ES2251957T3 - Procedimiento para la determinacion de contaminacion microbiana. - Google Patents
Procedimiento para la determinacion de contaminacion microbiana.Info
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Abstract
Procedimiento para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de contaminación microbiana de suspensiones, emulsiones o dispersiones que contienen minerales y/o pigmentos y/o cargas y/o materiales de fibras, caracterizado porque a) una muestra de las suspensiones, emulsiones o dispersiones se mezcla con una o varias sustancias orgánicas que son degradadas por microorganismos, que actúan como agente de separación entre los microorganismos y los minerales, pigmentos, cargas y/o materiales de fibras, en el que la cantidad en sustancia biodegradable se elige de modo que es posible una separación de los microorganismos y los minerales, cargas, pigmentos y/o materiales de fibras, y de forma opcional se incuba para el aumento del número de microorganismos, b) se centrifuga la mezcla así obtenida, para separar en su mayor parte los minerales y/o cargas y/o pigmentos y/o materiales de fibras de los microorganismos, con lo que los microorganismos se encuentran en la fase superior, y c) el sobrenadante acuoso obtenido mediante la centrifugación se somete preferiblemente a una incubación o varias incubaciones, para multiplicar el número de microorganismos en este sobrenadante, y d) se determina el número y/o tamaño y/o tipo de microorganismos en el sobrenadante.
Description
Procedimiento para la determinación de
contaminación microbiana.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la determinación cuantitativa y/o cualitativa de
contaminación microbiana de suspensiones, emulsiones o dispersiones
acuosas que contienen minerales y/o pigmentos y/o cargas y/o
materiales de fibras, de forma opcional en combinación con
polímeros en forma coloidal.
La determinación de la presencia de gérmenes y
controles higiénicos de suspensiones acuosas con procedimientos
habituales están esencialmente todos relacionados con la capacidad
de multiplicación de los microorganismos que se han de comprobar.
Estos procedimientos necesitan tiempo conforme a la naturaleza, que
pueden encontrarse entre 24 horas y varios días. Para muchas
aplicaciones estos periodos de tiempo son demasiado grandes, y los
resultados se presentan demasiado tarde para poder intervenir en los
procesos productivos. Cada vez más se requieren procedimientos
especialmente para el control antes de la expedición, que se
caractericen por un corto periodo de inspección.
De este modo, por ejemplo, el problema
fundamental de los análisis microbiológicos habituales de gérmenes
aerobios mesófilos, como recuento en placa o Easicult, es el largo
tiempo de incubación de hasta 48 horas. No es posible una
evaluación y por tanto una determinación del número de gérmenes con
estos procedimientos antes de dos días. A esto se añaden todavía
distintas influencias como, por ejemplo, medios de cultivo, presión
parcial del oxígeno (aerobio/anaerobio), selectividad, pH y aún
muchos más.
Por tanto no es posible frecuentemente determinar
el número de gérmenes de productos como suspensiones de pigmentos
antes de la entrega a clientes e intervenir mediante adición de
sustancias de acción biocida. Debido a los largos trayectos de
transporte de hasta 6 semanas en buques de altura o del ferrocarril
la suspensión de pigmento puede deteriorase y llegar a ser
inservible. La suspensión de pigmento blanca puede volverse gris y
comenzar a oler mal. La sobredosificación preventiva de sustancias
de acción biocida a la suspensión de pigmento, hoy en día la única
posibilidad para evitar un deterioro es muy costosa, constituye un
derroche de recursos y es ecológicamente poco razonable. Además se
deben hacer para el análisis de gérmenes y hongos aerobios
mesófilos dos experiencias distintas. Además se requieren series de
dilución lo que aumenta el número de análisis en una
multiplicidad.
multiplicidad.
Se describen procedimientos comunes para la
determinación de gérmenes en la industria del papel y pigmentos,
por ejemplo, en Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56,
párrafo 7.01, edición 1985, revisión de 1988, "Bestimmung von
aeroben Bakterien und Keime" ("Determinación de bacterias y
gérmenes aerobios") y en Schweizerisches Lebensmittelbuch,
capítulo 56, párrafo 7.22, edición 1985, revisión de 1988,
"Bestimmung von Pilzen" ("Determinación de hongos").
Normalmente el tiempo de incubación es, antes de que se pueda
llevar a cabo una determinación, de aproximadamente 48 horas.
Se desarrolló por parte de la compañía Microbial
Systems Ltd. el dispositivo y procedimiento de análisis de
partículas Cellfacts^{R}. Se encuentra información más detallada
al respecto en Labor flash 9/96, Zeitung mit Leserdienst für
Leserdienst für Labor und Foschung, editorial Ott + Druck AG,
Ch-3607 Thun, Suiza. Se indica de este modo, por
ejemplo, que el analizador Cellfacts también es de utilidad también
para la determinación del número de gérmenes en lodos de carbonato
de calcio. En el laboratorio de la solicitante investigaciones
llevadas a cabo mostraron sin embargo que una determinación de este
tipo no es posible o sólo lo es de forma inexacta en la forma
descrita por el fabricante.
El principio de medida del analizador Cellfacts
se basa en la medida de bacterias, hongos y levaduras como
partículas en un campo eléctrico, en el que se determina mediante
incubación en intervalos de las muestras y subsiguiente medida el
aumento del número de partículas y en el crecimiento exponencial se
intrapola hasta t_{o}. Este principio de medida funciona también
con un número "bajo" en "partículas extrañas" con tamaños
iguales o similares que las bacterias, hongos y levaduras. En las
suspensiones y emulsiones con una proporción en "partículas
extrañas", es decir de minerales, cargas y/o pigmentos de > 1%
en peso, el número de "partículas extrañas" presentes con los
mismos tamaños que los microorganismos de 0,5 a 20 \mum inertes,
así como del valor del blanco t_{o}, es elevado, de modo tal que
ya no es detectable un aumento adicional de gérmenes mediante
multiplicación en un lapso de tiempo < 10 horas en el incubador.
De este modo el equipo de análisis Cellfacts ya no puede medir de
forma suficientemente exacta, y el fabricante exige para asegurar
una utilidad una dilución de la solución de partida.
Un aumento de 10^{3} partículas/ml, con un
valor del blanco de 10^{8} partículas/ml, ya no es detectado de
forma significativa con el equipo de análisis Cellfacts. Sin embargo
la dilución requerida en base a las "partículas extrañas" es
tan grande que la dilución de organismos capaces de multiplicarse
que se diluyen de forma natural en el mismo factor, ya no es
significativa y el resultado obtenido es falso. "Partículas
extrañas" con un diámetro > 20 \mum pueden obstruir además
las celdas de medida de sólo 30 \mum de diámetro. Las
"partículas extrañas" pueden ser, por ejemplo, de naturaleza
mineral como carbonato de calcio, de naturaleza polimérica
orgánica sintética como dispersiones de poli(acrilato de
estireno) o de naturaleza orgánica natural como soluciones de
almidón o hemicelulosas y/o fibras de celulosa o una combinación de
las partículas anteriores, como se presenta por ejemplo en el
proceso de una fábrica de papel.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un procedimiento rápido y eficiente, que se lleve a
cabo de forma sencilla, para la determinación cuantitativa y/o
cualitativa de contaminación microbiana de suspensiones,
emulsiones o dispersiones acuosas que contienen minerales y/o
pigmentos y/o cargas y/o materiales de fibras, que evite los
inconvenientes anteriormente descritos del estado de la técnica.
