WO2000032213A1

WO2000032213A1 - Agents de potentialisation de l'immunoactivite des cellules $g(y)$g(d)t contenant un extrait mycelien de shiitake

Info

Publication number: WO2000032213A1
Application number: PCT/JP1999/006617
Authority: WO
Inventors: Kenji Asano; Yukiko Matsuda; Yutaka Tajima
Original assignee: Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd.; Nagaoka, Hitoshi
Priority date: 1998-11-27
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2000-06-08
Also published as: HK1040913A1; GB0113001D0; CN1332634A; CN1171631C; HK1042652B; HK1042652A1; GB2359562A; CA2352459A1; TW200412989A; KR20010089497A; JP2000157203A; GB2359562B; TWI245636B

Description

明細書

菌糸体抽出物を含む r δΤ細胞免疫活性増強剤技術分野

本発明は、シィタケ菌糸体抽出物を含む、ァ δΤ 細胞の活性増強剤の開発および提供、ひいては、免疫活性剤の開発および提供に関する。

本発明はさらに、シィタケ菌糸体抽出物を含む、ァ δ Τ 細胞の活性増強作用、ひいては、免疫活性作用を有する食品、飲料および飼料の開発および提供に関する。

本発明はさらに、シィタケ菌糸体抽出物を含む、抗腫瘍剤、抗細菌感染治療剤および抗ウィルス感染治療剤の開発および提供に関する。背景技術

r (5 T細胞の特徴

動物の血液中に存在する末梢 T細胞は、その細胞表面抗原である T細胞受容体 (TCR)の種類から、大きく分けて二種類の T細胞が存在することが知られている。 1種類は、細胞表面に TCRa鎖および 3鎖を有する a i3 T細胞であり、もう 1種類は TCRr鎖および δ鎖を有するァ δΤ細胞である。ヒトにおいては、ァ δΤ細胞は、通常の末梢血液およびリンパ組織においては数％〜10%程度しか存在しない、 α β Τ細胞とは全く異なる特徴を有する傷害キラー細胞である。

7· <5Τ 細胞は、ヒトにおいては腸管、皮膚および末梢血液中等に存在して、局所免疫に働いている。 r δΤ 細胞の機能としては、ガン細胞傷害活性、細菌またはウィルスに対する感染防御活性などが現在までに報告されている。

r (5 T細胞の感染防御活性

脾臓などに認められるァ 5T細胞の中には、感染の際に IL-4や IFN-ひなどのサィトカインを産生する細胞が存在する。実験的にこれらの細胞が存在しない状況を作ると、細菌感染に対する抵抗性が減弱することが知られている。たとえば、 7 δ型 TCR抗体を投与して一過性にァ <5T細胞の機能を抑制したマウスや TCR0遺伝子欠損マウスにおいて、 Mycobacterium tuberculosisの感染に対する抵抗性が低下したことが報告されている（Ladel C, et al. , Eur J Immunol, 1995, 25:2877 - 2881)。また、 Listeria monocytogenesの感染初期においてァ δ T細胞が登場してくることも報告されている（Hiromatsu Κ, et al. , J Exp Med, 1992, 175:49-56)。これらの知見から、ァ δΤ 細胞は、細菌感染に対する生体防御において重要な細胞であることが示唆された。

さらに、 Β型肝炎ウィルスの慢性感染により、肝臓および脾臓のァ δΤ細胞が増殖誘導されることが報告された（Ozaki S, et al.,〗 Med Invest, 1998, 44:215-217)。また、正常マウスと比較して、ァ δ T細胞を欠損するマウス体内では、ワクシニアウィルスが感染初期において顕著に増加することも報告されている（Welsh RM, et al. , Immunol Rev, 1997, 159:79-93)。これらの知見から、ァ δΤ 細胞は、上述した細菌感染症に対する作用のみならず、ウィルス感染に対しても作用していることが示唆された。

r (5 T細胞のガン細胞傷害活性

ァ δΤ 細胞は、自己ガン細胞を特異的に殺すことができ、しかも自己の正常リンパ球（たとえば、 a i3 T細胞）には全く傷害を示さない T細胞である。この点で、活性化したァ δΤ 細胞を使用してガンの治療をする時には、副作用を生じる危険性が非常に少ないという効果がある。 τ δΤ 細胞とは逆に、ひ Τ細胞は、自己ガン細胞を殺さず、自己白血球を殺すことが知られているため、ガンの治療においてひ /3 Τ細胞を活性化することにより大きな副作用を生じる危険がある。したがって、ガンを治療するためには、活性化したァ δΤ 細胞を使用することにより行うことが望ましいと考えられていた。

