時間後，便者比曰強：等達 。展’就可^^中測定懸浮體的污染情形。利；：： III Γιϋ JPkf......- .T ___ 沒方 1262214 _» 89101541 —_年 a a # 正_ 五'•發明說明（20) 式，可在「無生長」，「弱生長」及「強生長」之間作成 半定量的鑑別。另外，按照Schwei zerisches Lebensmi ttelbuch從事細菌計數的測定，以供比較。 (Schweizerisches Lebensmittelbuch 1 985 年版及 1 988 年 修訂版第56 章 7.01 節「Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen」）。 所用的萃取劑： 1·習用技藝所用者’係以重量為準，含有〇· 9%氣化鈉溶液 的蒸館水，但不含可當作養份的有機物質。 2·如本發明所用者，係以重量為準的3%有機滋養溶液（胰 蛋白酵素豆羹瓊脂）。 按照Schweizerisches Lebensmittelbuch 從事細菌計婁文的 測定 樣品A :經過48小時後，懸浮體中有3 X 1 〇4需氧嗜常溫細 菌數/公撮。 ' 樣品B :經過48小時後，懸浮體中有7 X 1 〇7需氧嗜常溫細 菌數/公撮。 結果 · 以BioOrbit光度計作成的污染評估 習用技藝所用者，即以重量為準，含有〇· 9%氯化鈉溶液的 蒸餾水

1262214 _案號89101541_年月 日， 修正 五'發明說明（21) 培養時間 樣品1 A在LCD顯示器 樣品1B在LCD顯示器 (小時） 上的光強度[RLU] 上的光強度[RLU] 0 0. 001 0.001 4 0.002 0. 003 7 0. 002 0.004 17 0.004 0. 007 採取習用方法時，經過1 7小時後並未觀察出輕度及重度污 染懸浮體之間有明顯的差異。 如本發明所用者，即以重量為準的3%有機滋養溶液（胰蛋 白酵素豆羹瓊脂） 培養時間 樣品1 A在LCD顯示器 樣品1B在LCD顯示器 (小時） 上的光強度[RLU] 上的光強度[RLU] 0 0. 001 0. 002 4 0. 004 0. 006 7 0.007 0. 045 17 0.050 0. 240

第26頁

1262214 -- -塞j虎89101541 . 年月 H 故:r_ 五、發明說明（22) " 採取如本發明所述的新穎方式，經7小時後便已能在「輕 度」及「重度」污染溶液之間觀察出區別。 此外，「輕度污染」在1 7小時也已能被具體檢測出。 文獻及1 995年5月發行的3.0版Bi〇〇rbit光度計使用手冊， 以及設址於FIN 20 5 2 1 Turku, Finland (芬蘭）之

BioOrbi t 0Y公司的應用說明第2〇項，均顯示出利用[RLU] 數值來計算生物量（biomass)的評估模型。另外，利用已 知污染度的懸浮體從事「校準」，亦可測定細菌數/公 撮。 範例4 )美國黏土槳料 處理過程 以重1為準，將若干各為3公撮，產自美國喬治亞州的 72· 8%天然美國黏土粉（95%小於2以瓜的粒子，78%小於i = 的粒子）以〇. 3 5%的商用聚丙烯酸鈉予以分散，再用吸 置官吸入各自的無菌燒杯中。以重量為準，對其中一件樣 =加入3公撮3%的TAT肉羹基質/Tween 2〇滋養溶液，另對 第一件樣品加入3公撮3 %的胰蛋白酵素豆羹滋養溶液。其 後’把這兩件樣品充分摻混2〇秒鐘，然後進行離心處理。 在8 0 0 g條件下離心丨〇分鐘後，清澈的上清液相即被隔離 出來並利用Cel 1 Facts予以分析。這分析是分別在經過離 心（時間tGh)後，以及經過2小時（時間)，4小時（時間t4h ) 及6小日守（時間)的培養時間後，以立即量測c e 1 1 F a c t s儀 器中之粒子數的方式進行。培養溫度為3 〇。C。緣出粒子數

