TWI245636B - gamma delta T cell immunoactivity enhancers containing extract of Lentinus edodes mycelium - Google Patents

Description

1245636 (1) 玖、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明爲提供一種含香菇菌絲體萃取物’ y δ τ細胞 的活性增強劑之開發，即，關於免疫活性劑的開發以及提 供。 本發明更係含香菇菌絲體萃取物，r 6 Τ細胞的活性 增強作用，即，關於提供具有免疫活性作用的食品、飮料 以及飼料的開發。 本發明進一步地爲關於提供含香蘇菌絲體卒取物’抗 腫瘤劑、抗細菌感染治療劑以及抗病毒感染治療劑之開發 【先前技術】 7 (5 T細胞的特徵 於動物的血液中存在的末梢T細胞，由其細胞表面抗 原的T細胞受容體（T C R )的種類，大略分爲二種類之 T細胞，其存在係公知的事。其中一種爲於細胞表面具有 T C R α鏈以及/3鏈的a /3 T細胞，另一種爲T C R 7鏈 以及具有5鏈r (5 Τ細胞。對於人類，r <5 Τ細胞對一般 末梢血液以及淋巴組織僅存在數％至1 0 %程度，其爲完 全與a /3 T細胞具有相異特徵的傷害殺傷細胞。 r占Τ細胞存在於人的腸管、皮膚以及末梢血液中等 ，作用於局部免疫。作爲7 (5 T細胞的功能，有對癌細胞 傷害活性、細菌或病毒的感染防禦活性等至今被報告出。 (2) 1245636 T 5 T細胞的感染防禦活性 脾臟等被認定的7 δ Τ細胞中，存在著感染時產生 I L 一 4或I FN—α等cytokine的細胞。在實驗上作出 不存在這些細胞的狀況時，已知會對細菌感染抵抗性減弱 。例如，有報告指出，對投與T 6型T C R抗體時可過渡 性地抑制7 5 T細胞機能的老鼠或T C R 6基因缺失老鼠 而言，可降低 Mycobacterium tuberculosis的感染之抵ί几 性（Ladel C，et al.，Eur J Immunol，1995,25:2877-2881) 。又有報告指出Listeria monocytogenes 的感染的初期有 7 5T 細胞出現（Hiromatsu K，et al.，J Exp Med，1992, 1 7 5 : 4 9 - 5 6 )。由這些可知，r δ T細胞對於細菌感染爲 生物體防禦的重要細胞。 且，有報告指出B型肝炎病毒的慢性感染，肝臟以及 脾臟的Τ δ T細胞會被誘發增殖（Ozaki S, et al ·，J Med Invest, 1998,44:215-217)。又，與正常老鼠比較，缺欠r (5 T 細胞的老鼠體內，對於牛痘病毒感染初期，有報告指出會有 顯著地增加（Welsh RM，et al.，Immunol Rev, 1997, 1 5 9:79-93 )。可此可知，r 5 T細胞不僅對於上述細菌 感染症有作用，對於病毒的感染亦顯出有作用。 7 3 T細胞的癌細胞傷害活性 r <5 T細胞係對自身癌細胞有著特異殺傷性，且係對 於自身的正常淋巴球（例如a /3 T細胞）卻完全無顯示殺 -6- (3) 1245636 * 傷的T細胞。此點表不，使用 . 時，有著極少產生副作用的危 相反的a /3 Τ細胞因已知其對 傷自身白血球，對於癌的治療 產生嚴重副作用的危險性。因 性化的^ d Τ細胞爲可期待的 且7 5 T細胞爲Μ H C非 與Ν κ細胞類似的性質。