KR20010103001A - 미생물 오염의 측정 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미네랄 및/또는 안료 및/또는 충전제 및/또는 섬유 물질을 함유하는 현탁액, 유화액 또는 분산액의 샘플을, 미생물에 의해 분해될 수 있는 하나 이상의 유기 물질을 첨가한 다음, 혼합하고, 임의로 후속적으로 배양한 후에 원심 분리시켜 미생물들을 상기 미네랄 및/또는 충전제 및/또는 안료 및/또는 섬유 물질로부터 분리시키고, 수성 상등액 상 중의 상기 미생물의 수 및/또는 크기 및/또는 유형을 1 회 이상 배양한 후에 측정하는, 상기 현탁액, 유화액 또는 분산액의 미생물 오염에 대한 정량적 및/또는 정성적인 측정 방법을 개시한다.
Description
통상적인 방법에 의한 수성 현탁액의 세균 오염 측정 및 위생 관리는 필수적으로 검출되는 미생물의 번식력에 의존한다. 당연히, 상기 방법을 수행하는데 요구되는 시간의 범위는 24 시간에서 수일까지이다. 이러한 기간은 여러 면에서 너무 길며, 생산 공정에 지표가 되는 방식으로 조정하기에는 결과가 너무 늦게 얻어진다. 특히 상기 수행은 운반 전에 관리되며, 다시 짧은 측정 간격을 특징으로 하는 방법이 필요하다.
따라서, 호기성 중온균의 통상적인 미생물 분석, 예를 들어 평판 배양법 또는 이지컬트(Easicult)의 주요 문제점은 48 시간까지의 긴 배양 기간이다. 상기 방법에 의해서는, 평가치를 얻고 이에 의해 2 일이 경과하기 전에 세균수를 측정하는 것은 불가능하다. 또한, 다수의 다른 영향들, 예를 들어 영양 배지, 산소 분압(호기성/혐기성), 감도, pH 및 훨씬 더 많은 영향들을 고려해야 한다.
따라서, 제품, 예를 들어 안료 슬러리를 소비자에게 선적하기 전에 그의 세균 수를 측정하고 살균 물질을 가함으로써 지표가 되는 방식으로 조정하는 것은 종종 불가능하다. 원양 어선 또는 철도에 의해 6 주까지 소요되는 긴 운반 시간으로 인해, 안료 슬러리가 열화되거나 쓸모없게 될 수도 있다. 백색 안료 슬러리는 회색이 나타나고 냄새가 나기 시작할 수도 있다. 지금까지는, 안료 슬러리 중의 살균 물질의 예방적인 과잉 투여가 변질을 차단하기 위해 유일하게 가능한 것이며, 이는 매우 비용 집약적이고, 자원 낭비적이며, 생태학적으로 터무니없는 것이다. 더욱이, 호기성 중온균과 진균을 모두 분석하기 위해서는 2 개의 상이한 접근법이 필요하다. 더욱 또한, 일련의 희석 제법이 필요하며, 따라서 분석 회수가 가중된다.
종이 및 안료 산업에서 통상적인 세균 측정 방법이 예를 들어 문헌["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"] 및 ["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.22, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von Pilzen"]에 개시되어 있다. 일반적으로, 각 경우의 측정을 수행하기 전에 약 48 시간의 배양 기간이 필요하다.
셀팩츠(CellFacts)(등록상표) 분석기 및 분석 방법이 마이크로비얼 시스템스 캄파니 리미티드(Microbial Systems company, Ltd.)에 의해 개발되었다. 보다 상세한 정보를 문헌[Labor flash 9/96, Zeitung mit Leserdienst fur Labor undForschung, Ott Verlag + Druck AG, Ch-3607 Thun, Switzerland]으로부터 얻을 수 있다. 따라서, 상기 셀팩츠 분석기를 탄산 칼슘 슬러리 중의 세균 수를 측정하는데 또한 사용할 수도 있음이 언급되었다. 그러나, 상기 출원인의 실험실에서 수행된 실험들은 제조사에 의해 개시된 방식으로 상기 유형의 측정을 수행하는 것은 불가능하거나 또는 부정확할 뿐임을 밝혔다.
상기 셀팩츠 분석기에 의해 수행된 측정 원리는 전장에서 입자 형태의 세균, 진균 및 효모의 측정을 기본으로 하며, 여기에서 입자의 수를 샘플의 간격 배양 및 후속적인 입자 수의 증가에 대한 측정, 및 지수 증식기의 경우에 t0에 대한 외삽법에 의해 측정한다. 이러한 측정 원리는 또한 세균, 진균 및 효모와 같이 동일하거나 유사한 크기를 갖는 “적은” 수의 “외래 입자”를 측정하는데 효과적이다. 다량의 “외래 입자”, 예를 들어 미네랄, 충전제 및/또는 안료를 1 중량% 넘게 함유하는 현탁액 및 유화액의 경우에 미생물과 같은 크기, 즉 0.5 내지 20 ㎛로 존재하는 불활성 “외래 입자”의 수, 즉 블랭크 값 t0는 10 시간 이내에 배양기에서 증식에 의한 세균의 추가적인 증가를 탐지하기에 너무 크다. 따라서, 상기 셀팩츠 분석기는 충분히 정확한 측정을 수행할 수 없으며, 제조사는 적응성을 보장하기 위해서 출발 액체의 희석을 요구한다.
108입자/㎖의 블랭크 값에서, 상기 셀팩츠 분석기에 의해 103입자/㎖의 증가를 현저하게 탐지하는 것은 불가능하다. 그러나, “외래 입자”의 존재로 인해 요구되는 희석은 물론 동일한 정도의 크기로 희석되는 재현 미생물의 희석이 더이상 현저하지 않을 정도로 너무 높으며, 얻어지는 결과는 부정확하다. 더욱 또한, >20 ㎛의 직경을 갖는 “외래 입자”는 단지 30 ㎛의 직경을 갖는 측정 쎌을 막히게 할 수도 있다. “외래 입자”는 예를 들어 미네랄 유형의 것, 예를 들어 탄산 칼슘, 중합체 유형의 합성물, 유기물, 예를 들어 폴리스티렌 아크릴레이트 분산액, 또는 천연의 유기물 유형, 예를 들어 전분 용액, 헤미셀룰로즈 및/또는 셀룰로즈 섬유, 또는 예를 들어 종이 분쇄 주기 주기 중에 존재하는 상기 입자들의 복합물일 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 종래 기술의 상술한 단점들이 배제된, 미네랄 및/또는 안료 및/또는 충전제 및/또는 섬유 물질의 수성 현탁액, 유화액 또는 분산액의 미생물 오염에 대한, 신속하고 강력하며 용이하게 수행되는 정량적 및/또는 정성적인 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라, 상기 목적은 상기 현탁액, 유화액 또는 분산액의 샘플을, 미생물에 의해 분해될 수 있는 하나 이상의 유기 물질을 첨가한 다음, 임의로 후속적으로 배양한 후에 원심 분리시켜 상기 미생물들을 상기 미네랄 및/또는 충전제 및/또는 안료 및/또는 섬유 물질로부터 분리시키고, 수성 상등액 상 중의 상기 미생물의 수 및/또는 크기 및/또는 성질을 1 회 이상 배양한 후에 측정함을 특징으로 하는, 청구의 범위 제 1 항의 포괄적인 부분에 따른 방법에 의해 해결되었다.