さらに Τ δΤ細胞は、 MHC非拘束性にガン細胞を殺し、 ΝΚ細胞と似た性格を有している。 r 5T細胞は、小児末梢血液中においては 10%程度存在するが、加齢とともにその数が減少する。そのため加齢とともにガンが多くなつていく原因として、このような体内におけるァ δΤ 細胞の減少が関与していることが示唆されている。また、ニヮトリ、ヒッジ、ゥシなどでは、末梢血中に 15〜50%ものァ δ Τ 細胞が存在している。これらの動物では腫瘍の発生が少ないことから、末梢ァ «5Τ細胞の存在がガンの抑制に大きく関与していることが示唆される。

>薬理効果シィタケ（Lentinus edodes) は日本、中国の代表的な食用キノコであり、日本では約 300年前から人工栽培が行われてきた。日常食用にしているキノコは子実体と呼ばれ、菌類が子孫を残すために胞子を生じる生殖体であり、栄養体である菌糸細胞は地中や原木中で長い時間をかけて成長する。

シィタケは古くからさまざまな病気や症状に効果があると言われてきたが、その薬理作用が解明されてきたのは比較的最近である。シィタケ菌糸体抽出物については、ラット、マウスでの発ガン実験において、動物の大腸、肝臓などの腫瘍形成および移植腫瘍細胞の増殖を抑制し、動物の生存率を上昇させたこと (N. Sugano et al. , Cancer Letter, 27:1, 1985；鈴木康将ら、日本大腸肛門病会誌、 43:178, 1990など）、マイトジェン活性を示したこと（T. Tabata et al. , Immunopharmacology, 24: 57, 1992;Υ. Hibino et al. , Immunopharmacology, 28:77, 1994 など）、抗体産生を増強し、抗体を介する ADCC (antibody-dependentcell- mediated cytotoxicity) による免疫学的肝細胞障害に抑制効果を示したこと（溝ロ靖紘ら、肝胆塍、 15:127, 1987) などの種々な報告がなされている。

これらの知見をきっかけにシィタケの成分の薬理作用の研究が、医学薬学の分野で集中的に進められてきた。その結果、シィタケの成分の一部が、ヒトの免疫能力を回復することによりガンなどの治療に使用することができ、またガンの発病を抑制する可能性があることがわかってきた。

本発明の目的は、シィタケ菌糸体抽出物の薬理作用をさらに詳しく解明して、シィタケ菌糸体抽出物の新しい医薬、食品、飲料、飼料等の用途を探索することである。

本発明は、シィタケ菌糸体抽出物を含むァ δΊ 細胞活性増強物質を開発 ·提供し、ひいては免疫活性剤、例えば抗腫瘍剤、抗細菌感染治療剤および抗ウィルス感染治療剤を開発 ·提供することを目的とする。

本発明はまた、シィタケ菌糸体抽出物を含むァ 5Τ 細胞活性増強物質を使用して、もしくはシィタケ菌糸体抽出物を含む免疫活性剤を使用して、被検体の腫瘍を治療することも目的とする。発明の開示本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、シィ夕ケ菌糸体抽出物がァ（5 T 細胞の活性を顕著に増強する作用を示すことを発見して、本発明を兀成した。

すなわち、本発明は、シィタケ菌糸体抽出物を含むァ δ Τ 細胞活性増強物質を開発 ·提供し、ひいては免疫活性剤、例えば、抗腫瘍剤、抗細菌感染治療剤および抗ウィルス感染治療剤を開発 ·提供する。

本発明はまた、シィタケ菌糸体抽出物を使用する、腫瘍、細菌感染およびウイルス感染の治療方法も開発 ·提供する。

本発明の r (5 T 細胞活性増強物質または免疫活性剤は、シィタケ菌糸体抽出物および任意成分として薬剤的に許容できる担体を含む、医薬組成物の形であってい。

また、本発明のァ（5 T 細胞活性増強物質または免疫活性剤は、経口投与用、注射用、経粘膜投与用、経消化管投与用または経皮投与用のいずれであってもよい。また、本発明のァ δ Τ 細胞活性増強物質または免疫活性剤は、食品、飲料、または飼料のいずれの形であってもよい。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のシィタケ菌糸体抽出物の服用によりァ δ Τ 細胞の末梢血中比率が上昇することを示す。