第27頁 1262214 _4 案號89101541 _年.月日 修正 ·_ 五、發明說明（23) 位所存在的活細胞（峰值放大）及微生物的型式（細菌、酵 母菌或黴菌）。等達到與指數生長差不多的培養時間過 後，以反推到時間（tGh )的方式測定懸浮體的原始污染。另 外，按照Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計 數的測定，以供比較。（S c h w e i z e r i s c h e s

Lebensmittelbuch 1985 年版及 1988 年修訂版第56 章7. 01 節「Bestimmung von aeroben Bakterien und Ke i men」）。 按照Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計婁文的 測定 經過4 8小時後的細菌計數測定顯示：懸浮體中有5 · 〇 χ 1 (p 需氧嗜常溫細菌數/公撮。 利用C e 1 1 F a c t s粒子計數器測定細菌計數 1·ΤΑΤ肉羹基質/Tween 20 (聚氧化乙烯單月桂酸山梨糖） 2·胰蛋白酵素豆羹瓊脂 樣品 卒取劑 所需測定時間 懸浮體中之需氧嗜 (小時） 常溫細菌數/公撮 (粒子直徑為卜2. 5 時的最大峰值）

1 TAT 肉羹基質 12 1. 12 X HP /Tween 20

第28頁 1262214 皇號89ijn^ 五、發明說明（24) 5.21 X 1〇5 2 騰蛋白酵素豆 羹瓊脂 樣品 卒取劑 測定時間 (小時） 懸浮體中之黴菌數/公 撮（粒子直徑為5 - 9 # 1 時的最大峰值） 2 胰蛋白酵素 12 豆羹瓊脂 小於1 03 按知本發明所述方法予以分析的樣品，與按昭 Schweizerisches Lebensmittelbuch之方法經“小時後所 測定之細菌數的測定極為相符。 與知：fe^Schweizerisches Lebensmittelbuch 之方法所測定 的細菌數比較，兩種樣品均在可信限值内。 此處所稱可信限值（conf idence 1 i mi ts)係指依據設址於 61 Colindale Avenue, London NW 9 5HT, UK (英國）之 PHLS 中央公共衛生實驗室（PHLS Central Public Health L a b o r a t o r y)發行的0 7 0刊物中第6及7頁以及附件1，發行 日期為1998年11月16日，及報告曰期為1998年12月30日所 石$立的誤差標準，即個別細菌數測定在土 0 . 5 1 〇 g 1 0者。 範例5 ) 造紙機白水 處理過程 以重量為準，將3公撮含有約〇 · 2 %產自挪威之天然大理石 粉的0 . 5 %含水漿料（6 0 %小於2 // m的粒子，3 5 %小於1 // m

第29頁 1262214

—--_ 案號 smmwi 五、發明說明（25) 勺粒子）以〇 · 1 5 %的商用聚丙細酸鈉，如紙廠所用的約〇 3 % ，纖維素纖維（亞硫酸/硫酸鹽紙漿），及大約〇· 〇5%的商用" 聚，烯驢胺予以分散，再用吸量管吸入一無菌燒杯°中:以 重夏為準，對這樣品加入3公撮3 %的胰蛋白酵素豆囊滋養 溶液。其後，把這樣品充分摻混2〇秒鐘，然後進行離=處 理。1 0 0 0 g條件下離心10分鐘後，清澈的上清液相位$ 被隔離出來並利用C e 1 1 F a c t S予以分析。這分析是分別在 經士過離心（時間tGh)後，以及經過1小時（時間tlh)及2小時 (時間hh)的培養時間後，以立即量測Cel 1Facts儀器中之 粒子數的方式進行。培養溫度為3 Q。C。繪出粒子數對粒子 直徑的圖表，即可在特定培養時間過後測定清澈相位所存 在的活細胞（峰值放大）及微生物的種別（細菌、酵母菌或 黴菌）。等達到與指數生長差不到的培養時間過後，以反 推到時間（tQh )的方式測定懸浮體的原始污染。另外，按 照8(：11%^1261^3(31^3 1^6611311^1：16 11)11(3]1從事細菌計數的測 疋’以供比較。（Schweizerisches Lebensmittelbuch 1985年版及1988年修訂版第56章7·01節「Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen 」）。 按如Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計數的 測定 經過4 8小時後的細菌計數測定顯示：懸浮體中有3. 〇 χ 1 〇7 需氧嗜常溫細菌數/公撮。