Este objetivo se consigue de acuerdo con la
invención mediante un procedimiento para la determinación
cuantitativa y/o cualitativa de contaminación microbiana de
suspensiones, emulsiones o dispersiones que contienen minerales
y/o pigmentos y/o cargas y/o materiales de fibras, que se
caracteriza porque
- a)
- una muestra de las suspensiones, emulsiones o dispersiones se mezcla con una o varias sustancias orgánicas que son degradadas por los microorganismos, que actúan como agente de separación entre los microorganismos y los minerales, pigmentos, cargas y/o materiales de fibras, en el que la cantidad en sustancia biodegradable se elige de modo que es posible una separación de los microorganismos y los minerales, cargas, pigmentos y/o materiales de fibras, y de forma opcional se incuba para el aumento del número de microorganismos,
- b)
- se centrifuga la mezcla así obtenida, para separar en su mayor parte los minerales y/o cargas y/o pigmentos y/o materiales de fibras de los microorganismos, con lo que los microorganismos se encuentra en la fase superior, y
- c)
- el sobrenadante acuoso obtenido mediante la centrifugación se somete preferiblemente a una incubación o varias incubaciones, para multiplicar el número de microorganismos en este sobrenadante, y
- d)
- se determina el número y/o tamaño y/o tipo de microorganismos en el sobrenadante.
De las reivindicaciones subordinadas resultan
configuraciones preferidas de la invención así como en la siguiente
descripción y de los ejemplos de realización.
La determinación cuantitativa y cualitativa de
microorganismos pertenece desde hace tiempo al estado de la
técnica. Sin embargo la determinación de contaminación microbiana da
lugar a dificultades especiales si se presenta una elevada
concentración de otras partículas de sustancias sólidas como
minerales, pigmentos, cargas y/o materiales de fibras en la muestra
a inspeccionar. Debido a que estas "partículas extrañas"
muestran frecuentemente un tamaño similar al de los
microorganismos, normalmente el número de "partículas
extrañas" se ha de minimizar normalmente sólo mediante una
elevada dilución de la muestra de partida. Sin embargo mediante
esta etapa de dilución elevada se reduce a la vez e inevitablemente
el número de microorganismos contaminantes, y es necesario un
periodo de incubación mayor para aumentar el número de
microorganismos mediante multiplicación, lo que hace posible una
detección segura.
Se mantiene por tanto la necesidad de
proporcionar un nuevo procedimiento del tipo mencionado al
comienzo, que de en esencialmente menor tiempo resultados
reproducibles y seguros respecto al número, tamaño y/o tipo de
microorganismos en la muestra inspeccionada.
De forma sorprendente y no previsible se ha
encontrado que se pueden separar los microorganismos mediante la
adición de sustancias orgánicas que se pueden degradar a la muestra
y una centrifugación subsiguiente del material inerte
("partículas extrañas"). Normalmente los microorganismos se
adhieren preferiblemente a los materiales minerales, pigmentos,
cargas y/o de fibras en la superficie y se pueden separar sólo muy
difícilmente de la superficie. Ciertamente mediante una etapa de
centrifugación sencilla sedimentan las "partículas extrañas",
eliminándose sin embargo de modo que los microorganismos se adhieren
preferiblemente a estas partículas, quedando estos con el
sedimento, de modo que la proporción de microorganismos que queda
en el sobrenadante da valores falsos en cuanto al grado de
presencia de gérmenes con microorganismos.
De forma asombrosa, se podría mostrar que
mediante la adición de sustancias orgánicas biológicamente
degradables se consigue una separación de los microorganismos y de
minerales, pigmentos, cargas y/o materiales de fibras. Se prefiere
que la sustancia orgánica que se degrada con los microorganismos sea
un medio nutritivo, que se usa normalmente para el cultivo de los
microorganismos. Este medio nutritivo actúa de forma sorprendente
como agente de separación entre los microorganismos y las
partículas extrañas y hace posible así principalmente primero la
separación y el distanciamiento de ambos y no altera las demás
etapas en el análisis de los microorganismos. Las sustancias no
degradables biológicamente o sólo difícilmente encierran el peligro
de separar ciertamente los microorganismos de las partículas
inertes pero al mismo tiempo provocar la inhibición de
microorganismos en el crecimiento y por tanto dar lugar un
resultado falso.
Mediante el procedimiento de acuerdo con la
invención no sólo se puede ahorrar sólo una etapa de trabajo, a
saber, la etapa de dilución, sino además se acorta también de forma
extraordinaria el tiempo de incubación. Además no se añade agente
de separación alguno, sino que el agente de separación actúa a la
vez como solución nutritiva, que de forma óptima se puede usar para
la multiplicación de los microorganismos que se inspeccionan y en
una forma de realización preferida se elige de modo que este es
específico para un tipo de microorganismos determinado que se
investigue, por ejemplo, para bacterias, hongos o levaduras.
Ya con la introducción de una sustancia orgánica
que se degrada con microorganismos, preferiblemente en forma de
una solución nutritiva y/o un medio nutritivo, y con la introducción
de la etapa de centrifugación se consigue el objetivo propuesto de
acuerdo con la invención. El tiempo de análisis se acorta, ya que
en la muestra que se inspecciona está contenido un número bajo de
"partículas extrañas" o esto ya es en general posible. Además
el número original y el aumento en partículas microbiológicas puede
ser con la incubación en el tiempo inferior que en muestras con un
valor del blanco elevado, por tanto de un número elevado en
"partículas extrañas".
Mediante el procedimiento de acuerdo con la
invención se pueden inspeccionar suspensiones, emulsiones y
dispersiones acuosas, que, entre otros, contienen minerales,
pigmentos, cargas y/o materiales de fibras, por ejemplo, fibras de
celulosa y de forma opcional además polímeros, por ejemplo,
polímeros naturales, sintéticos o semi-sintéticos
en forma coloidal. Ejemplos de polímeros de este tipo son:
estirenobutadieno, estirenoacrilato, resinas de melamina, resinas
de formaldehído-urea, almidones,
carboximetilcelulosa.
Las muestran que se inspeccionan provienen
preferiblemente de la industria de procesamiento del papel. Otros
campos de uso son la industria de los pigmentos y la industria de
transformación de metales.
De acuerdo con la invención se toma una muestra
de suspensiones, emulsiones o dispersiones que se inspeccionan en
cuanto a contaminación microbiana. La cantidad de la muestra
retirada es por lo general de 0,5 a 20 ml, sin embargo puede
encontrarse también por debajo o por encima. En general, la
cantidad de muestra retirada no es decisiva para el éxito del
procedimiento de acuerdo con la invención.
A la muestra retirada se añaden sustancias
orgánicas que se degradan con microorganismos y se mezclan entre
ellos. La proporción de las sustancias orgánicas biodegradables
añadidas a la muestra es, por ml de muestra, de 0,5 a 50 ml de la
sustancia biodegradable.
La relación de volumen de muestra al volumen de
sustancia biodegradable depende de la concentración original de la
muestra y de la concentración de sustancia biodegradable en
solución. La relación se regula de modo que la cantidad de la
sustancia biodegradable es tan alta que es posible una separación
de los microorganismos y de los minerales, cargas, pigmentos y/o
materiales de fibras y de forma opcional adicionalmente de los
polímeros en forma coloidal. La relación óptima respectiva para la
determinación de volumen de muestra a volumen de sustancia
biodegradable se puede determinar por parte del especialista en la
técnica mediante experimentación
manual.
manual.
Normalmente la concentración de la solución, que
contiene la sustancia biodegradable, se elige de modo que la
relación de solución de muestra a la solución que contiene la
sustancia biodegradable es de 1:0,1 a 1:100. La relación óptima
depende fuertemente de la concentración y de la composición de la
solución de muestra correspondiente. Las suspensiones de pigmento
y/o carga con un contenido de sólido > 65% en peso se diluyen
normalmente en relación 1:2 a 1:10, preferiblemente 1:3. A un
contenido en sólido < 65% en peso se diluye normalmente en
relación 1:0,1 a 1:1. En ciertos casos, especialmente si se espera
una presencia de gérmenes muy elevada, se diluye normalmente en
relación 1:10 a 1:100. El factor de dilución elegido se ha de
considerar en el posterior cálculo de presencia de gérmenes o
advertir especialmente en el resultado.