図 2は、シィタケ菌糸体抽出物の服用前後における、 τ δ Τ 細胞のフローサイトメトリー解析の結果を示す。

図 3は、本発明のシィタケ菌糸体抽出物の服用によりひ） 3 Τ細胞の末梢血中比率がむしろ減少することを示す対照である。発明を実施するための最良の形態

本発明の Τ (5 Τ 細胞活性増強に使用するシィタケ菌糸体抽出物とは、シィタケ菌を固体培地上で培養して得られる菌糸体、好ましくは菌糸体を含む固体培地を水および酵素の存在下に粉砕、分解して得られる抽出物を言う。

—菌糸体抽出物は好ましくは以下の方法により得られたものを使用するが、これに限定されない。すなわち、バガス（サトウキビのしぼりかす）と脱脂米糠を基材とする固体培地上にシィ夕ケ菌を接種し、次いで菌糸体を増殖して得られる菌糸体を含む固体培地を 1 2メッシュ通過分が 30重量％以下となるよう解束する。この解束された固体培地に水およびセルラーゼ、プロテア一ゼまたはグルコシ夕ーゼから選ばれる酵素の 1 種またはそれ以上を、前記固体培地を 30〜 55°Cの温度に保ちながら添加するとともに、前記固体培地を前記酵素の存在下に粉砕し、すりつぶしてバガス繊維の少なくとも 70重量％以上が 12メッシュ通過分であるようにする。次いで 95°Cまでの温度に加熱することにより酵素を失活させるとともに滅菌し、得られた懸濁状液を濾過することによってシィタケ菌糸体抽出物を得る。シィタケ菌糸体抽出物はそのまま本発明のァ δ Τ 細胞活性増強物質に用いてもよいが、これを濃縮、凍結乾燥して粉末として保存し、使用時に種々の形態で使用するのが便宜的である。凍結乾燥して得られる粉末は褐色粉末で、吸湿性があり、特異な味と臭いをもつ。

シィタケ菌糸体抽出物の i n v i voにおけるァ (5 T細胞活性増強効果を以下の実施例に記載される方法により試験したところ、顕著な r δ Τ 細胞活性増強効果が観察された。

本発明の r (5 T細胞活性増強物質は、ァ 5 T細胞により傷害される腫瘍細胞によつて引き起こされる腫瘍の治療および Ζまたは予防に有効である。本発明のァ (5 Τ 細胞活性増強物質は、特定の腫瘍細胞を特異的に治療するのではなく、 r 5 T 細胞の活性を高め、活性化されたァ 5 Τ 細胞により結果として腫瘍細胞を破壊することを目的とするという特徴を有する。すなわち、本発明のァ δ Τ 細胞活性増強物質を用いた治療の対象となる腫瘍細胞は、悪性腫瘍細胞だけでなく、良性腫瘍細胞であってもよく、特定の腫瘍細胞に限定されるものではない。従って、シィタケ菌糸体抽出物および任意成分として薬剤的に許容できる担体を含むァ δ Τ 細胞活性増強物質は、いずれかの腫瘍の治療用および/または予防用組成物として使用することができる。

本発明のァ (5 Τ 細胞活性増強物質は、細菌感染またはウィルス感染の治療用および Ζまたは予防用組成物としても使用することができる。本発明のァ 6 Ί 細胞活性増強物質は、特定の細菌またはウィルスに対して特異的に作用するのではなく、ァ δΤ 細胞の活性を高め、結果として感染した細菌またはウィルスを体内から排除することを目的とする。本発明のァ (5Τ 細胞活性増強物質により治療可能な細菌性またはウィルス性疾患には、たとえば結核菌 (Mycobacterium sp. ), リステリア菌（Listeria monocytogenes；)、肝炎ウィルス（A型、 B型、 C型）、ヒト免疫不全ウィルス（Human Immunodeficiency Virus) , ワクシニアウィルス (Vaccinia virus) などがあるが、これらに限定されない。

治療用および Zまたは予防用組成物としての投与経路は、経口投与が最も好ましいが、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経鼻投与、経皮投与などであってもよい。経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが含まれるが、これに限定されない。経鼻投与または経皮投与に適した製剤には、パップ剤、貼布剤などが含まれるが、これに限定されない。