第30頁 1262214

利用Cel 1 Facts粒子計數器測定細菌計數 1·騰蛋白酵素豆羹瓊脂 樣品 卒取劑 所需測定時間 (小時） 溫細菌數/公撮子 ί佐為1 ~ 2 . 5 " m時的 敢大峰值） 3 · 4 5 X 1 〇7 懸浮體中之黴菌數/公 撮（粒子直徑為5 — 9 v 時的最大峰值） 1 胰蛋白酵素 2 豆羹瓊脂 樣品 萃取劑 測定時間 (小時） 胰蛋白酵素 6 約1 〇4 豆羹瓊脂 按照本發明所述方法予以分析的樣品，與按照

Schweizerisches Lebensmittelbuch 之方法經48 小時後所 測疋之細囷數的測定極為相符。 與知：Schweizerisches Lebensmi ttelbuch 之方法所測定 的細菌數比較，兩種樣品均在可信限值内。 此處所稱可信限值係指依據設址於β丨c 〇 1 i n d a 1 e A V e n u e，

London NW9 5HT，UK (英國）之pHLS中央公共衛生實驗室

第31頁 1262214 案號 89101541

五、發明說明（27) (PHLS Central Public .,,^ , „ 7 _ Health Laboratory)發行的〇70 刊 物中弟6及7頁以及附件〗，π — + 、 1干1 ，發行日期為1 9 98年11月16日， 及報告日期為1998年12月3d 口 & 士 # &、， <月川日所確立的誤差標準，即個別 細囷數測定在± 0 · 5 1 〇 g 1 Q者。 範例6)膠狀玉米澱粉 處理過程

以重里為f將3公撮如紙廠所用的丨〇 %膠狀玉米澱粉懸浮 體以吸里吕吸入一無菌燒杯中。以重量為帛，對這樣品加 入3公撮3%的胰蛋白酵素豆羹滋養溶液。其後，把這樣品 充分摻混20秒鐘，然後進行離心處理。在80 0 g條件下離 心1 0分鐘後，清澈的上清液相位即被隔離出來並利用 C e 1 1 F a c ΐ s予以为析。這分析是分別在經過離心（時間u ) 後，以及經過1小時（時間tih)及2小時（時間的培養時間 後，以立即量測Cel lFacts儀器中之粒子數的方式進行。 培養温度為30。C。繪出粒子數對粒子直徑的圖表，即可在 特定培養時間過後測定清澈相位所存在的活細胞（峰值放 大）及微生物的種別（細菌、酵母菌或黴菌）。等達到與指

數生長差不多的培養時間過後，以反推到時間（)的方式 測定懸浮體的原始污染。另外，按照Schweizerisches Lebensmi ttelbuch從事細菌計數的測定，以供比較。 (Schweizerisches Lebensmittelbuch 1985 年版及1988 年 修訂版第56 章7.01 節「Bestimmung von aeroben

Bakter i en und Keimen」）。 按照Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計數

