CZ302995B6

CZ302995B6 - Zpusob kvantitativního a kvalitativního urcení mikrobiální kontaminace v suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplnové látky a/nebo vláknité materiály

Info

Publication number: CZ302995B6
Application number: CZ20012588A
Authority: CZ
Inventors: Buri@Matthias; Schwarzentruber@Patrick
Original assignee: Omya Development Ag
Priority date: 1999-02-02
Filing date: 2000-01-17
Publication date: 2012-02-15
Also published as: WO2000046392A3; HUP0105360A2; NZ513627A; HUP0105360A3; CA2361665C; ATE307894T1; WO2000046392A2; TWI262214B; CA2361665A1; AU778034B2; CO5241363A1; BR0007965B1; KR20010103001A; TR200102213T2; NO20013506L; DE19904057A1; AR022339A1; EP1149172A2; CZ20012588A3; EP1149172B1

Abstract

Zpusob kvantitativního a/nebo kvalitativního urcení mikrobiální kontaminace v suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplnové látky a/nebo vláknité materiály, kdy vzorek suspenzí, emulzí nebo disperzí je následne po pridání jedné nebo více organických látek, které jsou degradovatelné mikroorganismy, promíchán a po prípadné následné inkubaci je centrifugován z duvodu oddelení mikrooganismu od zmínených minerálních látek a/nebo výplnových látek a/nebo pigmentu a/nebo vláknitých látek. Ve vodné supernatantové fázi po jedné nebo více inkubacích je urcen pocet a/nebo velikost a/nebo typ mikroorganismu.

Description

(57) Anotace:

Způsob kvantitativního a/nebo kvalitativního určení mikrobiální kontaminace v suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplňové látky a/nebo vláknité materiály, kdy vzorek suspenzí, emulzí nebo disperzí je následné po přidání jedné nebo více organických látek, které jsou degradovatelné mikroorganismy, promíchán a po případné následné inkubaci je centrifugován z důvodu oddělení mikrooganismů od zmíněných minerálních látek a/nebo výplňových látek a/nebo pigmentů a/nebo vláknitých látek. Ve vodné supernatantové fázi po jedné nebo více inkubacích je určen počet a/nebo velikost a/nebo typ mikroorganismů.

Způsob kvantitativního a kvalitativníbo určení mikrobiální kontaminace v suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplňové látky a/nebo vláknité materiály

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k procesu kvantitativního a/nebo kvalitativního určení mikrobiální kontaminace ve vodných suspenzích, emulzích nebo disperzích, které obsahují minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplňové vláknité materiály, volitelně v kombinaci s polymery v koloidní formě.

Dosavadní stav techniky

Určování mikrobiální kontaminace a hygienické kontroly vodných suspenzí pomocí prostředků konvenčních metod se hlavně opírá o kapacitu pomnožení mikroorganismů, které mají být detekovány. Přirozeně čas, který je nezbytný pro provedení těchto metod, se pohybuje od 24 h do několika dní. Tato časová období jsou z mnoho důvodů příliš dlouhá, a výsledky jsou dosažené příliš pozdě na to, aby bylo možno zasáhnout řízeným způsobem do výrobních procesů. Zvláště provádění kontrol předcházející období transportu opět vyžaduje metody, pro které jsou charakteristické krátké intervaly určení kontaminace.

Tudíž hlavním problémem konvenčních mikrobiálních analýz aerobních mezofilních mikroorganismů, takových metod, jako jsou Plate Count nebo Easicult, je jejich dlouhá kultivační doba dosahující až 48 h. Těmito metodami je nemožné získat vyhodnocení a, tím pádem, určení počtu mikroorganismů dříve, než po uplynutí dvou dnů. Kromě toho musí být bráno v úvahu několik dalších vlivů takových, jako jsou kultivační médium, parciální tlak kyslíku (aerobní/anaerobní mikroorganismy), selektivita, pH a ještě další.

Proto je často nemožné určit počet mikroorganismů v takových výrobcích, jako jsou pigmentové pryskyřice, před jejich dopravou námořním transportem k zákazníkům a zasáhnout řízeným způsobem přidáním biocidních látek. Z důvodu dlouhých transportních časů, které vyžadují až 6 týdnů zaoceánskou lodí nebo po železnici, se může pigmentová pryskyřice zkazit nebo se stát nepoužitelnou. V bílé pigmentové pryskyřici se může vyvinout šedá barva a může začít zapáchat. V současnosti pouze jedinou možností, jak vyloučit znehodnocení, je preventivní předá vkování pigmentové pryskyřice biocidními látkami, které je velmi nákladné, promrhává prostředky a je ekologicky nesmyslné. Navíc jsou nezbytné dva různé přístupy analýzy pro oba typy mesofilních mikroorganismů, pro bakterie a pro plísně. Kromě toho je nezbytná příprava mnohonásobných ředění, což znásobuje počet analýz.

Konvenční metody určení mikroorganismů vpapímickém průmyslu a průmyslu barviv byly například popsány v „Schweizerisches Lebensmittebuch“, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988, v „Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen“, a v „Schweizerisches Lebensmittelbuch“, kapitola 56, sekce 7.22, edice 1985, revidovaná verze 1988, v „Bestimmung von Pilzen“. Obecně je před prováděním určování v každém případě nezbytné inkubační období okolo 48 hodin.

Společností Microbial Systems, Ltd. byly vyvinuty metoda a CellFacts® částicový analyzátor. Podrobnější informace mohou být získány z Labor flash 9/96, Zeitung mit Leserdienst fiir Labor und Forschung, Ott Verlag + Druck AG, Ch-3607 Thun, Švýcarsko. Tudíž bylo zmíněno, že CellFacts analyzátor může být také použit pro provádění určování počtu mikroorganismů v pryskyřicích uhličitanu vápenatého. Nicméně experimenty provedené v laboratoři přihlašovatele vynálezu ukázaly, že určení tohoto typu způsobem, který popisuje výrobce, je neproveditelné nebo pouze nepřesné.

- 1 CZ 302995 B6

Princip měření prováděný CellFacts analyzátorem je založen na měření baktérii, plísní a kvasinek ve formě částic v elektrickém poli, kde je počet částic určován podle intervalu inkubace vzorků a následným měřením zvýšení poětu částic a, v případě exponenciálního růstu, extrapolací k času to. Tento princip měření je také účinný při měření „nízkého“ počtu „cizích částic“, které mají stejnou nebo podobnou velikost jako bakterie, plísně a kvasinky. V případě suspenzí a emulzí obsahujících podíl takových „cizích částic“, jako jsou minerální látky, náplně a/nebo pigmenty o podílu > 1 % hmotnosti, má řada přítomných inertních „cizích částic“ stejnou velikost jako mikroorganismy, a to 0,5 až 20 pm, což znamená, že počáteční hodnota v čase to je příliš velká, než io by umožnila detekci dalšího zvýšení pomnožení mikroorganismů v inkubátoru v rámci časového období < 10 hodin. Tudíž CellFacts analyzátor je neschopný provést dostatečně přesné měření, a výrobce vyžaduje ředění počáteční kapaliny, aby mohl zaručit aplikovatelnost.

Při počáteční hodnotě 10⁸ částic/ml je nemožné významně detekovat zvýšení o IO³ částic/ml pro15 středky CalIFacts analyzátoru. Nicméně ředění požadované z důvodu přítomnosti „cizích částic“ je příliš vysoké, takže ředění množících se organismů, které jsou samozřejmě zředěné ve stejném řádu hodnoty, není dále významné, a dosažený výsledek je nesprávný. Kromě toho „cizí částice“ mající průměr > 20 pm mohou ucpat měřicí prostor, který má průměr pouze 30 pm. „Cizí částice“ mající průměr > 20 pm mohou ucpat měřicí prostor, který má průměr pouze 30 pm. „Cizí částice“ mohou být například minerálního typu takového, jako je uhličitan vápenatý, syntetického, organického, polymemího typu takového, jako jsou póly sty ren-akrylátové disperze, nebo přírodního organického typu takového, jako jsou roztoky škrobu nebo hemicelulózy a/nebo celulózová vlákna, nebo kombinace výše popsaných částic, které jsou například přítomny ve výrobním cyklu papírny.

