NO328953B1

NO328953B1 - Fremgangsmate for kvantitativ og /eller kvalitativ bestemmelse av en mikrobiell forurensning av suspensjoner, emulsjoner eller dispersjoner som inneholder mineraler og/eller pigmenter og/eller fyllstoffer og/eller fibermaterialer.

Info

Publication number: NO328953B1
Application number: NO20013506A
Authority: NO
Inventors: Matthias Buri; Patrick Schwarzentruber
Original assignee: Omya Development Ag
Priority date: 1999-02-02
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2010-06-28
Also published as: WO2000046392A2; MXPA01007694A; NO20013506L; HU228078B1; KR100790011B1; NZ513627A; DE50011446D1; EP1149172B1; SK10342001A3; CO5241363A1; EP1149172A2; DE19904057C2; TR200102213T2; US6627413B1; KR20010103001A; HUP0105360A3; AU2109100A; BR0007965B1; BR0007965A; NO20013506D0

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse av mikrobielle forurensninger i vandige suspensjoner, emulsjoner eller dispersjoner, som inneholder mineraler og/eller pigmenter og/eller fyllstoffer og/eller fibermaterialer, eventuelt i kombinasjon med polymerer i kolloidal form.

Bestemmelse av mikrobiell forurensning og hygieniske kontroller av vandige suspensjoner ved hjelp av vanlig kjente fremgangsmåter, er i alt vesentlig avhengig av oppformeringskapasiteten på den eller de mikroorganismer som skal påvises. Naturlig nok vil den tidsperiode som er nødvendig for å utføre disse fremgangsmåter variere fra 24 timer til flere døgn. Disse tidsperioder er for lange i mange sammenhenger, og man får tilveiebrakt resultatene for sent til å gripe inn på en kontrollerende måte i produksjonsprosessene. Spesielt viktig er problemet med å gjennomføre kontroller før en utfører en transport, og dette vil igjen kreve fremgangsmåter som er karakterisert ved korte bestemmelsesintervaller.

Hovedproblemet ved vanlige mikrobiologiske analyser for påvisning av aerobe mesofile mikrober, såsom en platetelling eller Easicult, er således deres lange inkubasjonsperiode på opptil 48 timer. Ved hjelp av disse fremgangsmåter er det umulig å oppnå en bedømmelse og deretter en bestemmelse av mikrobetallet tidligere enn etter et forløp på to døgn. I tillegg er det flere andre effekter som må avveies, såsom næringsmedier, delvis oksygentrykk (aerob/anaerob), selektivitet, pH og mange andre faktorer.

Det er derfor ofte umulig å bestemme mikrobetallet i visse produkter, såsom pigmentsuspensjoner, før disse sendes til forbrukerne eller kundene, og derved ha mulighet for å gripe inn på en kontrollerende måte ved å tilsette biosidale stoffer. På grunn av de lange transporttidene som er nødvendig, dvs. opptil seks uker ved oversjøisk skipstransport eller jernbane, så kan pigmentsuspensjonen eventuelt bli ødelagt eller bli ustabil. Hvite pigmentsuspensjoner kan utvikle en grå farge og dessuten utvikle lukt. Til dags dato er en forebyggende overdose av biocidale stoffer i pigmentsuspensjonen vært den eneste mulighet for å utelukke ødeleggelse, og dette er en kostbar metode, sterk sløsing med ressurser og er dessuten økologisk forkastelig. Videre er det nødvendig med to forskjellige fremgangsmåter eller tilnærminger for å analysere både aerobe mesofile mikrober og sopp. Videre er det nødvendig å fremstille seriefortynninger, noe som nødvendigvis øker antallet analyser.

Vanlige fremgangsmåter for bestemmelse av mikrober i papir- og pigmentindustrien er f.eks. beskrevet i «Schweizerisches Lebensmittelbuch», kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgaven, 1988 revidert versjon, «Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen», og i «Schweizerisches Lebensmittelbuch», kapittel 56, seksjon 7.22, 1985 utgaven, 1988 revidert utgave, «Bestimmung von Pilzen». Generelt kan det angis at før en kan utføre en bestemmelse i hvert enkelt tilfelle er det nødvendig med en inkubasjonsperiode på ca. 48 timer.

CellFacts<®> partikkelanalysatoren og fremgangsmåten er utviklet av Microbial Systems Company, Ltd. Mer detaljert informasjon kan oppnås fra Labor flash 9/96, Zeitung mit Leserdienst fur Labor und Forschung, Ott Verlag + Druck AG, CH-3607 Thun, Sveits. Det har således vært nevnt at CellFacts-analysatoren også kan brukes for å utføre bestemmelser av mikrobetall i kalsiumkarbonatsuspensjoner. Eksperimenter som imidlertid er utført i søkerens laboratorium har vist at bestemmelse av denne type på den måten som er beskrevet av fabrikkanten, er umulig eller i beste fall helt unøyaktig.

Prinsippet bak den måling som utføres ved hjelp av CellFacts-analysatoren er basert på målingen av bakterier, sopp og gjær i form av partikler i et elektrisk felt, hvor antallet partikler bestemmes ved en intervallinkubering av prøvene og en etterfølgende måling av et eventuelt økt partikkeltall, og i forbindelse med eksponentiell vekst, ved en ekstrapolering til to. Dette måleprinsippet er også effektivt ved måling av «et lavt» tall av «fremmede partikler» med samme eller lignende størrelse som bakterie, sopp og gjærceller. I de tilfeller hvor suspensjonene og emulsjonene inneholder en viss mengde av «fremmede partikler» såsom mineraler, fyllstoffer og/eller pigmenter, dvs. > 1 vekt%, så vil antallet av inerte «fremmede partikler» som er tilstede med samme størrelse som mikroorganismene, dvs. fra 0,5-20 u.m, så vil basisverdien to, være for høy til å muliggjøre en påvisning av en ytterligere økning av mikrobene med en oppformering i inkubatoren innenfor en periode på < 10 timer. Således er CellFacts-analysatoren ikke i stand til å utføre en tilstrekkelig nøyaktig måling, og fabrikkanten krever en fortynning av startvæsken for å sikre en anvendbarhet.

Med en basisverdi på 10 Q partikler/ml er det umulig signifikant å påvise en økning på 10<3> partikler/ml ved hjelp av CellFacts-analysatoren. Den fortynning som er nødvendig på grunn av nærværet av de «fremmede partiklene», er imidlertid for høyt, slik at fortynningen av reproduserende organismer som selvsagt også blir fortynnet av samme størrelsesorden, ikke lenger er signifikant, hvoretter de oppnådde resultatene er feilaktige. Videre kan «fremmede partikler» med en diameter på > 20 u.m tiltette målecellen som har en diameter på bare 30 u.m. Disse «fremmede partikler» kan f.eks. være av mineralsk opprinnelse, f.eks. kalsiumkarbonat, syntetisk, eller organisk, av polymertypen, såsom polystyrenakrylatdispersjoner, eller av naturlig organisk type, såsom stivelsesløsninger eller hemicellulose og/eller cellulosefibrer, eller en kombinasjon av de ovennevnte partikler, f.eks. slik det er tilstede på forskjellige steder under den syklus som brukes for fremstilling av papir.

Teknikkens stand er også beskrevet i EP 0816512 Al.