본 발명의 바람직한 실시태양은 종속항들 뿐만 아니라 하기의 명세서 및 실시예로부터 자명해질 것이다.
본 발명은 미네랄 및/또는 안료 및/또는 충전제 및/또는 섬유 물질을, 임의로 콜로이드 형태의 중합체와 함께 함유하는 수성 현탁액, 유화액 또는 분산액의 미생물 오염에 대한 정량적 및/또는 정성적인 측정 방법에 관한 것이다.
수년 이래로, 미생물의 정량적 및 정성적인 측정은 종래 기술에 속해 있다. 그러나, 미생물 오염의 측정은 고 농도의 다른 고체 입자들, 예를 들어 미네랄, 안료, 충전제 및/또는 섬유 물질이 조사하려는 샘플 중에 존재하는 경우 특히 어렵다. 이들 “외래 입자”는 종종 미생물과 유사한 크기를 갖기 때문에, 일반적으로는 고도의 희석을 수행함으로써 상기와 같은 “외래 입자”의 수를 최소화시키는 것이 가능할 뿐이다. 그러나, 부수적이고도 불가피하게, 이들 고도의 희석 단계는 오염 미생물의 수를 감소시키며, 안전한 검출을 수행할 수 있을 정도로 증식에 의해 상기 미생물의 수를 증가시키기 위해서는 긴 배양 기간이 필요하다.
따라서, 실질적으로 보다 단 시간에 조사하려는 샘플 중의 미생물의 수, 크기 및/또는 유형에 대해 재현가능하고 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는, 서두에서 언급한 유형의 새로운 방법을 창출할 필요가 있었다.
놀랍고도 뜻밖으로, 분해성 유기 물질을 상기 샘플에 가하고 후속적으로 원심분리를 수행함으로써 미생물을 불활성 물질(“외래 입자”)로부터 분리시킬 수 있음이 밝혀졌다. 대개, 미생물들은 바람직하게는 미네랄, 안료, 충전제 및/또는 섬유 물질의 표면에 들러붙어 이들을 상기 표면으로부터 분리시키기 어렵게 만든다. 상기 “외래 입자”는 간단한 원심분리 단계에 의해 침전되지만, 미생물들은 되도록이면 상기 입자에 들러붙기 때문에 펠릿 내로 끌어당겨지고, 이에 의해상등액 중에 남아있는 미생물 부분은 미생물에 의한 오염 정도에 대해 부정확한 값을 제공한다.
놀랍게도 생물학적으로 분해가능한 유기 물질을 첨가하여 미생물과 미네랄, 안료, 충전제 및/또는 섬유 물질을 분리시킬 수 있는 것으로 나타났다. 바람직하게는, 미생물에 의해 분해될 수 있는 유기 물질은 미생물의 배양에 통상적으로 사용되는 영양 배지이다. 놀랍게도, 이 영양 배지는 미생물과 외래 입자간의 분리제로서 작용하며, 따라서 처음으로 상기 둘을 추가의 미생물 분석 단계들에 영향을 미치지 않으면서 분리시킬 수 있다. 생물학적으로 분해될 수 없거나 생물학적 분해가 어려운 물질들은 미생물을 불활성 입자로부터 분리시키는 동시에 상기 물질이 미생물 증식의 억제제로서 작용하여 부정확한 결과를 생성시킨다는 위험성을 갖는다.
본 발명에 따른 방법에서는 하나의 공정 단계, 즉 희석 단계를 생략할 수 있을 뿐만 아니라, 배양 시간도 대단히 단축된다. 더욱 또한, 상기 분리제는 단지 분리제로서만 첨가되는 것이 아니라 동시에 조사하려는 미생물의 최적의 증식에 사용될 수 있는 영양 용액으로서도 작용하며, 바람직한 실시태양에서 시험하려는 특정한 미생물 유형, 예를 들어 세균, 진균 또는 효모에 대해 특이적인 것으로 선택된다.
본 발명에 따른 목적은 단지, 바람직하게는 각각 영양 용액 또는 배지의 형태로 미생물에 의해 분해될 수 있는 유기 물질을 첨가하고 원심분리 단계를 도입시킴으로써 해결되었다. 시험하려는 샘플이 보다 적은 수의 “외래 입자”를 함유하기 때문에 분석 시간의 단축 또는 심지어 분석을 수행할 가능성이 일단 성취되었다. 더욱이, 보다 큰 블랭크 값, 즉 보다 큰 수의 “외래 입자”를 갖는 샘플 보다는 보다 작은 출발 미생물 수 및 시간에 따른 보다 작은 미생물 입자의 증가를 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 방법에 의해, 다른 물질들 중에서도 특히 미네랄, 안료, 충전제 및/또는 섬유 물질, 예를 들어 셀룰로즈 섬유를 함유하고, 임의로 중합체, 예를 들어 콜로이드 형태의 천연, 합성 또는 반합성 중합체를 추가로 함유하는 수성 현탁액, 유화액 및 분산액을 조사할 수 있다. 이러한 중합체의 예로는 스티렌 부타디엔, 스티렌 아크릴레이트, 멜라민 수지, 포름알데히드 우레아 수지, 전분, 카복시메틸셀룰로즈가 있다.
바람직하게는, 시험 샘플을 종이 가공 산업으로부터 얻는다. 추가의 용도 분야는 안료 산업 및 금속 가공 산업이다.
본 발명에 따라, 미생물 오염에 대해 시험할 현탁액, 유화액 또는 분산액의 샘플을 취한다. 일반적으로는, 수득된 샘플의 양은 0.5 내지 20 ㎖이나, 보다 적거나 보다 많은 양을 취할 수도 있다. 게다가, 취한 샘플의 양은 본 발명의 방법의 성공에 중요하지 않다.
수득된 샘플을 가하고 미생물에 의해 분해될 수 있는 유기 물질과 혼합한다. 상기 샘플에 첨가되는 생분해성 유기 물질의 양은 샘플 ㎖ 당 생분해성 물질 0.5 내지 50 ㎖이다.