薬剤的に許容できる担体には、当業界で公知の適当な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などを含むが、これに限定されない。

本発明の L A K活性増強用製剤に任意に混合可能な薬学上許容できる担体としては、当業界において公知の賦形剤（例えば、乳糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース等）、結合剤（デンプン、ゼラチン、メチルセルロース、ポリビニルビロリドン等）、崩壊剤（デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルポキシメチルス夕一チ等）、滑沢剤（タルク、ステアリン酸塩等）、コーティング剤（白糖、タルク、ゼラチン等）等があり、さらに各種の光沢化剤、着香剤、着色剤、矯味剤、溶解補助剤、安定化剤、懸濁剤、吸収促進剤等を目的に応じて加えてもよいが、これらに限定されない。また、注射剤として使用する場合には、この分野において慣用されている各種希釈剤（例えば、水、エチルアルコール等）を使用できる。

本発明の T 5T 細胞活性増強物質の投与量は被検体の年齢、体重、症状、投与経路などを考慮して医師により決定される。本発明のァ δΊ 細胞活性増強物質に含まれるシィタケ菌糸体抽出物は元来食品として使用されてきたものであり、極めて安全であるところから、投与量を厳しく限定する必要はないが、通常シイタケ菌糸体抽出物を、好ましくは 1 日数回（2〜3回程度）、 1 回 100 mg〜10000 mg (総投与量にして 1 日あたり 200 mg〜30000 mg)、さらに好ましくは 1 日 3回、 1 回あたり 500 mg〜5000 mg (総投与量にして 1 日あたり 1500 mg〜1 5000 mg)、さらに好ましくは 1 日 3回、 1回あたり 1 000 mg〜 1 500 mg (総投与量にして 1 日あたり 3000 mg〜4500 mg) である。さらに、他の抗腫瘍剤と併用して投与してもよい。

本発明の r δ Τ 細胞活性増強物質は、腫瘍の治療のための養子免疫療法においても使用する製剤として提供することができる。養子免疫療法とは、感作された細胞、通常はリンパ球を生体内に移入することにより、腫瘍細胞を殺すことを目的とした腫瘍の治療方法をいう。本発明の場合、まず被検体由来の末梢血中から r δ Τ細胞を分離し、分離したァ（5 Τ細胞を i n v i t roにおいて本発明のァ <5 T細胞活性増強物質により活性化した後、活性化されたァ（5 T 細胞を再び被検体体内に戻す。その結果、活性化された τ δ Τ 細胞の作用により、体内の腫瘍細胞を破壊することができる。

本発明のァ δ Τ 細胞活性増強物質は、シィタケ菌糸体抽出物そのものであってもよく、あるいは、シィタケ菌糸体抽出物を含むァ δ Τ 細胞活性増強物質および薬学上許容可能な担体を含有する医薬また獣医薬用組成物であってもよい。

本発明の Τ 6 Ί 細胞活性増強物質は、食品の形で提供することもできる。好ましい食品の形態としては粉末、顆粒、ペースト状、ゼリー状などが挙げられる。さらに顆粒等にする場合は、甘味を加えるため、乳糖などの糖類を加えることが望ましい。また、本発明のァ δ Τ 細胞活性増強物質は、飲料の形で提供することもできる。このような食品または飲料には、シィタケ菌糸体抽出物の他に、ビ夕ミン剤、カルシウムなどの無機成分、アルコール類、ポリフエノールなどの消臭成分などを追加してもよい。この食品または飲料には、特定保健用食品、病者用食品等の範疇にあるものも含まれる。

本発明の r δ Τ 細胞活性増強物質は、飼料としてまたは飼料への添加剤の形で提供することもできる。家畜の飼料としてまたは飼料への添加剤として本発明の r δ Τ 細胞活性増強物質を使用することにより、家畜に発生する腫瘍を治療および Ζまたは予防し、あるいは家畜に対する細菌またはウィルス性の感染症を治療および zまたは予防することができる。その結果、家畜について現在使用されている治療薬、たとえば抗生物質などの使用量を減少することができ、それに伴つて飼育コストを低下することができる。さらに、抗生物質を投与したために生産物を出荷できない期間をより短くすることができるというさらなる効果もある。ヒト被検体における、 i n v i voでのァ δ Τ細胞活性増強効果試験法は以下の通り行った。まずヒト被検者にシィタケ菌糸体抽出物原末 3. 6 gを 7日間にわたり毎日接種させた（全量 25. 2 g) o 次いでシィタケ菌糸体抽出物服用後の末梢血中ァ (5 T 細胞頻度を、服用前の当該細胞頻度との比較においてフローサイトメトリーを用いて測定した。