Det er en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en rask og meget nøyaktig og lett gjennomførbar fremgangsmåte for kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse av mikrobiell forurensning av vandige suspensjoner, emulsjoner eller dispersjoner, som inneholder mineraler og/eller pigmenter og/eller fyllstoffer og/eller fibermaterialer, og hvor nevnte fremgangsmåte unngår de ovenfor angitte ulemper ved tidligere kjente fremgangsmåter.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan denne hensikt oppfylles ved hjelp av en fremgangsmåte som beskrevet generelt i krav 1, karakterisert ved at en prøve av suspensjonene, emulsjonene eller dispersjonene, etter tilsetning av ett eller flere organiske stoffer som kan nedbrytes av mikroorganismene og eventuelt etter en etterfølgende inkubering, sentrifugeres for å skille mikroorganismene fra mineralene og/eller fyllstoffene og/eller pigmentene og/eller fibermaterialene, hvoretter antallet og/eller størrelsen og/eller typen av mikroorganismene i den vandige supernatantfasen bestemmes etter én eller flere inkuberinger.

Foretrukne utførelser av den foreliggende oppfinnelse vil fremgå fra de etterfølgende krav såvel som den etterfølgende beskrivelse og eksemplene.

Over mange år har kvantitative og kvalitative bestemmelser av mikroorganismer vært utført ved hjelp av tidligere kjente fremgangsmåter. Bestemmelsen av mikrobiell forurensning er imidlertid spesielt vanskelig i de tilfeller hvor det foreligger en høy konsentrasjon av andre faste partikler såsom mineraler, pigmenter, fyllstoffer og/eller fibermaterialer i den prøven som skal undersøkes. Ettersom disse «fremmede partiklene» ofte har samme størrelse som mikroorganismene generelt, er det bare mulig å minimalisere antallet av slike «fremmede partikler» ved å utføre store fortynninger. Samtidig med dette og helt uunngåelig vil disse sterke fortynningene også redusere antallet av forurensende mikroorganismer, og følgelig vil lange inkubasjonsperioder være nødvendig for å øke antallet av mikroorganismer ved hjelp av oppformering til en grad eller et nivå som muliggjør en sikker påvisning.

Det har følgelig vært et behov for å frembringe eller å skape en ny fremgangsmåte av den typen som er nevnt ovenfor, som gir reproduserbare og holdbare resultater med hensyn til antall, størrelse og/eller type av mikroorganismer i den prøven som skal undersøkes, innenfor et vesentlig kortere tidsrom.

Overraskende og uventet har en nå oppdaget at det er mulig å skille mikroorganismene fra inerte materialer («fremmede partikler»), ved å tilsette nedbrytbare organiske stoffer til prøven og deretter utføre en sentrifugering. Vanligvis vil mikroorganismene fortrinnsvis feste seg til overflaten av mineralene, pigmentene, fyllstoffene og/eller fibermaterialene, og dette gjør det vanskelig å løsne dem fra overflaten på partiklene. Skjønt de «fremmede partiklene» kan sedimenteres eller skilles ut ved enkel sentrifugering, så vil også mikroorganismene følge disse partiklene fordi de fortrinnsvis som nevnt ovenfor, fester seg til partiklene, og den andel av mikroorganismene som forblir i supernatanten gir følgelig et ukorrekt eller helt feilaktig bilde med hensyn til graden av forurensning av nevnte mikroorganismer.

Det har nå blitt vist at tilsetningen av biologisk nedbrytbare organiske stoffer

overraskende gjør det mulig å skille mikroorganismene og mineralene, pigmentene, fyllstoffene og/eller fibermaterialene. Det er foretrukket at det organiske stoffet som kan brytes ned av mikroorganismene, er et næringsmedium av den type som brukes under dyrkningen av mikroorganismene. Overraskende har man funnet at dette næringsmediet virker som et separasjonsmiddel mellom mikroorganismene og de fremmede partiklene, og det er derfor for første gang mulig å skille mellom de to elementene uten videre å påvirke de etterfølgende trinn av mikroorganismeanalysen. Stoffer som ikke lar seg biologisk nedbryte eller hvor den biologiske nedbrytningen er vanskelig, vil være et problem fordi skjønt mikroorganismene blir skilt fra de inerte partiklene, så vil stoffene samtidig kunne virke som inhibitorer på resten av mikroorganismene og følgelig føre til unøyaktige resultater.

I den foreliggende fremgangsmåten blir ikke bare ett prosesstrinn, nemlig fortrynningstrinnet, er utelatt, men i tillegg kan inkubasjonsperioden bli sterkt redusert. Videre er det slik at en ikke bare tilsetter et separasjonsmiddel, men separasjonsmidlet virker samtidig som en næringsløsning, som kan brukes for en optimal oppformering av den mikroorganisme som skal undersøkes, og i en foretrukket utførelse, blir denne valgt slik at den er spesifikk for den spesielle mikroorganisme som skal testes eller undersøkes, f.eks. bakterier, sopp eller gjær.

Det var bare ved å tilsette et organisk stoff som kan nedbrytes av mikroorganismene, fortrinnsvis i form av en næringsløsning eller et medium henholdsvis, og ved å innføre et sentrifugeringstrinn, at en har kunnet oppfylle hensikten ifølge foreliggende oppfinnelse. En reduksjon av analysetiden eller endog muligheten for å kunne utføre en analyse i det hele tatt, er blitt oppnådd, fordi den prøve som skal undersøkes inneholder et lite antall «fremmede partikler». Videre er det mulig å starte et mindre antall og en mindre økning med hensyn til mikrobiologiske partikler over tid enn når man har prøver med en høyere basisverdi, dvs. et høyere antall «fremmede partikler».

Ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåten kan vandige suspensjoner, emulsjoner og dispersjoner undersøkes, og disse kan blant andre stoffer inneholde mineraler, pigmenter, fyllstoffer og/eller fibermaterialer, såsom cellulosefibrer, og kan dessuten ytterligere inneholde polymerer såsom naturlige, syntetiske eller semisyntetiske polymerer i kolloidal form. Eksempler på slike polymerer er: styrenbutadien, styrenakrylat, melaminharpikser, formaldehydureaharpikser, stivelse, karboksymetylcellulose.

Fortrinnsvis er de prøver som skal undersøkes avledet eller fremstilt i papirprosessindustrien. Andre områder hvor nevnte fremgangsmåte kan anvendes er i pigmentindustrien og i metallbearbeidingsindustrien.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tar man ut en prøve av de suspensjoner, emulsjoner eller dispersjoner som skal testes eller undersøkes. Generelt vil mengden på prøven variere fra 0,5-20 ml, men en kan selvsagt også ta mindre eller større mengder. Mengden av den prøve som tas er imidlertid ikke viktig for at foreliggende fremgangsmåte kan gjennomføres med godt resultat.

Etter uttak blir prøven tilsatt og blandet med organiske stoffer som kan nedbrytes av mikroorganismene. Mengden av bionedbrytbare organiske stoffer som tilsettes prøven vil være fra 0,5-50 ml av det bionedbrytbare stoffet pr. ml av prøven.

