BR0007965B1

BR0007965B1 - processo para determinação de contaminação microbiana.

Info

Publication number: BR0007965B1
Application number: BRPI0007965-0A
Authority: BR
Inventors: Matthias Buri; Patrick Schwarzentruber
Priority date: 1999-02-02
Filing date: 2000-01-17
Publication date: 2011-09-20
Also published as: AU778034B2; AU2109100A; TR200102213T2; TWI262214B; NO20013506D0; US6627413B1; CZ302995B6; ES2251957T3; DE19904057C2; CO5241363A1; NO328953B1; SK10342001A3; CA2361665A1; KR100790011B1; EP1149172B1; NZ513627A; EP1149172A2; BR0007965A; DE19904057A1; CA2361665C

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA DETERMINAÇÃO DE CONTAMINAÇÃO MICROBIANA".

A presente invenção refere-se a um processo para a determina- ção quantitativa e/ou qualitativa da contaminação microbiana de suspensões, emulsões ou dispersões aquosas contendo minerais e/ou pigmentos e/ou ma- teriais de enchimento (daqui adiante denominados de cargas) e/ou materiais de fibras, opcionalmente em combinação com polímeros na forma coloidal.

As determinações da contaminação por germe e controles higiê- nicos de suspensões aquosas por meio de métodos convencionais essenci- almente se baseiam na capacidade de propagação dos microorganismos a ser detectados. Naturalmente, o tempo requerido para realizar esses métodos varia de 24 horas a vários dias. Esses períodos de tempo são muito grandes por muitas questões, e os resultados são obtidos muito tarde para intervir de uma maneira orientadora nos processos de produção. Particularmente a reali- zação dos controles antes da hora do transporte e novamente requer métodos que são caracterizados por intervalos de determinação curtos.

Desse modo, o problema principal de análises microbianas con- vencionais de germes mesofílicos aeróbicos, tal como Contagem de Placa ou Easicult, é o seu longo período de incubação de até 48 horas. Através deste método, é impossível se obter uma avaliação e, desse modo, a determinação da contagem de germe antes de se passar dois dias. Em adição, vários outros efeitos devem ser considerados tal como o meio nutriente, pressão parcial do oxigênio (aeróbica/anaeróbica), seletividade, pH e muito mais.

Desse modo, é muitas vezes impossível determinar a contagem de germes do produto, tal como pastas fluidas de pigmentos, antes do seu carregamento para os compradores e intervir de uma maneira orientadora através da adição de substâncias biocidas. Devido às longas horas de trans- porte requeridas de até 6 semanas em alto mar ou ferrovia, a pasta fluida de pigmento pode se deteriorar ou se tornar inútil. A pasta fluida de pigmento branco pode desenvolver uma cor cinza e começar a soltar cheiro. Até ago- ra, superdosagem preventiva de substâncias biocidas na pasta fluida de pigmento é apenas a única possibilidade de se excluir o apodrecimento, é de custo intensivo, de recursos dispersos e é ecologicamente sem sentido. A- lém disso, duas abordagens diferentes são necessárias para analisar ambos germes mesofílicos aeróbicos e fungos. Além disso, a preparação de dilui- ções seriais é necessária, desse modo multiplicando o número de análises.

Os métodos convencionais para a determinação de germes nas indústrias de papel e pigmento foram escritos por exemplo no "Schweizeris- ches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985, versão revisada em 1988, "Bestimmung von aeroben Bekterien und Keimen" e no "Schweizerisches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.22, edição de 1985 versão revisada de 1988, "Bestimmung von Pilzen". Em geral, antes de se realizar a determinação em cada caso um período de incubação de cerca de 48 horas é requerido.

O analisador de partícula CelIFacts® e método foram desenvol- vidos pela Microbial Systems company, Ltd. Mais informação detalhada pode ser obtida da Labor flash 9/96, Zeitung mit Leserdienst für Labor und Fors- chung, Ott Verlag + Druck AG, Ch-3607 Thun, Suíça. Desse modo, foi men- cionado que o analisador CelIFacts pode ser também usado para realizar determinações da contagem de germe em pastas fluidas de carbonato de cálcio. No entanto, experimentos realizados no laboratório da requerente revelaram que uma determinação deste tipo da maneira descrita pelo fabri- cante é impossível ou apenas imprecisa.

O princípio da medição realizada pelo analisador CelIFacts é basea- do na medição de bactérias, fungos e leveduras na forma de partículas em um campo elétrico onde o número de partícula é determinado por um intervalo de incubação das amostras e subseqüente medição do aumento da contagem das partículas e, no caso de crescimento exponencial, através de extrapolamento para to. Este princípio de medição é também eficaz na medição de um número "baixo" de partículas "exógenas" (daqui adiante denominadas partículas "estrangeiras") tendo o mesmo tamanho ou um similar às bactérias, fungos e leveduras. No caso de suspensões e emulsões contendo uma proporção de "partículas estrangeiras", tal como minerais, cargas e/ou pigmentos, de >1% em peso, o número de "partí- culas estrangeiras" inertes presentes tendo o mesmo tamanho que os mi- croorganismos, a saber, 0,5-20 μηι, isto é o valor em branco tO, é muito alto para permitir a detecção de um aumento adicional dos germes através de propagação na incubadora dentro de um período <10 horas. Desse modo, o analisador CeIIFacts é incapaz de realizar uma medição suficientemente exata, e o fabricante requer uma diluição do líquido de partida para assegu- rar a aplicabilidade.

Em um valor em branco de 108 partículas/ml, é impossível de- tectar significantemente um aumento de 103 partículas/ml através do anali- sador CeIIFacts. No entanto, a diluição requerida devido à presença das "partículas estrangeiras" é muito alta de modo que a diluição dos organismos reprodutivos que com certeza são diluídos pela mesma ordem de magnitude não é mais significante, e o resultado obtido é incorreto. Além disso, "partículas estrangeiras" tendo um diâmetro de >20 μιτι podem ligar a célula de medição que tem um diâmetro de apenas 30 μιτι. As partículas "estrangeiras" podem por exemplo ser do tipo mineral, tal como carbonato de cálcio, sintéticas, orgânicas, do tipo polimérico, tal como dispersões de poliestireno acrilato, ou do tipo natural, orgânico, tal como soluções de amido ou fibras de hemicelu- Iose e/ou celulose, ou uma combinação das partículas acima conforme elas estiverem presentes por exemplo em um ciclo de moagem de papel.

É um objetivo da presente invenção prover um processo rápido e potente, de fácil realização para a determinação quantitativa e/ou qualitativa da contaminação microbiana de suspensões, emulsões ou dispersões aquosas contendo minerais e/ou pigmentos e/ou cargas e/ou materiais de fibra onde o dito processo evita as desvantagens acima descritas da técnica anterior.