샘플 부피 대 생분해성 물질의 부피 비는 샘플의 원래 농도 및 용액 중의 생분해성 물질의 농도에 따라 변한다. 상기 비를 미생물과 미네랄, 충전제, 안료 및/또는 섬유 물질 및 임의로 또한 콜로이드 형태의 중합체를 분리시킬 수 있을만큼 충분히 큰 생분해성 물질의 양으로 조절한다. 각각의 경우에 측정해야 하는 샘플 부피 대 생분해성 물질 부피의 최적 비는 숙련가에 의해 수동 실험하여 측정할 수 있다.
대개는 생분해성 물질을 함유하는 용액의 농도를 샘플 용액 대 상기 생분해성 물질 함유 용액의 비가 1:0.1 내지 1:100이 되도록 선택한다. 최적의 비는 각 샘플 용액의 농도 및 조성에 크게 좌우된다. >65 중량%의 고체 함량을 갖는 안료 및/또는 충전제 현탁액을 일반적으로는 1:2 내지 1:10의 비로, 바람직하게는 1:3의 비로 희석한다. 고체 함량이 <65%인 경우에는 희석을 대개 1:0.1 내지 1:1의 비로 수행한다. 몇몇 경우에, 특히 매우 심한 오염을 예상할 수 있는 경우에는 희석을 일반적으로 1:10 내지 1:100의 비로 수행한다. 선택된 희석 인자는 후속적인 오염 평가에서 고려되어야 하거나 또는 결과에 명확하게 지적되어야 한다.
생분해성 유기 물질은 특히 시험하려는 특정한 미생물 종에 대해 특이적인 영양 배지 그룹을 포함한다. 바람직하게는, 영양 배지는 탄소, 질소, 인산염 및/또는 황 공급원뿐만 아니라, 임의로 미네랄, 성장 인자 및/또는 비타민을 함유한다. 다른 물질들이 미생물의 최적 생육에 요구된다면 이들을 영양 배지에 가할 수도 있다. 하기에, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 바람직한 배지들을 개시한다.
임의로, 영양 배지의 첨가에 이어서 하나 이상의 배양 단계를 샘플 중의 미생물 수를 증가시키기 위해서 수행할 수도 있다. 이는 특히 후속의 정성 분석에 유리할 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시태양에서는 원심분리 전의 이 배양을 생략하여 시간을 현저하게 단축시킨다.
미생물을 미네랄, 충전제, 안료 및/또는 섬유 물질로부터 분리시키기 위해서, 영양 배지의 첨가 및 임의의 후속적인 배양 단계에 이어서 원심 분리 단계를 수행한다. 상기 원심 분리 단계는 대부분, 즉 50% 이상의 미생물을 “외래 입자”, 즉 미네랄, 충전제, 안료, 중합체 및 섬유 물질로부터 제거하는 방식으로 수행된다. 원심 분리는 외래 입자가 침전되는 동안 미생물을 보다 위의 상에 축적시키기에 효과적이어야 한다. 이를 위해서, 원심 분리를 바람직하게는 100 내지 1500 g, 바람직하게는 200 내지 1200 g, 특히 바람직하게는 600 내지 1000 g에서 수행한다. 중력 장을 각각 분리시키려는 미네랄, 충전제, 안료 및 섬유 물질에 따라, 또는 분리시키려는 미생물에 따라 조절한다.
최적 침강 지수를 숙련가가 실험에 의해 측정할 수 있다. 원심 분리 자체를 1 내지 30 분, 바람직하게는 2 내지 15 분, 특히 바람직하게는 5 내지 10 분간 수행한다. 최적의 원심 분리 시간을 숙련가가 실험실 실험을 수행하여 측정할 수 있다.
미네랄 및/또는 충전제 및/또는 안료로서, 바람직하게는 원소 주기율표의 제 2 족 및/또는 제 3 족 및/또는 제 4 족 및/또는 제 4 족 부 그룹의 원소들, 특히 칼슘 및/또는 규소 및/또는 알루미늄 및/또는 티탄 및/또는 바륨 및/또는 유기 안료를 함유하는 화합물들이 사용된다.
미네랄, 충전제 및 안료로서, 바람직하게는 카올린 및/또는 수산화 알루미늄 및/또는 수산화 티탄 및/또는 황산 바륨 및/또는 폴리스티렌 중공 구 및/또는 포름알데히드 수지 및/또는 탄산 칼슘, 특히 천연 탄산 칼슘 및/또는 대리석 및/또는 석회석 및/또는 백운석 및/또는 탄산 칼슘 함유 백운석 및/또는 합성적으로 제조된 탄산 칼슘, 소위 침전된 탄산 칼슘을 함유하는 미네랄 및/또는 충전제 및/또는 안료가 사용된다.
미생물을 함유하는 상등액을 회수한 다음 상기를 미생물 오염의 정량적 및/또는 정성적인 측정에 직접 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기에 이어서 상기 상등액 중의 미생물 수를 증가시키기 위해서 하나 이상의 배양 단계를 수행한다. 이러한 증식 단계는 미생물에게 유리하고 증식시킬 미생물의 유형에 따라 좌우되는 배양 온도에서 수행한다. 바람직한 배양 온도는 20 내지 37 ℃, 더욱 바람직하게는 28 내지 34 ℃, 특히 바람직하게는 31.5 내지 32.5 ℃의 범위이다. 각각의 경우에 필요한 배양 온도는 숙련가들에게 공지되어 있으며 모노그래프에서 찾을 수 있거나 혹은 실험적으로 측정될 수도 있다.
30 ℃의 배양 온도에서 개별적인 배양 단계의 총 시간은 샘플 ㎖ 당 105세균 미만의 오염도에서 12 시간 이하, 105세균 이상, 그러나 106세균 미만의 오염도에서 6 시간 이하이고, 60 내지 80 중량%의 최초 고형물 함량을 갖는 현탁액 중에서 105세균/㎖ 이상의 오염도에서 3 시간 이하이다(트립신에 의해 생성된 대두브로쓰 아가 사용).
30 ℃에서 개별적인 배양 단계의 합은 샘플 ㎖ 당 105세균 미만의 오염도에서 2 내지 6 시간, 105세균 이상, 그러나 106세균 미만의 오염도에서 2 내지 4 시간이고, 60 내지 80 중량%의 최초 고형물 함량을 갖는 현탁액 중에서 105세균/㎖ 이상의 오염도에서 2 내지 3 시간이다(트립신에 의해 생성된 대두 브로쓰 아가 사용).