Forholdet mellom prøvevolum til volum av bionedbrytbart stoff er avhengig av den opprinnelige konsentrasjonen på prøven og konsentrasjonen av bionedbrytbare stoffer i løsning. Forholdet justeres slik at mengden av bionedbrytbare stoffer er tilstrekkelig stort til å muliggjøre en separasjon av mikroorganismene og mineralene, fyllstoffene, pigmentene og/eller fibermaterialene, foruten eventuelt også de polymerer som foreligger i kolloidal form. Det optimale forholdet mellom prøvevolumet og volumet på det bionedbrytbare stoffet må bestemmes i hvert enkelt tilfelle og dette kan lett utføres ved vanlig kjent manuell eksperimentering.

Vanligvis vil konsentrasjonen på den løsningen som inneholder det bionedbrytbare stoffet, velges slik at man oppnår et forhold mellom prøveløsning til den løsning som inneholder det bionedbrytbare stoffet, på 1:0,1 til 1:100. Det optimale forholdet er sterkt avhengig av konsentrasjonen og sammensetningen på prøveløsningen. Pigment og/eller fyll sto ffsuspensj onen som har et innhold av faste stoffer over 65 vekt%, blir vanligvis fortynnet i et forhold på 1:2 til 1:10, fortrinnsvis 1:3. Hvis innholdet av faste stoffer er mindre enn 65 vekt%, vil fortynningen vanligvis bli utført i et forhold fra 1:0,1 til 1:1.1 visse tilfeller, spesielt hvis en forventer meget høy forurensning, kan fortynningen utføres i forhold til 1:10 til 1:100. Den valgte fortynningsfaktoren må velges ut på bakgrunn av den etterfølgende bedømmelse av forurensningen, eller må velges ut spesifikt på bakgrunn av innledende resultater.

De bionedbrytbare organiske stoffene innbefatter spesielt en gruppe næringsmedia som er spesifikk for en spesiell mikroorganisme som skal undersøkes. Fortrinnsvis bør næringsmediet inneholde en kilde for karbon, nitrogen, fosfat og/eller svovel, såvel som andre mineraler, vekstfaktorer og/eller vitaminer. Andre stoffer kan tilsettes næringsmediet hvis de er nødvendig for å få en optimal vekst av mikroorganismene. Det er i det følgende beskrevet foretrukne media som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eventuelt etter at en har tilsatt næringsmediet kan en utføre ett eller flere inkuberingstrinn for å øke antallet av mikroorganismer i prøven. Dette kan være spesielt fordelaktig for en etterfølgende kvalitativ analyse. I en foretrukket utførelse av oppfinnelsen er imidlertid en slik inkubering utelatt før en utfører en sentrifugering, noe som fører til markant tidsreduksjon.

For å skille mikroorganismene fra mineralene, fyllstoffene, pigmentene og/eller fibermaterialene utføres det en sentrifugering etter at en har tilsatt næringsmediet og eventuelt utført et inkuberingstrinn. Sentrifugeringen utføres på en slik måte at man fjerner mesteparten av mikroorganismene, dvs. mer enn 50 %, fra de «fremmede partiklene», dvs. mineraler, fyllstoffer, pigmenter, polymerer og fibermaterialer. Sentrifugeringen må være så effektiv at mikroorganismene akkumuleres eller samles i den øvre fasen, mens de fremmede partikler blir sedimentert. For dette formål bør sentrifugeringen utføres ved 100-1500 g, fortrinnsvis 200-1200 g, og spesielt foretrukket fra 600-1000 g. Gravititetsområdet justeres avhengig av de mineraler, fyllstoffer, pigmenter og fibermaterialer som skal skilles ut, eller avhengig av den mikroorganisme som skal skilles ut henholdsvis.

Den optimale sedimentasjonsindeksen kan lett bestemmes ved hjelp av eksperimenter. Selve sentrifugeringen utføres i et tidsrom fra 1-30 min., fortrinnsvis 2-15 min. og spesielt fra 5-10 min. Den optimale sentrifugeringstiden kan lett bestemmes av fagfolk ved hjelp av laboratorieeksperimenter.

Som mineralene og/eller fyllstoffene og/eller pigmentene fortrinnsvis: forbindelser som inneholder elementer fra den andre og/eller tredje hovedgruppe og/eller fjerde sidegruppe i det periodiske system av grunnstoffene, da spesielt kalsium og/eller silisium og/eller aluminium og/eller titan og/eller barium og/eller organiske pigmenter.

Som mineralene, fyllstoffene og pigmentene bruker en fortrinnsvis mineraler og/eller fyllstoffer og/eller pigmenter som inneholder kaolin og/eller aluminiumhydroksid og/eller titanhydroksid og/eller bariumsulfat og/eller hule polystyrenkuler og/eller formaldehydharpiks og/eller kalsiumkarbonat, da spesielt naturlige kalsiumkarbonater og/eller marmor og/eller kalk og/eller dolomitt og/eller kalsiumkarbonater som inneholder dolomitt og/eller syntetisk fremstilte kalsiumkarbonater, såkalte utfelte kalsiumkarbonater.

Supernatanten som inneholder mikroorganismene blir fjernet, og så brukt direkte i en kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse av den mikrobielle forurensningen. Dette blir fortrinnsvis fulgt av ett eller flere inkuberingstrinn for å øke antallet mikroorganismer i supernatanten. Dette oppformeringstrinnet blir utført ved en inkuberingstemperatur som er gunstig for mikroorganismene, og er selvsagt avhengig av den type mikroorganismer som skal oppformeres. Foretrukne inkuberingstemperaturer ligger i området fra 20-37°C, mer foretrukket 28-34°C, og mest foretrukket 31,5-32,5°C. De inkuberingstemperaturene som er nødvendig i hvert enkelt tilfelle, vil være kjent for fagfolk, og kan enten finnes i monografier eller litteraturen eller kan bestemmes eksperimentelt.

Den totale tid for de individuelle inkuberingstrinn ved inkuberingstemperatur på 30 °C, er opptil 12 timer ved en forurensning som er mindre enn IO<5 >mikroorganismer/ml prøve, opp til 6 timer ved en forurensning på mer enn 10<5 >mikroorganismer/ml prøver, men kan være mindre enn IO<6> mikroorganismer/g prøve, og opptil 3 timer i en suspensjon med et opprinnelig innhold av faste stoffer på fra 60-80 vekt%, og en forurensning på mer enn 10<5> mikroorganismer/ml (ved å bruke tryptisk soyadyrkningsagar).

Summen av de individuelle inkuberingstrinnene ved 30 °C er opptil 2-6 ved en forurensning på mindre en 10<5> mikroorganismer/ml prøve, 2-4 ved en forurensning på mer enn IO<5> mikroorganismer/ml prøve, men mindre enn IO<6> mikroorganismer/g prøve, og 2-3 i en suspensjon med et opprinnelig innhold av faste stoffer fra 60-80 vekt%, og en forurensning på mer enn 10<5> mikroorganismer/ml (ved å bruke tryptisk soyadyrkningsagar).

De individuelle inkuberingstidene ved en inkuberingstemperatur på 30 °C er fra 1-12 timer ved en forurensning på mindre enn 10<5> mikroorganismer/ml prøve, 1-6 timer ved en forurensning på mer enn 10<5> mikroorganismer/ml prøve, men mindre enn IO<6> mikroorganismer/g prøve, og 1-2 timer i en suspensjon med et opprinnelig innhold av faste stoffer fra 60-80 vekt%, og en forurensning på mer enn 10<5 >mikroorganismer/ml (ved å bruke tryptisk soyadyrkningsagar).