Podstata vynálezu

Předmět předkládaného vynálezu zajišťuje rychlý a silný, jednoduše proveditelný proces kvanti30 tativního a/nebo kvalitativního určení mikrobiální kontaminace ve vodných suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplňové látky a/nebo vláknité materiály, kde se zmíněný proces vyhýbá výše popsaným nevýhodám předchozího stavu techniky.

Předkládaný vynález se týká způsobu kvantitativního a/nebo kvalitativního určení mikrobiální kontaminace v suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplňové látky a/nebo vláknité materiály, kdy:

a) vzorek suspenzí, emulzí nebo disperzí se smíchá s jednou nebo více organickými látkami, které jsou degradovatelné mikroorganismy, a které jsou účinné jako separační činidla mezi mikroorganismy a minerálními látkami, pigmenty, výplňovými látkami a/nebo vláknitými materiály, přičemž množství biodegradovatelné látky je vybráno takovým způsobem, že se oddělí mikroorganismy od minerálních látek, výplňových látek, pigmentů a/nebo vláknitých materiálů, a kdy se případně provede inkubace, aby došlo ke zvýšení poětu mikroorganismů,

b) získaná směs se centrífuguje tak, že většina minerálních látek a/nebo výplňových látek a/nebo pigmentů a/nebo vláknitých látek se oddělí od mikroorganismů, které jsou pak v horní fázi, a

c) vodný supematant získaný centrifugací se výhodně podrobí jedné nebo více inkubacím za účelem zvýšení počtu mikroorganismů ve zmíněném supematantu, a

d) se stanoví počet a/nebo velikost a/nebo typ mikroorganismů v tomto supematantu.

Byl tedy vyřešen způsob, kdy vzorek suspenzí, emulzí nebo disperzí po přidání jedné nebo více organických látek, které jsou degradovatelné mikroorganismy, a případně po následné inkubaci, . 9 .

je centrifugován, aby došlo k oddělení mikroorganismů od minerálních látek a/nebo výplňových látek a/nebo pigmentů a/nebo vláknitých materiálů a počet a/nebo velikost a/nebo charakter mikroorganismů ve vodné fázi supematantu byl určen po jedné nebo více inkubacích.

Již několik let patří kvantitativní a kvalitativní stanovení mikroorganismů do stavu techniky. Nicméně stanovení mikrobiální kontaminace je zvláště obtížné v případech, kde ve vzorku, který má být zkoumán, je přítomna vysoká koncentrace dalších částic pevného materiálu takového, jako jsou minerální látky, pigmenty, výplňové látky a/nebo vláknité materiály. Protože tyto „cizí částice“ mají často velikost podobnou mikroorganismům, je obecně možné pouze minimalizovat io počet takovýchto „cizích částic“ vytvořením vyšších ředění. Nicméně současně a nevyhnutelně tyto kroky vysokého ředění redukují počet kontaminujících mikroorganismů a dlouhé inkubační období je nezbytné, aby se zvýšil počet mikroorganismů prostředky rozmnožování do stupně, který umožňuje bezpečnou detekci.

Proto zde byla potřeba vytvořit nový proces, který zajistí reprodukovatelné a spolehlivé výsledky s ohledem na počet, velikost a/nebo typ mikroorganismů ve vzorku, který má být zkoumán, v podstatě kratším čase.

Překvapivě a neočekávaně bylo objeveno, že je možné oddělit mikroorganismy od inertních materiálů („cizích částic“) přidáním degradovatelných organických látek ke vzorku a provedením následné centrifugace. Obvykle se mikroorganismy přednostně drží na povrchu minerálních látek, pigmentů, výplňových látek a/nebo vláknitých materiálů, což dělá jejich oddělí od povrchu obtížným. Ačkoliv jsou „cizí částice“ sed i mentovány jednoduchým centrifugačním krokem, přesto jsou mikroorganismy taženy spolu do pelety, protože přednostněji lpí na těchto částicích, a proto množství mikroorganismů, které zbývají v supematantu, poskytuje nepřesné hodnoty s ohledem na stupeň kontaminace těmito mikroorganismy.

Bylo prokázáno, že přidání biologicky degradovatelných organických látek umožňuje oddělení mikroorganismů a minerálních látek, pigmentů, výplňových látek a/nebo vláknitých materiálů.

Přednostněji je organickou látkou, která může být degradována mikroorganismy, živné médium konvenčně používané při kultivaci mikroorganismů. Překvapivě toto živné médium působí jako separaění činidlo mezi mikroorganismy a cizími částicemi a tudíž z počátku umožňuje oddělení a rozlišení mezi těmito dvěma skupinami bez toho, aby mělo vliv na další kroky analýzy mikroorganismů. Látky, které nemohou být biologicky degradovány nebo jejichž biologická degradace je obtížná, sebou nesou riziko, že zatímco jsou mikroorganismy oddělovány od inertních částic, tak ve stejnou dobu působí tyto látky jako inhibitory růstu mikroorganismů a tudíž vedou k chybným výsledkům.

Při procesu podle předkládaného vynálezu ne pouze jeden procesní krok, zejména krok ředění, může být vynechán, ale navíc inkubační doba je neobyčejně redukována. Kromě toho zde separační látka není pouze přidávána, ale separační látka současně působí jako živný roztok, který může být použit pro optimální pomnožení mikroorganismů k tomu, aby mohly být analyzovány, a v upřednostňované části vynálezu, je vybrána tak, aby byla specifická pro konkrétní typy mikroorganismů, které mají být testovány, takové, jako jsou baktérie, plísně nebo kvasinky.

Předmět podle předkládaného vynálezu byl vyřešen tím, že byla pouze přidána organická látka, která může být degradována mikroorganismy, přednostně ve formě živného roztoku nebo média, respektive, a byl zaveden centrifugační krok. Bylo dosaženo zredukování doby analýzy nebo dokonce možnosti vůbec analýzu provést, protože vzorek, který má být testován, obsahuje malé množství „cizích částic“. Kromě toho je možné použít menší počáteční množství a menší zvýšení mikrobiálních částic během časového období, než u vzorků, které mají vyšší počáteční hodnotu, to znamená vyšší počet „cizích částic“.

Podle procesu podle předkládaného vynálezu mohou být testovány vodné suspenze, emulze a disperze, které kromě dalších látek obsahují minerální látky, pigmenty, výplňové látky a/nebo

-3 CZ 302995 B6 vláknité materiály takové, jako jsou celulózová vlákna, a které volitelně dále obsahují polymery takové, jako jsou přírodní, syntetické nebo polysyntetické polymery v koloidní formě. Příklady takovýchto polymerů zahrnují: styrenbutadien, styrenakrylát, melaminovou pryskyřici, pryskyřice formaldehydu močoviny, škrob, karboxymethylcelulózu.

Přednostně jsou vzorky, které mají být testovány, získány z průmyslu zpracování papíru. Dalšími oblastmi použití jsou průmysl barviv a průmysl zpracování kovů.

Podle předkládaného vynálezu je získán vzorek suspenzí, emulzí nebo disperzí, který má být testován na přítomnost mikrobiální kontaminace. Obecně množství získaného vzorku je 0,5 až 20 ml, nicméně může být odebráno menší nebo větší množství vzorku. Kromě toho množství odebraného vzorku není důležité pro úspěšné provedení procesu podle předkládaného vynálezu. Odebraný vzorek je přidán k a mixován s organickými látkami, které mohou být degradovány mikroorganismy. Množství biodegradovatelných organických látek přidaných ke vzorku odpovídá 0,5 až 50 ml biodegradovatelné látky na ml vzorku.