De acordo com a presente invenção, este objetivo foi resolvido através de um processo de acordo com a parte genérica da reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que uma amostra das suspensões, emulsões ou dispersões, seguindo a adição de uma ou mais substâncias orgânicas que podem ser degradadas pelos microorganismos e opcionalmente seguindo uma incubação subseqüente, é centrifugada para separar os microorganis- mos dos minerais e/ou cargas e/ou pigmentos e/ou materiais de fibra e o número e/ou tamanho e/ou natureza dos microorganismos na fase de sobre- nadante aquosa é determinado após uma ou mais incubações.

As modalidades preferidas da presente invenção se tornarão óbvias a partir das Reivindicações dependentes bem como do Relatório e Exemplos que seguem.

Há vários anos, a determinação quantitativa e qualitativa de mi- croorganismos pertence à técnica anterior. No entanto, a determinação da contaminação microbiana é particularmente difícil nos casos onde uma alta concentração de outras partículas sólidas tal como minerais, pigmentos, car- gas e/ou materiais de fibra está presente na amostra a ser investigada. De- vido ao fato dessas "partículas estrangeiras" terem freqüentemente um ta- manho similar aos microorganismos, geralmente, é apenas possível minimi- zar o número de tais "partículas estrangeiras" ao realizar altas diluiçõeg, No entanto, concomitantemente e inevitavelmente, essas etapas de alta diluição reduzem o número de microorganismos de contaminação, e um longo perío- do de incubação é requerido para aumentar o número de microorganismos por meio de propagação até um grau que permita a detecção segura.

Desse modo, tem havido uma necessidade de se criar um novo processo do tipo mencionado no início que proveja resultados reproduzíveis e confiáveis com relação ao número, tamanho e/ou tipo dos microorganis- mos na amostra a ser investigada em um tempo substancialmente menor.

Surpreendentemente e inesperadamente, foi verificado que é possível separar os microorganismos de materiais inertes ("partículas estran- geiras") através da adição de substâncias orgânicas degradáveis à amostra e realização de uma centrifugação subseqüente. Geralmente, os microorga- nismos de preferência aderem à superfície do mineral, pigmento, carga e/ou material de fibra tornando difícil separá-lo da superfície. Embora as "partí- culas estrangeiras" sejam sedimentadas por uma etapa de centrifugação simples, no entanto, os microorganismos são arrastados juntos para o pélete porque eles de preferência aderem àquelas partículas, e desse modo a por- ção de microorganismos restante no sobrenadante, provê valores incorretos com relação ao grau de contaminação com microorganismos.

Foi mostrado que a adição de substâncias orgânicas biologica- mente degradáveis surpreendentemente permite uma separação dos micro- organismos e dos minerais, pigmentos, cargas e/ou materiais de fibra. De preferência, a substância orgânica que pode ser degradada por microorga- nismos é um meio nutriente convencionalmente usado no cultivo de microor- ganismos. Surpreendentemente, este meio nutriente atua como um agente de separação entre os microorganismos e as partículas estrangeiras e, desse modo, pela primeira vez permite a separação de, e distinção entre os dois sem afetar etapas adicionais da análise de microorganismo. As substâncias que não podem ser biologicamente degradadas ou cuja degradação biológica é difícil têm o risco de que os microorganismos sejam separados das partículas inertes enquanto ao mesmo tempo as substâncias agem como inibidores do crescimento de microorganismos e desse modo levam a resultados imprecisos.

No processo de acordo com a presente invenção não apenas uma etapa de processo, a saber a etapa de diluição, pode ser omitida mas em adição o período de incubação é extraordinariamente reduzido. Além disso, não foi apenas adicionado um agente de separação, mas o agente de separação simultaneamente age como uma solução nutriente que pode ser empregada para propagação ótima dos microorganismos a ser investigados e, em uma modalidade preferida, é selecionado para ser específico para um tipo de microorganismo em particular a ser testado, tal como bactérias, fun- gos ou leveduras.

Foi apenas através da adição de uma substância orgânica que pode ser degradada pelos microorganismos, de preferência na forma de uma solução ou meio nutriente, respectivamente, e através da introdução de uma etapa de centrifugação que o objetivo de acordo com a invenção foi atingido. Uma redução no tempo de análise ou até mesmo a possibilidade de se realizar uma análise foi conseguida porque a amostra a ser testada con- tém um número menor de "partículas estrangeiras". Além disso, é possível usar um número de partida menor e um aumento menor nas partículas mi- crobianas com o tempo do que com amostras tendo um valor em branco maior, isto é, um número de "partículas estrangeiras" maior.

Através do processo de acordo com a invenção, suspensões, emulsões e dispersões aquosas podem ser investigadas, as quais dentre outras substâncias contêm minerais, pigmentos, cargas e/ou materiais de fibra, tal como fibras de celulose, e que contêm ainda opcionalmente políme- ros tal como polímeros naturais ou semi-sintéticos na forma coloidal. Exem- pios de tais polímeros são: estireno butadieno, estireno acrilato, resinas de melamina, resinas de formaldeído uréia, amido, carboximetilcelulose.

De preferência, as amostras a serem testadas são derivadas da indústria de processamento de papel. Áreas adicionais de uso são a indús- tria de pigmento e a indústria de processamento de metal.

De acordo com a presente invenção, uma amostra das suspen- sões, emulsões ou dispersões a serem testadas quanto à contaminação mi- crobiana é tomada. Geralmente, a quantidade da amostra obtida é 0,5-20 ml, no entanto, uma quantidade menor ou maior pode ser tomada. Além disso, a quantidade de amostra tomada não é importante para o sucesso do proces- so da invenção.

A amostra obtida é adicionada e misturada com substâncias orgâ- nicas que podem ser degradadas por microorganismos. A quantidade de substâncias orgânicas biodegradáveis adicionada à amostra é 0,5-50 ml de substância biodegradável por ml da amostra.

A razão do volume da amostra para o volume da substância bio- degradável é dependente da concentração original da amostra e da concen- tração da substância biodegradável na solução. A razão é ajustada para uma quantidade de substância biodegradável que é grande o suficiente para permitir a separação dos microorganismos e dos minerais, cargas, pigmen- tos e/ou materiais de fibra e opcionalmente também polímeros na forma co- loidal. A razão ótima do volume da amostra para o volume de substância biodegradável que pode ser determinado em cada caso pode ser determina- da pelo versado na técnica por meio de experimentação manual.

Geralmente a concentração da solução contendo a substância biodegradável é selecionada para se conseguir uma razão da solução de amostra para a solução contendo a substância biodegradável de 1:0,1 a 1:100. A razão ótima é fortemente dependente da concentração e da com- posição da respectiva solução de amostra. Pigmerito e/ou suspensões de carga tendo um teor de sólido de >65% em peso são geralmente diluídos em uma razão de 1:2 a 1:10, de preferência em uma razão de 1:3. Se o teor de sólidos for <65% em peso, a diluição é geralmente realizada em uma razão de 1:0,1 a 1:1. Em certos casos, especialmente se uma contaminação muito alta puder ser esperada, a diluição é geralmente realizada em uma razão de 1:10 a 1:100. O fator de diluição escolhido deve ser considerado na avalia- ção subseqüente da contaminação ou deve ser apontado especificamente no resultado.