第32頁 1262214 案號 89101541 年 月 曰 修正 五、發明說明（28) 的測定 經過48小時後的細菌計數測定顯示：懸浮體中有4. 0 X 1 06 需氧嗜常溫細菌數/公撮。 利用C e 1 1 F a c t s粒子計數器測定細菌計數 1.胰蛋白酵素豆羹瓊脂 樣品 萃取劑 所需測定時間 (小時） 懸浮體中之需氧嗜常溫 細菌數/公撮（粒子直徑 為1-2.5 //m時的最大 峰值） 1 胰蛋白酵素 豆羹瓊脂 4.2 2 X 106 樣品 萃取劑 測定時間 (小時） 懸浮體中之黴菌數/公撮 (粒子直徑為5-9 /zm時 的最大峰值） 胰蛋白酵素 12 豆羹瓊脂 小於1 02 按照本發明所述方法予以分析的樣品，與按照 Schweizerisches Lebensmittelbuch 之方法經48 小時後戶斤 測定之細菌數的測定極為相符。

第33頁 1262214 _案號89101541 , 年月日 •修正__ 五、發明說明（29) 與按照 S c h w e i z e r i s c h e s L e b e n s m i 11 e 1 b u c h 之方法戶斤測定 的細菌數比較，兩種樣品均在可信限值内。 此處所稱可信限值係指依據設址於6 1 C ο 1 i n d a 1 e A v e n u e， London NW9 5HT，UK (英國）之PHLS中央公共衛生實驗室 (PHLS Central Public Health Laboratory)發行的 0 7 0 刊 物中第6及7頁以及附件1，發行日期為i 9 9 8年11月i 6曰， 及報告日期為1 9 9 8年1 2月3 0日所確立的誤差標準，即個別 細菌數測定在± 〇 · 5 1 〇g 1 〇者。 範例7 ) 處理過程 以重s為準’將若干各3公撮的71· 5%天然大理石粉含水漿 料（90%小於2 的粒子，65%小於i "爪的粒子）以〇 5%的 商用^丙烯酸鈉予以分散，再分別置於無菌燒杯中並以各 3=撮的萃取劑充分摻混。在80 0 g條件下離心1 〇分鐘後， 清澈^上清液相位即被隔離出來並利用Cel lFacts予以分 =乂刀析疋分別在經過離心（時間U )後，以及經過2小 ^士 ^間^)，4小時（時間^)，7小時（時間t7h)，17小時 1 17h 及24小時（時間kh)的培養時間後，以立即量 c。繪出粒子數子數的方式進行。培養溫度為3〇。 養時間過後測定、、主激二柏彳子之直徑的圖表，即可在特定培 生物的種別（細菌θ 位所存在的活細胞（峰值放大）及微 不多的培養時間過後囷或黴菌）。等達到與指數生長差 體的原始污染。另冰，：反推到時間（t°h)的方式測定懸浮 ---二卜，按照 S c h w e i z e r i s c h e s

第34頁 1262214 _.案號89101541_1年月 曰_修正 _ 五、發明說明（30) L e b e n s m i 11 e 1 b u c h從事細菌計婁欠的測定，以供比較。 (Schweizerisches Lebensmi ttelbuch 1985 年版及 1988 年 修訂版第56 章7·01 節「Bestimmung von aeroben Bakter i en und Keimen」）。 所用的萃取劑： 習用技藝 1.蒸館水 2 ·以重量為準，含有〇 · 9 %氯化鈉溶液的蒸餾水，無機鹽 3·以重量為準，〇· 8%的聚氧化乙烯單月桂酸山梨糖溶液（2 克分子的聚氧化乙烯），有機界面活性劑 如本發明所述的範例 以重夏為準’4.3%的有機滋養溶液（胰蛋白酵素豆羹瓊脂） 按照Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計數的 測定 經過48小時後的細菌計數測定顯示：懸浮體中有5. 〇 χ 1 〇4 需氧嗜常溫細菌數/公撮。 利用Cel 1 Facts粒子計數器測定細菌計數 樣品 萃取劑 所需測定時間 懸浮體中之需氧嗜常 (小時） 溫細菌數/公撮（粒子 直徑為1-2.5 //m時的 最大峰值）