A las sustancias orgánicas biodegradables
pertenecen especialmente el grupo de los medios nutritivos, que
son específicos de una especie de microorganismos determinados que
se inspeccionan. Los medios nutritivos contienen preferiblemente
una fuente de carbono, nitrógeno, fosfato y/o azufre así como de
forma opcional sustancias minerales, sustancias de crecimiento y/o
vitaminas. Se puede incorporar otras sustancias al medio
nutritivo, en caso que se requiera para el crecimiento óptimo de los
microorganismos. Se describen a continuación más exactamente
medios nutritivos preferidos que se pueden usar de acuerdo con la
invención.
Después de la adición del medio nutritivo se
pueden realizar de forma opcional una o varias etapas de
incubación, para aumentar el número de microorganismos en la
muestra. Esto puede ser especialmente ventajoso para el posterior
análisis cualitativo. Sin embargo, en una forma de realización
preferida de la invención esta incubación no tiene lugar antes de
la centrifugación, lo que lleva a un ahorro de tiempo evidente.
Para separar los microorganismos de los
minerales, cargas, pigmentos y/o materiales de fibras, se realiza
tras la adición del medio nutritivo y la etapa de incubación
subsiguiente opcional una etapa de centrifugación. La
centrifugación se lleva a cabo de modo que se separan la mayor parte
del número de microorganismos, es decir, más del 50%, de las
"partículas de sustancias extrañas", en suma de los minerales,
cargas, pigmentos, polímeros y materiales de fibras. La
centrifugación se debe llevar a cabo de modo que los
microorganismos se agrupen en la fase superior, mientras que las
partículas de sustancias extrañas sedimentan. Para este fin se
lleva a cabo la centrifugación preferiblemente de 100 a 1.500 g,
preferiblemente de 200 a 1.200 g y especialmente preferiblemente de
600 a 1.000 g. El campo gravitacional se regula en función de los
minerales, cargas, pigmentos y materiales de fibras que se separan
y/o en función de los microorganismos que se separan.
El número de sedimentaciones óptimo se determina
por parte del especialista en la técnica en base a experimentos.
La centrifugación misma se lleva a cabo durante un periodo de tiempo
de 1 a 30 minutos, preferiblemente de 2 a 15 minutos y con
especial preferencia de 5 a 10 minutos. El tiempo de centrifugación
óptimo se puede determinar por el especialista en la técnica
mediante experimentación de laboratorio.
\newpage
Se usan preferiblemente como minerales y/o cargas
y/o pigmentos: elementos del segundo y/o tercer grupo principal
y/o del cuarto grupo principal y/o del cuarto grupo secundarios del
sistema periódico de los elementos, especialmente compuestos que
contienen calcio y/o silicio y/o aluminio y/o titanio y/o bario y/o
pigmentos orgáni-
cos.
cos.
Se usan preferiblemente como minerales, cargas y
pigmentos caolín y/o hidróxido de aluminio y/o óxido de titanio
y/o sulfato de bario y/o esferas huecas de poliestireno y/o resinas
de formaldehído y/o minerales que contienen carbonato de calcio
y/o cargas y/o pigmentos, especialmente carbonatos de calcio
naturales y/o mármol y/o cal y/o dolomita y/o carbonatos de calcio
que contienen dolomita y/o carbonatos de calcio preparados
sintéticamente, denominados carbonatos de calcio precipitados.
El sobrenadante que contiene los microorganismos
se recoge y se puede incorporar después directamente a una
determinación cuantitativa y/o cualitativa de contaminación
microbiana. Preferiblemente se incluye aquí una o varias etapas de
incubación para multiplicar el número de microorganismos en el
sobrenadante. Esta etapa de multiplicación se realiza a una
temperatura de incubación favorable para los microorganismos que
depende del tipo de organismos que se multiplican. Las temperaturas
de incubación preferidas se encuentran en el intervalo de 20 a
37ºC, más preferiblemente de 28 a 34ºC y con especial preferencia de
31,5 a 32,5ºC. Las respectivas temperaturas de incubación
necesarias son conocidas por el especialista en la técnica y se
pueden determinar bien a partir de documentos de consulta o
mediante experimentación.
El tiempo total de los tiempos de incubación
individuales a temperatura de incubación de 30ºC es con una
presencia de gérmenes inferior a 10^{5} gérmenes/ml de muestra de
hasta 12 horas, con una presencia de gérmenes de más de 10^{5}
gérmenes/ml de muestra pero inferior a 10^{6} gérmenes/g de hasta
6 horas, en una suspensión con originalmente proporción de sólidos
de 60 a 80% en peso con una presencia de gérmenes de más de
10^{5} gérmenes/ml (con uso de agar en caldo tríptico de soja) de
hasta 3 horas.
La suma de las etapas de incubación individuales
a 30ºC es con una presencia de gérmenes inferior a 10^{5}
gérmenes/ml de muestra de 2 a 6, con una presencia de gérmenes de
más de 10^{5} gérmenes/ml de muestra pero inferior a 10^{6}
gérmenes/g de 2 a 4, en una suspensión con originalmente proporción
de sólidos de 60 a 80% en peso con una presencia de gérmenes de más
de 10^{5} gérmenes/ml (con uso de agar en caldo tríptico de
soja) de 2 a 3.
Los tiempos de incubación individuales a
temperatura de incubación de 30ºC es con una presencia de gérmenes
inferior a 10^{5} gérmenes/ml de muestra de 1 a 12 horas, con una
presencia de gérmenes de más de 10^{5} gérmenes/ml de muestra
pero inferior a 10^{6} gérmenes/g de 1 a 6 horas, en una
suspensión con originalmente proporción de sólidos de 60 a 80% en
peso con una de 60 a 80% en peso de más de 10^{5} gérmenes/ml
(con uso de agar en caldo tríptico de soja) de 1 a 2 horas.
Para la determinación cuantitativa y/o
cualitativa de los microorganismos así obtenidos se encuentran
disponibles distintos procedimientos conocidos del estado de la
técnica. Especialmente se prefiere de acuerdo con la invención el
análisis por Cellfacts^{R} o el procedimiento ATP. Se encuentran
disponibles y son conocidos por los especialistas en la técnica
otros procedimientos. Los procedimientos preferidos se describen
más detalladamente en los ejemplos siguientes.
Tras la realización del procedimiento de acuerdo
con la invención es posible una determinación cualitativa y/o
cuantitativa de microorganismos. Con determinación cualitativa se
entiende en primer lugar una diferenciación aproximada entre los
grupos de hongos, levaduras y bacterias. Tras calibración del
análisis por Cellfacts^{R} con microorganismos especiales, por
ejemplo bacterias especiales, es posible también otra
especificación en los subtipos individuales. El análisis
cuantitativo, por ejemplo, con el procedimiento Cellfacts^{R}
tiene lugar en base a una diferenciación según tamaños y/o volumen
de una célula individual.
El tipo de medio nutritivo usado como agente de
separación depende especialmente del microorganismo que se separa
y que se multiplica. Se prefieren usar aquellos medios nutritivos
que hacen posible un crecimiento selectivo de los gérmenes que se
determinan y atenuar en lo posible el crecimiento de otros gérmenes
que nos se determinan. Ejemplos de medios nutritivos que se pueden
usar de acuerdo con la invención son agar en caldo triptona
azolectina/Tween 20 (TAT), solución de glucosa, peptona/caseína,
caldo nutritivo, preferiblemente agar en caldo tríptico de soja.
La composición de los medios nutritivos se indica en el suplemento
a esta descripción.
La concentración del medio nutritivo para los
microorganismos se encuentra preferiblemente de 0,1 a 10% en peso,
de forma más ventajosa en 2 a 5% en peso y especialmente de forma
ventajosa en aproximadamente el 3% en peso.
Mediante el procedimiento de acuerdo con la
invención es posible tanto una determinación cualitativa como
también cuantitativa de las bacterias, hongos y levaduras. En una
forma de realización preferida se realiza un análisis de este tipo
en una etapa.