As substâncias orgânicas biodegradáveis incluem particular- mente o grupo de meio nutriente que é específico para uma espécie particular de microorganismos a ser testada. De preferência, os meios nutrientes contêm uma fonte de carbono, nitrogênio, fosfato e/ou enxofre bem como opcional- mente minerais, fatores de crescimento e/ou vitaminas. Outras substâncias podem ser adicionadas ao meio nutriente se elas forem requeridas para crescimento ótimo dos microorganismos. A seguir, são descritos meios pre- feridos que podem ser empregados de acordo com a presente invenção.

Opcionalmente, seguindo a adição dos meios nutrientes, uma ou mais etapas de incubação podem ser realizadas para aumentar o número de microorganismos na amostra. Isto pode ser especialmente vantajoso para uma análise qualitativa subseqüente. Em uma modalidade preferida da in- venção, no entanto, esta incubação antes da centrifugação é omitida levan- do a uma redução acentuada no tempo.

Para separar os microorganismos dos minerais, cargas, pigmentos e/ou materiais de fibra uma etapa de centrifugação é realizada seguindo a adição do meio nutriente e a etapa de incubação subseqüente adicional. A etapa de centrifugação é realizada de uma maneira para remover a maior parte dos microorganismos, isto é, mais do que 50%, das "partículas estran- geiras", isto é, os minerais, cargas, pigmentos, polímeros e materiais de fi- bra. A centrifugação deve ser eficaz para acumular os microorganismos na fase superior enquanto as partículas estrangeiras são sedimentadas. Para este propósito, a centrifugação é de preferência realizada a 100 até 1500 g, de preferência 200 a 1200 g e particularmente preferido a 600 até 1000 g. O campo de gravidade é ajustado dependendo dos minerais, cargas, pigmen- tos, e materiais de fibra a serem separados ou dependendo dos microorga- nismos a ser separados, respectivamente.

O índice de sedimentação ótimo pode ser determinado pelo ver- sado na técnica por meio de experimentação. A própria centrifugação é rea- lizada por um período de 1 a 30 minutos, de preferência 2 a 15 minutos e particularmente de preferência 5 a 10 minutos. O tempo de centrifugação ótimo pode ser determinado pelo versado na técnica que realiza os experi- mentos de laboratório.

Como os minerais e/ou cargas e/ou pigmentos são de preferên- cia usados: compostos contendo elementos do segundo e/ou terceiro grupo principal e/ou quarto grupo principal e/ou quarto grupo lateral do sistema pe- riódico dos elementos, particularmente cálcio e/ou silício e/ou alumínio e/ou titânio e/ou bário e/ou pigmentos orgânicos.

Como os minerais, cargas e pigmentos, são usados de preferên- cia minerais e/ou cargas e/ou pigmentos contendo caulim e/ou hidróxido de alumínio e/ou hidróxido de titânio e/ou sulfato de bário e/ou esferas de poli- estireno ocas e/ou resinas de formaldeído e/ou carbonato de cálcio, particu- larmente carbonatos de cálcio particularmente naturais e/ou mármore e/ou cal e/ou dolomita e/ou carbonatos de cálcio contendo dolomita e/ou carbo- natos de cálcio sinteticamente preparados, os chamados carbonatos de cál- cio precipitados.

O sobrenadante contendo os microorganismos é removido e pode então ser usado diretamente em uma determinação quantitativa e/ou qualitativa da contaminação microbiana. De preferência, isto é seguido por uma ou mais etapas de incubação para aumentar o número de microorga- nismos no sobrenadante. Esta etapa de propagação é realizada em uma temperatura de incubação que favorece os microorganismos e é dependente do tipo de microorganismos a ser propagados. As temperaturas de incuba- ção preferidas estão na faixa de 20 a 37°C, com mais preferência 28 a 34°C, e particularmente preferido 31,5 a 32,5°C. As temperaturas de incubação que são necessárias em cada caso são conhecidas dos versados na técnica e podem ser ou encontradas em monografias ou podem ser experimental- mente determinadas.

O tempo total das etapas de incubação individuais em uma tem- peratura de incubação de 30°C é de até 12 horas em uma contaminação de menos do que 105 germes/ml de amostra, até 6 horas em uma contamina- ção de mais do que 105 germes/ml de amostra mas menos do que 10^6 ger- mes/ml de amostra, e até 3 horas em uma suspensão com teor de sólidos original de 60-80% em peso e uma contaminação de mais do que 10^5 ger- mes/ml (usando ágar de caldo de soja).

A soma das etapas de incubação individuais a 30°C é de até 2 a 6 em uma contaminação de menos do que 105 germes/ml de amostra, 2 a 4 em uma contaminação de mais do que 105 germes/ml de amostra mas me- nos do que 106 germes/g de amostra, e 2 a 3 em uma suspensão com um teor de sólidos original de 60-80% em peso e uma contaminação de mais do que 105 germes/ml (usando ágar de caldo de soja tríptico).

Os tempos de incubação individuais em uma temperatura de incubação de 30°C são de 1 a 12 horas em uma contaminação de menos do que 105 gramas/ml de amostra, 1 a 6 horas em uma contaminação de mais do que 105 germes/ml mas menos do que 10^6 germes/g de amostra, e 1 a 2 horas em uma suspensão com um conteúdo de sólidos original de 60-80% em peso e uma contaminação de mais do que 10^5 germes/ml (usando ágar de caldo de soja tríptico).

Vários métodos conhecidos da técnica anterior estão disponíveis para determinação quantitativa ou qualitativa, respectivamente, dos microor- ganismos desse modo obtidos. Particularmente preferido de acordo com a presente invenção é a análise CellFacts® ou o método ATP. Outros métodos estão disponíveis e são conhecidos daqueles versados na técnica. Os méto- dos preferidos são descritos em mais detalhes nos Exemplos que seguem.

Após o processo de acordo com a presente invenção ter sido realizado, uma determinação qualitativa e/ou quantitativa dos microorganis- mos pode ser realizada. Primeiro, a determinação qualitativa significa uma diferenciação aproximada entre os grupos de fungos, leveduras e bactéria. Se a análise de CelIFacts® for calibrada, a qual especifica microorganismos tal como bactéria específicas, também uma especificação adicional dentro dos subtipos individuais pode ser realizada. A análise qualitativa, por exem- pio, através do método CelIFacts®, é realizada com base em uma diferenci- ação bruta com relação ao tamanho ou volume, respectivamente, de uma célula simples.