Det er flere kjente fremgangsmåter som er tilgjengelige for en kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse henholdsvis, av de således utskilte mikroorganismer. Spesielt foretrukket ifølge foreliggende oppfinnelse er CellFacts<®->analysen eller ATP-metoden. Andre fremgangsmåter er tilgjengelige og velkjente for fagfolk. De foretrukne fremgangsmåter er mer detaljert beskrevet i de følgende eksempler.

Etter at fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er gjennomført kan det utføres en kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av mikroorganismer. En første kvalitativ bestemmelse bestyr en grov differensiering eller en første differensiering mellom gruppene sopp, gjær og bakterier. Hvis CellFacts<®->analysen blir kalibrert med spesifikke mikroorganisme, f.eks. spesifikke bakterier, kan man utføre en ytterligere spesifikasjon innenfor de individuelle undertyper. Den kvalitative analysen, f.eks. ved hjelp av CellFacts<®->metoden, utføres på basis av en første differensiering med hensyn til størrelse eller volum henholdsvis, av en enkelt celle.

Den type næringsmedium som anvendes som separasjonsmiddel, er spesielt avhengig av den mikroorganisme som skal utskilles eller oppformeres. Man bruker fortrinnsvis næringsmedia som muliggjør selektiv vekst av de mikroorganismer som skal bestemmes, og hvis det er mulig, undertrykke veksten av andre mikroorganismer som ikke skal bestemmes. Eksempler på næringsmedia som kan brukes ifølge foreliggende oppfinnelse er tryptonazolektin/Tween 20 (TAT) næringsagar, glukoseløsning, pepton/kaseinnæringsmedium, fortrinnsvis tryptisk soyadyrkningsagar. Sammensetningen av de angitte næringsmedia er gitt i et vedlegg til denne beskrivelsen.

Konsentrasjonen av næringsmediet for mikroorganismene er fortrinnsvis i området fra 0,1-10 vekt%, mer fordelaktig fra 2-5 vekt%, og spesielt fordelaktig ca. 3 vekt%.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse gjør det ikke bare mulig å utføre en kvalitativ, men også en kvantitativ bestemmelse av bakterier, sopp og gjær. I en foretrukket utførelse blir denne analysen utført i ett trinn.

Etter separasjonen av mikroorganismene og mineralene, fyllstoffene, pigmentene og/eller fibermaterialene, dvs. de «fremmede partiklene», så blir det utført ett eller flere, fortrinnsvis to til fem inkuberingstrinn for å øke antallet av de mikroorganismer som er tilstede i supernatanten fra prøven.

Multiple inkuberinger kan utføres med visse mellomrom, dvs. at målingen av forurensningen i hvert enkelt tilfelle blir gjentatt etter tidspunktet to+x. Dette gjør det mulig å begrense inkuberingstiden og inkuberingsintervallene. Ved det tidspunkt en observerer en eksponentiell vekst, kan det utføres en ekstrapolering og beregning tilbake til tidspunkt to. Således kan en høy opprinnelig grad av forurensning resultere i en vekst, som kan observeres og beregnes tidligere, slik at etterfølgende inkuberinger kan utelates.

Inkuberingstiden ved en forurensning på mindre enn 10<5> mikroorganismer/ml prøve er opptil 12 timer, og ved en forurensning på mindre enn IO<6> mikroorganismer/ml opp til 6 timer, i en suspensjon som opprinnelig inneholder fra 60-80 vekt% faste stoffer og har en forurensning på mer enn 10<5> mikroorganismer/ml prøve, opptil 3 timer, og i sistnevnte tilfelle er det foretrukket å bruke tryptisk soyadyrkingsagar. Den inkuberingstid som skal brukes, er avhengig av graden av forurensning med mikroorganismer, og kan ganske enkelt bestemmes av fagfolk ved enkel manuell eksperimentering. Jo lavere den opprinnelige graden av mikrobiell forurensning er i prøven, jo lengre inkuberingstid må velges og vise versa. Den opprinnelige delen av faste stoffer i suspensjonen vil ikke direkte påvirke inkuberingstiden.

Således gjelder foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse av en mikrobiell forurensning av suspensjoner, emulsjoner eller dispersjoner som inneholder mineraler og/eller pigmenter og/eller fyllstoffer og/eller fibermaterialer, kjennetegnet ved

a) at en prøve av suspensjonen, emulsjonen eller dispersjonen blir blandet med én eller flere organiske substanser som er nedbrytbare ved hjelp av

mikroorganismer, som virker som skillemiddel mellom mikroorganismene og

mineralene, pigmentene, fyllstoffene og/eller fibermaterialene, der substansene som er nedbrytbare med mikroorganismer er næringsmedier for mikroorganismer tilsatt i en konsentrasjon på 0,1 - 10 vekt%, og der det valgfritt blir utført en inkubasjon for å forhøye antall av mikroorganismer,

b) den slik oppnådde blanding blir sentrifugert for å separere hoveddelen av mineralene og/eller fyllstoffene og/eller pigmentene og/eller fibermaterialene fra

mikroorganismene, der mikroorganismene befinner seg i den øvre fase, og

c) den vandige supernatanten oppstått ved sentrifugeringen foretrukket blir underkastet én eller flere inkubasjoner, for å forhøye antallet av mikroorganismer i

denne supernatanten, og

d) bestemme antallet og/eller størrelsen og/eller typen av mikroorganismer i supernatanten.

I det følgende vil oppfinnelsen bli mer detaljert forklart med hensyn til sammenlignende eksempler og egne eksempler. Ytterligere modifikasjoner av oppfinnelsen kan gjennomføres av fagfolk på basis av den foreliggende beskrivelse sammen med de etterfølgende krav såvel som på basis av anvendt ekspertise. Oppfinnelsen er ikke begrenset til de foreliggende eksempler.

Bestemmelse av mikroorganismetallet ved å bruke CellFacts<®> partikkelteller Ifølge foreliggende oppfinnelse blir mikroorganismene i suspensjonen og/eller emulsjonen og/eller dispersjonen ved hjelp av vakuum suget gjennom en målepore med en definert diameter. En spenning i volt er påsatt denne poren (kapillær, 30 lim). Fordi intakte celler i en første tilnærmelse kan anses som isolatorer, vil en observere en målbar økning i motstanden når en celle passerer måleporen, og hvor verdien av denne økningen er avhengig av cellevolumet. Strømpulsen vil således være direkte korrelert med volumet. Ved inkubering av prøvene, så vil en kunne måle små forskjeller i veksten av cellene, dvs. at celledelinger fører til en proporsjonal økning av partikkeltallet. Etter en observasjon av den eksponentielle fasen, kan startkonsentrasjonen beregnes ved ekstrapolering, fordi cellevekstfunksjonen er eksponentiell. På grunn av fremstillingen av industrielle prøver ifølge foreliggende oppfinnelse og ved å bruke den ovennevnte fremgangsmåte, så kan bestemmelsestiden for CaC03, talkum og kaolinsuspensjoner såvel som andre materialer (f.eks. kjølemidler, vaskevann, kollodialt suspendert stivelse etc.) ligge i området fra bare 2-12 timer, istedenfor fra 24-48 timer i tidligere kjente fremgangsmåter.