Poměr objemu vzorku ku objemu biodegradovatelné látky je závislý na původní koncentraci vzorku a koncentraci biodegradovatelné látky v roztoku. Poměr je upraven vzhledem k množství biodegradovatelné látky, které je dostatečně velké, aby umožnilo oddělení mikroorganismů a minerálních látek, výplňových látek, pigmentů a/nebo vláknitých materiálů a volitelně také polymerů v koloidní formě. Optimální poměr objemu vzorku ku objemu biodegradovatelné látky, který musí být určen v každém případě, může být určen osobou znalou stavu techniky pomocí prostředků manuálního experimentování.

Obvykle je koncentrace roztoku obsahujícího biodegradovatelnou látku vybrána tak, aby dosáhla poměru roztoku vzorku ku roztoku, který obsahuje biodegradovatelnou látku, v hodnotách od 1:0,1 do 1:100. Optimální poměr je silně závislý na koncentraci a složení jednotlivého roztoku vzorku. Pigmenty a/nebo suspenze výplňových látek, které mají obsah pevných částic > 65 % hmotnosti, jsou obvykle ředěny v poměru od 1:2 do 1:10, vhodněji v poměru 1:3. Pokud je obsah pevných částic <65% hmotnosti, pak je roztok obvykle upraven v poměru od 1:0,1 do 1:1. V některých případech, zvláště pokud může být očekávána velmi vysoká kontaminace, je ředění obecně prováděno v poměru od 1:10 do 1:00. Vybraný ředicí faktor musí být brán v úvahu při následném určování kontaminace nebo musí být specificky zdůrazněn ve výsledku.

Biodegradovatelné organické látky zvláště zahrnují skupinu živných médií, která jsou specifická pro konkrétní rody mikroorganismů, které mají být testovány. Živné médium vhodně obsahuje zdroj uhlíku, dusíku, fosforečnanu, a/nebo síry právě tak, jako volitelně materiály, růstové faktory a/nebo vitamíny. Další látky mohou být přidány do živného média, pokud jsou nezbytné pro optimální růst mikroorganismů. V následujícím textu jsou popsány upřednostňované materiály, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu.

Volitelně po přidání živného média může být proveden jeden nebo více inkubačních kroků, aby došlo k zvětšení počtu mikroorganismů ve vzorku. Toto může být zvláště výhodné pro následnou kvalitativní analýzu. Nicméně v upřednostňované části předkládaného vynálezu je tato inkubace předcházející centrifugaci vynechána, což vede ke znatelnému snížení času.

Aby došlo k oddělení mikroorganismů od minerálních látek, výplňových látek, pigmentů a/nebo vláknitého materiálu je centrifugaČní krok prováděn následně po přidání živného média a volitelně po následném inkubačním kroku. CentrifugaČní krok je prováděn takovým způsobem, aby došlo k odstranění většiny mikroorganismů, to znamená více než 50 %, od „cizích částic“, to znamená od minerálních látek, výplňových látek, pigmentů, polymerů a vláknitých materiálů. Centrifugace musí být účinná, aby došlo k akumulaci mikroorganismů v horní fází, zatímco cizí částice sedimentují. Z tohoto důvodu je centrifugace přednostně prováděna při 100 až 1500g, vhodněji při 200 až 1200 g a zvláště nejvhodněji pri 600 až 1000 g. Gravitační poleje nastaveno v závislosti na minerálních látkách, výplňových látkách, pigmentech a vláknitých materiálech,

-4CZ 302995 B6 které mají být odděleny, nebo v závislosti na mikroorganismech, které mají být odděleny, respektive.

Optimální sedimentační index může být určen osobou znalou stavu techniky pomocí experimentálních prostředků. Centrifugace samotná je prováděna po dobu od 1 do 30 minut, vhodněji od 2 do 15 minut a zvláště nejvhodněji od 5 do 10 minut. Optimální doba centrifugace může být určena osobou znalou stavu techniky prováděním laboratorních experimentů.

Jako minerální látky a/nebo výplňové látky a/nebo pigmenty jsou zde přednostně použity sloučeniny obsahující prvky druhé a/nebo třetí hlavní skupiny a/nebo čtvrté hlavní skupiny a/nebo čtvrté vedlejší skupiny periodického systému prvků, zvláště pak vápník a/nebo křemík a/nebo hliník a/nebo titan a/nebo barium a/nebo organické pigmenty.

Jako minerální látky, výplňové látky a pigmenty jsou zde přednostně použity minerální látky a/nebo výplňové látky a/nebo pigmenty obsahující kaolin a/nebo hydroxid hlinitý a/nebo hydroxid titaničitý a/nebo síran bamatý a/nebo polystyrénové duté koule a/nebo formaldehydové pryskyřice a/nebo uhličitan vápenatý, zvláště přírodní uhličitany vápenaté a/nebo mramor a/nebo vápno a/nebo dolomit a/nebo uhličitany vápenaté obsahující dolomit a/nebo synteticky připravené uhličitany vápenaté, takzvané vysrážené uhličitany vápenaté.

Supernatant obsahující mikroorganismy je odstraněn a může pak být použit přímo při kvantitativním a/nebo kvalitativním určování mikrobiální kontaminace. Přednostněji je toto následováno jedním nebo více inkubačními kroky, aby došlo ke zvýšení počtu mikroorganismů v supernatantu. Tento pomnožovací krok je prováděn při inkubační teplotě, která vyhovuje mikroorganismům aje závislá na typu mikroorganismu, který má být pomnožen. Upřednostňované inkubační teploty jsou v rozmezí od 20 do 37 °C, dále vhodnější od 28 do 34 °C, a zvláště vhodné od 31,5 do 32,5 °C. Inkubační teploty, které jsou nezbytné pro každý jednotlivý případ, jsou známé osobám znalým stavu techniky a mohou být bud’ nalezeny v monografiích, nebo mohou být určeny experimentálně.

Celkový čas jednotlivých inkubačních kroků při inkubační teplotě 30 °C je do 12 hodin při kontaminaci menší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorku, do 6 hodin při kontaminaci vyšší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorku, ale nižší než 10⁶ mikroorganismů/ml vzorku, a do 3 hodin v suspenzi, která má původní obsah pevných částic 60 až 80 % hmotnosti, a kontaminaci vyšší než 10⁵mikroorganismů/ml (za použití tryptického maso—sójového agaru).

Suma jednotlivých inkubačních kroků při 30 °C je od 2 až 6 při kontaminaci menší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorku, od 2 do 4 pri kontaminaci vyšší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorku, ale nižší než 10⁶ mikroorganismů/ml vzorku, a od 2 do 3 v suspenzi, která má původní obsah pevných částic 60 až 80 % hmotnosti, a kontaminaci vyšší než 10⁵ mikroorganismů/ml (za použití tryptického maso-sójového agaru).

Jednotlivé inkubační časy pri inkubační teplotě 30 °C jsou 1 až 12 hodin při kontaminaci menší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorku, 1 až 6 hodin pri kontaminaci vyšší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorku, ale nižší než 10⁶ mikroorganismů/ml vzorku, a 1 až 2 hodiny v suspenzi, která má původní obsah pevných částic 60 až 80 % hmotnosti, a kontaminaci vyšší než 10⁵ mikroorganismů/ml (za použití tiyptického maso-sójového agaru).

Několik metod známých ze stavu techniky je dostupných pro kvantitativní nebo kvalitativní určení, respektive, takto získaných mikroorganismů. Zvláště upřednostňovanou metodou podle předkládaného vynálezu je CellFacts® analýza nebo ATP metoda. Další metody jsou dostupné a jsou známy osobám znalým stav techniky. Upřednostňované metody jsou detailněji popsány v následujících příkladech.