r (5 有1 0 %存在著，但隨著年齢 報告指出隨著年齡的增長癌的 體內的r 6 τ細胞減少有關。 血中1 5%至5 0%者有7 δ 較少發生癌症的事看來，顯示 症的抑制有著密切的關係。 香薛的藥理效果 香薛(Leutinus edodes) 用菇，日本約3 0 0年前便進 類爲子實體，其爲菌類爲使下 殖體，係爲營養體的菌絲細胞 生長。 香菇自古便有傳說對各種 對其藥理作用的解明僅爲最近 物的小白鼠、家鼠之引發癌症 活性r δ τ細胞對癌作治療 險性之效果。與r 6 τ細胞 自身癌細胞無殺傷，而會殺 因活性化a /3 T細胞而有著 此，對癌的治療考慮使用活 〇 限制性地殺死癌細胞，有著 Τ細胞於幼兒末梢血液中約 的增加其數會減少。因此有 發生便提高其爲原因，此與 又，雞、綿羊、牛等其末稍 Τ細胞存在。由這些動物中 末梢Τ 5 Τ細胞的存在與癌 於曰本、中國爲代表性的食 行人工栽培。日常食用的菇 一代能留下而產生胞子的生 於地中或原木中經常時間的 疾病或症狀有治療效果，但 的事。對於香菇菌絲體萃取 實驗中，可抑制動物的大腸 -7- (4) 1245636 • 、肝臟等腫瘤形成或移植腫瘤細胞的增殖’提升動物的生 存率(N . Sugano e t al.，Cancer Letter, 27:1，1985;鈴 木康將們，日本大腸肛門病會誌，4 3 :1 7 8,1 9 90等），顯示促進 糸田月包分裂活性（T · T a b a t a e t a 1 · ， I m m u η o p h a r m a c o 1 o g y， 24:5 7， 1 9 9 2;Y . Hibino et al . , I m m uηopharmaco1ogy; 2 8:77, 1 994 等）、增強抗體的產生，藉著抗體 ADCC(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicty)顯示 免疫學上對肝細胞障礙的抑制效果（溝口靖紘們，肝膽滕 ，1 5 ·· 1 2 7，1 9 8 7 )等種種有報告。 由此見解可知香菇成分的藥理成份之硏究，已進行至 醫學藥學的分野中。其結果，香菇成份的一部分可使用於 人類免疫能力回復進而對癌症等之治療，又已知可能具有 抑制引發癌症之事。 本發明的目的爲，對香菇菌絲體萃取物的藥理作用更 詳細說明，則爲探索香菇菌絲體萃取物的新穎性醫藥、食 品、飮料、飼料等用途。 本發明的目的爲開發、提供一種含有香菇菌絲體萃取 物的r (5 T細胞活性增強物質，並且又開發、提供一種免 疫活性劑，例如爲抗腫瘤劑、抗細菌感染治療劑以及抗病 毒感染治療劑。 本發明另一目的爲，使用含有香菇菌絲體萃取物的 r 5 τ細胞活性增強物質，或者使用含有香菇菌絲體萃取 物的免疫活性劑，治療被檢驗體的腫瘤。 -8- 1245636 (5) * 【發明內容】 * 〔發明的揭示〕 本發明者爲解決上述課題而詳細硏究結果’發現香菇 菌絲體萃取物顯示有顯著增強r 6 τ細胞活性的作用，便 完成本發明。 即，本發明的目的爲開發、提供一種含有香菇菌絲體 萃取物的r δ τ細胞活性增強物質，並且又開發、提供一 種免疫活性劑，例如爲抗腫瘤劑、抗細菌感染治療劑以及 抗病毒感染治療劑。 本發明的r 6 τ細胞活性增強物質或免疫活性劑係， 可含有香菇菌絲體萃取物以及作爲任一成份之藥劑上可容 許的載體，以醫藥組成物的型態。 又，本發明的7 δ τ細胞活性增強物質或免疫活性劑 ，可經口投與用、注射用、經黏膜投與用、經消化管投與 用或經皮投與用任一種皆可。 又，本發明的7 (5 T細胞活性增強物質或免疫活性劑 可以食品、飮料、或飼料任一種型態皆可。 【實施方式】 〔實施發明的最佳型態〕 使用於本發明的r <5 τ細胞活性增強的香菇菌絲體萃 取物，係由香菇菌於固體培養基下培養所得的菌絲體，較 佳爲含有菌絲體的固體培養基，於水與酵素存在下粉碎， 分解所得的萃取物而言。