30 ℃의 배양 온도에서 개별적인 배양 시간은 샘플 ㎖ 당 105세균 미만의 오염도에서 1 내지 12 시간, 105세균 이상, 그러나 106세균 미만의 오염도에서 1 내지 6 시간이고, 60 내지 80 중량%의 최초 고형물 함량을 갖는 현탁액 중에서 105세균/㎖ 이상의 오염도에서 1 내지 2 시간이다(트립신에 의해 생성된 대두 브로쓰 아가 사용).
종래 기술로부터 공지된 다수의 방법들을 상기와 같이 수득된 미생물의 정량적 또는 정성적인 측정에 각각 이용할 수 있다. 본 발명에 따라 특히 바람직한 것은 셀팩츠(등록상표) 분석 또는 ATP 방법이다. 다른 방법들도 이용할 수 있으며, 이는 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다. 바람직한 방법들이 하기의 실시예에 보다 상세히 개시되어 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행한 후에, 미생물에 대한 정량적 및/또는 정성적인 측정을 수행할 수도 있다. 먼저, 정성적인 측정은 진균, 효모 및 세균 그룹들 간의 대략적인 차이를 의미한다. 셀팩츠 분석이 특정 미생물, 예를 들어 특정 세균을 규격화하는 경우, 또한 개별적인 서브유형 내에서 추가의 명세사항을 작성할 수 있다. 정성적인 분석, 예를 들어 셀팩츠 방법을 통한 분석은 단일 세포의 크기 또는 부피 각각에 대한 대강의 차이를 기준으로 수행한다.
분리제로서 사용되는 영양 배지의 유형은 특히 분리 또는 증식시키려는 미생물에 따라 다르다. 바람직하게는 측정할 세균을 선택적으로 증식시킬 수 있고, 가능하다면 측정하지 않을 다른 세균의 증식은 억제시킬 수 있는 영양 배지를 사용한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 영양 배지의 예는 트립톤 아졸렉틴/트윈 20(TAT) 브로쓰 아가, 글루코스 용액, 펩톤/카제인 영양 브로쓰, 바람직하게는 트립신에 의해 생성된 대두 브로쓰 아가이다. 상기 영양 배지의 조성은 본 명세서에 첨부되어 있다.
미생물용 영양 배지의 농도 범위는 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%, 보다 유리하게는 2 내지 5 중량%, 특히 유리하게는 약 3 중량%이다.
본 발명에 따른 방법은 세균, 진균 및 효모를 정성적으로 뿐만 아니라 정량적으로 측정할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 분석은 한 단계로 수행된다.
미생물과 미네랄, 충전제, 안료 및/또는 섬유 물질, 즉 “외래 입자”를 분리시킨 다음, 샘플 상등액 중에 존재하는 미생물의 수를 증가시키기 위해서 하나 이상, 바람직하게는 2 내지 5 회의 배양 단계를 수행한다.
수회 배양을 간격을 두고 수행한다, 즉 오염의 측정을 각각의 경우에 시간 t0+x후에 반복 수행한다. 이는 배양 시간과 배양 간격을 제한할 수 있다. 지수 증식이 관찰되는 때에, 시간 t0에 대한 외삽법 및 역산을 수행한다. 따라서, 높은 최초의 오염 정도는 보다 이르게 관찰될 수 있고 계산될 수 있는 증식을 생성시켜 후속의 배양 간격들을 생략시킬 수도 있다.
샘플 ㎖ 당 105세균 미만의 오염도에서 배양 시간은 12 시간 이하이고, 106세균/㎖ 미만의 오염도에서는 6 시간 이하이며, 원래 60 내지 80 중량%의 고형물을 함유하고 105세균/㎖ 이상의 오염도를 갖는 현탁액에서는 3 시간 이하이며, 이때 최 후자의 경우 트립신에 의해 생성된 대두 브로쓰 아가를 사용하는 것이 바람직하다. 미생물에 의한 오염 정도에 따라 사용되는 배양 시간은 당해 분야의 숙련가들에 의해 간단한 수동 실험에 의해 측정될 수 있다. 샘플 중의 최초 미생물 오염 정도가 낮을수록 선택되는 배양 시간은 길어지며, 이와 역의 관계도 마찬가지이다. 현탁액 중의 최초 고형물 부분은 배양 시간에 직접적으로 영향을 미치지 않는다.
하기에서, 본 발명을 비교 실시예 및 실시예와 관련하여 보다 상세히 설명할 것이다. 본 발명의 추가적인 변경이 첨부된 청구의 범위와 관련하여 본 명세서 뿐만 아니라 추정되는 전문적인 지식을 근거로 숙련가들에 의해 수행될 수 있다. 본 발명을 이들 실시예로 제한하는 것은 아니다.
셀팩츠(등록상표) 입자 계수기를 사용하는 세균 수의 측정
본 발명에 따라, 현탁액 및/또는 유화액 및/또는 분산액의 미생물을 규정 직경을 갖는 측정 기공을 통해 진공을 사용하여 흡기시킨다. 상기 기공(모세관, 30 ㎛)에 전압(볼트)을 인가시킨다. 처음 근사치에서 완전 세포를 절연물로서 간주할 수 있기 때문에 측정 기공을 통해 세포가 통과하는 동안 측정가능한 저항의 증가가 관찰되는 반면, 이러한 증가 값은 상기 세포의 부피에 따라 변한다. 전류 펄스는 상기 부피와 직접적으로 상관 있다. 샘플의 배양에 의해 세포들의 작은 증식 차이를 측정할 수 있다. 즉, 세포 분열에 의해 입자 수가 비례적으로 증가한다. 지수 증식기의 관찰 후에, 세포 증식 함수는 지수 함수이기 때문에 출발 농도를 외삽법에 의해 산출할 수 있다. 본 발명에 따라 상기 방법을 사용하는 산업용 샘플의 제조에 기인하여, CaCO3, 활석 및 카올린 슬러리뿐만 아니라 다른 물질들(예: 냉각제, 화이트 워터, 콜로이드 현탁된 전분, 등)에 대한 측정 시간은 종래 기술의 24 내지 48 시간 대신에 단지 2 내지 12 시간의 범위이다.
상기에 의해 상품이 고도로 오염되고/되거나 손상되기 전에 보존제를 사용하여 시기 적절하게 조정할 수 있다.
종래 기술의 실시예
실시예 1) 탄산 칼슘 슬러리
A) 문헌["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"] 및 ["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.22, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von Pilzen"]에 따른 세균 수 측정.
실행 방법
상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.65 중량%가 함께 분산된 노르웨이의 분쇄된 천연 대리석의 수성 슬러리 77.5 중량%(<2 ㎛ 입자 90 중량%, <1 ㎛ 입자 65 중량%) 3 ㎖을 문헌["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"]의 방법에 따라 분석하였다.