CUipo de meios nutrientes empregados, como o agente de sepa- ração depende particularmente do microrganismo a ser separado ou propa- gado. De preferência, os meios nutriente empregados são os que permitem o crescimento seletivo dos germes a ser determinados e, se possível, supri- mem o crescimento de outros germes a não serem determinados. Exemplos de meios nutrientes que podem ser empregados de acordo com a presente inven- ção são ágar do caldo de triptona azolectina/Tween 20 (TAT), solução de glico- se, caldo nutriente de peptona/caseína, de preferência ágar de caldo de soja tríptico. A composição dos meios nutrientes é dada em anexo a este relatório.

A concentração do meio nutriente quanto aos organismos está de preferência na faixa de 0,1 a 10% em peso, mais vantajosamente 2 a 5% em peso, e particularmente vantajosamente cerca de 3% em peso.

O processo de acordo com a presente invenção não apenas permite uma determinação qualitativa mas também uma quantitativa das bactérias, fungos e leveduras. Em uma modalidade preferida, esta análise é realizada em uma etapa.

Seguindo a separação de microorganismos e minerais, cargas, pigmen tos e/ou materiais de fibra, isto é, as "partículas estrangeiras", uma ou mais, de preferência duas a cinco etapas de incubação são realizadas para au- mentar o número de microorganismos presentes no sobrenadante de amostra.

Incubações múltiplas são realizadas em intervalos, isto é, a me- dida da contaminação é em cada caso repetida após o tempo to+x. Isto per- mite a limitação do tempo de incubação e dos intervalos de incubação. No momento que o crescimento exponencial é observada uma extrapolação e um cálculo de volta para o tempo to é realizado. Desse modo, um alto grau original de contaminação vai resultar em um crescimento que pode ser ob- servado e calculado mais cedo de modo que os intervalos de incubação subseqüentes podem ser omitidos.

O tempo de incubação em uma contaminação de menos do que 105 gramas/ml da amostra é de até 12 horas, em uma contaminação de me- nos do que 106 germes até 6 horas, em uma suspensão contendo original- mente 60-80 % em peso de sólidos e tendo uma contaminação de mais do que 105 germes/ml de amostra até 3 horas onde no último caso o uso de ágar de caldo de soja tríptico é preferido. O tempo de incubação que deve ser usado dependendo do grau de contaminação com microorganismos pode ser determinado por aqueles versados na técnica através de experi- mentação manual simples. Quanto menor o grau original de contaminação microbiana na amostra, mais longos são os tempos de incubação a serem selecionados e vice-versa. A porção original de sólidos na suspensão não afeta diretamente o tempo de incubação.

A seguir, a invenção será explicada em mais detalhes com rela- ção aos exemplos comparativos e Exemplos. Modificações adicionais da invenção podem ser praticadas pelo versado na técnica com base no presente relatório com relação às reivindicações apensas bem como com base em expe- riência assumida. A invenção não é limitada aos presentes exemplos.

Determinação da Contagem de Germe Usando o Contador de Partícula Cellfacts®

De acordo com a presente invenção, os microorganismos da suspensão e/ou emulsão e/ou dispersão são aspirados por meio de vácuo através de um poro de medição tendo um diâmetro definido. Uma tensão (VoIts) é aplicada a este poro (capilar, 30 μηι). Devido ao fato de células in- tactas em uma primeira aproximação serem capazes de ser consideradas como isolantes um aumento que pode ser medido na resistência é observa- do durante a passagem de uma célula através do poro de medição enquanto o valor deste aumento é dependente do volume da célula. O pulso de cor- rente está diretamente relacionado ao volume. Através da incubação das amostras, pequenas diferenças no crescimento das células podem ser me- didas, isto é, as divisões da célula levam a um aumento proporcional no nú- mero de partícula. Após observação da fase exponencial, a concentração de partida pode ser calculada através de extrapolação porque a função de cres- cimento é exponencial. Devido à preparação de amostras industriais de acordo com a presente invenção e uso do método acima o tempo de deter- minação para CaCCh, pastas de talco e caulim bem como outros materiais (por exemplo, resfriadores, água branca, amido coloidal suspenso, etc) está na faixa de apenas 2-12 horas ao invés de 24-48 horas da técnica anterior.

Isto permite a intervenção conveniente usando conservantes antes da alta contaminação e/ou apodrecimento dos produtos. Exemplos da técnica anterior Exemplo 1) Pasta fluida de carbonato de cálcio

A) Determinações de contagem de germe de acordo com "Schwei- zerisches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985, versão evisada em 1988, "Bestimmung von aeroben Bekterien und Keimen" e de acordo com "Schweizerisches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.22, edição de 1985 versão revisada de 1988, "Bestimmung von Pilzen". Procedimento

3 ml de uma pasta fluida aquosa a 77,5% em peso de mármore natural moído da Norway (90% em peso de partículas < 2 μηη, 65% em peso das partículas < 1 μηι) dispersas com 0,65% em peso de um poliacrilato de sódio comercial foram analisados de acordo com o método "Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen" e no "Schweizerisches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988. Resultados:

Após um período de incubação de 48 horas a contagem de ger- me determinada foi: 3,0 χ 106 de germes mesofílicos aeróbicos/ml de sus- pensão. Nenhuma levedura foi verificada no meio nutriente usado para ger- mes mesofílicos aeróbicos. De acordo com o método descrito no "Schweizeris- ches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.22, edição de 1985, versão revi- sada em 1988, "Bestimmung von Pilzen", <102 de fungos/ml foram detectados.

B) Determinação da contagem de germe usando o contador de partícula CeIIFActs Procedimento

3 ml da pasta fluida aquosa de 77,5% em peso de mármore na- tural moído da Norway (90% em peso das partículas <2 μιη, 65% em peso das partículas <1 μηι) dispersos com 0,65% em peso de um poliacrilato de sódio comercial usado no Exemplo 1A) foram pipetados em um frasco esté- ril. A amostra foi adicionada com 3 ml de uma solução de nutriente de caldo de base TAT/Tween 20 a 3% e analisada por meio de CeIIFacts. A análise foi realizada tentando imediatamente a medição do número de partículas no instrumento CeIIFacts (tempo t0h). Uma vez que o número de partículas era muito mais alto o instrumento necessitou de uma diluição da amostra. Após uma diluição de 1:10.000 ter sido realizada, a concentração da partícula foi aceita pelo instrumento, e o valor branco (toh) pôde ser determinado. Após tempos de incubação de 2 horas (tempo t2h), 4 horas (tempo t4h), após 6 ho- ras (tempo t6h), após 12 horas (tempo ti2h) o número de partículas foi nova- mente determinado no instrumento CeIIFacts. A temperatura de incubação era de 30°C. Através do gráfico do número de partícula contra o diâmetro de partícula é possível determinar a presença de células vivas ("alargamento de pico", eixo y) e o tipo de microorganismos, por exemplo, bactéria, leveduras ou fungos (0 de partícula médio, eixo x) após tempos de incubação particu- lares da fase transparente).