Dette gjør det mulig å gripe inn på et tidligere tidspunkt ved å bruke konserveringsmidler før det skjer en sterk forurensning og/eller ødeleggelse av produktene.

Eksempler på tidligere kjente fremgangsmåter

Eksempel 1) Kalsiumkarbonatsuspensjon

A) Bestemmelsene av antallet mikroorganismer ble utført ifølge Scweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgaven, 1988 revidert versjon, «Bestimmung von aeroben Bakterien und Keimen» og ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.22, 1985 utgaven 1988 revidert versjon, «Bestimmung von Pilzen».

Fremgangsmåte

3 ml av en 77,5 vekt% vandig suspensjon av naturlig oppmalt marmor fra Norge (90 vekt% av partiklene < 2 u.m, 65 vekt% av partiklene < 1 u.m) dispergert med 0,65 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat, ble analysert ifølge fremgangsmåten «Bestimmung von aeroben meophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgaven, 1988 revidert versjon.

Resultat:

Etter en inkuberingsperiode på 48 timer ble antallet mikroorganismer bestemt som: 3,0 x IO<6> aerobe mesofile mikroorganismer/ml suspensjon. Ingen gjær ble påvist i det næringsmedium som ble brukt for de aerobe mesofile mikroorganismene. Ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.22, 1985, 1988 revidert versjon, «Bestimmung von Pilzen», ble det påvist < IO<2> sopp/ml. B) Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts partikkelteller.

Fremgangsmåte

3 ml av en 77,5 vekt% vandig suspensjon av naturlig malt marmor fra Norge (90 vekt% av partiklene < 2 u.m, 65 vekt% av partiklene < 1 u.m) dispergert ved 0,65 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat av samme type som brukt i eksempel IA), ble pipettert inn i en steril kolbe. Prøven ble tilsatt 3 ml v en 3 vekt% TAT mediumsbase/Tween 20 næringsløsning og analysert ved hjelp av CellFacts. Analysen ble utført umiddelbart for derved å kunne måle antallet partikler i CellFacts-instrumentet (tot). Ettersom antallet partikler var for høyt i instrumentet, så krevet dette en fortynning av prøven. Etter at det var utført en fortynning på 1:10000, var partikkelkonsentrasjonen tilstrekkelig lav til å bli akseptert av instrumentet, og en kunne bestemme en basisverdi (tot). Etter en inkuberingstid på 2 timer (tid t2t), 4 timer (tid t4t), etter 6 timer (tid t6t), og etter 12 timer (tid ti2t) ble antall partikler igjen bestemt i CellFacts-elementet. Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette antallet partikler mot partikkeldiameteren, var det mulig å bestemme nærværet av levende celler («toppforstørrelse», y-aksen), og type av mikroorganismer, f.eks. bakterier, gjær eller sopp (midlere partikkeldiameter 0, x-akse) etter de angitte inkuberingstider av den klare fasen.

Etter en inkuberingstid på 12 timer ble den opprinnelige forurensningen av suspensjonen beregnet ved å ekstrapolere seg tilbake til tidspunktet for tidspunkt (tot). Som en referanse brukte en resultatet fra eksempel IA), dvs. den bestemmelse av antallet mikroorganismer som utført ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch.

(«Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgaven, 1988 revidert versjon.

Resultat:

Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts partikkelteller.

1. Tryptisk soyadyrkingsagar

Det fremgår av eksempel IA) og IB) at ved å bruke tidligere kjente fremgangsmåter, er det umulig å utføre en bestemmelse av bakterier, sopp og gjær i ovennevnte suspensjoner ved hjelp av CellFacts-instrument, og spesielt at tallet < 10 mikroorganismer/ml er et fullstendig unøyaktig resultat. Videre kan det angis at bestemmelsen ifølge den fremgangsmåte som er angitt i Schweizerischs Lebensmiddelbuch, krever 48 timer.

Antagelig vil den prøvefortynning som er nødvendig for at CellFacts-instrumentet skal virke, så vil også de tilstedeværende mikroorganismer bli fortynnet til under påvisningsgrensen.

Ved å utføre bestemmelsen ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch, så vil varigheten av analysen være 48 timer. C) Bestemmelse av antall mikroorganismer ved hjelp av ATP-måling.

Fremgangsmåte'

3 ml av prøven fra eksempel IA, 77,5 vekt% vandig suspensjon av naturlig malt marmor fra Norge (90 vekt% av partiklene < 2 u.m, 65 vekt% av partiklene < 1 u.m) dispergert med 0,65 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat, ble pipettert over i en steril kolbe. Prøven ble tilsatt 3 ml av e 3 vekt% TAT mediumbase/Tween 20 næringsløsning og analysert ved hjelp av BioOrbit luminometeret 1253. Analysen ble utført umiddelbart for derved å måle den lysmengde som ble frigjort ved ATP i BioOrbit luminometeret 1253 (tid tot). I tillegg ble det utført en måling på en prøve etter å ha utført en 1:10000 fortynning. På denne måten finner man i hvert enkelt tilfelle bestemt en basisverdi (tot). Etter inkuberingstider på 4 timer (tid t4t), etter 7 timer (tid t7t), og etter 17 timer (tidnt), ble det utført målinger av lysintensiteten i BioOrbit 1253 luminometeret. Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette lysintensiteten ved de respektive inkuberingstidspunkter mot inkuberingstiden, er

det mulig å påvise nærværet av levende celler (økende lysintensitet over tid). Etter en inkuberingstid med nesten eksponentiell vekst, kan en bestemme forurensningen av suspensjonen ved å sammenligne utviklingen på kurvene for individuelle prøver. På denne måten kan en få en semikvantitativ distinksjon mellom «ingen vekst», «svak vekst» og «sterk vekst».

Fremgangsmåte ved målingen i luminometeret 1253

a) Først ble 100 u.1 av hver prøve fremstilt som beskrevet ovenfor, pipettert over i en luminometerkyvette. b) Til nevnte kuvette ble det tilsatt 100 u.1 av ATP-frigjørende reagens, kuvetten ble ristet og hensatt ett minutt slik at ATP kan fjernes ved ekstraksjon. c) Etterpå ble 500 u.1 AMR-reagens tilsatt og blandet med innholdet ved risting. d) Deretter ble kuvetten ført inn i målecellen og det ble utført avlesninger av lysemisjonen.

Referanse: Brukermanualen for BioOrbit luminometeret versjon 3.0, mai 1995 såvel som applikasjonsnote 20 fra BioOrbit OY company, FIN 20521 Turku, Finland.

Resultat:

Etter 17 timer kunne en ikke observere noen forskjeller mellom de individuelle inkuberingstider ved hjelp av denne tidligere kjente fremgangsmåten, dvs. en kunne da ha antatt at suspensjonen ikke var forurenset. Ettersom imidlertid den samme suspensjonen var blitt brukt i eksempel IA) (fremgangsmåte ifølge Scweizerisches Lensmittelbuch), og ettersom den fremgangsmåten ble brukt i dette eksempel gir et resultat for 3 x IO6 mikroorganismer/ml, så er det innlysende at resultatet fra målingene i eksempel 1C) er feilaktige. I praksis ville dette kunne få fatale konsekvenser, f.eks. ved matvareforgiftning eller ødeleggelse av produkter.