Después de la separación de los microorganismos
de los minerales, cargas, pigmentos y/o materiales de fibras, en
suma de las "sustancias extrañas", se llevan a cabo una o
varias, preferiblemente dos a cinco etapas de incubación, para
multiplicar el número de microorganismos que se encuentran en el
sobrenadante de la muestra.
Se realizan múltiples incubaciones en intervalos,
es decir, se repite la medida de la contaminación después del
tiempo t_{o+x}. Así es posible limitar el tiempo de incubación y
los intervalos de incubación. En el momento en el que se evidencia
un crecimiento exponencial se intrapola y se calcula en el tiempo
t_{o}. Un grado de presencia de gérmenes originalmente más
elevado lleva a un crecimiento que se ajusta y calcula antes, de
modo que se puede renunciar a los subsiguientes intervalos de
incubación.
El tiempo de incubación con una presencia de
gérmenes inferior a 10^{5} gérmenes/ml de muestra es de hasta 12
horas, con una presencia de gérmenes inferior a 10^{6} gérmenes/ml
de hasta 6 horas, en una suspensión con originalmente proporción
de sólidos de 60 a 80% en peso con una presencia de gérmenes de más
de 10^{5} gérmenes/ml de muestra de hasta 3 horas, en donde en el
último caso se usa preferiblemente agar en caldo tríptico de soja.
El tiempo de incubación que se va a usar en función del grado de
contaminación con microorganismos se puede determinar por el
especialista en la técnica mediante experimentación manual
sencilla. Cuanto más bajo es el grado de contaminación microbiana
original de la muestra, tanto más prologados se deben elegir los
tiempos de incubación y viceversa. La proporción de sólidos original
de la suspensión no influye directamente en el tiempo de
incubación.
A continuación se aclara más detalladamente la
invención en función de los ejemplos comparativos y ejemplos de
realización. Se pueden llevar a cabo otras modificaciones de la
invención por parte del especialista en la técnica en base a la
presente descripción en relación con las reivindicaciones de
patente anexas así como en base al conocimiento específico que se
supone. La invención no se encuentra limitada por los presentes
ejemplos.
Se succionan los microorganismos de la suspensión
y/o emulsión y/o dispersión de acuerdo a través de un poro de
medida con diámetro definido por medio de vacío. En este poro
(capilar, 30 \mum) se dispone una tensión (voltaica). Debido a
que las células intactas se pueden considerar en primera instancia
como aislantes, en el paso de una célula por el poro de medida se
da un aumento de la resistencia medible, cuyos tamaños depende del
volumen de la célula. El pulso de corriente es directamente
proporcional al volumen. Mediante incubación de las muestras se
pueden medir pequeñas diferencias en crecimiento de las células, es
decir, en la división celular aumenta el número de las partículas
proporcionalmente. Debido a que la función del crecimiento celular
es exponencial se puede intrapolar según la percepción del alcance
de la fase exponencial sobre la concentración de partida. El
tiempo de determinación para suspensiones de CaCO_{3} - talco y
caolín así como otras sustancias (por ejemplo, lubricantes
refrigeradores, agua blanca, almidón suspendido coloidal etc.) se
encuentra en la preparación de acuerdo con la invención de muestras
industriales y con uso del anterior procedimiento en sólo 2 a 12
horas en lugar de las 24 a 48 horas del estado de la técnica.
Esto permite una intervención a tiempo con
sustancias conservantes antes de una contaminación elevada y/o del
deterioro de la mercancía.
1^{er}
Ejemplo
A) Determinaciones del número de gérmenes según
Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01,
edición 1985, revisión 1988, "Bestimmung von aeroben Bakterien und
Keime" y según el Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo
56, párrafo 7.22, edición 1985, revisión 1988, "Bestimmung von
Pilzen"
Se analizaron 3 ml de un lodo acuoso al 77,5% en
peso de mármol de Noruega natural, molido (90% en peso de
partículas < 2 \mum, 65% en peso de partículas < 1 \mum),
dispersados con 0,65% de un poli(acrilato de sodio)
disponible en el mercado según el procedimiento "Bestimmung von
aeroben mesophilen Keimen" ("Determinación de gérmenes
aerobios mesófilos"), Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo
56, párrafo 7.01, edición 1985, revisión 1988.
La determinación del número de gérmenes dio
después de 48 horas de tiempo de incubación: 3,0 x 10^{6}
gérmenes mesófilos aerobios/ml de suspensión. No se encontraron
hongos con el medio nutritivo usado para gérmenes mesófilos
aerobios. Según el procedimiento descrito en Schweizerisches
Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.22, edición 1985,
revisión 1988, "Bestimmung von Pilzen" se encontraron <
10^{2} hongos/ml.
Se pipetean 3 ml del lodo acuoso al 77,5% en peso
usado en el ejemplo 1A) de mármol de Noruega natural, molido (90%
en peso de partículas < 2 \mum, 65% en peso de partículas <
1 \mum), dispersados con 0,65% en peso de un
poli(acrilato de sodio) disponible en el mercado, en un
frasquillo estéril. Se adiciona a la muestra 3 ml de solución
nutritiva base de caldo TAT/Tween 20 al 3% en peso y se analiza con
el CellFacts. El análisis se realiza de modo que se inspeccionó al
instante (tiempo t_{oh}) midiendo el número de partículas en el
equipo Cellfacts. Debido a que el número de partículas era demasiado
elevado, el equipo requirió una dilución de la muestra. Después de
una dilución de 1:10.000 fue aceptada la concentración de
partículas por el equipo y se puede determinar el valor del blanco
(t_{oh}). Después de 2 horas (tiempo t_{2h}), 4 horas (tiempo
t_{4h}), después de 6 horas (tiempo t_{6h}), después de 12 horas
(tiempo t_{12h}) de tiempo de incubación se midió el número de
partículas en el equipo Cellfacts. La temperatura de incubación fue
de 30ºC. Representando el número de partículas frente al diámetro
de estas partículas, se puede determinar según tiempos de
incubación determinados de la fase clara si se encuentran presentes
células con vida ("elevación de pico", eje y) y de qué tipo
de microorganismos se trata, por ejemplo, bacterias, levaduras u
hongos (diámetro de partícula medio, eje x).
Después de 12 horas de tiempo de incubación se
determinó mediante intrapolación hasta el tiempo (t_{oh}) la
presencia de gérmenes original de la suspensión. En comparación con
esto sirve el resultado del ejemplo 1 A) determinación del número
de gérmenes según el Schweizerisches Lebensmittelbuch
("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches
Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01, edición 1985, revisión
1988).
Determinación del número de gérmenes con el
contador de partículas Cellfacts
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Gérmenes mesófilos aerobios/ml de suspensión |
| extracción | en horas | (máximo de pico en partículas de 1 a 2,5 \mum de diámetro) | |
| 1 | Agar de caldo | 12 | < 10^{2} |
| tríptico de soja |
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Hongos/ml de suspensión (máximo de pico en partículas |
| extracción | en horas | de 5 a 9 \mum de diámetro) | |
| 1 | Agar de caldo | 12 | < 10^{2} |
| tríptico de soja |
Del ejemplo 1 A) y 1 B) resulta claramente que la
determinación de bacterias, hongos y levaduras en la suspensión
anterior con los procedimientos del estado de la técnica no es
posible por un lado con el equipo CellFacts, da respectivamente
con < 10^{2} gérmenes/ml un resultado completamente falso o la
determinación según el procedimiento del Schweizerisches
Lebensmittelbuch dura 48 horas.
En el equipo Cellfacts tuvo lugar la dilución
necesaria de la muestra supuestamente también hasta una dilución
de los gérmenes microbiológicos presentes por debajo de su límite de
determinación.
En la determinación según el Schweizerisches
Lebensmittelbuch el análisis duró 48 horas.