Após um tempo de incubação de 12 horas a contaminação origi- nal da suspensão é avaliada através de extrapolação de volta para o tempo (t0h). Como uma referência, o resultado do Exemplo 1A), determinação de contagem de germe de acordo com "Schweizerisches Lebensmittelbuch", é usada. "Bestimmung von aeroben aeroben mesophilen Keimen", "Schweize- risches Lebensmittelbuch", capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985, versão revisada em 1988. Resultado:

Determinação de contagem de germe usando o contador de partícula CeIIFacts 1. Ágar de caldo de soja tríptico <table>table see original document page 15</column></row><table>

Fica claro a partir dos Exemplos 1A) e 1B) que usando os méto- dos da técnica anterior é impossível realizar uma determinação de bactérias, fungos e leveduras na suspensão acima por meio do instrumento CeIIFacts1 e que particularmente em <102 germes/ml um resultado completamente im- preciso é obtido. Além disso, a determinação de acordo com o método de "Schweizerisches Lebensmittelbuch" requer 48 horas.

Presumivelmente, através da diluição da amostra requerida no instrumento CeIIFActs1 também os germes microbianos presentes foram di- luídos para abaixo do limite de detecção.

Realizando da determinação de acordo com "Schweizerisches Lebensmittelbuch" a duração da análise é de 48 horas.

C) Determinação da contagem de germe através de medição ATP Procedimento

3 ml da amostra do Exemplo 1A), pasta fluida aquosa 77,5% em peso de mármore natural moído da Norway (90% em peso das partículas <2μm, 65% em peso das partículas <1 μηπ) dispersa com 0,65% em peso de um poliacrilato de sódio comercial, foram pipetados no frasco estéril. A amostra foi adicionada com 3 ml de uma solução nutriente de base de caldo TAT/Tween 20 a 3% em peso e analisada por meio do luminômetro 1253 Bio- Orbit. A medida foi realizada através de tentativa imediata da medição da quan- tidade de luz liberada pelo ATP no luminômetro 1253 BioOrbit (tempo toh). Em adição, uma amostra foi medida após realização de uma diluição de 1:10.000. Desta maneira, o valor branco (toh) foi determinado em cada caso. Após tempos de incubação de 4 horas (tempo t4h), após 7 horas (tempo t7h) e após 17 horas (tempo t17h) medições da intensidade de luz no luminômetro 1253 BioOrbit fo- ram realizadas. A temperatura de incubação era de 30°C. Através do gráfico da intensidade de luz no respectivo tempo de incubação contra o tempo de incu- bação é possível determinar a presença de células vivas (aumento na intensi- dade de luz com o tempo). Após um tempo de incubação com crescimento quase exponencial a contaminação da suspensão pode ser determinada com- parativamente através da comparação da progressão das curvas das amos- tras individuais. Através disto, uma distinção semiquantitativa pode ser feita en- tre "nenhum crescimento", "crescimento fraco" e "crescimento forte".

Procedimento da medição no luminômetro 1253

a) Inicialmente, 100 μl de cada uma das amostras preparadas conforme acima descrito são pipetados em um tubo de ensaio do luminômetro.

b) A isto, 100 μl de reagente de liberação de ATP são adiciona- dos, misturados bem e deixados por um minuto de modo que o ATP pode ser removido através de extração.

c) Em seguida, 500 μΙ de reagente AMR são adicionados e mis- turados através de agitação.

d) Então, o tubo de ensaio pode ser introduzido na célula de medição e as leituras da emissão de luz podem ser realizadas.

Referência: O manual do usuário do luminômetro BioOrbit ver. 3,0. Maio de 1995, bem como nota da requerente 20 da BioOrbit OY com- pany, FIN 20521 Turky, Finlândia.

Resultado:

<table>table see original document page 16</column></row><table> Após 17 horas, nenhuma diferença entre os tempos de incuba- ção individuais pôde ser observada usando o método anterior da técnica, isto é, deve ser assumido que a pasta fluida não está contaminada. No en- tanto, a mesma pasta fluida foi usada no Exemplo 1A) (método de acordo com Schweizerisches Lebesmittelbuch), e uma vez que este método consi- derado usado no Exemplo dá um resultado de 3 χ 106 germes/ml fica óbvio que o resultado do presente Exemplo 1C) deve estar errado. Na prática, isto acarretaria conseqüências fatais tal como envenenamento do alimento ou o apodrecimento de produtos.

Usando o método da técnica anterior, é impossível determinar as bactérias, fungos e leveduras na suspensão acima mencionada.

Presumivelmente, a alta concentração de partícula na concen- tração original da suspensão resultou em adsorção de luz completa da quantidade de luz liberada pelo ATP na suspensão, e a diluição da amostra através deste método também leva a uma diluição dos germes microbiológi- cos presentes abaixo do seu limite de detecção.

Exemplos da Invenção:

Exemplo 2) Pasta fluida de carbonato de cálcio, instrumento de análise Instrumento de medição CellFacts

Procedimento

3 ml de cada pasta fluida aquosa a 77,5% em peso de mármore natural moído da Norway (90% em peso das partículas <2 μm, 65% em peso das partículas < 1 μm) dispersa com 0,65% em peso de um poliacrilato de sódio comercial são pipetados para os frascos estéreis separados. Uma amostra é adicionada com 3 ml de uma solução nutriente de 3% em peso de base de caldo TAT/Tween 20 e a segunda amostra com 3 ml de uma solu- ção nutriente de caldo de soja tríptico a 3% em peso. Em seguida, ambas amostras são bem misturadas por 20 segundos e então centrifugadas. Após uma centrifugação por 10 minutos a 800 g a fase de sobrenadante transpa- rente é isolada e analisada por meio de CellFacts. A análise é realizada através da medição do número de partículas no instrumento CellFacts ime- diatamente após a centrifugação (tempo t0h), após tempos de incubação de 2 horas (tempo t2h), 4 horas (tempo t4h) e após 6 horas (tempo t6h). A tempe- ratura de incubação era 30°C. Ao pôr em gráfico o número de partículas contra o diâmetro de partícula é possível determinar a presença de célula vivas (alargamento de pico) e o tipo de microorganismo (bactérias, leveduras ou fungos) após tempos de incubação particulares da fase transparente. Após um tempo de incubação com crescimento quase exponencial a conta- minação original da suspensão é determinada através do extrapolamento de volta para o tempo tOh comparação, a determinação de contagem de germe de acordo com Schweizerisches Lebesmittelbuch é realizada. ("Bes- timmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches Lebensmi- ttelbuch, capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988). Resultados:

Determinação de Contagem de Germe de Acordo com Schweizerisches Le- bensmittelbuch

A determinação de contagem de germe após 48 horas revelou: 3,0 x 10'6 germes mesofílicos aeróbicos/ml da suspensão

Determinação de contagem de germe usando o contador de partícula CellFacts

1. Base de caldo TAT/Tween 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano)

2. Ágar de caldo de soja tríptico

<table>table see original document page 18</column></row><table>

As amostras analisadas de acordo com o método da presente invenção estão de excelente acordo com a determinação da contagem de germe de acordo com o Schweizerisches Lebensmittelbuch determinado após 48 horas.