결과:
48 시간의 배양 기간 후에, 측정된 세균 수는 현탁액 ㎖ 당 호기성 중온균 3.0 x106개였다. 호기성 중온균에 대해 사용된 영양 배지에서 효모는 발견되지 않았다. 문헌["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.22, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von Pilzen"]에 개시된 방법에 따라 <102진균/㎖이 검출되었다.
B) 셀팩츠 입자 계수기를 사용하는 세균 수의 측정
실행 방법
실시예 1A)에 사용된 상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.65 중량%가 함께분산된 노르웨이의 분쇄된 천연 대리석의 수성 슬러리 77.5 중량%(<2 ㎛ 입자 90 중량%, <1 ㎛ 입자 65 중량%) 3 ㎖을 멸균 플라스크 내로 피펫팅하였다. 상기 샘플에 3 중량%의 TAT 브로쓰 염기/트윈 20 영양 용액 3 ㎖을 가하고 셀팩츠를 사용하여 분석하였다. 상기 분석은 셀팩츠 장치에서 입자 수의 측정을 바로 시도함으로써 수행하였다(시간 t0h). 입자 수가 너무 많았기 때문에 상기 장치는 샘플 희석이 필요하였다. 1:10,000의 희석을 수행한 후에, 입자 농도가 상기 장치에 허용되었으며, 블랭크 값(t0h)을 측정할 수 있었다. 2 시간(시간 t2h), 4 시간(시간 t4h)의 배양 시간 후, 6 시간(시간 t6h), 12 시간(시간 t12h) 후에, 입자 수를 다시 셀팩츠 장치로 측정하였다. 배양 온도는 30 ℃였다. 입자 수를 입자 직경에 대해 플롯팅함으로써, 등명한 상의 특정한 배양 시간 후에 살아있는 세포의 존재(“피크 확대”, y 축) 및 미생물, 예를 들어 세균, 효모 또는 진균의 유형(평균 입자 Ø, x 축)을 측정할 수 있다.
12 시간의 배양 시간 후에, 현탁액의 최초 오염을 시간(t0h)에 대해 역 외삽법을 행함으로써 평가한다. 참고로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정인 실시예 1A)의 결과를 사용한다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
결과:
셀팩츠 입자 계수기를 사용한 세균 수의 측정
실시예 1A) 및 1B)로부터, 종래 기술의 방법을 사용하여 셀팩츠 장치에 의해 상기 현탁액 중의 세균, 진균 및 효모의 측정을 수행할 수 없으며, 특히 <102세균/㎖에서 전적으로 부정확한 결과가 얻어짐이 자명해진다. 더욱 또한, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]의 방법에 따른 측정은 48 시간을 요한다.
추정 상, 셀팩츠 장치에서 요구되는 샘플 희석에 의해서 존재하는 미생물 균이 또한 측정 한계 이하로 희석되었다.
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 측정의 수행에서 분석 지속 기간은 48 시간이다.
C) ATP 측정에 의한 세균 수의 측정
실행 방법
실시예 1A)의 샘플, 즉 상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.65 중량%가 함께 분산된 노르웨이의 분쇄된 천연 대리석의 수성 슬러리 77.5 중량%(<2 ㎛ 입자90 중량%, <1 ㎛ 입자 65 중량%) 3 ㎖을 멸균 플라스크 내로 피펫팅하였다. 상기 샘플에 3 중량%의 TAT 브로쓰 염기/트윈 20 영양 용액 3 ㎖을 가하고 바이오오비트 발광계(BioOrbit luminometer) 1253을 사용하여 분석하였다. 분석은 상기 바이오오비트 발광계 1253에서 ATP에 의해 방출되는 빛의 양의 측정을 즉시 시도함으로써 수행하였다(시간 t0h). 또한, 샘플을 1:10,000으로 희석한 후에 측정하였다. 이러한 방식으로, 블랭크 값(t0h)을 각각의 경우에 측정하였다. 4 시간(시간 t4h)의 배양 시간 후, 7 시간(시간 t7h) 및 17 시간(시간 t17h) 후에 상기 바이오오비트 1253 발광계에서 광도를 측정하였다. 배양 온도는 30 ℃였다. 각 배양 시간에서의 광도를 배양 시간에 대해 플롯팅함으로써 살아있는 세포의 존재(시간에 대한 광도의 증가)를 측정할 수 있다. 거의 지수 증식기를 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 오염을 개별적인 샘플에 대한 곡선의 진행을 비교함으로써 상대적으로 측정할 수 있다. 이에 의해 반-정량적인 구별이 “증식 안됨”, “약한 증식” 및 “강한 증식”간에 이루어졌다.
발광계 1253에서의 측정 실행 방법
a) 처음에, 상술한 바와 같이 제조된 샘플 각 100 ㎕를 발광계 큐벳 내로 피펫팅하였다.
b) 여기에, ATP 방출 시약 100 ㎕를 가하고, ATP가 추출에 의해 제거될 수 있도록 잘 흔들고 1 분간 방치시켰다.
c) 그 후에, AMR 시약 500 ㎕를 가하고 진탕에 의해 혼합하였다.
d) 이어서, 상기 큐벳을 측정 쎌 내로 도입시켜 빛의 방출을 판독할 수도 있다.
참고 문헌: 바이오오비트 발광계 버전 3.0, May 95 뿐만 아니라 어플리케이션 노트 20(Application Note 20, BioOrbit OY Company, FIN 20521 Turku, Finland)의 사용자 안내서
결과:
17 시간 후에, 상기 종래 기술의 방법을 사용하여 개별적인 배양 시간들 간의 차이를 관찰할 수 없었다, 즉 슬러리가 오염되지 않은 것으로 가정해야 한다. 그러나, 동일한 슬러리를 실시예 1A)(문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 방법)에서 사용하였으며, 상기 실시예에 사용된 이러한 인정된 방법은 3 x 106세균/㎖의 결과를 제공하므로, 본 실시예 1C)의 결과는 틀린 것임이 분명해진다. 실제로, 상기는 식품의 중독 또는 상품의 변질과 같은 치명적인 결과들을 수반할 것이다.
종래 기술의 방법들을 사용하여 상기 언급한 현탁액에서 세균, 진균 및 효모를 측정하는 것은 불가능하다.
추정 상, 상기 현탁액의 최초 농도에서 높은 입자 농도는 상기 현탁액 중의 ATP에 의해 방출된 빛의 양을 완전히 흡수하였으며, 이 방법에 의한 샘플 희석은 또한 존재하는 미생물 균을 그의 검출 한계 아래로 희석시켰다.