-9- (6) 1245636 香？S菌絲體萃取物較佳爲使用以下的方法所得者，但 不限定於此。即’蔗渣（甘蔗渣）與脫脂米糠爲基材的固 體ί古養基上接種香姑菌，再將其菌絲體增殖所得的含有菌 絲體的固體培養基通過1 2篩孔（每平方英吋孔眼數）的 份量爲3 0重量％以下而解束。此被解束的固體培養基中 添加水以及選自於纖維酶、蛋白酶或葡萄糖酶的一種或以 上的酵素’前述固體培養基保持3 〇至5 5〇c的溫度而添 加的同時’前述的固體培養基於前述酵素存在下粉碎，禱 爛使蔗澄最少以7 0重量％以上的份量通過1 2篩孔。再 加熱至9 5 C的溫度使其酵素失去活性而同時滅菌，所得 的懸濁狀液經濾過而得到香菇菌絲體萃取物。此香菇菌絲 體卒取物可直接使用於本發明的r 6 T細胞活性增強物質 ’亦可將此濃縮、冷凍乾燥成爲粉末保存，使用時可因種 種的型態而便利使用。冷凍乾燥所得的粉末爲褐色粉末， 具吸濕性，且具特異味道與臭味。 香姑囷絲體萃取物的體內（i n V i V 〇 )中γ 3 T細胞活 性增強物質以下述的實施例所記載的方法進行試驗時，觀 察到顯著的r (5 τ細胞活性增強效果。 本發明的r (5 τ細胞活性增強物質對因r 5 τ細胞對 腫瘤細胞進行傷害而對腫瘤之治療以及/或預防具有效果 。本發明的7 5 T細胞活性增強物質並無對特定的腫瘤細 胞有彳寸性的治療，其特徵爲以提高7 5 T細胞的活性，因 7’ δ 丁細胞的活性化其結果可以破壞腫瘤細胞爲目的。即 ’使用本發明的7 (5 Τ細胞活性增強物質對作爲治療對象

•10- 1245636 (7) ' 的腫瘤細胞之治療，不僅爲惡性腫瘤細胞，良性腫瘤細胞 * 即可，不限定特定腫瘤細胞。因此，含有香菇菌絲體萃取 物以及作爲任意成份而藥劑上可容許的載體之7 6 τ細胞 活性增強物質，可作爲任一種腫瘤治療用以及/或預防用 組成物而使用。 本發明的7 δ τ細胞活性增強物質，可作爲細菌感染 或病毒感染的治療用以及/或預防用組成物使用◦本發明 的r δ τ細胞活性增強物質非對特定細菌或病毒有者特異 的作用，而以提高7 (5 T細胞的活性，以其結果被感染細 菌或病毒由體內排除爲目的。本發明的r <5 T細胞活性增 強物質可治療的細菌性或病毒性疾病，例如有結核菌（ Mycobacterium sp·)、單核白血球增多性李士德菌 (Listeria monocytogenes)、肝炎病毒（A 型、B 型、C 型） 、人類免疫不全病毒（Human Immunodeficiency Virus) > 牛痘病毒（Vaccinia virus)等可舉出，但不侷限於此。 作爲治療用以及/或預防用組成物的投與路線，雖經 口投與最佳，但以靜脈內投與、腹腔內投與、皮下投與、 肌肉內投與、經鼻投與、經皮投等亦可。作爲經口投與較 佳的製劑含有，錠劑、膠囊、散劑、顆粒劑、溶液劑、糖 漿劑等，但不侷限於此。經鼻投與或經皮投與較適合的製 劑含有貼劑、貼布劑等，但不侷限於此。 藥劑可容許的載體含有斯業界公知的適當賦形劑、分 解劑、滑潤劑、香料、著色劑、溶解補助劑、懸濁劑、塗 布劑等。但不侷限於此。 -11 - 1245636 (8) • 作爲本發明的L A K活性增強用製劑可任意 - 學上谷δ午之載體’斯案界中公知的賦形劑（例如 葡萄糖、澱粉、結晶纖維等）、結合劑（澱粉、 基纖維、聚乙嫌比各院酮等）、分解劑（丨殿粉、 纖維鈣、羧基甲基澱粉等）、潤滑劑（滑石、硬 )、塗布劑（白糖、滑石、明膠等）等，且各種 、香料 '著色劑、矯味劑、溶解補助劑、安定化 劑、吸收促進劑等可因應目的而添加，但不侷限 ，作爲注射劑使用時，對於此分野可使用一般慣 稀釋劑（例如有水、乙醇等）。 本發明的r 3 τ細胞活性增強物質的投與量 者的年齡、體重、症狀、投與途徑等被考慮而由 。本發明的r 5 τ細胞活性增強物質所含有的香 萃取物原本即可作爲食品使用，由其爲極爲安全 ，雖無需嚴格限定其投與量，但香蘇菌絲體萃取 次（2至3次左右），1次量爲1〇〇 mg至1 m g ( 1日的總投與量約爲2 0 0 m g至3 0 〇 )爲佳，且較佳爲1日3次，1日約5〇〇m g 5 0 0 0 m g (總投與量爲1日約1 5〇〇m g 15000 mg)，且更佳爲1曰3次，1曰約 m g至1 5 0 0 m g (總投與量爲1日約3 0〇 4 5 0 0 m g )。且，可與其他抗腫瘤劑合倂使 本發明的r 6 τ細胞活性增強細胞物質爲， 治療腫瘤時於被動免疫法所使用的製劑。作爲被 混合的藥 有乳糖、 明膠、甲 羧基甲基 脂酸鹽等 光澤化劑 劑、懸濁 於此。又 用的各種 依被檢驗 醫師決定 菇菌絲體 的事看來 物1曰數 0 0 0 0 0 0 m g 至 至 10 0 0 〇m g至 用。 提供一種 動免疫法 -12- (9) 1245636 * ，於被感染的細胞中一般將淋巴球移入生物體內，達到殺 . 死腫瘤細胞爲目的的腫瘤治療方法。本發明的情況，首先 將來自被檢驗體的的末梢血分離r δ τ細胞，分離後的 r 5 τ細胞於體外中以本發明的r 6 τ細胞活性增強物質 活性化後，活性化後的r (5 τ細胞再次還回被檢驗體的體 內。結果，因活性化的r δ τ細胞的作用，將可破壞體內 的腫瘤細胞。 本發明的r (5 τ細胞活性增強物質，可直接使用香菇 菌絲體萃取物亦可，或含有香菇菌絲體萃取物的r (5 τ細 胞活性增強物質，以及含有藥學上許可的載體之醫藥，或 獸醫藥用組成物即可。 本發明的7 δ T細胞活性增強物質可用食品的型態提 供。較佳的食品型態爲粉末、顆粒、糊狀、膠狀等可舉出 。且使用顆粒等時，作爲可添加的甘味料，可添加乳糖等 糖類。又，本發明的7 5 T細胞活性增強物質可以飮料的 型態提供。如此之食品或飮料中，含有特定保健用食品、 病者用食品等範圍。 本發明的r (5 τ細胞活性增強物質，做爲飼料或添加 於飼料中添加劑的形式提供亦可。作爲家畜的飼料或飼料 中的添加劑，因使用本發明的7 (5 τ細胞活性增強物質， 可治療以及/或預防家畜發生腫瘤，或可對於家畜的細菌 或病毒性感染症之治療以及/或預防。其結果，對於家畜 現今所使用的治療藥，例如可減少抗生素物質等的使用量 ’並可減低隨之的飼料成本。且，具有可降低因抗生物質 -13- (10) 1245636 s與時生產物無法出貨的時間之驚人效果。 _ h人類被檢驗體，體內中的^ ^ τ細胞活性增強效 ^ §式驗法如以下進行。首先將香菇菌絲萃取物粉末3 . 6 g，經7天每天接種於人類被檢驗體（全量爲2 5 · 2 g ) °再以香链菌絲體萃取物服用後的末梢血中7 6 T細胞頻 率與服用前的當該細胞頻率以使用流動細胞測試儀測定並 作比較。 