Comparadas à determinação da contagem de germe de acordo com Schweizerisches Lebensmittelbuch ambas amostras estão muito bem dentro dos limites de confiança.

Os limites de confiança, conforme aqui usado, pretendem signifi- car um desvio de ± 0,5 Iogi0 de determinações de contagem de germe indi- viduais conforme estabelecido pelo PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, Londres NW9 5HT, RU1 distribuição 070, páginas 6 e 7 e apêndice 1, data da distribuição 16 de novembro de 1998, data do relatório 30 de dezembro de 1998.

Exemplo 3) Pasta fluida de carbonato de cálcio, dispositivo de análise Iumi- nómetro BioOrbit 1253

Procedimento

500 ml de cada uma da pasta fluida aquosa de mármore natural moído a 71,5% em peso (90% em peso das partículas <2 μιτι, 65% em peso das partículas <1 μm) dispersa com 0,5% em peso de um poliacrilato de só- dio comercial foram carregados em frascos de vidro de 1 litro. Uma das amostras foi armazenada por 3 dias a 5°C (amostra A), a outra foi armaze- nada por 3 dias a 30°C (amostra B). Em seguida, as amostras foram trazidas para 20°C, e 3 ml de cada uma das amostras foram misturados bem com 3 ml do respectivo agente de extração em frascos estéreis. Seguindo a centri- fugação por 10 minutos a 600 g a fase de sobrenadante transparente é iso- lada e analisada quanto à emissão de luz por meio do luminômetro BioOrbit 1253. A análise é realizada medindo a intensidade da luz no luminômetro BioOrbit 1253 imediatamente após a centrifugação (tempo t0h), após 4 horas (tempo t4h), após 7 horas (tempo t7h), após 17 horas (tempo t17h>- A tempe- ratura de incubação era 30°C. Ao pôr em gráfico a intensidade de luz após o respectivo tempo de incubação contra o tempo de incubação é possível de- terminar a presença de células vivas (aumento na intensidade de luz com o tempo) na fase transparente. Após um tempo de incubação com crescimento quase exponencial o crescimento da contaminação da suspensão pode ser determinado comparativamente comparando a progressão das curvas das amostras individuais. Através disto, uma distinção semiquantitativa pode ser feita entre "nenhum crescimento", "crescimento fraco" e "crescimento forte".

Em comparação, uma contagem de determinação de germe de acordo com Schweizerisches Lebesmittelbuch foi realizada. ("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988).

Agentes de extração usados:

1. Técnica anterior, 0,9% em peso de solução de NaCI em água destilada sem substância orgânica que pode servir como um nutriente

2. De acordo com a invenção, 3% em peso de solução nutriente orgânica (ágar de caldo de soja tríptico)

Determinação de contagem de germe de acordo com o Schweizerisches Lebesmittelbuch

Amostra A: 5 χ 104 germes mesofílicos aeróbicos/g da suspen- são após 48 horas revelou;

Amostra B: 7 χ 107 germes mesofílicos aeróbicos/g da suspen- são após 48 horas revelou.

Resultado: Avaliação da contaminação com o luminômetro BioOrbit

Técnica anterior, 0,9% em peso da solução de NaCI em água destilada

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Usando o método da técnica anterior, nenhuma diferença clara é observada entre a suspensão fracamente e fortemente contaminada após 17 horas. De acordo com a presente invenção, 3% em peso de solução

nutriente orgânica (ágar de caldo de soja tríptico)

<formula>formula see original document page 21</formula>

Intensidade de luz

<figure> figure see orginal document page </figure>

Usando o novo método de acordo com a presente invenção, é possível distinguir entre soluções "fracamente" e "fortemente" contaminadas já após 7 horas.

Em adição, uma "contaminação fraca" pode ser significante- mente determinada já após 17 horas.

A literatura e o manual do usuário do luminômetro BioOrbit ver. 3.0, maio de 1995 bem como a "nota da requerente 20" da BioOrbit OY company, FIN 20521 Turku, Finlândia, também mostram modelos de avalia- ção para o cálculo da biomassa usando os valores [RLU]. Além disso, a contagem de germe/ml pode ser determinada através de "calibragem" usan- do suspensões com um grau de contaminação conhecido. Exemplo 4) Pasta fluida de argila americana Procedimento

3 ml cada de uma da pasta fluida a 72.8% em peso de argila americana natural moída da Geórgia USA (95% em peso das partículas <2 μm, 78% em peso das partículas < 1μm) dispersa com 0,35% em peso de um polia- crilato de sódio comercial são pipetados em frascos estéreis separados. Uma amostra é adicionada com 3 ml de uma solução nutriente de base de caldo TAT/Tween 20 a 3% em peso e a segunda amostra com solução nutri- ente de caldo de soja tríptico a 3% em peso. Em seguida, ambas amostras são misturadas bem por 20 segundos e então centrifugadas. Após uma cen- trifugação por 10 minutos a 800 g, a fase sobrenadante transparente é isola- da e analisada por meio de CeIIFacts. A análise é realizada através da medi- ção do número de partículas no instrumento CeIIFacts imediatamente se- guindo a centrifugação (tempo toh), após tempos de incubação de 2 horas (tempo t2h), após 4 horas (tempo t4h), após 6 horas (tempo t6h), após 12 ho- ras (tempo ti2h). A temperatura de incubação era 30°C. Ao pôr em gráfico o número de partícula contra o diâmetro dessas partículas é possível determi- nar a presença de células vivas (alargamento de pico) e as espécies dos microorganismos (bactérias, leveduras ou fungos) após tempos de incuba- ção particulares da fase transparente. Após um tempo de incubação com crescimento quase exponencial a contaminação original da suspensão é determinada através de extrapolamento de volta para o tempo W Em com- paração, uma determinação de contagem de germe de acordo com Schwei- zerisches Lebesmittelbuch é realizada. ("Bestimmung von aeroben meso- philen Keimen", Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988).

Determinação de contagem de germe de acordo com Schweize- risches Lebensmittelbuch

A determinação de contagem de germe após 48 horas revelou: 5,0 x 105 germes mesofílicos aeróbicos/ml de suspensão

Determinação da contagem de germe usando o contador de partícula CeIIFActs

1. Base de caldo TAT/Tween 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano) 2. Ágar de caldo de soja tríptico

<table>table see original document page 23</column></row><table>

Comparado à determinação da contagem de germe de acordo com Schweizerisches Lebensmittelbuch ambas amostras estão muito bem dentro dos limites de confiança.