-5CZ 302995 B6

Poté co byl proces podle předkládaného vynálezu proveden, může být provedeno kvalitativní a/nebo kvantitativní určení mikroorganismů. Zaprvé kvalitativní určení znamená hrubé rozdělení mezi skupinami plísní, kvasinek a baktérií. Pokud je CelIFacts® analýza nakalibrována na to, o který specifický mikroorganismus takový, jako jsou specifické bakterie, se jedná, může také být dále provedena specifikace mezi jednotlivými poddruhy. Kvalitativní analýza, například cestou CelIFacts® metody, je prováděna na základě celkového rozlišení s ohledem na velikost nebo objem, respektive, jednotlivé buňky.

Použitý druh živného média jako separačního činidla zvláště závisí na mikroorganismu, který má být oddělen nebo pomnožen. Přednostně jsou použita ta živná média, která umožňují selektivní růst těch mikroorganismů, které mají být určeny, a, pokud to je možné, potlačují růst jiných mikroorganismů, které určeny být nemají. Příkladem živných médií, která mohou být použita podle předkládaného vynálezu, jsou trypton azolektin/Tween 20 (TAT) masový agar, glukózový roztok, pepton/kasein masové živné médium, přednostně tryptické maso-sójový agar. Složení živného média je uvedeno v příloze této specifikace.

Koncentrace živného média pro mikroorganismy je přednostně v rozmezí od 0,1 do 10 % hmotnosti, výhodněji od 2 do 5 % hmotnosti, a zvláště výhodně okolo přibližně 3 % hmotnosti. Proces podle předkládaného vynálezu neumožňuje pouze kvalitativní, ale také kvantitativní určení baktérií, plísní a kvasinek. V upřednostňované části předkládaného vynálezu je tato analýza prováděna v jednom kroku.

Následně po oddělení mikroorganismů a minerálních látek, výplňových látek, pigmentů a/nebo vláknitého materiálu, to znamená „cizích částic“, je provedeno jeden nebo více, přednostněji dva až pět, inkubačních kroků, aby došlo ke zvýšení počtu mikroorganismů přítomných ve vzorku supernatantu.

Několikanásobné inkubace jsou prováděny v intervalech, to znamená, že měření kontaminace je v každém případě opakováno po časovém období to _{+ x}. Toto umožňuje omezení inkubační doby a inkubačních intervalů. V časovém období, kdy je pozorován exponenciální růst, je provedena extrapolace a výpočet pro čas to. Tudíž vysoký původní stupeň kontaminace bude výsledkem u růstu, který může být pozorován a vypočítán dříve, takže následné inkubační intervaly mohou být vynechány.

Doba inkubace při kontaminaci menší než 10⁵ mikroorganismů/ml vzorkuje do 12 hodin, při kontaminaci menší než 10⁶ mikroorganismů/ml vzorku je do 6 hodin, v suspenzi, která má původní obsah pevných částic 60 až 80 % hmotnosti a mající kontaminaci vyšší než 10⁵ mikroorganismů/ml do 3 hodin, přičemž v posledním případě je upřednostňováno použití tryptického maso-sójového agaru. Doba inkubace, která je použita v závislosti na stupni kontaminace mikroorganismy, může být určeny těmi, kteří jsou znalí stavu techniky, jednoduchým manuálním experimentováním. Čím je nižší původní stupeň mikrobiální kontaminace ve vzorku, tím delší jsou inkubační časy, aby došlo k oddělení, a naopak. Původní množství pevných částic v suspenzi nemá přímý vliv na inkubační dobu.

V následujícím textu bude předkládaný vynález vysvětlen detailněji s ohledem na příklady. Další modifikace předkládaného vynálezu mohou být použity osobou znalou stavu techniky na základě předkládané specifikace a ve spojení s připojenými patentovými nároky právě tak, jako na základě předpokládaného znaleckého posudku. Předkládaný vynález není omezen pouze na předkládané příklady.

Určení počtu mikroorganismů za použití CelIFacts® částicového počítače - podle předkládaného vynálezu jsou mikroorganismy v suspenzi a/nebo emulzi a/nebo disperzi odsávány prostřednictvím vakua přes měřicí otvor, který má definovaný průměr. Na tyto otvory (kapilára, 30 μηι) je aplikováno napětí (volty). Protože neporušené buňky mohou být v první aproximaci povazovány za izolátory, je pozorováno měřitelné zvýšení odporu během průchodu buněk přes měřicí otvory,

-6CZ 302995 B6 zatímco hodnota tohoto zvýšení je závislá na objemu buňky. Proudový pulz je v přímém vztahu k objemu. Inkubací vzorků mohou být změřeny malé odchylky v růstu buněk, to znamená, že buněčné dělení vede k přiměřenému zvýšení počtu částic. Po zpozorování exponenciální fáze růstu může být extrapolací vypočítána počáteční koncentrace, protože funkce buněčného růstu je exponencionální. Z důvodu přípravy průmyslových vzorků podle předkládaného vynálezu a za použití výše popsané metody je doba určení pro CaCCh, mastek a kaolinové polotekuté hmoty právě tak, jako pro další materiály (např. chladicí kapaliny, pěny, Škrob v koloidní suspenzi atd.) v rozmezí od pouze 2 do 12 hodin místo 24 až 48 hodin, jak vyplývá ze stavu techniky.

Toto umožňuje včasnou intervenci za použití konzervačních prostředků před tím, než se rozvine vysoká kontaminace a/nebo dojde znehodnocení zboží.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - polotekutá hmota uhličitanu vápenatého

A) Počet mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988, „Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen“, a podle Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.22, edice 1985, revidovaná verze 1988, „Bestimmung von Pilzen“.

Postup - 3 ml vodné polotekuté hmoty o 77,5 hmotn. % přírodního zemního mramoru z Norska (90 % hmotnosti částic < 2 μιη, 65 % hmotnosti částic < t pm) dispergovaných s 0,65 hmotn. % komerčního polyakrylátu sodného bylo analyzováno podle metody „Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988.

Výsledek - po inkubační periodě 48 hodin bylo určeno množství mikroorganismů: 3,0 x 10^óaerobních mesofílních mikroorganismů/ml suspenze. Žádné kvasinky nebyly nalezeny v živném médiu použitím pro aerobní mesofilní mikroorganismy. Podle metody popsané v Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.22, edice 1985, revidovaná verze 1988, „Bestimmung von Pilzen“, < 10² plísní/ml bylo detekováno.

B) Postup - 3 ml vodné polotekuté hmoty o 77,5 hmotn. % přírodního zemního mramoru z Norska (90 % hmotnosti částic < 2 pm, 65 % hmotnosti < 1 pm) dispergovaných s 0,65 hmotn. % komerčního polyakrylátu sodného použité v příkladu 1A) byly napipetovány do sterilní lahve. Vzorek byl přidán k 3 ml živného roztoku (3 hmotn. %) TAT založeného na masové bázi/Tween 20 a analyzován prostřednictvím CelIFacts. Analýza byla provedena tak, že byl okamžitě proveden pokus o změření počtu částic v CelIFacts zařízení (čas to_h). Protože počet částic byl příliš velký, tak zařízení vyžadovalo zředění vzorku. Poté co bylo provedeno zředění 1:10 000, byla koncentrace částic zařízením akceptována a počáteční hodnota (to_h) mohla být určena. Po inkubačních časech 2 hodiny (čas t_2h), 4 hodiny (čas tn,), 6 hodin (čas t_6h), a po 12 hodinách (čas ti_2h) byl opět určen počet částic v zařízení CelIFacts. Inkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu počtu částic proti průměru částic je možné určit přítomnost živých buněk („zvětšení píku“, osay) a typ mikroorganismů, např.: bakterií, kvasinek nebo plísní (průměrný průměr částice, osa x) po konkrétních inkubačních dobách jasné fáze.