本發明雖於下述的實施例中更詳細說明，但其不能限 定本發明的範圍。本發明的方法可由斯業者作種種變更、 修飾而使用，這些則包含於本發明中。 實施例 實施例1 :香菇菌絲體萃取物的調製法 蔗瘡9 0重量份，米糠1 〇重量份所成的固體培養基 使其含適當水後，接種香菇種菌，放置於調整溫度以及濕 度的培養室內，使菌絲體增殖。菌絲體於固體培養基下聚 集後’解開蔗渣基材的纖維素束，使其成爲1 2篩孔（每 平方英吋的孔眼數）可通過份量爲2 4重量％以下。此解 束之後的培養基1 · 〇 k g中，純水3 · 5 L以及純化的 纖維酵素2 · 〇 g，以邊保持固體培養基爲4 〇 °C邊加入 ，成爲含有培養基的混合物。 其次’含有培養基的混合物以附有變速齒輪的幫浦一 邊將其循環，一邊將固體培養基於齒輪部分進行粉碎以及 揆爛作用2 0 〇分鐘的程度，使其蔗渣纖維能約以8 0重 -14- 1245636 (11) 量％作爲1 2篩孔的通過份量，含有培養基的混合物進行 - 粉碎與揆爛爲，邊徐徐上升該混合物的溫度邊實施。其後 ’含有培養基的混合物再加溫至9 〇 t放置3 0分鐘。使 酵素失去活性同時進行滅菌，於9 〇 t下放置3 〇分鐘。 因9 0 °C的加熱使得酵素失去活性，且實施殺菌過程。所 得的含有培養基混合液以6 0篩孔濾布過濾作爲香菇菌絲 體萃取物，將此濃縮後經凍結乾燥，得到香菇菌絲萃取物 原始粉末。 如此所得的香菇菌絲體萃取物以苯酚硫酸法進行糖値 分析得知含有糖値爲2 5 · 3 % (重量/重量）、以洛瑞 法（Lowry法）進行蛋白質分析得知含有蛋白質1 9 . 7 % (重量/重量），以沒食子酸爲基準的佛隆-丹尼斯法 (Folon-Denis法）得知含有聚苯酚2 . 6 % (重量/重 量）。香菇菌絲體萃取物中亦含有其他粗脂肪8 % 、粗灰 份2 2 % ，糖質以外的可溶性無氨物約2 0 % 。 其中香菇菌絲體萃取物中所構成的糖組成物如以下所 示：Xyl :15.2;Ara:8.2;Man:

8.4;Gul :39.4 ; Gal :5.4;G1cN :12.0 ;GLuUa:11.3° 實施例2 :香菇菌絲體萃取物的r 5 T細胞活性增強體內 試驗 人類被檢驗者3名（被檢驗者A〜C )以香薛菌絲體 萃取物原始粉末3 · 6 g /日經7天每天經口服用（全量 -15- 1245636 (12) ' 爲2 5 · 2 g )。經過香菇菌絲體萃取物的服用期間後， - 自人類被檢驗體取出末梢血。服用後所取的末梢血中之 7，5 T細胞頻率，與服用前所取的末梢血中之細胞頻率作 比較，以流動細胞測試器測定。所得的結果如圖1以及圖 2所示。 3名全部人員皆與香菇菌絲體萃取物的服用前作比較 ，服用後的其末梢血中7 δ T細胞的比率平均上升4〇％ 以上。 表1 :對服用前後，末梢血r c? Τ細胞比率的增加率

被檢驗者 被檢驗者 被檢驗者 平均:t S EM

ABC 增加 1 2 4.3 9% 146.15% 1 5 0.00% 1 4 0.1 8 % ± 7.7 9 % 率 另一方面，對由同一被檢驗者中取出服用前後的末梢 血液，對r δ τ細胞以外的標示物作調查。其結果，香菇 菌絲體萃取物中未見到對r 5 τ細胞的增値活性，其平均 値卻顯示細胞比率的減少（圖3 )。 產業上可利用性 含有本發明的香菇菌絲體萃取物之r 6 τ細胞活性增 強物質，得知實際上可活性化τ 6 τ細胞。