본 발명의 실시예:
실시예 2) 셀팩츠 측정 장치에 의한 탄산 칼슘 슬러리 분석
상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.65 중량%가 함께 분산된 노르웨이의 분쇄된 천연 대리석의 수성 슬러리 77.5 중량%(<2 ㎛ 입자 90 중량%, <1 ㎛ 입자 65 중량%) 3 ㎖ 씩을 각각 별도의 멸균 플라스크 내로 피펫팅한다. 하나의 샘플에 3 중량%의 TAT 브로쓰 염기/트윈 20 영양 용액 3 ㎖을 가하고 두 번째 샘플에는 3 중량%의 트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 영양 용액 3 ㎖을 가한다. 그 후에, 상기 두 샘플을 모두 20 초 동안 잘 혼합하고, 이어서 원심분리시킨다. 800 g에서 10 분간 원심분리시킨 후에, 등명한 상등액 상을 분리시키고 셀팩츠에 의해 분석한다. 분석은 원심 분리 직후(시간 toh), 2 시간(시간 t2h), 4 시간(시간 t4h)의 배양 시간 후 및 6 시간(시간 t6h) 후에 입자 수를 셀팩츠 장치로 측정함으로써 수행한다. 배양 온도는 30 ℃였다. 입자 수를 입자 직경에 대해 플롯팅함으로써, 등명한 상의 특정한 배양 시간 후에 살아있는 세포의 존재(피크 확대) 및 미생물, 예를 들어 세균, 효모 또는 진균의 유형을 측정할 수 있다. 지수 증식을 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 최초 오염을 시간(t0h)에 대해 역 외삽법을행함으로써 측정한다. 비교로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정을 수행한다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
결과:
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정
48 시간 후의 세균 수 측정은 3.0 x 106호기성 중온균/현탁액 ㎖로 밝혀졌다.
셀팩츠 입자 계수기를 사용한 세균 수의 측정
본 발명의 방법에 따라 분석된 샘플은 48 시간 후에 측정된 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정에 잘 일치한다.
상기 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정에 비해, 상기 두 샘플은 모두 신뢰 한계 내에 있다.
본 발명에 사용된 신뢰 한계는 문헌[PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, distribution 070, p. 6&7 and appendix 1, distribution date Nov. 16, 1998, report date Dec. 30, 1998]에 의해 설정된 개별적인 세균 수 측정의 ±0.5 log10의 편차를 의미한다.
실시예 3) 분석 장치 바이오오비트 1253 발광계에 의한 탄산 칼슘 슬러리 분석
실행 방법
상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.5 중량%가 함께 분산된 분쇄된 천연 대리석의 수성 슬러리 71.5 중량%(<2 ㎛ 입자 90 중량%, <1 ㎛ 입자 65 중량%) 500 ㎖ 씩을 각각 1 ℓ 유리 플라스크에 충전시켰다. 상기 샘플들 중 하나를 5 ℃에서 3 일간 보관하고(샘플 A), 다른 하나는 30 ℃에서 3 일간 보관하였다(샘플 B). 그 후에 상기 샘플들을 20 ℃로 만들고, 각 샘플 3 ㎖을 멸균 플라스크에서 각각의 추출제 3 ㎖과 잘 혼합하였다. 600 g에서 10 분간 원심분리시킨 다음 등명한 상등액 상을 단리시키고 바이오오비트 발광계 1253을 사용하여 빛의 방출에 대해 분석하였다. 분석은 원심분리 직후(시간 t0h), 4 시간(시간 t4h), 7 시간(시간 t7h), 17 시간(시간 t17h) 후에 상기 바이오오비트 발광계 1253에서 광도를 측정함으로써 수행한다. 배양 온도는 30 ℃였다. 각 배양 시간 후의 광도를 배양 시간에 대해 플롯팅함으로써 등명한 상 중의 살아있는 세포의 존재(시간에 대한 광도의 증가)를 측정할 수 있다. 거의 지수 증식기를 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 오염을 개별적인 샘플에 대한 곡선의 진행을 비교함으로써 상대적으로 측정할 수 있다. 이에 의해 반-정량적인 구별이 “증식 안됨”, “약한 증식” 및 “강한 증식”간에 이루어질 수 있다. 비교로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정을 수행하였다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
사용된 추출제:
1. 종래 기술, 영양분으로서 작용할 수도 있는 유기 물질이 없는 탈염수 중의 NaCl 0.9 중량% 용액
2. 본 발명에 따른, 유기 영양 분(트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 아가) 3 중량% 용액
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정
샘플 A: 48 시간 후에 현탁액 g 당 5 x 104개의 호기성 중온균
샘플 B: 48 시간 후에 현탁액 g 당 7 x 107개의 호기성 중온균
결과:
바이오오비트 발광계에 의한 오염의 평가
종래 기술의 방법을 사용하여, 17 시간 후에 약하게 오염된 현탁액과 강하게 오염된 현탁액 간에 뚜렷한 차이가 관찰되지 않는다.
본 발명에 따른 신규 방법을 사용하여, 이미 7 시간 후에 “약하게 오염된” 용액과 “강하게 오염된” 용액을 구분할 수 있다. 또한, “약한 오염”은 이미 17 시간 후에 현저하게 탐지될 수 있다.
상기 문헌 및 바이오오비트 발광계 버전 3.0, May 95 뿐만 아니라 어플리케이션 노트 20["Application Note 20", BioOrbit OY Company, FIN 20521 Turku, Finland]의 사용자 안내서는 또한 상기 [RLU] 값을 사용하는 바이오매스의 계산을 위한 평가 모델을 나타낸다. 더욱 또한, 세균 수/㎖을 오염도를 알고 있는 현탁액을 사용하여 “눈금화”함으로써 측정할 수 있다.