Os limites de confiança, conforme aqui usado, pretende signifi- car um desvio de ± 0,5 log10 de determinações de contagem de germe indi- viduais conforme estabelecido pelo PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, Londres NW9 5HT, RU, distribuição 070, páginas 6 e 7 e apêndice 1, data da distribuição 16 de novembro de 1998, data do relatório 30 de dezembro de 1998. Exemplo 5) Água branca de máquina de fazer papel Procedimento

3 ml de uma pasta fluida aquosa a 0,5% em peso contendo cer- ca de 0,2% em peso de mármore natural moído da Norway (60% em peso das partículas <2 μm, 35% em peso das partículas < 1 μm) dispersa com 0,15% em peso de um poliacrilato de sódio comercial e cerca de 0,3% em peso de fibras de celulose (polpa de papel de sulfeto/sulfato) como é usada nas fábricas de papel para fabricação de papel e cerca de 0,05% em peso de uma poliacrilamida comercial são pipetados para um frasco estéril sepa- rado. A amostra é adicionada com 3 ml de uma solução nutriente de caldo de soja tríptico a 3% em peso. Em seguida, a amostra é bem misturada por 20 segundos e então centrifugada. Após uma centrifugação por 10 minutos a 1000 g a fase de sobrenadante transparente é isolada e analisada por meio de CeIIFacts. A análise é realizada através da medição do número de partí- culas no instrumento CeIIFacts imediatamente após a centrifugação (tempo t0h), após tempos de incubação de 1 hora (tempo tih), 2 horas (tempo t2h). A temperatura de incubação era 30°C. Ao pôr em gráfico o número de partí- culas contra o diâmetro dessas partículas é possível determinar a presença de célula vivas (alargamento do pico) e o tipo de microorganismo (bactérias, leveduras ou fungos) após tempos de incubação particulares da fase trans- parente. Após um tempo de incubação com crescimento quase exponencial a contaminação original da suspensão é determinada através do extrapola- mento de volta para o tempo toh Em comparação, a determinação de contagem de germe de acordo com Schweizerisches Lebesmittelbuch é realizada. ("Bes- timmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches Lebensmi- ttelbuch, capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988).

A determinação da contagem de germe após 48 horas revelou: 3,0 χ 107 germes mesofílicos aeróbicos/ml de suspensão

Determinação de contagem de germe usando o contador de partícula CeIIFActs

1. Ágar de caldo de soja tríptico

<table>table see original document page 24</column></row><table> <table>table see original document page 25</column></row><table>

Os limites de confiança, conforme aqui usado, pretende signifi- car um desvio de ± 0,5 logio de determinações de contagem de germe indi- viduais conforme estabelecido pelo PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, Londres NW9 5HT, RU, distribuição 070, páginas 6 e 7 e apêndice 1, data da distribuição 16 de novembro de 1998, data do relatório 30 de dezembro de 1998.

Exemplo 6) Suspensão de amido coloidal

Procedimento

3 ml de uma suspensão de amido de milho coloidal aquosa a 10% em peso conforme empregada em fábricas de papel são pipetados para um frasco estéril separado. A amostra é adicionada com 3 ml de uma solu- ção nutriente de caldo de soja tríptico a 3% em peso. Em seguida, a amostra é bem misturada por 20 segundos e então centrifugada. Após uma centrifu- gação por 10 minutos a 800 g a fase sobrenadante transparente é isolada e analisada por meio de CeIIFacts. A análise é realizada através da medição do número de partículas no instrumento CeIIFacts imediatamente após a centrifugação (tempo t0h), após tempos de incubação de 1 hora (tempo t1h), 2 horas (tempo t2h). A temperatura de incubação era 30°C. Ao pôr em gráfico o número de partículas contra o diâmetro dessas partículas é possível deter- minar a presença de célula vivas (alargamento do pico) e o tipo de microor- ganismo (bactérias, leveduras ou fungos) após tempos de incubação parti- culares da fase transparente. Após um tempo de incubação com cresci- mento quase exponencial a contaminação original da suspensão é determi- nada através do extrapolamento de volta para o tempo W Em comparação, a determinação de contagem de germe de acordo com Schweizerisches Le- besmittelbuch é realizada. ("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988).

A determinação da contagem de germe após 48 horas revelou: 4,0 χ 106 germes mesofílicos aeróbicos/ml de suspensão

Determinação de contagem de germe usando o contador de partícula CeIIFActs

1. Ágar de caldo de soja tríptico

Amostra Agente de Extração Tempo de determi- nação requerido em horas Germes mesofílicos aeróbi- cos/ml de suspensão (pico máx. no diâmetro de partí- cula de 1-2,5 μm)

Ágar de caldo de soja tríptico <table>table see original document page 26</column></row><table>

As amostras analisadas de acordo com o método da presente invenção estão de excelente acordo com a determinação da contagem de ger- me de acordo com o Schweizerisches Lebensmittelbuch determinado após 48 horas.

Os limites de confiança, conforme aqui usado, pretende signifi- car um desvio de ± 0,5 Iogio de determinações de contagem de germe indi- viduais conforme estabelecido pelo PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, Londres NW9 5HT, RU1 distribuição 070, páginas 6 e 7 e apêndice 1, data da distribuição 16 de novembro de 1998, data do relatório 30 de dezembro de 1998.

Exemplo 7)

Procedimento

3 ml cada de uma da pasta fluida a 71,5% em peso de mármore natural moído (90% em peso das partículas <2 μηπ, 65% em peso das partí- culas < 1μιτι) dispersa com 0,5% em peso de um poliacrilato de sódio co- mercial são misturados bem em frascos estéreis com 3 ml cada do respecti- vo agente de extração. Após uma centrifugação por 10 minutos a 800 g, a fase sobrenadante transparente é isolada e analisada por meio de CeIIFacts. A análise é realizada através da medição do número de partículas no ins- trumento CeIIFacts imediatamente seguindo a centrifugação (tempo toh), após tempos de incubação de 2 horas (tempo t2h), após 4 horas (tempo Í4h), após 7 horas (tempo t7h), após 17 horas (tempo ti7h) e após 24 horas (tempo t24h)· A temperatura de incubação era 30°C. Ao pôr em gráfico o número de partícula contra o diâmetro dessas partículas é possível determinar a pre- sença de células vivas (alargamento de pico) e as espécies dos microorga- nismos (bactérias, leveduras ou fungos) após tempos de incubação particu- lares da fase transparente. Após um tempo de incubação com crescimento quase exponencial a contaminação original da suspensão é determinada através de extrapolamento de volta para o tempo W Em comparação, uma determinação de contagem de germe de acordo com Schweizerisches Le- besmittelbuch é realizada. ("Bestimmung von aeroben mesophilen Keimen", Schweizerisches Lebensmittelbuch, capítulo 56, seção 7.01, edição de 1985 versão revisada de 1988).