Ved å bruke tidligere kjente fremgangsmåter er det umulig å måle bakterier, sopp og gjær i de ovennevnte suspensjoner.

Den høye partikkelkonsentrasjonen i den opprinnelige suspensjonen resulterte i en fullstendig lysabsorpsjo av den mengde lys som var frigjort av ATP i suspensjonen, og prøvefortynningen i denne fremgangsmåten førte også til en fortynning av antallet tilstedeværende mikroorganismer til under påvisningsgrensen for metoden.

O ppfinneriske eksempler:

Eksempel 2) Kalsiumkarbonatsuspensjon. analyseinstrument CellFacts måleinstrument

Metode

3 ml prøver av en 77,5 vekt% vandig suspensjon av naturlig malt marmor fra Norge (90 vekt% av partiklene < 2 u.m, 65 vekt% av partiklene < 1 u.m) dispergert i 0,65 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat, ble pipettert over i separate sterile kolber. En prøve blir tilsatt 3 ml av en 3 vekt% TAT mediumbase/Tween 20 næringsløsning, mens den andre prøven med 3 ml av en 3 vekt% tryptisk soyanæringsløsning. Etterpå ble begge prøvene blandet i 20 sekunder og så sentrifugert. Etter en sentrifugering på 10 minutter ved 800 g ble en klar supernatantfase isolert og analysert ved hjelp av CellFacts. Analysen ble utført ved å måle antall partikler i CellFacts-instrumentet umiddelbart etter sentrifugeringen (tid tot), etter inkuberingstider på 2 timer (tid t2t), 4 timer (tid Ut) og etter 6 timer (tid t6t). Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette antall partikler mot partikkeldiameteren er det mulig å påvise nærværet av levende celler (toppforstørrelse) og type av mikroorganismer (bakterier, gjær og sopp) eter spesielle inkuberingstider av den klare fasen. Etter en inkuberingstid med eksponentiell vekst, ble den opprinnelige forurensningen av suspensjonen bestemt ved å ekstrapolere seg tilbake til tid tot. Som en sammenligning ble det utført en bestemmelse av antall mikroorganismer slik som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch («Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgave, 1988 revidert versjon).

Resultater:

Bestemmelse av antall mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Bestemmelser av antall mikroorganismer etter 48 timer viste følgende resultat: 3,0 x IO<6> aerobe mesofile mikroorganismer/ml suspensjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts partikkeltelleren.

TAT mediumbase/Tween 20 (polyoksyetylensorbitanmonolaurat).

Tryptisk soyadyrkingsagar.

De prøver som ble analysert ifølge foreliggende fremgangsmåte er utmerkede og i overensstemmelse med bestemmelsen av antall mikroorganismer slik dette ble utført ved hjelp av Schweizerisches Lebensmittelbuch etter 48 timer. Sammenlignet med bestemmelsen av antall mikroorganismer slik det er beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch, så ligger begge prøver godt innenfor sikkerhetsgrensene.

Sikkerhetsgrensene slik det brukes her, betyr et avvik på + 0,5 logio for individuelle tellinger av mikroorganismer slik dette er beskrevet av PHLS Central Public Health Laboratory 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, fordeling 070, sider 6 og 7 og appendix 1, utsendelsesdato 16. november 1998, rapportdato 30. desember 1998.

Eksempel 3) Kalsiumkarbonatsuspensjon, analyseapparat BioOrbit 1253 luminometer.

Fremgangsmåte

500 ml prøver av en 71,5 vekt% vandig suspensjon av naturlig malt marmor (90 vekt% av partiklene < 2 (im, 65 vekt% partikler < 1 jam) dispergert med 0,5 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat, ble tilsatt 1 liters glasskolber. En av prøvene ble lagret i 3 døgn ved 5 °C (prøve A), mens den andre ble lagret i 3 døgn ved 30 °C (prøve B). Etterpå ble prøvene justert til 20 °C og 3 ml av hver av prøvene ble blandet med 3 ml av de respektive ekstraksjonsmidler i sterile kolber. Etter en sentrifugering i 10 min. ved 600 °C ble det isolert en klar supernatantfase og denne ble analysert for lysemisjon ved hjelp av BioOrbit luminometeret 1253. Analysen ble utført ved å måle lysintensiteten i BioOrbit luminometeret 1253 umiddelbart etter sentrifugering (tid tot), etter 4 timer (tid t4t), etter 7 timer (tid t7t) og etter 17 timer (tid tnt). Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette lysintensiteten etter den angitte inkubasjonstiden mot inkubasjonstiden, er det mulig å påvise nærværet av levende celler (økende lysintensitet over tid) i den klare fasen. Etter en inkuberingstid med nesten eksponentiell vekst, er det mulig å bestemme forurensningen i suspensjonen ved å sammenligne progresjonen for kurvene for de individuelle prøvene. På denne måten kan man utføre en semikvantitativ distinksjon mellom «ingen vekst», «svak vekst» og «sterk vekst». Som en sammenligning ble det utført en bestemmelse av antall mikroorganismer slik det er beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch. («Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgaven, 1988 revidert versjon).

Anvendte ekstraksjonsmidler:

1. Tidligere fremgangsmåter, 0,9 vekt% løsning av NaCl i destillert vann uten organiske stoffer som måtte kunne tjene som et næringsmiddel. 2. Ifølge foreliggende oppfinnelse, 3 vekt% av en organisk næringsløsning (tryptisk soyadyrkningsagar).

Telling av mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Prøve A: 5 x IO<4> aerobe mesofile mikroorganismer/g suspensjon etter 48 timer.

Prøve B: 7 x 10 aerobe mesofile mikroorganismer/g suspensjon etter 48 timer.

Resultat:

Bedømmelse av forurensningen med BioOrbit luminometeret.

Tidligere kjente fremgangsmåter, 0,9 vekt% av NaCl i destillert vann.

Ved å bruke tidligere kjente fremgangsmåter kunne en ikke observere noen klar forskjell mellom den svakt og den sterkt forurensede suspensjonen etter 17 timer.

Ifølge foreliggende oppfinnelse, 3 vekt% av en organisk næringsløsning (tryptisk soyadyrkingsagar)

Ved å bruke den nye fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er det mulig å skille mellom «svakt» og «sterkt forurensede» løsninger allerede etter 7 timer.

I tillegg kan en «svak forurensning» signifikant påvises allerede etter 17 timer.

Litteraturen og brukermanualen for BioOrbit luminometeret ver. 3.0, mai 1995 såvel som «application note 20» fra BioOrbit OY company, FIN 20521 Turku, Finland, viser også beregningsmodeller for beregningen av biomassen ved å bruke RLU-verdiene. Videre kan antallet av mikroorganismer/ml bestemmes ved «kalibrering» ved å bruke suspensjoner med kjent grad av forurensning.