실시예 4) US 점토 슬러리
실행 방법
상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.35 중량%가 함께 분산된 미국 조지아의 분쇄된 천연 US 점토의 수성 슬러리 72.8 중량%(<2 ㎛ 입자 95 중량%, <1 ㎛ 입자 78 중량%) 3 ㎖ 씩을 각각 별도의 멸균 플라스크 내로 피펫팅한다. 하나의 샘플에 3 중량%의 TAT 브로쓰 염기/트윈 20 영양 용액 3 ㎖을 가하고 두 번째 샘플에는 3 중량%의 트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 영양 용액 3 ㎖을 가한다. 그 후에, 상기 두 샘플을 모두 20 초 동안 잘 혼합하고, 이어서 원심분리시킨다. 800 g에서 10 분간 원심분리시킨 후에, 등명한 상등액 상을 분리시키고 셀팩츠에 의해 분석한다. 분석은 원심분리 직후(시간 t0h), 2 시간(시간 t2h), 4 시간(시간 t4h)의 배양 시간 후, 6 시간(시간 t6h) 및 12 시간(시간 t12h) 후에 입자 수를 셀팩츠 장치로 측정함으로써 수행한다. 배양 온도는 30 ℃였다. 입자 수를 입자 직경에 대해 플롯팅함으로써, 등명한 상의 특정한 배양 시간 후에 살아있는 세포의 존재(피크 확대) 및 미생물의 종(예를 들어 세균, 효모 또는 진균)을 측정할 수 있다. 거의 지수 증식을 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 최초 오염을 시간(t0h)에 대해 역 외삽법을 행함으로써 측정한다. 비교로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정을 수행한다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정
48 시간 후의 세균 수 측정은 5.0 x 105호기성 중온균/현탁액 ㎖로 밝혀졌다.
셀팩츠 입자 계수기를 사용한 세균 수의 측정
본 발명의 방법에 따라 분석된 샘플은 48 시간 후에 측정된 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정과 잘 일치한다.
상기 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정에 비해, 상기 두 샘플은 모두 신뢰 한계 내에 있다.
본 발명에 사용된 신뢰 한계는 문헌[PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, distribution 070, p. 6&7 and appendix 1, distribution date Nov. 16, 1998, report date Dec. 30, 1998]에 의해 설정된 개별적인 세균 수 측정의 ±0.5 log10의 편차를 의미한다.
실시예 5) 제지기 화이트 워터
실행 방법
상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.15 중량%, 및 제지용 종이 분쇄기에 사용되는 셀룰로즈 섬유(설파이트/설페이트 종이 펄프) 약 0.3 중량% 및 상업적인 폴리아크릴아미드 약 0.05 중량%가 함께 분산된 노르웨이의 분쇄된 천연 대리석 약 0.2 중량%를 함유하는 수성 슬러리 0.5 중량%(<2 ㎛ 입자 60 중량%, <1 ㎛ 입자 35 중량%) 3 ㎖을 멸균 플라스크 내로 피펫팅한다. 상기 샘플에 3 중량%의 트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 영양 용액 3 ㎖을 가한다. 그 후에, 상기 샘플을 20 초간 잘 혼합하고 이어서 원심분리시킨다. 1000 g에서 10 분간 원심분리시킨 후에, 등명한 상등액 상을 분리시키고 셀팩츠에 의해 분석한다. 분석은 원심분리 직후(시간 t0h), 1 시간(시간 t1h), 2 시간(시간 t2h)의 배양 시간 후에 입자 수를 셀팩츠 장치로 측정함으로써 수행한다. 배양 온도는 30 ℃였다. 입자 수를 입자 직경에 대해 플롯팅함으로써, 등명한 상의 특정한 배양 시간 후에 살아있는 세포의 존재(피크 확대) 및 미생물의 종(예를 들어 세균, 효모 또는 진균)을 측정할 수 있다. 거의 지수 증식을 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 최초 오염을 시간(t0h)에 대해 역 외삽법을 행함으로써 평가한다. 비교로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정을 수행한다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정
48 시간 후의 세균 수 측정은 3.0 x 107호기성 중온균/현탁액 ㎖로 밝혀졌다.
셀팩츠 입자 계수기를 사용한 세균 수의 측정
본 발명의 방법에 따라 분석된 샘플은 48 시간 후에 측정된 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정과 잘 일치한다.
상기 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정에 비해, 상기 두 샘플은 모두 신뢰 한계 내에 있다.
본 발명에 사용된 신뢰 한계는 문헌[PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, distribution 070, p. 6&7 and appendix 1, distribution date Nov. 16, 1998, report date Dec. 30, 1998]에 의해 설정된 개별적인 세균 수 측정의 ±0.5 log10의 편차를 의미한다.
실시예 6) 콜로이드 전분 현탁액
실행 방법
종이 분쇄기에 사용되는 10 중량%의 수성 콜로이드 옥수수 전분 현탁액 3 ㎖을 멸균 플라스크 내로 피펫팅한다. 상기 샘플에 3 중량%의 트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 영양 용액 3 ㎖을 가한다. 그 후에, 상기 샘플을 20 초간 잘 혼합하고 이어서 원심분리시킨다. 800 g에서 10 분간 원심분리시킨 후에, 등명한 상등액 상을 분리시키고 셀팩츠에 의해 분석한다. 분석은 원심분리 직후(시간 t0h), 1 시간(시간 t1h), 2 시간(시간 t2h)의 배양 시간 후에 입자 수를 셀팩츠 장치로 측정함으로써 수행한다. 배양 온도는 30 ℃였다. 입자 수를 입자 직경에 대해 플롯팅함으로써, 등명한 상의 특정한 배양 시간 후에 살아있는 세포의 존재(피크 확대) 및 미생물의 종(예를 들어 세균, 효모 또는 진균)을 측정할 수 있다. 거의 지수 증식을 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 최초 오염을 시간(t0h)에 대해 역 외삽법을 행함으로써 평가한다. 비교로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정을 수행한다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정
48 시간 후의 세균 수 측정은 4.0 x 106호기성 중온균/현탁액 ㎖로 밝혀졌다.
셀팩츠 입자 계수기를 사용한 세균 수의 측정
본 발명의 방법에 따라 분석된 샘플은 48 시간 후에 측정된 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정과 잘 일치한다.
상기 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정에 비해, 상기 두 샘플은 모두 신뢰 한계 내에 있다.
본 발명에 사용된 신뢰 한계는 문헌[PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, distribution 070, p. 6&7 and appendix 1, distribution date Nov. 16, 1998, report date Dec. 30, 1998]에 의해 설정된 개별적인 세균 수 측정의 ±0.5 log10의 편차를 의미한다.
실시예 7)
실행 방법
상업적인 나트륨 폴리아크릴레이트 0.5 중량%가 함께 분산된 분쇄된 천연 대리석의 수성 슬러리 71.5 중량%(<2 ㎛ 입자 90 중량%, <1 ㎛ 입자 65 중량%) 3 ㎖씩을 각각 개별적인 추출제 각 3 ㎖과 함께 멸균 플라스크에서 잘 혼합한다. 800 g에서 10 분간 원심분리시킨 후에, 등명한 상등액 상을 분리시키고 셀팩츠에 의해 분석한다. 분석은 원심분리 직후(시간 t0h), 2 시간(시간 t2h), 4 시간(시간 t4h)의 배양 시간 후, 7 시간(시간 t7h), 17 시간(시간 t17h) 및 24 시간(시간 t24h) 후에 입자 수를 셀팩츠 장치로 측정함으로써 수행한다. 배양 온도는 30 ℃였다. 입자 수를 입자 직경에 대해 플롯팅함으로써, 등명한 상의 특정한 배양 시간 후에 살아있는 세포의 존재(피크 확대) 및 미생물의 종(예를 들어 세균, 효모 또는 진균)을 측정할 수 있다. 거의 지수 증식을 갖는 배양 시간 후에, 현탁액의 최초 오염을 시간(t0h)에 대해 역 외삽법을 행함으로써 평가한다. 비교로, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정을 수행한다["Schweizerisches Lebensmittelbuch", Chap. 56, section 7.01, 1985 ed, 1988 개정판, "Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen"].