Se pipetean 3 ml de muestra como en el ejemplo 1
A), lodo acuoso al 77,5% en peso de mármol de Noruega natural,
molido (90% en peso de partículas < 2 \mum, 65% en peso de
partículas < 1 \mum), dispersados con 0,65% en peso de un
poli(acrilato de sodio) disponible en el mercado, en un
frasquillo estéril. Se adiciona a la muestra 3 ml de solución
nutritiva base de caldo TAT/Tween 20 al 3% en peso y se analiza con
el luminómetro 1253 BioOrbit. Se realiza el análisis de modo que se
inspeccionó al instante (tiempo t_{oh}), midiendo la cantidad de
luz liberada por el ATP en el luminómetro 1253 BioOrbit. Igualmente
se midió una muestra después de una dilución de 1:10.000. Se
determinó respectivamente el valor del blanco (t_{oh}). Después
de 4 horas (tiempo t_{4h}), después de 7 horas (tiempo t_{7h})
y después de 17 horas (tiempo t_{17h}) de tiempo de incubación se
midió de nuevo la intensidad de luz en el luminómetro 1253 de
BioOrbit. La temperatura de incubación fue de 30º C. Representando
la intensidad de luz en función del tiempo de incubación
correspondiente frente al tiempo de incubación, se puede determinar
si se encuentran presentes células con vida (aumento de la
intensidad de luz en el tiempo). Después de un tiempo de incubación
en el que el crecimiento discurre aproximadamente de forma
exponencial, se puede determinar comparativamente mediante
comparación del transcurso de las curvas de las muestras
individuales unas con otras la presencia de gérmenes en la
suspensión. Se puede distinguir por tanto semicuantitativamente
entre "ningún crecimiento", "crecimiento débil" y
"fuerte crecimiento".
- a)
- Se pipetean al inicio, de cada una de las muestras preparadas como se describieron anteriormente, 100 \mul en una cubeta del luminómetro.
- b)
- A esto se añaden 100 µl de reactivo de liberación de ATP, se agita bien y se deja reposar durante un minuto, con lo que se puede extraer el ATP.
- c)
- Después se incorporan 500 µl de reactivo AMR y se mezcla con agitación.
- d)
- La cubeta se puede introducir en la celda de medida y se lee la emisión de luz.
Bibliografía: instrucciones de uso del
luminómetro BioOrbit versión 3.0, Mayo de 1995 así como la nota de
aplicación 20 de la compañía BioOrbit OY, FIN 20521, Turku,
Finlandia.
| Resultado: | ||
| Tiempo de incubación en | Intensidad de luz de la muestra | Muestra diluida a 1:10.000, |
| horas | [RLU] en la pantalla de | intensidad de luz [RLU] en la |
| visualización LCD | pantalla de visualización LCD | |
| 0 | 0,001 | 0,002 |
| 4 | 0,000 | 0,001 |
| 7 | 0,002 | 0,002 |
| 17 | 0,001 | 0,001 |
En este procedimiento del estado de la técnica no
se evidencia después de 17 horas diferencia alguna entre los
tiempos de incubación individuales, es decir, se debe suponer que la
suspensión no presenta gérmenes. Sin embargo debido a que se trata
de la misma suspensión que en el ejemplo 1 A (procedimiento según
Schweizerischem Lebensmittelbuch) y el procedimiento reconocido,
usado ahí da un resultado de 3 x 10^{6} gérmenes/ml, está claro
que en este ejemplo 1C) se trata de un resultado falso, lo que en la
práctica puede llevar a consecuencias fatales como intoxicación de
alimentos o deterioro de mercancías.
La determinación de bacterias, hongos y levaduras
en la suspensión anterior no es posible con estos procedimientos
del estado de la técnica.
Presumiblemente la elevada concentración de
partículas en la concentración original de la suspensión llevó a
adsorción de luz completa de la cantidad de luz liberada mediante
ATP en la suspensión, y la dilución de la muestra llevó igualmente
a una dilución de los gérmenes microbiológicos presentes por debajo
del límite de determinación con este procedimiento.
2º
Ejemplo
Se pipetean 3 ml de un lodo acuoso al 77,5% en
peso de mármol de Noruega natural, molido (90% en peso de
partículas < 2 \mum, 65% en peso de partículas < 1 \mum),
dispersados con 0,65% en peso de un poli(acrilato de sodio)
disponible en el mercado en un frasquillo estéril separado. Se
adiciona a una muestra 3 ml de solución nutritiva base de caldo
TAT/Tween 20 al 3% en peso y a la segunda muestra 3 ml de solución
nutritiva de caldo tríptico de soja al 3% en peso. A continuación
se agitan bien ambas muestras durante 20 segundos y a continuación
se centrifugan. Después de 10 minutos de centrifugación a 800 g se
aísla la fase clara que queda en la parte superior y se analiza
con el CellFacts. El análisis se realiza de modo que se mide al
instante tras la centrifugación (tiempo t_{oh}), después de 2
horas (tiempo t_{2h}), 4 horas (tiempo t_{4h}) y después de 6
horas (tiempo t_{6h}) de tiempo de incubación el número de
partículas en el equipo. Representando el número de partículas
frente al diámetro de estas partículas, se puede determinar según
tiempos de incubación determinados de la fase clara si se
encuentran presentes células con vida (elevación del pico) y de qué
tipo de microorganismos se trata (bacterias, levaduras u hongos).
Después de un tiempo de incubación en el que el crecimiento
transcurre exponencialmente, se determina mediante intrapolación
hasta el tiempo t_{oh} la presencia de gérmenes original de la
suspensión. En comparación con esto se llevó a cabo una
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch ("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen",
Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01,
edición 1985, revisión 1988).
Determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch.
La determinación del número de gérmenes dio
después de 48 horas: 3,0 x 10^{6} gérmenes aerobios mesófilos/ml
de suspensión.
Determinación del número de gérmenes con el
contador de partículas Cellfacts
1. Base de caldo TAT/Tween 20
(poli(monolaurato de oxietilensorbitán))
2. Agar en caldo tríptico de soja
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Gérmenes aerobios mesófilos/ml de suspensión (máximo |
| extracción | necesario en horas | de pico en partículas de 1 a 2,5 \mum de diámetro) | |
| 1 | Base de caldo | 6 | 1,25 x 10^{6} |
| TAT/Tween 20 | |||
| 1 | Agar en caldo | 4 | 3,14 x 10^{6} |
| tríptico de soja |
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Hongos/ml de suspensión (máximo de pico en partículas |
| extracción | en horas | de 5 a 9 \mum de diámetro) | |
| 2 | Agar en caldo | 12 | < 10^{2} |
| tríptico de soja |
Las muestras analizadas según el procedimiento de
acuerdo con la invención dan una concordancia extraordinaria con
la determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch, determinado después de 48 horas de tiempo de
incubación.
Ambas muestras se encuentran respecto a la
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch perfectamente dentro del margen de confianza.
Con margen de confianza se entiende en esta
invención la desviación de + - 0,5 log_{10} de determinaciones
del número de gérmenes individuales como se resolvió por parte de
PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue,
Londres NW9 5HT, Reino Unido, Distribución 070, página 6 y 7 y
apéndice 1, fecha de distribución 16 de Noviembre de 1998, fecha
del informe 30 de Diciembre de 1998.