Po inkubační době 12 hodin je vypočítána původní kontaminace suspenze extrapolací zpětně kčasu (toh). Jako odkaz je použit výsledek příkladu 1A) určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch. („Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

-7CZ 302995 B6

Výsledek:

Počet mikroorganismů určený za použití CellFacts částicového počítače 5 1. Tryptické maso-sójový agar

vzorek	extrakční činidlo	doba určování v hodinách	aerobní mesofilní mikroorganismy/ml suspenze (max. pík pri průměru částice mezi 1 až 2,5 pm)
1	tryptický maso- sójový agar	12	< 10²
vzorek	extrakční činidlo	doba určování v hodinách	plísně/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 5 až 9 pm)
1	tryptický maso- sójový agar	12	< 10²

io Zdá se jasné z příkladů 1A) a 1B), že použitím metod známých ze stavu techniky je nemožné provést určení baktérií, plísní a kvasinek ve výše popsané suspenzi prostřednictvím CellFacts zařízení, a že zvláště při < IO² mikroorganismů/ml je dosaženo nepřesných výsledků. Kromě toho určení podle metody popsané v Schweizerisches Lebensmittelbuch vyžaduje 48 hodin.

Podle předpokladu, zředěním vzorku na hodnotu požadovanou zařízením CellFacts byly také přítomné mikroorganismy zředěny pod detekční limit.

Při provedení určení podle Schweizerisches Lebensmittelbuch je doba trvání analýzy 48 hodin.

C) Určení počtu mikroorganismů měřením ATP

Postup - 3 ml vzorku z příkladu 1 A) vodné polotekuté hmoty o 77,5 hmotn. % přírodního zemního mramoru z Norska (90 % hmotnosti částic < 2 pm, 65 % hmotnosti < 1 pm) dispergovaných s 0,65 hmotn. % komerčního polyakrylátu byly napipetovány do sterilní lahve. Vzorek byl přidán k

3 ml živného roztoku (3 hmotn. %) TAT založeného na masové bázi/Tween 20 a analyzován prostřednictvím zařízení BioOrbit luminometr 1253. Analýza byla provedena tak, že byl okamžitě proveden pokus o změření množství světla vydávaného ATP v zařízení BioOrbit luminometr 1253 (čas toh). Kromě toho byl vzorek změřen po zředění na hodnotu ředění 1:10 000, Tímto způsobem byla pro každý případ určena počáteční hodnota (t_oh). Po inkubačních časech 4 hodiny (čas t4h), 7 hodiny (čas t₇h), a po 17 hodinách (čas ti_7h) byla provedena měření intenzity světla v luminometru BioOrbit 1253. lnkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu intenzity světla při konkrétním inkubačním intervalu proti inkubačnímu času je možné určit přítomnost živých buněk (zvýšení intenzity světla v čase). Po inkubační době s přibližně exponenciálním růstem může být kontaminace v suspenzi určena komparativně srovnáním růstu křivek v jednotlivých vzorcích. Takto může být udělán serni kvantitativni rozdíl mezi „žádným růstem“, „slabým růstem“ a „silným růstem“.

Postup měření v zařízení luminometr 1253 - a) nejdříve je 100 μΙ od každého ze vzorků připravených tak, jak je popsáno výše, napipetováno do kyvety luminometru.

b) K tomuto je přidáno 100 μΙ činidla, které uvolňuje ATP, celé je to dobře promícháno a ponecháno po dobu jedné minuty, takže ATP může být odstraněno extrakcí.

-8CZ 302995 B6

c) Potom je přidáno 500 μί AMR činidla ATP Monitoring reagent a promícháno protřepáním.

d) Pak může být kyveta vložena do měřicího prostoru a může být provedeno odečtení hodnoty emise světla.

Odkaz: Návod k použití zařízení BioOrbit luminometr ver. 3.0, květen 95, právě tak, jako Aplikační poznámka 20 od společnosti BioOrbit OY, FIN 20521 Turku, Finsko.

Výsledek:

H)

inkubační doba v hodinách	intenzita světla vzorku [RLU] na LCD displeji	intenzita světla vzorku ředěného 1:10000 [RLU] na LCD displeji
0	0,001	0,002
4	0,000	0,001
7	0,002	0,002
17	0,001	0,001

Po 17 hodinách nemůže být pozorován žádný rozdíl mezi jednotlivými inkubačními časy při použití této metody známé ze stavu techniky, to znamená, že musí být předpokládáno, že polotekutá is hmota není kontaminovaná. Nicméně stejná polotekutá hmota byla použita v příkladu 1A) (metoda podle Schweizerisches Lebensmittelbuch), a protože tato hodnotná metoda použitá v příkladech vykázala výsledek 3 x 10⁶ mikroorganismů/ml, je zjevné, že výsledek předkládaného příkladu 1C) musí být chybný. V praxi by toto znamenalo fatální následky takové, jako je otrávení potravin nebo znehodnocení zboží.

Použitím metod známých ze stavu techniky je nemožné určit baktérie, plísně a kvasinky ve výše zmíněné suspenzi.

Předpokládá se, že vysoká koncentrace částic v původní koncentraci suspenze má za následek 25 úplnou absorpci světla, toho světla, které je uvolňováno ATP v suspenzi, a zředění vzorku v této metodě také vede k zředění přítomných mikroorganismů pod jejich detekční limit.

Příklad 2 - polotekutá hmota uhličitanu vápenatého, analytickým zařízením je CelIFacts měřicí 30 zařízení

Postup - 3 ml každého vzorku vodné polotekuté hmoty o 77,5 hmotn. % přírodního zemního mramoru z Norska (90 % hmotnosti částic < 2 μπι, 65 % hmotnosti částic < 1 pm) dispergovaných s 0,65 hmotn. % komerčního polyakrylátu sodného použité v příkladu 1A) byly napipetová35 ny do oddělených sterilních lahví. Jeden vzorek byl přidán k 3 ml živného roztoku (3 hmotn. %)

TAT založeného na masové bázi/Tween 20 a druhý vzorek k 3 ml tryptíckého maso-sójového (3 hmotn. %) živného roztoku. Potom byly oba vzorky dobře promíchány po dobu 20 sekund a pak centrifugo vány. Po centrifugací, která probíhala po dobu 10 minut pri 800 g, byla čistá fáze supematantu izolována a analyzována prostřednictvím CelIFacts. Analýza byla provedena měře40 ním počtu částic v CelIFacts zařízení okamžitě po centrifugací (čas tou), po inkubační době 2 hodiny (čas t₂h), 4 hodiny (čas t4h) a 6 hodin (čas t#,). Inkubační teplota byla 30 °C . Sestavením grafu počtu částic proti průměru částic je možné určit přítomnost živých buněk (zvětšení píku) a typ mikroorganismů (bakterie, kvasinky nebo plísně) po konkrétních inkubačních časech v čisté fázi. Po inkubační době, kde se objevil exponenciální růst, je vypočítána původní kontaminace suspenze extrapolací zpětně k času tbh- Pro porovnání bylo provedeno určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch. („Bestimmung von aeroben mesophilen

-9CZ 302995 B6

KeiinerC, Schweiterisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

Výsledek:

Určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Určení počtu mikroorganismů po 48 hodinách prokázalo: 3,0 x 10⁶ aerobních mezofilních mikroorganismů/ml suspenze.

io

Určení počtu mikroorganismů za použití CellFacts počítače částic.