Eksempel 4) US leiresuspensjon

Fremgangsmåte

3 ml prøver av en 72,8 vekt% vandig suspensjon av naturlig malt US leire fra Georgia i USA (95 vekt% av partiklene < 2 u.m, 78 vekt% av partiklene < 1 u.m) dispergert med 0,35 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat, ble pipettert over i separate sterile kolber. En prøve ble tilsatt 3 ml av en 3 vekt% TAT mediumbase/Tween 20 næringsløsning, mens en annen prøve ble tilsatt 3 ml av en 3 vekt% tryptisk soyanæringsløsning. Etterpå ble begge prøvene blandet godt i 20 sek. og så sentrifugert. Etter en sentrifugering i 10 min. ved 800 g ble en klar supernatantfase isolert og analysert ved hjelp av CellFacts. Analysen ble utført ved å måle antall partikler i CellFacts-instrumentet umiddelbart etter sentrifugeringen (tid tot), etter inkuberingstider på 2 timer (tid t2t), 4 timer (tid t4t), etter 6 timer (tid t6t) og etter 12 timer (tid t^t). Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette antall partikler mot diameteren på partiklene, er det mulig å påvise nærværet av levende celler (topputvidelse), og arter av mikroorganismene (bakterier, gjær eller sopp) etter spesielle inkuberingstider for den klare fasen. Etter en inkuberingstid med nesten eksponentiell vekst, ble den opprinnelige forurensningen av suspensjonen bestemt ved en ekstrapolering tilbake til tot. Som en sammenligning ble det utført en bestemmelse av antallet mikroorganismer ved hjelp av Schweizerisches Lebensmittelbuch («Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgave, 1988 revidert versjon).

Bestemmelse av antall mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Bestemmelse av antall mikroorganismer etter 48 timer viste: 5,0 x IO<5> aerobe mesofile mikroorganismer/ml suspensjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts partikkeltelleren.

TAT mediumbase/Tween 20 (polyoksyetylensorbitanmonolaurat).

Tryptisk soyamediumagar.

Prøvene analysert ifølge den foreliggende fremgangsmåte er i utmerket overensstemmelse med bestemmelsen på antall mikroorganismer utført ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch etter 48 timer.

Sammenlignet med bestemmelsen av antall mikroorganismer som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch, så ligger begge prøver godt innenfor sikkerhetsgrensene.

Sikkerhetsgrenser slik det er brukt her, betyr et avvik på + 0,5 logio av de individuelle bestemmelsene av antall mikroorganismer som beskrevet av PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, publikasjon 070, sider 6 og 7 og appendix 1, utgitt 16. november 1998, rapportdato 30. desember 1998.

Eksempel 5 ) Kalkvann fra papirfremstillingsmaskin

Fremgangsmåte

3 ml av en 0,5 vekt% vandig suspensjon som innholdt 0,2 vekt% naturlig malt marmor fra Norge (60 vekt% av partiklene < 2 u.m, 35 vekt% av partiklene < 1 u.m) dispergert med 0,15 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat og ca. 0,3 vekt% cellulosefibre (sulfitt/sulfat papirmasse) slik det brukes i papirindustrien for fremstilling av papir, og ca. 0,05 vekt% av et kommersielt polyakrylamid, ble pipettert over en steril kolbe. Prøven ble tilsatt 3 ml av en 3 vekt% tryptisk soyanæringsløsning. Etterpå ble prøven blandet i 20 sekunder og så sentrifugert. Etter en sentrifugering i 10 minutter ved 1000 g, ble en klar supernatantfase isolert og analysert ved hjelp av CellFacts. Analysen ble utført ved å måle antall partikler i CellFacts-instrumenter umiddelbart etter sentrifugeringen (tid tot), etter inkuberingstid på 1 time (tid tu), 2 timer (tid t2t), inkuberingstiden var 30 °C. Ved å avsette antall partikler mot diameteren på partiklene, er det mulig å påvise nærværet av levende celler (topputvidelse), og de typer av mikroorganismer som var tilstede (bakterier, gjær eller sopp), etter spesielle inkuberingstider for den klare fasen. Etter en inkuberingstid med nesten eksponentiell vekst, kan den opprinnelige forurensningen i suspensjonen bestemmes ved en ekstrapolering tilbake til tidspunkt tot-1 tillegg og som en sammenligning ble det utført en bestemmelse av antallet mikroorganismer som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch («Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgave, 1988 revidert versjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Bestemmelse av antall mikroorganismer etter 48 timer viste: 3,0 x IO<7> aerobe mesofile mikroorganismer/ml suspensjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts partikkeltelleren.

1. Tryptisk soyanæringsagar.

Prøvene analysert ifølge den foreliggende fremgangsmåten er i utmerket overensstemmelse med den bestemmelse, som ble utført som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch etter 48 timer.

Sammenlignet med bestemmelsen av antallet mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch, så ligger begge prøver godt innenfor sikkerhetsgrensene.

Med sikkerhetsgrenser forstås her et avvik på + 0,5 logio av de individuelle bestemmelser av antallet mikroorganismer, slik det er beskrevet av PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, London NW9 5HT, UK, publikasjon 070, sider 6 og 7 og appendix 1, publikasjonsdato 16. november 1998, rapportdato 30. desember 1998.

Eksempel 6) Kolloidal stivelsessuspensjon

Fremgangsmåte

3 ml av en 10 vekt% vandig kolloidal maisstivelsessuspensjon slik det brukes i papirfabrikker, ble pipettert over en steril kolbe. Prøven ble tilsatt 3 ml av en 3 vekt% tryptisk soyanæringsløsning. Prøven ble deretter blandet i 20 sekunder og så sentrifugert. Etter sentrifugering i 10 minutter ved 800 g, ble en klar supernatantfase isolert og analysert ved hjelp av CellFacts. Analysen ble utført ved å måle antall partikler i CellFacts-instrumenter umiddelbart etter sentrifugeringen (tid tot), etter inkuberingstid på 1 time (tid tit), 2 timer (tid t2t). Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette antall partikler mot diameteren på partiklene, er det mulig å påvise nærværet av levende celler (topputvidelse), og de typer av mikroorganismer som var tilstede (bakterier, gjær eller sopp), etter spesielle inkuberingstider for den klare fasen. Etter en inkuberingstid med nesten eksponentiell vekst, kan den opprinnelige forurensningen i suspensjonen bestemmes ved en ekstrapolering tilbake til tidspunkt tot. I tillegg og som en sammenligning ble det utført en bestemmelse av antallet mikroorganismer som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch («Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgave, 1988 revidert versjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch.

Bestemmelse av antall mikroorganismer etter 48 timer viste: 4,0 x IO6 aerobe mesofile mikroorganismer/ml suspensjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts partikkeltelleren.