第35頁 1262214 __案號89101541__年月日 修正 五、發明說明（31) 1 Aq. Dest. 17 2 X 1〇3 2 氯化納溶液 18 1· 6 X 1〇3 3 聚氧化乙烯單 月桂酸三梨糖 24 小於1 〇2 4 有機滋養溶液 7 5.6x10^ 樣品1 -3先是確切證明需要很長的培養時間始能計算出結 果，其次，也證明這結果並不正確（參考資料：按照 Schweizerisches Lebensmittelbuch從事細菌計數的測 定）。 就樣品1-3而言’按照Schweizerisches

Lebensmi ttelbuch所測定的細菌計數，其變化遠超過可信 限值。 樣品1及2缺乏可供當作養分的有機物質。樣品3雖含有有 機物質，但這物質並無可供當作養分的效用，反倒具有作 為抑制劑的效用。在使用T w e e η 2 0的範例4 - 1中，如果用 其結果與範例4 - 2比較，即可觀察出τ w e e η 2 0有某種抑制 作用。然而，就範例4-2而言，當作本發明所用滋養溶液 的有機物質卻能防止產生不正確的結果。不過，與範例7 — 4比較時，範例7 - 3卻會得出重大的錯誤結果。 已知：ft?、本發明所述方法予以分析的樣品4，與按照

Schweizerisches Lebensmi ttelbuch 得出之細菌計數的測 定極為相符。

第36頁 1262214 _案號89101541_年月 曰1 修正_ 五、發明說明（32) 出之細菌計數的測定在可信限值内。 此處所稱可信限值係指依據設址於6 1 C ο 1 i n d a 1 e A v e n u e， London NW9 5HT，UK (英國）之PHLS中央公共衛生實驗室 (PHLS Central Public Health Laboratory)發行的 070 刊 物中第6及7頁以及附件1，發行日期為1 9 9 8年11月1 6日， 及報告日期為1 9 9 8年1 2月3 0日所確立的誤差標準，即個別 細菌計數測定在± 〇 · 5 1 〇 g 1 〇者。 較佳營養培養基的成分 胰蛋白酵素豆羹 Bacto胰化月東17.0 g/1 Bacto胰化月東3.0 g/1 Bacto 葡萄糖2. 5 g/1 氯化鈉5. 0 g / 1 填酸氫二钾2. 5 g/1 TAT肉羹基質

Bacto胰化月東20.0 g/i 偶氮卵填脂5. 0 g / 1 營養肉羹 B a c t 〇濃縮牛肉汁3. 〇 g / 1

Bacto 蛋白晦（peptin)5.〇 g/1

1262214 •_案號89101541 1 年月日 修正. 五、發明說明（33) 酿蛋白之蛋白騰1.0 g/1 氣化鈉1. 8 g/1 平JHL計數用瓊脂 酵母浸膏2 . 5 g / 1 Bacto 葡萄糖1.0 g/1 1號瓊脂9. 0 g/1 乙二醇 乙二醇 1 · 〇 g/ 1 偶氮卵填脂5 . 0 g / 1 氯化納1. 8 g / 1 甘油酉旨 甘油酯1. 0 g/1 偶氮卵填脂5. 0 g / 1 氯化鈉1. 8 g/1

第38頁 1262214 _'案號89101541_年.月 日 修正 圖式簡單說明 第39頁

Claims (1)