Se rellenaron respectivamente 500 ml de un lodo
acuoso al 71,5% en peso de mármol de Noruega natural, molido (90%
en peso de partículas < 2 \mum, 65% en peso de partículas <
1 \mum), dispersados con 0,5% en peso de un poli(acrilato
de sodio) disponible en el mercado, en frascos de vidrio de 1
litro. Una muestra se conservó 3 días a 5ºC (muestra A), la otra
muestra durante 3 días a 30ºC (muestra B). A continuación se
temperizaron las muestras a 20ºC y se mezclaron bien 3 ml de cada
muestra en un frasquillo estéril con 3 ml del respectivo agente de
extracción. Después de 10 minutos de centrifugación a 600 g se aísla
la fase clara que queda en la parte superior y se analiza con el
luminómetro 1253 BioOrbit en cuanto a emisión de luz. El análisis
se realizó de modo que se midió al instante tras la centrifugación
(tiempo t_{oh}), después de 4 horas (tiempo t_{4h}), después
de 7 horas (tiempo t_{7h}), después de 17 horas (tiempo
t_{17h}) de tiempo de incubación la intensidad de luz en el
luminómetro 1253 BioOrbit. La temperatura de incubación fue de
30ºC. Representando la intensidad de luz según el tiempo de
incubación correspondiente frente al tiempo de incubación, se puede
determinar en la fase clara si se encuentran presentes células con
vida (aumento de la intensidad de luz en el tiempo). Después de un
tiempo de incubación en el que el crecimiento transcurre
aproximadamente de forma exponencial se puede determinar
comparativamente mediante comparación del transcurso de las curvas
de las muestras individuales conjuntamente la presencia de gérmenes
en la suspensión. Se puede distinguir por tanto
semicuantitativamente entre "ningún crecimiento",
"crecimiento débil" y "crecimiento fuerte". En
comparación con esto se llevó a cabo una determinación del número
de gérmenes según el Schweizerischen Lebensmittelbuch
("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches
Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01, edición 1985,
revisión 1988).
Solución de NaCl al 0,9% en peso en agua
destilada, sin sustancia que sirve como sustancia nutritiva
orgánica.
Solución nutritiva orgánica al 3% en peso (agar
en caldo tríptico de soja) Determinación del número de gérmenes
según Schweizerischen Lebensmittelbuch
Muestra A: 5 x 10^{4} gérmenes aerobios
mesófilos/g de suspensión después de 48 horas
Muestra B: 5 x 10^{7} gérmenes aerobios
mesófilos/g de suspensión después de 48 horas
| Estado de la técnica, NaCl al 0,9% en peso - solución en agua destilada | ||
| Tiempo de incubación en | Muestra 1A, intensidad de luz | Muestra 1B, intensidad de luz |
| horas | [RLU] en la pantalla de | [RLU] en la pantalla de |
| visualización LCD | visualización LCD | |
| 0 | 0,001 | 0,001 |
| 4 | 0,002 | 0,003 |
| 7 | 0,002 | 0,004 |
| 17 | 0,004 | 0,007 |
En el procedimiento del estado de la técnica no
es posible después de 17 horas diferencia inequívoca alguna entre
la suspensión con débil y fuerte presencia de gérmenes.
| Según la invención, solución nutritiva orgánica al 3% en peso (agar en caldo tríptico de soja) | ||
| Tiempo de incubación en | Muestra 2A, intensidad de luz | Muestra 2B, intensidad de luz |
| horas | [RLU] en la pantalla de | [RLU] en la pantalla de |
| visualización LCD | visualización LCD | |
| 0 | 0,001 | 0,002 |
| 4 | 0,004 | 0,006 |
| 7 | 0,007 | 0,045 |
| 17 | 0,050 | 0,240 |
Con el uso de los nuevos procedimientos de
acuerdo con la invención es posible una diferencia entre suspensión
con "débil" y "fuerte presencia de gérmenes" ya tras 7
horas.
Así mismo ya después de 17 horas se ha de
reconocer una significante "débil presencia de gérmenes".
En la bibliografía e: instrucciones de uso del
luminómetro BioOrbit versión 3.0, Mayo de 1995 así como en la
"Nota de aplicación 20" de la compañía BioOrbit OY, FIN 20521,
Turku, Finlandia se muestran también modelos de cálculo como se
puede calcular de los valores [RLU] sobre la biomasa. Además existe
la posibilidad de contrastar mediante "calibración" con
suspensiones con nivel de presencia de gérmenes de un número de
gérmenes/ml.
4º
Ejemplo
Se pipetean 3 ml de un lodo acuoso al 72,8% en
peso de arcilla estadounidense natural, molida de Georgia, EEUU
(95% en peso de partículas < 2 \mum, 78% en peso de partículas
< 1 \mum), dispersados con 0,35% en peso de un
poli(acrilato de sodio) disponible en el mercado, en un
frasquillo estéril separado. Se adiciona a una muestra 3 ml de
solución nutritiva de base de caldo TAT /Tween 20 al 3% en peso y a
la segunda muestra 3 ml de solución nutritiva de caldo tríptico de
soja al 3% en peso. A continuación se agitan bien ambas muestras
durante 20 segundos y a continuación se centrifugan. Después de 10
minutos de centrifugación a 800 g se aísla la fase clara que queda
en la parte superior y se analiza con el Cellfacts. El análisis se
realiza de modo que se miden al instante tras la centrifugación
(tiempo t_{oh}), después de 2 horas (tiempo t_{2h}), 4 horas
(tiempo t_{4h}), después de 6 horas (tiempo t_{6h}), después de
12 horas (tiempo t_{12h}) de tiempo de incubación el número de
partículas en el equipo Cellfacts. La temperatura de incubación fue
de 30ºC. Representando el número de partículas frente al diámetro
de estas partículas, se puede determinar según tiempos de
incubación determinados de la fase clara si se encuentran presentes
células con vida (elevación del pico) y de qué tipo de
microorganismos se trata (bacterias, levaduras u hongos). Después de
un tiempo de incubación en el que el crecimiento transcurre
exponencialmente se determina mediante intrapolación hasta el
tiempo t_{oh} la presencia de gérmenes original de la suspensión.
En comparación con esto se llevó a cabo una determinación del
número de gérmenes según el Schweizerischen Lebensmittelbuch
("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches
Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01, edición 1985, revisión
1988).
Determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch.
La determinación del número de gérmenes dio tras
48 horas: 3,0 x 10^{5} gérmenes aerobios mesófilos/ml de
suspensión.
Determinación del número de gérmenes con el
contador de partículas Cellfacts
1. Base de caldo TAT/Tween 20
(poli(monolaurato de oxietilensorbitán)
2. Agar en caldo tríptico de soja
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Gérmenes aerobios mesófilos/ml de suspensión (máximo |
| extracción | necesario en horas | de pico en partículas de 1 a 2,5 \mum de diámetro) | |
| 1 | Base de caldo | 12 | 1,12 x 10^{5} |
| TAT/Tween 20 | |||
| 1 | Agar en caldo | 6 | 5,21 x 10^{5} |
| tríptico de soja |
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Hongos/ml de suspensión (máximo de pico en partículas |
| extracción | en horas | de 5 a 9 \mum de diámetro) | |
| 2 | Agar en caldo | 12 | Aprox. 10^{3} |
| tríptico de soja |
Las muestras analizadas según el procedimiento de
acuerdo con la invención dan una concordancia extraordinaria con
la determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch, determinado después de 48 horas de tiempo de
incubación.
Ambas muestras se encuentran respecto a la
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch perfectamente dentro del margen de confianza.
Con margen de confianza se entiende en esta
invención la desviación de + - 0,5 log_{10} de determinaciones
del número de gérmenes individuales como se resolvió por parte de
PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue,
Londres NW9 5HT, Reino Unido, Distribución 070, páginas 6 y 7 y
apéndice 1, fecha de distribución 16 de Noviembre de 1998, fecha
del informe 30 de Diciembre de 1998.
\newpage
5º
Ejemplo
Se pipetean 3 ml de un lodo acuoso al 0,5% en
peso, que contiene mármol de Noruega natural, molido
aproximadamente al 0,2% en peso (60% en peso de partículas < 2
\mum, 35% en peso de partículas < 1 \mum), dispersados con
0,15% en peso de un poli(acrilato de sodio) disponible en el
mercado y fibras de celulosa/sulfito/sulfato celulosa
aproximadamente al 0,3% en peso, como se usan en fábricas de papel
para la fabricación de papel, y aproximadamente el 0,05% de una
poliacrilamida disponible en el mercado, en un frasquillo estéril.