1. TAT založený na masové bázi/Tween 20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurát)

2. Tryptické maso-sójový agar

vzorek	extrakční činidlo	nezbytná doba pro určení v hodinách	aerobní mesofilní mikroorgani smy/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 1 až 2,5 gm)
1	TAT založený na masové bázi/Tween 20	6	1,25 x 10⁶
2	tryptický maso-sojový agar	4	3,14x 10⁶

vzorek	extrakční činidlo	doba určování v hodinách	plísně/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 5 až 9 gm)
2	tryptický maso- sójový agar	12	< 10²

Vzorky analyzované podle metody popsané v předkládaném vynálezu jsou ve výborné shodě s určením počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch, kteiý byl určen po 48 hodinách.

Při porovnání s určením počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch jsou oba vzorky velmi dobře v rámci limitů důvěryhodnosti.

Limity důvěryhodnosti tak, jak jsou použity zde, jsou zvoleny k průměrné odchylce ± 0,5 logio jednotlivých určení počtu mikroorganismů, jak je zavedeno PHLS Central Public Health Labo30 ratory, 61 Colindale Avenue, London N W9 5HT, UK, výnos 070, strany 6 a 7 a dodatek 1, datum distribuce 6. listopad 1998, datum posudku 30. prosinec 1998.

Příklad 3 - polotekutá hmota uhličitanu vápenatého, analytickým zařízením je luminometr Bio35 Orbit 1253

- 10CZ 302995 B6

Postup - 500 ml každého vzorku vodné polotekuté hmoty o 71,5 hmotn. % přírodního zemního mramoru (90 % hmotnosti částic < 2 gm, 65 % hmotnosti částic < 1 gm) dispergovaných s 0,5 hmotn, % komerčního polyakrylátů bylo naplněno do II skleněných lahví. Jeden ze vzorků byl skladován po dobu 3 dnů při 5 °C (vzorek A), další byl skladován po dobu 3 dnů při 30 °C (vzorek B). Potom byly vzorky přeneseny do prostředí o teplotě 20 °C, a 3 ml z každého vzorku byly dobře smíšeny s 3 ml jednotlivého extrakčního Činidla ve sterilní lahvi. Po následné centrifugaci, která probíhala po dobu 10 minut při 600 g, byla čistá fáze supematantu odebrána a analyzován z hlediska emise světla prostřednictvím zařízení BioOrbit luminometr 1253. Analýza byla provedena měřením intenzity světla v zařízení BioOrbit luminometr 1253 okamžitě po centm rifugaci (čas t_Oh), po 4 hodinách (čas Uh), 7 hodinách (čas t₇h), a po 17 hodinách (čas ti_7h)· Inkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu intenzity světla po konkrétním inkubačním intervalu proti inkubačnímu Časuje možné určit přítomnost živých buněk (zvýšení intenzity světla v čase) v čisté fázi. Po inkubační době s přibližně exponencionálním růstem může být kontaminace v suspenzi určena komparativně srovnáním růstu křivek v jednotlivých vzorcích. Tato může být is udělán semi-kvantitativní rozdíl mezi „žádným růstem“, „slabým růstem“ a „silným růstem“. Pro porovnání bylo provedeno určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch („Bestimmung von aeroben mesophilen Keímen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

Použitá extrakční činidla:

1. Ze stavu techniky, 0,9% hmotn. roztok NaCl v destilované vodě bez organické látky, která může sloužit jako živina.

2. Podle předkládaného vynálezu, 3% hmotn. organický živný roztok (tryptické maso-sójový agar).

Určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch

Vzorek A: 5 x IO⁴ aerobních mezofilních mikroorganismů/g suspenze po 48 hodinách Vzorek B: 7 x 10⁷ aerobních mezofilních mikroorganismů/g suspenze po 48 hodinách

Výsledek: vyhodnocení kontaminace za použití luminometru BioOrbit Stav techniky, 0,9% hmotn. roztok NaCl v destilované vodě

doba inkubace v hodinách	vzorek 1 A, intenzita světla [RLU] na LCD displeji	vzorek IB, intenzita světla [RLU] na LCD displeji
0	0,001	0,001
4	0,002	0,003
7	0,002	0,004
17	0,004	0,007

Při použití této metody známé ze stavu techniky nemůže být pozorován žádný rozdíl mezi slabě a silně kontaminovanou suspenzí po 17 hodinách.

Podle předkládaného vynálezu, 3% hmotn. organický živný roztok (tryptické maso-sójový agar).

- 11 CZ 302995 B6

doba inkubace v hodinách	vzorek 1 A, intenzita světla [RLU] na LCD displeji	vzorek IB, intenzita světla [RLU] na LCD displeji
0	0,001	0,002
4	0,004	0,006
7	0,007	0,045
17	0,050	0,240

čas, hodiny

Při použití nové metody podle předkládaného vynálezu je možné udělat rozdíl mezi „slabě“ a „silně kontaminovanými“ roztoky již po 7 hodinách inkubace.

Kromě toho „slabá kontaminace“ může být významně detekována již po 17 hodinách inkubace.

Literatura a návod k použití luminometru BioOrbit ver. 3.0, květen 95 právě tak, jako „aplikační poznámka 20“ společnosti BioOrbit OY, FIN 20521 Turku, Finsko, také ukazují výpočetní modely pro výpočet biomasy za použití hodnot [RLU]. Navíc počet mikroorganismů/ml může být určen „kalibrací“ za použití suspenzí se známým stupněm kontaminace.

Přiklad 4 - US jílovitá polotekutá hmota

Postup - 3 ml každého vzorku vodné polotekuté hmoty o 72,8 hmotn. % přírodního zemního US jílu ze státu Georgia USA (95 % hmotnosti částic < 2 pm, 78 % hmotnosti částic < 1 pm) dispergovaných s 0,35 hmotn. % komerčního polyakrylátu sodného použité byly napípetovány do oddělených sterilních lahví. Jeden vzorek byl přidán k 3 ml živného roztoku (3 hmotn. %) TAT založeného na masové bázi/Tween 20 a druhý vzorek k 3 ml tryptického maso-sójového (3 hmotn. %) živného roztoku. Potom byly oba vzorky dobře promíchány po dobu 20 sekund a pak centrifugovány. Po centrifugaci, která probíhala po dobu 10 minut při 800 g, byla čistá fáze supematantu izolována a analyzována prostřednictvím CallFacts. Analýza byla provedena měřením počtu částic v CelIFacts zařízení okamžitě po centrifugaci (čas t_Oh), po inkubační době 2 hodiny (čas t_2h), 4 hodiny (čas t_4h), 6 hodin (čas Í6_h) a po 12 hodinách (t_i2h)· Inkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu počtu částic proti průměru těchto částic je možné určit přítomnost živých buněk (zvětšení píku) a typ mikroorganismů (bakterie, kvasinky nebo plísně) po konkrétních inkubačních časech v Čisté fázi. Po inkubační době, kde se objevil exponenciální růst, je vypočítána původní kontaminace suspenze extrapolací zpětně k času toh- Pro porovnání bylo pro- 12 CZ 302995 B6 vedeno určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch. („Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

Určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Určení počtu mikroorganismů po 48 hodinách prokázalo: 5,0 x 10⁵ aerobních mezofilních mikroorganismů/ml suspenze.

io Určení počtu mikroorganismů za použití CellFacts počítače částic.

1. TAT založený na masové bázi/Tween 20 (polyoxyethylensorbitanmonolaurát)

2. Tryptické maso-sójový agar

vzorek	extrakční činidlo	nezbytná doba pro určení v hodinách	aerobní mesofilní mikr oorgani smy/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 1 až 2,5 pm)
1	TAT založený na masové bázi/Tween 20	12	1,12 x 10⁵
2	tryptický maso-sojový agar	6	5,21 x 10⁵

vzorek	extrakční činidlo	doba určování v hodinách	plísně/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 5 až 9 pm)
2	tryptický maso- sójový agar	12	přibližně 10³

Vzorky analyzované podle metody popsané v předkládaném vynálezu jsou ve výborné shodě s určením počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch, který byl určen po 48 hodinách.