1262214

l 、一種微生物污染測定法，該測定方 質及/或色素顏料及/或填充劑及/或纖維盘益&有無機礦物 或色素顏料及/或填充劑懸浮體之混合的ς ^物質及/ 行定量及/或定性測定，其中該方法包勿污染進 (a)將一件懸浮體、乳化體或分散體的樣口 ^驟. 生物之培養基的形式被添加，其中所指沁7/邊荨裰 及/或黴菌及/或酵母菌之任一種，嗲二U生物為細菌 盥嗲簟沪^ /二 有機物質可讓微生物 二專1 充劑及/或顏料及/或纖維料分離· 礦物及=K(a)步驟之混合物’以便讓微生物與該等 生位Λ /及/或顏料及/或纖維料分離，離心後微 (C)將上層相位分離於下層相位；以及 夜體， (d)測定上清液中之微生物之數量及/或尺寸及/或型式。 2、如申請專利範圍第1項所述之方法，其中包括微 生物培養步驟以增加微生物數目。 人 3、如申請專利範圍第1項所述之方法，其中培養基 a有一種奴、氮、磷及/或硫的來源，以及選擇性的各種 礦物、生長因子及/或維生素來源。 4、 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中進行離 心的方法是把大部份的礦物及/或填充劑及/或顏料及/或 纖維料與微生物分開，並讓微生物累積在上層相位。 5、 如申凊專利範圍第4項所述之方法，其中是在 ^0-1，5 0 0g的條件下進行離心。 1262214 _案號 89101541_ j年 月‘日 修正 __ 六、申請專利範圍 6 、如申請專利範圍第5項所述之方法，其中是在 2 0 0 - 1，2 0 0 g的條件下進行離心。 7 .如申請專利範圍第6項所述之方法，其中是在 6 0 0 - 1，0 0 0 g的條件下進行離心為佳。 8、如申請專利範圍第2項所述之方法，其中培養溫 度係為2 0 - 3 7° C。 9 、 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中培養 溫度係為28- 34° C 1 0、如申請專利範圍第9項所述之方法，其中培養 溫度係以31. 5-32. 5° C為佳。 1 1 、如申請專利範圍第3項所述之方法，其中所用 的培養基能選擇性的使準備測定的細菌生長。 1 2 、如申請專利範圍第1 1項所述之方法，其中所 用的培養基係胰化偶氮卵磷脂/Tween 20 (TAT)肉羹 瓊脂及/或葡萄糖溶液及/或蛋白 fk /酪蛋白及/或滋養羹， 但以胰蛋白酵素豆羹瓊脂為宜。 1 3 、如申請專利範圍第1 2項所述之方法，其中以 重量為準，微生物培養基的濃度係為0 . 1 - 1 0%。 14、 如申請專利範圍第1 3項所述之方法，其中 队重量為準，微生物培養基的濃度係為2-5%。 15、 如申請專利範圍第1 4項所述之方法，其中 以重量為準，微生物培養基的濃度係以3 %為佳。 1 6 、如申請專利範圍第1項所述之方法，其中懸浮 體、乳化體或分散體另含有膠狀形式的聚合物。

第41頁 1262214 案號 89101541 .年 月 修正1 六、申請專利範圍 1 7、如申 及/或黴菌及/或 析中同時進行。 1 8、如申 步驟的進行時間 1 9、如申 心步驟的進行時 2 0、如申 心步驟的進行時 2 1、如申 心處理所取付的 分析微生物的量 2 2、如申 物尺寸及數量的 過一個具有一定 進口及出 積直接有 即與微生 2 3 離心處理 物所產生 2 4 體、乳化 及紙工業 口施加 關的樣 物的數 、如申 所取得 的ATP 、如申 體及懸 、以及 請專利範圍第1項所述之方法，其中細菌 酵母菌的定性及/或定量測定是在一次分 請專利範圍第5項所述之方法，其中離心 係為1 - 3 0分鐘。 請專利範圍第1 8項所述之方法，其中離 間係為2 - 1 5分鐘。 請專利範圍第1 9項所述之方法，其中離 間係為以1 0分鐘為佳。 請專利範圍1 8項所述之方法，其中以離 含有微生物的相位，係利用粒徑分析法來 請專利範圍第1項所述之 分析方式是利用真空把微 長度與直徑的量測孔，其 電壓，並在微生物通過與 品時，量測電流脈衝，而 量有關。 請專利範圍第2 1項所述 的含有微生物的相位，係 再據以分析微生物的量（ 請專利範圍第1項所述之 浮體的微生物污染，是在 紙工業白水所調查者。 方法，其中微生 生物樣品吸出通 中對該量測孔的 該等微生物之體 電流脈衝的數值 之方法，其中以 先測定該等微生 方法，其中分散 金屬工業、顏料

第42頁