Se adiciona a la muestra 3 ml de solución nutritiva de caldo
tríptico de soja al 3% en peso. A continuación se agitan bien las
muestras durante 20 segundos y a continuación se centrifugan.
Después de 10 minutos de centrifugación a 1.000 g se aísla la fase
clara que queda en la parte superior y se analiza con el Cellfacts.
El análisis se realiza de modo que se miden al instante tras la
centrifugación (tiempo t_{oh}), después de 1 hora (tiempo
t_{1h}), 2 horas (tiempo t_{2h}) de tiempo de incubación el
número de partículas en el equipo Cellfacts. La temperatura de
incubación fue de 30ºC. Representando el número de partículas
frente al diámetro de estas partículas, se puede determinar según
tiempos de incubación determinados de la fase clara si se
encuentran presentes células con vida (elevación del pico) y de qué
tipo de microorganismos se trata (bacterias, levaduras u hongos).
Después de un tiempo de incubación en el que el crecimiento
transcurre exponencialmente se determina mediante intrapolación
hasta el tiempo t_{oh} la presencia de gérmenes original de la
suspensión. En comparación con esto se llevó a cabo una
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch ("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen",
Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01,
edición 1985, revisión 1988).
Determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch.
La determinación del número de gérmenes dio
después de 48 horas: 3,0 x 10^{7} gérmenes aerobios mesófilos/ml
de suspensión.
Determinación del número de gérmenes con el
contador de partículas Cellfacts
1. Agar en caldo tríptico de soja
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Gérmenes aerobios mesófilos/ml de suspensión (máximo |
| extracción | necesario en horas | de pico en partículas de 1 a 2,5 \mum de diámetro) | |
| 1 | Agar en caldo | 2 | 3,45 x 10^{7} |
| tríptico de soja |
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Hongos/ml de suspensión (máximo de pico en partículas |
| extracción | en horas | de 5 a 9 \mum de diámetro) | |
| 1 | Agar en caldo | 6 | Aprox. 10^{4} |
| tríptico de soja |
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras analizadas según el procedimiento de
acuerdo con la invención dan una concordancia extraordinaria con
la determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch, determinado después de 48 horas de tiempo de
incubación.
La muestra se encuentra respecto a la
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch perfectamente dentro del margen de confianza.
Con margen de confianza se entiende en esta
invención la desviación de + - 0,5 log_{10} de determinaciones
del número de gérmenes individuales como se resolvió por parte de
PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue,
Londres NW9 5HT, Reino Unido, distribución 070, páginas 6 y 7 y
apéndice 1, fecha de distribución 16 de Noviembre de 1998, fecha
del informe 30 de Diciembre de 1998.
\newpage
6º
Ejemplo
Se pipetea 3 ml de una suspensión acuosa,
coloidal al 10% en peso de almidón de maíz, como es de uso en las
fábricas de papel, en un frasquillo estéril. Se adiciona a la
muestra 3 ml de solución nutritiva de caldo tríptico de soja al 3%
en peso. A continuación se agita bien las muestras durante 20
segundos y a continuación se centrifugan. Después de 10 minutos de
centrifugación a 800 g se aísla la fase clara que queda en la parte
superior y se analiza con el Cellfacts. Este análisis se realiza de
modo que se miden al instante tras la centrifugación (tiempo
t_{oh}), después de 1 hora (tiempo t_{1h}), 2 horas (tiempo
t_{2h}) de tiempo de incubación el número de partículas en el
equipo Cellfacts. La temperatura de incubación fue de 30ºC.
Representando el número de partículas frente al diámetro de estas
partículas, se puede determinar según tiempos de incubación
determinados de la fase clara si se encuentran presentes células con
vida (elevación del pico) y de qué tipo de microorganismos se
trata (bacterias, levaduras u hongos). Después de un tiempo de
incubación en el que el crecimiento transcurre exponencialmente se
determina mediante intrapolación hasta el tiempo t_{oh} la
presencia de gérmenes original de la suspensión. En comparación con
esto se llevó a cabo una determinación del número de gérmenes
según el Schweizerischen Lebensmittelbuch ("Bestimmung von
aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches Lebensmittelbuch,
capítulo 56, párrafo 7.01, edición 1985, revisión 1988).
Determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch.
La determinación del número de gérmenes dio
después de 48 horas: 4,0 x 10^{6} gérmenes aerobios mesófilos/ml
de suspensión.
Determinación del número de gérmenes con el
contador de partículas Cellfacts
1. Agar en caldo tríptico de soja
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Gérmenes aerobios mesófilos/ml de suspensión (máximo |
| extracción | necesario en horas | de pico en partículas de 1 a 2,5 \mum de diámetro) | |
| 1 | Agar en caldo | 2 | 4,22 x 10^{6} |
| tríptico de soja |
| Muestra | Agente de | Tiempo de determinación | Hongos/ml de suspensión (máximo de pico en partículas |
| extracción | en horas | de 5 a 9 \mum de diámetro) | |
| 1 | Agar en caldo | 12 | < 10^{2} |
| tríptico de soja |
La muestra analizada según el procedimiento de
acuerdo con la invención dio una concordancia extraordinaria con
la determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch, determinado después de 48 horas de tiempo de
incubación.
La muestra se encuentra respecto a la
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch perfectamente dentro del margen de confianza.
Con margen de confianza se entiende en esta
invención la desviación de + - 0,5 log_{10} de determinaciones
del número de gérmenes individuales como se resolvió por parte de
PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue,
Londres NW9 5HT, Reino Unido, distribución 070, páginas 6 y 7 y
apéndice 1, fecha de distribución 16 de Noviembre de 1998, fecha
del informe 30 de Diciembre de 1998.
7º
Ejemplo
Se mezclan bien 3 ml de un lodo acuoso al 71,5%
en peso de mármol natural, molido (90% en peso de partículas <
2 \mum, 65% en peso de partículas < 1 \mum), dispersados con
0,5% en peso de un poli(acrilato de sodio) disponible en el
mercado, en un frasquillo estéril con 3 ml del agente de extracción
respectivo. Después de 10 minutos de centrifugación a 800 g se
aísla la fase clara que queda en la parte superior y se analiza con
el Cellfacts. El análisis se realiza de modo que se miden al
instante tras la centrifugación (tiempo t_{oh}), después de 2
horas (tiempo t_{2h}), 4 horas (tiempo t_{4h}), después de 7
horas (tiempo t_{7h}), después de 17 horas (tiempo t_{17h}), y
después de 24 horas (tiempo t_{24h}) de tiempo de incubación el
número de partículas en el equipo Cellfacts. La temperatura de
incubación fue de 30ºC. Representando el número de partículas
frente al diámetro de estas partículas, se puede determinar según
tiempos de incubación determinados de la fase clara si se
encuentran presentes células con vida (elevación del pico) y de qué
tipo de microorganismos se trata (bacterias, levaduras u hongos).
Después de un tiempo de incubación en el que el crecimiento
transcurre exponencialmente se determinó mediante intrapolación
hasta el tiempo t_{oh} la presencia de gérmenes original de la
suspensión. En comparación con esto se llevó a cabo una
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch ("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen",
Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, párrafo 7.01,
edición 1985, revisión 1988).
1. Agua destilada
2. Solución de NaCl al 0,9% en peso en agua
destilada, sal inorgánica
3. Solución de poli(monolaurato de
oxietilen-sorbitán) (2 mol de
poli-oxietileno) al 0,8% en peso, agente humectante
orgánico
4. Solución nutritiva orgánica al 3% en peso
(agar en caldo tríptico de soja)
Determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch.
La determinación del número de gérmenes dio
después de 48 horas: 5,0 x 10^{4} gérmenes aerobios mesófilos/ml
de suspensión.