由此可知，本 發明的r 5 τ細胞活性增強物質因會誘導具有r 5 τ細胞 -16- 1245636 (13) '的腫瘤細胞傷害活性、抗細菌感染以及抗病毒感染作用， 而具有生物體對腫瘤、細菌感染以及病毒感染的防禦效果 ，可使用於腫瘤、細菌感染以及病毒感染的預防、治療。 又，7 6 T細胞對本發明的r (5 T細胞活性增強物質，因 無副作用故可安全地使用，期待可利用於龐大產業上。 又，對於引起細菌感染以及/或病毒感染的家畜而言 ，現今所使用的治療藥，例如抗生物質等可減少其使用量 ，隨之可降低飼養成本。且，因不使用抗生物質，故可減 短生產品無法出貨的時間之如此進一步效果。 【圖式簡單說明】 圖1爲表示，服用本發明的香菇菌絲體萃取物後， r 5 τ細胞於末梢血中比率的提高。 圖2爲表示，服用香菇菌絲體萃取物的前後，7占T 細胞的流動位置檢測解析（flowsite metry )之結果。 圖3爲表示，服用香菇菌絲體萃取物後α /3 τ細胞於 末梢血中的比率，換言之爲因減少而作爲照圖表示。

Claims (1)

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(1) j 拾、申請專利範圍

第93 1 00696號專利申請案 中文申請專利範圍修正本 民國94年5月9日修正 1 · 一種r 5 T細胞活性增強物質，其特徵爲含有& 含有蔗渣爲基材的固體培養基作爲原料，含有由以下步，驟 解開含有經接種香廷（Lentinus edodes)菌，增殖菌 絲體所得菌絲體之蔗渣爲基材的該固體培養基至1 2篩孔 通過部分爲30重量％以下； 經解開的固體培養基中於3 0〜5 5 °C下添加水及一種 或以上選自於纖維酶、蛋白酶、或葡萄糖酶之酵素； 該酵素存在下粉碎、禱爛該固體培養基； 使該酵素失去活性； 過濾所得之懸浮狀液體； 所得的香菇菌絲體萃取物者。 2 ·如申請專利範圍第1項的r 6 τ細胞活性增強物 質，其爲使用於經口投與者。 3 ·如申請專利範圍第1項的r <5 丁細胞活性增強物 質，其爲食品。 4 ·如申請專利範圍第1項的7 5 T細胞活性增強物 質，其爲飮料。 5 ·如申請專利範圍第1項的r 5 T細胞活性增強物 1245636 (2) ' 質，其爲飼料。 6 ·如申請專利範圍第1項的r 5 T細胞活性增強物 質，其爲使用於注射或經皮吸收者。 7 ·如申請專利範圍第1項的r 5 T細胞活性增強物 質，其使用於由被檢體所採集之r (5 T細胞於體外（in vitro)中使其活化者。 8 ·如申請專利範圍第1 、2、6或7項的r 5 丁細 胞活性增強物質，其使用於腫瘤的治療上。 9 ·如申請專利範圍第1、2、6或7項的r 5 T細 胞活性增強物質，其使用於細菌感染或病毒感染的預防或 治療上。 1〇.一種增強7 (5 τ細胞活性之使用於醫藥或獸醫 藥的醫藥組成物，其特徵爲含有如申請專利範圍第1項中 所記載之香菇菌絲體萃取物，以及藥劑學上可被接受的載 河曲 體。 1 1 ·如申請專利範圍第1 〇項之醫藥組成物，其爲 使用於經口投與者。 1 2 .如申請專利範圍第1 〇項之醫藥組成物，其爲 使用於注射或經皮吸收者。 1 3 ·如申請專利範圍第1 0項至第1 2項中任一項 之醫藥組成物，其爲使用於腫瘤之治療上。 1 4 ·如申請專利範圍第1 〇項至第1 2項中任一項 之醫藥組成物，其爲使用於細菌感染或病毒感染的預防或 治療上。 -2- 1245636 (3) ' 15.—種使用於被檢體之細菌感染或病毒感染之預 防或治療的醫藥組成物，其特徵爲含有如申請專利範圍第 9項之τ 5 T細胞活性增強物質。 -3-