Agentes de extração usados:

Técnica anterior:

1. Água destilada

2. 0,9% em peso de solução de NaCI em água destilada, sal inorgânico

3. 0,8% em peso de solução de monolaurato de polioxietileno sorbitano (2 moles de polioxietileno), tensoativo orgânico Exemplo de acordo com a presente invenção

4. 3% em peso de solução nutriente orgânica (ágar de caldo de soja tríptico) Determinação de contagem de germe de acordo com o Schweizerisches Lebesmittelbuch

A determinação da contagem de germe após 48 horas revelou 5,0 χ 104 germes mesofílicos aeróbicos/ml de suspensão

Determinação de contagem de germe usando o contador de

partícula CeIIFActs

<table>table see original document page 28</column></row><table>

As amostras 1-3 primeiro mostraram claramente que um tempo de incubação muito longo é requerido até que um resultado possa ser cal- culado e, segundo, que também este resultado está incorreto. (Referência: determinação da contagem de germe de acordo com o Schweizerisches Le- besmittelbuch).

Quanto às amostras 1-3, a variação para a contagem de germe determinada de acordo com o Schweizerisches Lebesmittelbuch está muito além do limite de confiança.

As amostras 1 e 2 não têm uma substância orgânica que pode agir como um nutriente. A amostra 3 contém uma substância orgânica. No entanto, esta substância não é ativa como um nutriente, pelo contrário, como um inibidor. Uma certa inibição pelo Tween 20 já pode ser observada no Exemplo 4-1 onde Tween 20 foi empregado se o resultado for comparado ao Exemplo 4-2. No entanto, a substância orgânica que atua como uma solução nutriente empregada de acordo com a presente invenção era capaz de pre- venir um resultado incorreto no caso do Exemplo 4-2. No entanto, em com- paração ao Exemplo 7-4, o Exemplo 7-3 dá um resultado errôneo fatal!

A amostra 4 que foi analisada de acordo com o método da pre- sente invenção está em excelente acordo com a determinação de contagem de germe de acordo com Schweizerisches Lebesmittelbuch.

Na amostra 4, a diferença para a determinação da contagem de germe de acordo com Schweizerisches Lebesmittelbuch está muito bem dentro dos limites de confiança.

Os limites de confiança, conforme aqui usado, pretendem signifi- car um desvio de ± 0,5 Iogi0 de determinações de contagem de germe indi- viduais conforme estabelecido pelo PHLS Central Public Health Laboratory, 61 Colindale Avenue, Londres NW9 5HT, RU, distribuição 070, páginas 6 e 7 e apêndice 1, data da distribuição 16 de novembro de 1998, data do relatório 30 de dezembro de 1998.

Composições do meio nutriente preferido

Caldo de soja tríptico

Bactotriptona 17,0 g/l

Bacto soitona 3,0 g/l

Bacto dextrose 2,5 g/l

Cloreto de sódio 5,0 g/l

Fosfato de dipotássio 2,5 g/l Base de caldo TAT

Bacto triptona 20,0 g/l

azolectina 5,0 g/l

Caldo Nutriente

Extrato de carne bacto 3,0 g/l

Bacto peptina 5,0 g/l

Peptina de caseína, digestão tríptica

Peptina de caseína 1,0 g/l

cloreto de sódio 1,8 g/l <table>table see original document page 30</column></row><table>

Claims

1. Processo para a determinação quantitativa e/ou qualitativa da contaminação microbiana de suspensões, emulsões ou dispersões contendo minerais e/ou pigmentos e/ou materiais de enchimento e/ou materiais de fibra, caracterizado pelo fato de que a) uma amostra das suspensões, emulsões ou dispersões é mis- turada com uma ou mais substâncias orgânicas que podem ser degradadas por microorganismos e que são eficazes como agente de separação entre os microorganismos e os minerais, pigmentos, materiais de enchimento e/ou materiais de fibra, onde a quantidade da substância biodegradável é sele- cionada de uma maneira que a separação dos microorganismos dos mine- rais, materiais de enchimento, pigmentos e/ou materiais de fibra é tornada possível, e onde opcionalmente uma incubação é realizada para aumentar o número dos microorganismos, b) a mistura desse modo obtida é centrifugada a 100 - 1500 g de modo que a maior parte dos minerais e/ou materiais de enchimento e/ou pigmentos e/ou materiais de fibra é separada dos microorganismos e os mi- croorganismos estão na fase superior, e c) o sobrenadante aquoso obtido através da centrifugação é de preferência submetido a uma ou mais incubações a fim de aumentar o nú- mero de microorganismos no dito sobrenadante, e d) o número e/ou o tamanho e/ou o tipo dos microorganismos neste sobrenadante é determinado, em que a dita contaminação microbiana é por bactérias e/ou fungos e/ou leveduras.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita substância orgânica que pode ser degradada pelos micro- organismos é adicionada na forma de um meio nutriente para os microorga- nismos.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o dito meio nutriente contém uma fonte de carbono, nitrogênio, fosfato e/ou enxofre bem como opcionalmente minerais, fatores de cresci- mento e/ou vitaminas.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a centrifugação é realizada de preferência a 200-1.200 g, particularmente de preferência a 600-1.000 g.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a temperatura de incubação é de 20-37°C, de preferência 28-34°C e mais vantajosamente 31,5-32,5°C.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tais meios nutrientes são usados, os quais permitem o crescimento seletivo dos germes a serem determinados.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é usado como o meio nutriente, ágar de caldo azolectina triptona/Tween 20 (TAT) e/ou solução de glicose e/ou pep- tona/caseína e/ou caldo nutriente, de preferência ágar de caldo de soja tríptico.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a concentração do meio nutriente quanto aos microorganismos é de preferência 0,1-10% em peso, mais vantajosa- mente 2-5% em peso e mais vantajosamente 3% em peso.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a suspensão, emulsão ou dispersão con- tém ainda polímeros em uma forma coloidal.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a determinação qualitativa e/ou quantita- tiva de bactérias e/ou fungos e/ou leveduras é realizada simultaneamente em uma análise.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a etapa de centrifugação é realizada por um tempo de 1-30 minutos, de preferência 2-15 minutos, particularmente de preferência 10 minutos.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a fase obtida através de centrifugação contendo microorganismos é analisada quanto à quantidade de microorga- nismos por meio do método de análise de tamanho de partícula.

13. Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tamanho e o número de microorganismos são analisados através da aspiração da amostra dos microorganismos por meio de um vá- cuo através de um poro de medição tendo um comprimento e um diâmetro definido onde uma tensão é aplicada à entrada e à saída do poro e um pulso de corrente é medido quando da passagem dos microorganismos através da amostra que está diretamente relacionado ao volume do microorganismo, e o número de pulsos de corrente está relacionado ao número de microorga- nismos.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a fase obtida através de centrifugação contendo microorganismos é analisada quanto à quantidade de microorga- nismos através da determinação da ATP produzida pelos microorganismos.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a contaminação microbiana de disper- sões, emulsões e suspensões é investigada na indústria de metal, na indús- tria de pigmento e papel bem como nas águas brancas da indústria de papel.