Determinación del número de gérmenes con el
contador de partículas Cellfacts
| Muestra | Agente de extracción | Tiempo de determinación | Gérmenes aerobios mesófilos/ml de suspensión |
| necesario en horas | (máximo de pico en partículas de 1 a 2,5 \mum | ||
| de diámetro) | |||
| 1 | Agua destilada | 17 | 2,0 x 10^{3} |
| 2 | Solución de NaCl | 18 | 1,6 x 10^{3} |
| 3 | Poli(monolaurato de | 24 | > 10^{2} |
| oxietilensorbitán) | |||
| 4 | Solución nutritiva | 7 | 5,6 x 10^{4} |
| orgánica |
\vskip1.000000\baselineskip
De las muestras 1 a 3 se deduce claramente que
por una parte el tiempo de incubación necesario es muy largo hasta
que se pueda conseguir un resultado y el resultado es además falso
(comparación: determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch).
En las muestras 1 a 3 se encuentra la desviación
respecto a la determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch bastante fuera del margen de
confianza.
Las muestras 1 y 2 no contienen sustancia que
actúa como sustancia nutritiva, orgánica alguna. La muestra 3
contiene una sustancia orgánica que no sirve como sustancia
nutritiva sino como sustancia inhibitoria. Ya en el ejemplo
4-1 se hubo de reconocer con el uso de Tween 20
respecto al ejemplo 4-2 una cierta inhibición
mediante Tween 20. La sustancia que sirve como solución nutritiva,
orgánica usada de acuerdo con la invención podría impedir sin
embargo un resultado falso en el ejemplo 4-2. ¡En el
ejemplo 7-3 sin embargo se encuentra un resultado
falso fatal respecto al ejemplo 7-4!.
La muestra 4 analizada según el procedimiento de
acuerdo con la invención da una concordancia extraordinaria con la
determinación del número de gérmenes según el Schweizerischen
Lebensmittelbuch.
En la muestra 4 se encuentra la desviación
respecto a la determinación del número de gérmenes según el
Schweizerischen Lebensmittelbuch perfectamente dentro del margen de
confianza.
Con margen de confianza se entiende en esta
invención la desviación de + - 0,5 log_{10} de determinaciones
del número de gérmenes individuales como se resolvió por parte de
PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue,
Londres NW9 5HT, Reino Unido, distribución 070, páginas 6 y 7 y
apéndice 1, fecha de distribución 16 de Noviembre de 1998, fecha
del informe 30 de Diciembre de 1998.
| Composición de medios nutritivos preferidos | ||
| Caldo tríptico de soja | ||
| Bacto-triptona | 17,0 g/l | |
| Bacto-soitona | 3,0 g/l | |
| Bacto-dextrosa | 2,5 g/l | |
| Cloruro de sodio | 5,0 g/l | |
| Fosfato de dicalcio | 2,5 g/l | |
| Base de caldo TAT | ||
| Bacto-triptona | 20,0 g/l | |
| Azolectina | 5,0 g/l | |
| Caldo nutritivo | ||
| Bacto-extracto de ternera | 3,0 g/l | |
| Bacto-peptina | 5,0 g/l | |
| Pepsina de caseína, de digestión tríptica | ||
| Pepsina de caseína | 1,0 g/l | |
| Cloruro de sodio | 1,8 g/l | |
| Agar para recuento en placa | ||
| Bacto-triptona | 5,0 g/l | |
| Extracto de levadura | 2,5 g/l | |
| Bacto-dextrosa | 1,0 g/l | |
| Agar nº 1 | 9,0 g/l | |
| Etilenglicol | ||
| Etilenglicol | 1,0 g/l | |
| Azolectina | 5,0 g/l | |
| Cloruro de sodio | 1,8 g/l | |
| Glicerina | ||
| Glicerina | 1,0 g/l | |
| Azolectina | 5,0 g/l | |
| Cloruro de sodio | 1,8 g/l |
Claims (16)
1. Procedimiento para la determinación
cuantitativa y/o cualitativa de contaminación microbiana de
suspensiones, emulsiones o dispersiones que contienen minerales y/o
pigmentos y/o cargas y/o materiales de fibras,
caracterizado porque
- a)
- una muestra de las suspensiones, emulsiones o dispersiones se mezcla con una o varias sustancias orgánicas que son degradadas por microorganismos, que actúan como agente de separación entre los microorganismos y los minerales, pigmentos, cargas y/o materiales de fibras, en el que la cantidad en sustancia biodegradable se elige de modo que es posible una separación de los microorganismos y los minerales, cargas, pigmentos y/o materiales de fibras, y de forma opcional se incuba para el aumento del número de microorganismos,
- b)
- se centrifuga la mezcla así obtenida, para separar en su mayor parte los minerales y/o cargas y/o pigmentos y/o materiales de fibras de los microorganismos, con lo que los microorganismos se encuentran en la fase superior, y
- c)
- el sobrenadante acuoso obtenido mediante la centrifugación se somete preferiblemente a una incubación o varias incubaciones, para multiplicar el número de microorganismos en este sobrenadante, y
- d)
- se determina el número y/o tamaño y/o tipo de microorganismos en el sobrenadante.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque en cuanto a la contaminación microbiana
se trata de bacterias y/o hongos y/o levaduras.
3. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la sustancia
orgánica degradable por microorganismos se añade en forma de un
medio nutritivo para los microorganismos.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado porque el medio nutritivo contiene una fuente
de carbono, nitrógeno, fosfato y/o azufre así como de forma opcional
sustancias minerales, sustancias de crecimiento y/o vitaminas.
5. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
centrifugación se realiza de 100 a 1.500 g, con especial
preferencia de 600 a 1.000 g.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
temperatura de incubación es de 20 a 37ºC, preferiblemente de 28 a
34ºC y lo más ventajosamente de 31,6 a 32,5ºC.
7. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se usan
aquellos medios nutritivos que hacen posible el crecimiento
selectivo de los gérmenes que se determinen.
8. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque, como
medio nutritivo se usa agar en caldo triptona azolectina/Tween 20
(TAT) y/o solución de glucosa y/o peptona/caseína y/o caldo
nutritivo, preferiblemente agar en caldo tríptico de soja.
9. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
concentración del medio nutritivo para microorganismos es
preferiblemente de 0,1 a 10% en peso, de forma ventajosa de 2 a 5%
en peso, lo más ventajosamente del 3% en peso.
10. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
suspensión, emulsión o dispersión contiene además polímeros
adicionales en forma coloidal.
11. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
determinación cualitativa y/o cuantitativa de bacterias y/o hongos
y/o levaduras se realiza conjuntamente en un análisis.
12. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la etapa
de centrifugación se realiza durante un periodo de tiempo de 1 a 30
minutos, preferiblemente de 2 a 15 minutos, con especial
preferencia de 10 minutos.
13. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la fase
obtenida con la centrifugación que presenta microorganismos se
analiza en cuanto a la cantidad de microorganismos por medio de un
procedimiento de análisis de tamaño de partícula.
14. Procedimiento según la reivindicación 13,
caracterizado porque se analizan los tamaños y número de
microorganismos, de modo que se succiona la muestra de
microorganismos con ayuda de un vacío por medio de un poro de
medida con longitud y diámetro definidos, en el que entre la entrada
y salida del poro se aplica una tensión, y en el paso de los
microorganismos por el poro se mide un pulso de corriente que es
directamente proporcional al volumen del microorganismo y el número
de pulsos de corriente es proporcional al número de
microorganismos.
15. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la fase
obtenida con la centrifugación que presenta microorganismos se
analiza en cuanto a la cantidad de microorganismos mediante
determinación del ATP producido por los microorganismos.
16. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la
contaminación microbiana de dispersiones, emulsiones y suspensiones
se inspecciona en la industria de transformación de metales, en la
industria de pigmentos y papel así como en las aguas de proceso de
la industria del papel.
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