Limity důvěryhodnosti tak, jak jsou použity zde, jsou zvoleny k průměrné odchylce ± 0,5 log₎₀jednotlivých určení počtu mikroorganismů, jak je zavedeno PULZ Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, výnos 070, strany 6 a 7 a dodatek 1, datum distribuce 6. listopad 1998, datum posudku 30, prosinec 1998.

Příklad 5 - Bílá voda ze stroje na výrobu papíru

Postup - 3 ml vodné polotekuté 0,5 hmotn. % hmoty obsahující 0,2 hmotn. % přírodního zemního mramoru z Norska (60 % hmotnosti částic < 2 pm, 35 % hmotnosti částic < 1 pm) dispergovaných s 0,15 hmotn. % komerčního polyakrylátu sodného a s přibližně 0,3 hmotn. % roztokem celulózových vláken (siričitano/síranová papírová drť) takovým, jaký se používá v papírových

- 13 CZ 302995 B6 mlýnech pro výrobu papíru, a s přibližně 0,05 hmotn. % komerčního polyakrylamidu byly napipetovány do sterilní lahve. Vzorek byl přidán k 3 ml tryptického maso-sójového (3 hmotn. %) živného roztoku. Potom byl vzorek dobře promíchán po dobu 20 sekund a pak centrifugován. Po centrifugací, která probíhala po dobu 10 minut při 1000 g, byla čistá fáze supematantu izolována a analyzována prostřednictvím CellFacts. Analýza byla provedena měřením počtu částic v CellFacts zařízení okamžitě po centrifugací (čas to_h), po inkubační době 1 hodiny (čas t₍h), 2 hodin (čas t_2h). Inkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu počtu částic proti průměru těchto částic je možné určit přítomnost živých buněk (zvětšení píku) a typ mikroorganismů (bakterie, kvasinky nebo plísně) po konkrétních inkubačních časech v čisté fázi. Po inkubační době, kde se objevil exponenciální růst, je vypočítána původní kontaminace suspenze extrapolací zpětně kčasu toh- Pro porovnání bylo provedeno určení počtu mikroorganismu podle Schweizerisches Lebensmittelbuch. („Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

Určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Určení počtu mikroorganismů po 48 hodinách prokázalo: 3,0 x 10⁷ aerobních mezofilních mikroorganismů/ml suspenze.

Určení počtu mikroorganismů za použití CellFacts počítače částic.

1. Tryptické maso-sójový agar

vzorek	extrakční činidlo	nezbytná doba pro určení v hodinách	aerobní mesofilní mikroorgani smy/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 1 až 2,5 pm)
1	tryptický maso-sójový agar	2	3,45x10⁷

vzorek	extrakční činidlo	doba určování v hodinách	plísně/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 5 až 9 pm)
1	tryptický maso- sójový agar	6	přibližně 10⁴

Limity důvěryhodnosti tak, jak jsou použity zde, jsou zvoleny k průměrné odchylce ± 0,5 log₁₀jednotlivých určení počtu mikroorganismů, jak je zavedeno PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, výnos 070, strany 6 a 7 a dodatek 1, datum distribuce 6. listopad 1998, datum posudku 30. prosinec 1998.

- 14CZ 302995 B6

Příklad 6 - koloidní škrobová suspenze

Postup - 3 ml vodné polotekuté 10 hmotn. % koloidní suspenze kukuřičného škrobu takového, jaký se používá v papírových mlýnech, byly napipetovány do sterilní lahve. Vzorek byl přidán k 3 ml tryptického maso-sójového (3 hmotn. %) živného roztoku. Potom byl vzorek dobře promíchán po dobu 20 sekund a pak centrifugo ván. Po centrifugací, která probíhala po dobu 10 minut při 800 g, byla čistá fáze supematantu izolována a analyzována prostřednictvím CellFacts. Analýza byla provedena měřením poětu částic v CellFacts zařízení okamžitě po centrifugací (čas to_h), po inkubační době 1 hodiny (čas t_íh), 2 hodin (čas t_2h). Inkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu poětu částic proti průměru těchto částic je možné určit přítomnost živých buněk (zvětšení píku) a typ mikroorganismů (bakterie, kvasinky nebo plísně) po konkrétních inkubačních časech v čisté fázi. Po inkubační době, kde se objevil exponenciální růst, je vypočítána původní kontaminace suspenze extrapolací zpětně k času toh- Pro porovnání bylo provedeno určení počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch. („Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7,01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

Určení počtu mikroorganismů Podle Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Určení počtu mikroorganismů po 48 hodinách prokázalo: 4,0 x 10⁶ aerobních mezofilních mikroorganismů/ml suspenze.

Určení počtu mikroorganismů za použití CellFacts počítače částic.

I. Tryptické maso-sójový agar

vzorek	extrakční činidlo	nezbytná doba pro určení v hodinách	aerobní mesofilní mikroorganismy/ml suspenze (max. pík pri průměru částice mezi 1 až 2,5 pm)
1	tryptický maso-sojový agar	2	g

vzorek	extrakční činidlo	doba určování v hodinách	plísně/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 5 až 9 pm)
1	tryptický maso- sójový agar	12	< 10²

Vzorek analyzovaný podle metody popsané v předkládaném vynálezu jsou ve výborné shodě s určením počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch, který byl určen po 48 hodinách.

Limity důvěryhodnosti tak, jak jsou použity zde, jsou zvoleny k průměrné odchylce ± 0,5 logio jednotlivých určení poctu mikroorganismů, jak je zavedeno PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, výnos 070, strany 6 a 7 a dodatek 1, datum distribuce 6. listopad 1998, datum posudku 30. prosinec 1998.

- 15 CZ 302995 B6

Příklad 7

Postup - 3 ml každého vzorku vodné polotekuté hmoty o 71,5 hmotn. % přírodního zemního mramoru (90 % hmotnosti částic < 2 pm, 65 % hmotnosti částic < 1 pm) dispergovaných s

0,5 hmotn. % komerčního polyakrylátu sodného byly dobře promíšeny ve sterilních lahvích s ml každého jednotlivého extrakčního činidla. Po centrifugací, která probíhala po dobu 10 minut při 800 g, byla čistá fáze supematantu izolována a analyzována prostřednictvím CallFacts. Analýza byla provedena měřením počtu částic v CellFacts zařízení okamžitě po centrifugací (čas toh), po inkubační době 2 hodiny (čas t_2h), 4 hodiny (čas t_4h), po 7 hodinách (čas t₇h), po 17 hodinách io (tm,), a po 24 hodinách (Čas t₂4h). Inkubační teplota byla 30 °C. Sestavením grafu počtu částic proti průměru těchto částic je možné určit přítomnost živých buněk (zvětšení píku) a typ mikroorganismů (bakterie, kvasinky nebo plísně) po konkrétních inkubačních časech v čisté fázi. Po inkubační době, kde se objevil exponenciální růst, je vypočítána původní kontaminace suspenze extrapolací zpětně k Času Lh- Pro porovnání bylo provedeno určení počtu mikroorganismů podle

Schweizerísches Lebensmittefbuch. („Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen“, Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapitola 56, sekce 7.01, edice 1985, revidovaná verze 1988).

Použitá extrakční činidla:

io Stav techniky

1. destilovaná voda

2. 0,9% hmotn. roztok NaCl v destilované vodě, anorganická sůl

3. 0,8% hmotn. roztok polyoxyethylensorbitanmonolaurátu (2 mol polyoxy ethy lénu), organic25 ký surfaktant

Příklad podle předkládaného vynálezu

4. 3 % hmotn. organický živný roztok (tryptické maso-sójový agar)

Určení počtu mikroorganismů podle Schweizerísches Lebensmittelbuch.

Určení počtu mikroorganismů po 48 hodinách prokázalo: 5,0 x 10⁴ aerobních mezofilních mikroorganismů/ml suspenze.