1. Tryptisk soyanæringsagar.

Eksempel 7)

Fremgangsmåte

3 ml prøver en av 71,5 vekt% vandig suspensjon av naturlig malt marmor (90 vekt% av partiklene < 2 u.m, 65 vekt% av partiklene < 1 uxn) dispergert med 0,5 vekt% av et kommersielt natriumpolyakrylat, ble blandet i sterile kolber med 3 ml hver av

forskjellige ekstraksjonsmidler. Etter en sentrifugering i 10 min. ved 800 g fikk man en klar supernatantfase, og denne ble analysert ved hjelp av CellFacts. Analysen ble utført ved å måle antall partikler i CellFacts-instrumentet umiddelbart etter sentrifugering (tid tot), og etter inkuberingstider på 2 timer (tid t2t), 4 timer (tid t4t), etter 7 timer (tid t7t), etter 17 timer (tid tnt) og etter 24 timer (tid t24t). Inkuberingstemperaturen var 30 °C. Ved å avsette antall partikler mot diameteren på partiklene, er det mulig å påvise nærværet av levende celler (topputvidelse), og de typer av mikroorganismer som var tilstede (bakterier, gjær eller sopp), etter spesielle inkuberingstider for den klare fasen. Etter en inkuberingstid med nesten eksponentiell vekst, kan den opprinnelige forurensningen i suspensjonen bestemmes ved en ekstrapolering tilbake til tidspunkt tot. I tillegg og som en sammenligning ble det utført en bestemmelse av antallet mikroorganismer som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch («Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen», Schweizerisches Lebensmittelbuch, kapittel 56, seksjon 7.01, 1985 utgave, 1988 revidert versjon.

Anvendte ekstraksjonsmidler:

Kjent teknikk

1. Destillert vann

2. 0,9 vekt% av en NaCl-løsning i destillert vann, uorganisk salt

3. 0,8 vekt% løsning av polyoksyetylensorbitanmonolaurat (2 mol polyoksyetylen), organisk overflateaktivt middel.

Eksempel ifølge foreliggende oppfinnelse

3 vekt% av en organisk næringsløsning (tryptisk soyaagar).

Bestemmelse av antall mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch Bestemmelse av antall mikroorganismer etter 48 timer viste: 5,0 x IO<4> aerobe mesofile mikroorganismer/ml suspensjon.

Bestemmelse av antall mikroorganismer ved å bruke CellFacts patikkeltelleren

Prøvene 1-3 viser klart at det er nødvendig med en lang inkuberingstid før en kan beregne et resultat, og dessuten, at dette resultatet ikke er korrekt. (Referanse: bestemmelse av antallet mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch).

For prøvene 1-3 er variasjonen med hensyn til antall mikroorganismer som ble tellet ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch, langt utenfor sikkerhetsgrensen.

Prøvene 1 og 2 mangler et organisk stoff som kan virke som et næringsmiddel. Prøve 3 inneholder et organisk stoff. Dette stoffet er imidlertid ikke aktivt som næringsmiddel, men snarere som en inhibitor. En viss inhibering av Tween 20 kan allerede observeres i eksempel 4-1, hvor Tween 20 har blitt brukt, hvis resultatet blir sammenlignet med eksempel 4-2. Det organiske stoff som virker som en næringsløsning og anvendt ifølge foreliggende oppfinnelse, var imidlertid i stand til å hindre et galt resultat i eksempel 4-2. En sammenligning mellom eksempel 7-4 og eksempel 7-3 gir imidlertid fatalt feilaktig resultat.

Prøve 4 som har blitt analysert ifølge den foreliggende fremgangsmåten, er i utmerket overensstemmelse med bestemmelsen av antall mikroorganismer utført som beskrevet i Schweizerisches Lebensmittelbuch.

I prøve 4 er forskjellen mellom bestemmelsen av antallet mikroorganismer ifølge Schweizerisches Lebensmittelbuch, godt innenfor sikkerhetsgrensene.

Sammensetning av foretrukne næringsmedia

TAT næringsbase Næringsmedium Peptin fra kasein, tryptisk nedbrukt Platetellingsagar Etylenglykol

Glyserin

Claims

1. Fremgangsmåte for kvantitativ og/eller kvalitativ bestemmelse av en mikrobiell forurensning av suspensjoner, emulsjoner eller dispersjoner som inneholder mineraler og/eller pigmenter og/eller fyllstoffer og/eller fibermaterialer, karakterisert veda) at en prøve av suspensjonen, emulsjonen eller dispersjonen blir blandet med én eller flere organiske substanser som er nedbrytbare ved hjelp av mikroorganismer, som virker som skillemiddel mellom mikroorganismene og mineralene, pigmentene, fyllstoffene og/eller fibermaterialene, der substansene som er nedbrytbare med mikroorganismer er næringsmedier for mikroorganismer tilsatt i en konsentrasjon på 0,1 - 10 vekt%, og der det valgfritt blir utført en inkubasjon for å forhøye antall av mikroorganismer, b) den slik oppnådde blanding blir sentrifugert for å separere hoveddelen av mineralene og/eller fyllstoffene og/eller pigmentene og/eller fibermaterialene fra mikroorganismene, der mikroorganismene befinner seg i den øvre fase, og c) den vandige supernatanten oppstått ved sentrifugeringen foretrukket blir underkastet én eller flere inkubasjoner, for å forhøye antallet av mikroorganismer i denne supernatanten, og d) bestemme antallet og/eller størrelsen og/eller typen av mikroorganismer i supernatanten.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte mikrobielle forurensning er bakterier og/eller sopp og/eller gjær.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte næringsmedium inneholder en kilde for karbon, nitrogen, fosfat og/eller svovel, såvel som eventuelle mineraler, vekstfaktorer og/eller vitaminer.

4. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at sentrifugeringen utføres ved 100-1500 g, fortrinnsvis 200-1200 g, mest foretrukket fra 600-1000 g.

5. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at inkuberingstemperaturen er 20-37°C, fortrinnsvis 28-34°C, og mest fordelaktig 31,5-32,5°C.

6. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det brukes slike næringsmedia som gjør det mulig med en selektiv vekst av de mikroorganismer som skal bestemmes.

7. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at det næringsmedium som brukes er tryptonazolektin/Tween 20 (TAT) næringsagar og/eller glukoseløsning og/eller pepton/kasein og/eller næringsmedium, fortrinnsvis tryptisk soyanæringsagar.

8. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at konsentrasjonen av næringsmediet for mikroorganismene er 2-5 vekt% og mest fordelaktig 3 vekt%.

9. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at suspensjonen, emulsjonen eller dispersjonen ytterligere inneholder polymerer i kolloidal form.

10. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den kvalitative og/eller kvantitative bestemmelsen av bakterier og/eller sopp og/eller gjær utføres samtidig i en analyse.

11. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at sentrifugeringen utføres i et tidsrom på fra 1-30 min., fortrinnsvis 2-15 min., spesielt foretrukket 10 min.

12. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den fasen som oppnås ved sentrifugering og som inneholder mikroorganismene, analyseres for mengde av mikroorganismer ved hjelp av en partikkelstørrelsesanalysemetode.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at størrelsen og antallet av mikroorganismene analyseres ved å suge mikroorganismeprøven ved hjelp av et vakuum, gjennom en målepore med en definert lengde og diameter, og hvor det er påsatt en spenning ved poreinnløpet og utløpet, og at en strømpuls måles ved passasje av mikroorganismene gjennom poren, og som er direkte korrelert til volumet av mikroorganismene, og hvor antallet strømpulser er korrelert med antallet av mikroorganismer.

14. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at fasen som oppnås ved sentrifugering og som inneholder mikroorganismene, analyseres for mengde av mikroorganismer ved å bestemme den mengde ATP som produseres av mikroorganismene.

15. Fremgangsmåte ifølge et eller flere av de foregående krav, karakterisert ved at den mikrobielle forurensningen av dispersj onene, emulsjonene og suspensjonene undersøkes i metallindustrien, i pigment- og papirindustrien såvel som i sirkulerende vann fra papirindustrien.