사용된 추출제:
1. 탈염 수
2. 탈염수 중의 NaCl 0.9 중량% 용액, 무기 염
3. 폴리옥시에틸렌 솔비탄 모노라우레이트 0.8 중량% 용액(폴리옥시에틸렌 2 몰), 유기 계면활성제
본 발명에 따른 실시예
4. 유기 영양 분(트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 아가) 3 중량% 용액
문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정
48 시간 후의 세균 수 측정은 5.0 x 104호기성 중온균/현탁액 ㎖로 밝혀졌다.
셀팩츠 입자 계수기를 사용한 세균 수의 측정
샘플 1 내지 3은 먼저 결과를 산출할 수 있을 때까지 매우 긴 배양 시간이 필요함을 분명히 입증하였으며, 두 번째로 또한 상기 결과가 부정확함을 입증하였다. (참고: 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정).
샘플 1 내지 3에 대해서, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따라 측정된 세균 수에 대한 변화량은 신뢰 한계에 훨씬 밖에 있다.
샘플 1 및 2는 영양분으로서 작용할 수 있는 유기 물질이 결여되어 있다. 샘플 3은 유기 물질을 함유한다. 그러나, 이 물질은 영양분으로서 작용하기 보다는 억제제로서 작용한다. 트윈 20에 의한 특정한 억제는 이미 결과가 실시예 4-2와 비교된 트윈 20이 사용된 실시예 4-1에서 관찰할 수 있다. 그러나, 본발명에 따라 사용된 영양 용액으로서 작용하는 유기 물질은 실시예 4-2의 경우에 부정확한 결과를 막을 수 있었다. 그러나, 실시예 7-4에 비해, 실시예 7-3은 결정적으로 틀린 결과를 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 분석된 샘플 4는 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정과 잘 일치한다.
샘플 4에서, 문헌[Schweizerisches Lebensmittelbuch]에 따른 세균 수 측정의 차이는 신뢰 한계 내에 매우 충분히 있다.
본 발명에 사용된 신뢰 한계는 문헌[PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, distribution 070, p. 6&7 and appendix 1, distribution date Nov. 16, 1998, report date Dec. 30, 1998]에 의해 설정된 개별적인 세균 수 측정의 ±0.5 log10의 편차를 의미한다.
바람직한 영양 배지의 조성
Claims (17)
- 미네랄 및/또는 안료 및/또는 충전제 및/또는 섬유 물질을 함유하는 현탁액, 유화액 또는 분산액의 샘플을, 미생물에 의해 분해될 수 있는 하나 이상의 유기 물질을 첨가한 다음, 혼합하고, 임의로 후속적으로 배양한 후에 원심 분리시켜 미생물들을 상기 미네랄 및/또는 충전제 및/또는 안료 및/또는 섬유 물질로부터 분리시키고, 수성 상등액 상 중의 상기 미생물의 수 및/또는 크기 및/또는 유형을 1 회 이상 배양한 후에 측정하는,상기 현탁액, 유화액 또는 분산액의 미생물 오염에 대한 정량적 및/또는 정성적인 측정 방법.
- 제 1 항에 있어서, 미생물 오염이 세균 및/또는 진균 및/또는 효모인 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 미생물에 의해 분해될 수 있는 유기 물질을 미생물용 영양 배지 형태로 첨가하는 방법.
- 제 3 항에 있어서, 영양 배지가 탄소, 질소, 인산염 및/또는 황 공급원뿐만아니라 임의로 미네랄, 생육 인자 및/또는 비타민을 함유하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 원심 분리를 미생물로부터 미네랄 및/또는 충전제 및/또는 안료 및/또는 섬유 물질의 대부분을 제거하고 상기 미생물을 상부 상 중에 축적시키는 방식으로 수행하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 원심 분리를 100 내지 1,500 g, 바람직하게는 200 내지 1,200 g, 특히 바람직하게는 600 내지 1,000 g에서 수행하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 온도가 20 내지 37 ℃, 바람직하게는 28 내지 34 ℃, 가장 유리하게는 31.5 내지 32.5 ℃인 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 측정하려는 세균을 선택적으로 증식시킬 수 있는 영양 배지를 사용하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 영양 배지로서 트립톤 아졸렉틴/트윈 20(TAT) 브로쓰 아가 및/또는 글루코스 용액 및/또는 펩톤/카제인 및/또는 영양 브로쓰, 바람직하게는 트립신에 의해 생긴 대두 브로쓰 아가를 사용하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물용 영양 배지의 농도가 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%, 보다 유리하게는 2 내지 5 중량%, 가장 유리하게는 3 중량%인 방법.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 탁액, 유화액 또는 분산액이 콜로이드 형태의 중합체를 추가로 함유하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 세균 및/또는 진균 및/또는 효모의 정성적 및/또는 정량적인 측정을 하나의 분석으로 동시에 수행하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 원심 분리 단계를 1 내지 30 분, 바람직하게는 2 내지 15 분, 특히 바람직하게는 10 분간 수행하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물을 함유하는 원심 분리에 의해 수득된 상을 입자 크기 분석 방법에 의해 상기 미생물의 양에 대해 분석하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 미생물의 크기 및 수를, 한정된 길이 및 직경을 갖는 측정 기공을 통해 진공을 사용하여 미생물 샘플을 흡기시킴으로써 분석하며, 이때 전압을 상기 기공의 유입구 및 유출구에 인가시키고 상기 샘플을 통해 미생물이 통과할 때 상기 미생물의 부피와 직접적으로 상관 있고 미생물의 수와 상관 있는 전류 펄스를 측정하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물을 함유하는 원심 분리에 의해 수득된 상을 상기 미생물에 의해 생성된 ATP의 측정에 의해 상기 미생물의 양에 대해 분석하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 분산액, 유화액 및 현탁액의 미생물 오염을 금속 산업, 안료 및 종이 산업뿐만 아니라 종이 산업 화이트 워터에서 조사하는 방법.
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