Určení počtu mikroorganismů za použití CellFacts počítače částic.

vzorek	extrakční činidlo	extrakční Činidlo v hodinách	aerobní mesofílní mikroorganismy/ml suspenze (max. pík při průměru částice mezi 1 až 2,5 pm)
l	destilovaná voda	17	ϊχΙΟ³
2	roztok NaCl	18	1,6 x 10*
3	polyoxyethyíensorbitan -monolaurát	24	> 10²
4	organický živný roztok	7	5,6 x IO⁴

- 16CZ 302995 B6

Vzorky 1 až 3 nejdříve jasně demonstrují, že je nezbytná velmi dlouhá inkubační doba, než může být vypočítán výsledek, a za druhé, že také dosažený výsledek je nesprávný. (Odkaz: určování počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch).

Pro příklady 1 až 3 je odchylka počtu mikroorganismů určeného podle Schweizerisches Lebensmittelbuch daleko za limitem důvěryhodnosti.

Vzorky 1 a 2 postrádají organickou látku, která může fungovat jako živina. Vzorek 3 obsahuje organickou látku. Nicméně tato látka nepůsobí jako živina, ale spíše jako inhibitor. Jistá inhibice činidlem Tween 20 může být již pozorována u příkladu 4-1, kde byl Tween 20 použit, pokud je výsledek přirovnán s příkladem 4-2. Nicméně organická látka fungující jako živný roztok, použitý podle předkládaného vynálezu, byla schopná zabránit chybnému výsledku v případě příkladu 4-2. Nicméně při porovnání s příkladem 7-4, dává příklad 7-3 fatálně chybný výsledek!

Vzorek 4, který byl analyzován podle metody podle předkládaného vynálezu, je ve výborné shodě s určením počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch.

IJ vzorku 4 je odchylka určením počtu mikroorganismů podle Schweizerisches Lebensmittelbuch velmi dobře v rámci limitů důvěryhodnosti.

Limity důvěryhodnosti tak, jak jsou použity zde, jsou zvoleny k průměrné odchylce ± 0,5 log_í0jednotlivých určení počtu mikroorganismů, jak je zavedeno PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, výnos 070, strany 6 a 7 dodatek 1, datum distribuce 6. listopad 1998, datum posudku 30. prosinec 1998.

Složení upřednostňovaných živných médií:

Tryptické maso-sójové bakteriologický trypton 17,0 g/1 bakteriologický soyton 3,0 g/1 bakteriologická dextróza 2,5 g/1 chlorid sodný 5,0 g/1 hydrogenfosforečnan draselný 2,5 g/1

TAT založené na masové bázi bakteriologický tryptin 20,0 g/1 azolektin 5,0 g/1

Živné masové bakteriologický hovězí extrakt 3,0 g/1 bakteriologický peptin 5,0 g/1

Peptin z kaseinu, tryptické štěpení peptid z kaseinu 1,0 g/1 chlorid sodný 1,8 g/1

Agar na miskách pro určení počtu bakteriologický trypton 5,0 g/1 kvasničný extrakt 2,5 g/1 bakteriologická dextróza 1,0 g/1 agar č. 1 9,0 g/1

Ethylenglykol ethylenglykol 1,0 g/1 azolektin 5,0 g/1

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob kvantitativního a/nebo kvalitativního určení mikrobiální kontaminace v suspenzích, emulzích nebo disperzích obsahujících minerální látky a/nebo pigmenty a/nebo výplňové látky a/nebo vláknité materiály, vyznačující se tím, že:

a) vzorek suspenzí, emulzí nebo disperzí se smíchá s jednou nebo více organickými látkami, které jsou degradovatelné mikroorganismy, a které jsou účinné jako separační činidla mezi mikroorganismy a minerálními látkami, pigmenty, výplňovými látkami a/nebo vláknitými materiály, přičemž množství biodegradovatelné látky je vybráno takovým způsobem, že se oddělí mikroorganismy od minerálních látek, výplňových látek, pigmentů a/nebo vláknitých materiálů, a kdy se případně provede inkubace, aby došlo ke zvýšení počtu mikroorganismů,

b) získaná směs se centrifuguje tak, že většina minerálních látek a/nebo výplňových látek a/nebo pigmentů a/nebo vláknitých látek se oddělí od mikroorganismů, které jsou pak v horní fázi, a

c) vodný supematant získaný centrifugaci se výhodně podrobí jedné nebo více inkubacím za účelem zvýšení počtu mikroorganismů ve zmíněném supernatantu, a

d) stanoví se počet a/nebo velikost a/nebo typ mikroorganismů v tomto supernatantu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zmíněnou mikrobiální kontaminací jsou bakterie a/nebo plísně a/nebo kvasinky.
3. Způsob podle jakéhokoli z nároků I nebo 2, vyznačující se tím, že zmíněná organická látka, která je degradovatelná mikroorganismy, se přidává ve formě živného média pro mikroorganismy.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že zmíněné živné médium obsahuje zdroj uhlíku, dusíku, fosfátu a/nebo síry, případně minerální látky, růstové faktory a/nebo vitamíny.
5. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků laž4, vyznačující se tím, že centrifugace se provádí pri 100 až 1500 g, vhodněji při 200 až 1200 g, zvláště přednostně pak při 600 až 1000 g.
6. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků laž5, vyznačující se tím, že se použije inkubační teplota pri 20 až 37 °C, vhodněji 28 až 34 °C a nejvýhodněji 31,5 až 32,5 °C.
7. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků laž6, vyznačující se tím, že se použijí taková živná média, která umožňují selektivní růst těch mikroorganismů, které mají být určeny.

- 18CZ 302995 B6
8. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků l až 7, vyznačující se tím, že se jako živné médium použije trypton azolektin/Tween 20 - TAT masový agar a/nebo glukózový roztok a/nebo pepton/kasein a/nebo živné masové médium, přednostně tryptícké maso-sójový agar.
9. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků laž8, vyznačující se tím, že koncentrace živného média pro mikroorganismy je vhodně OJ až
10 % hmotn., výhodněji 2 až 5 % hmotn. a nejvýhodněji 3 % hmotn.

to 10. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků laž9, vyznačující se tím, že se použije suspenze, emulze nebo disperze, které dále obsahují polymery v koloidní formě.
11. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků lažlO, vyznačující se !5 t í m , že kvalitativní a/nebo kvantitativní určení baktérií a/nebo plísní a/nebo kvasinek se provádí simultánně v jedné analýze.
12. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že krok centrifugace se provádí po dobu 1 až 30 minut, vhodněji 2 až 15 minut a zvláště

20 přednostně 10 minut.
13. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků laž!2, vyznačující se tím, že fáze získaná centrifugací obsahující mikroorganismy se analyzuje z hlediska množství mikroorganismů pomocí prostředků metody analýzy velikosti částice.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že velikost a počet mikroorganismů se analyzuje odsáváním vzorku mikroorganismů prostřednictvím vakua přes měřicí póry, které mají definovanou délku a průměr, přičemž napětí se aplikuje na vstup a výstup z póru a proudový pulz se měří při průchodu mikroorganismů pres vzorek, který se ihned koreluje k objemu mikro30 organismů, a počet proudových pulzů se koreluje k počtu mikroorganismů.
15. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků lažl4, vyznačující se tím, že fáze obsahující mikroorganismy získaná centrifugací se analyzuje z hlediska počtu mikroorganismů určením ATP, které je těmito mikroorganismy produkováno.
16. Způsob podle jednoho nebo více z předcházejících nároků lažl5, vyznačující se tím, že mikrobiální kontaminace disperzí, emulzí a suspenzí se určuje v průmyslu kovů, průmyslu výroby barvi v a papíru právě tak, jako v bílých vodách pocházejících z průmyslu výroby papíru.