本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。本発明の方法を種々変更、修飾して使用することが当業者には可能であり、これらも本発明の範囲に含まれる。実施例

実施例 1 ：シィタケ菌糸体抽出物の調製法

バガス 90重量部、米糠 10重量部からなる固体培地に純水を適度に含ませた後に、シィタケ種菌を接種し、温度および湿度を調節した培養室内に放置し、菌糸体を増殖させた。菌糸体が固体培地に蔓延した後、バガス基材の繊維素を解束し、 12メッシュ通過分が 24重量％以下となるようにした。この解束された培地 1. Okg に、純水 3. 5 Lおよび精製セルラーゼ 2. 0 gを固体培地を 40°Cに保ちながら加えて培地含有混合物とした。

次いで培地含有混合物を変速付ギヤ一ポンプにより循環させながら、固体培地にギヤ一部分において粉砕およびすりつぶし作用を 200分間程度加え、パガス繊維の約 80重量％が 12メッシュ通過分となるようにした。培地含有混合物の粉砕およびすりつぶしは、該混合物の温度を徐々に上昇させながら行った。その後培地含有混合物をさらに加熱して、 90でとして 30分間放置した。 90°Cへの加熱により、酵素を失活せしめ、かつ殺菌を施した。得られた培地含有混合液を 60メッシュ濾布を用いて濾過してシィタケ菌糸体抽出液を得た。これを濃縮した後、凍結乾燥し、シィタケ菌糸体抽出物原末を得た。このようにして得られるシィタケ菌糸体抽出物はフエノール硫酸法による糖質分析により糖質を 25.3% (w/w)、 Lowry法によるタンパク質分析によりタンパク質を 19.7% (w/w) , 没食子酸を標準とする Folon- Denis法によりポリフエノールを 2.6% (w/w) 含んでいた。シィタケ菌糸体抽出物にはそのほかに粗脂肪 8%、粗灰分 22%、糖質以外の可溶性無窒素物を約 20%含む。

また、シィタケ菌糸体抽出物の構成糖組成（％) は以下の通りであった： Xyl： 15.2； Ara： 8.2； Man： 8.4； Gul ： 39.4； Gal： 5.4； GlcN： 12.0； GLuUA： 11.3。実施例 2 ：シィタケ菌糸体抽出物のァ 6 T細胞活性増強 in vivo試験

ヒト被検者 3名（被験者 A〜C) にシィタケ菌糸体抽出物原末 3.6 日を 7日間にわたり毎日経口的に服用させた（全量 25.2 g)。シィタケ菌糸体抽出物服用期間経過後、ヒト被検者から末梢血を採取した。服用後に採取した末梢血中のァ 6Ί 細胞頻度を、服用前に採取した末梢血中の細胞頻度と比較して、フローサイトメトリーにより測定した。得られた結果を図 1および図 2に示す。

3名全員とも、シィタケ菌糸体抽出物の服用前と比較して、服用後には末梢血中の r 3T細胞の比率が、平均して 40%以上上昇した。表 1 ：服用前後における、末梢血ァ δΤ細胞比率の増加率

被検者 Α 被検者 B 被検者 C 平均土 SEM 増加率 124.39% 146.15% 150.00% 140.18% ±7.97% 一方、同一の被検者から採取した服用前後の末梢血液について、ァ（5T 細胞以外のマ一カーについて調べた。その結果、シィタケ菌糸体抽出物には α 3 T細胞に対する増殖活性は見られず、平均すると細胞比率の減少が見られた（図 3)。産業上の利用可能性

本発明のシィタケ菌糸体抽出物を含む τ δ T細胞活性増強物質は、実際にァ 6Ί 細胞を活性化することができることがわかった。このことから、本発明のァ（5T 細胞活性増強物質は、ァ δ T 細胞の有する腫瘍細胞傷害活性、抗細菌感染および抗ウィルス感染作用を誘導することにより、生体を腫瘍、細菌感染およびウィルス感染から防御する効果を有しており、腫瘍、細菌感染およびウィルス感染の予防、治療に使用できる。また、ァ 5 T細胞のにより、本発明の？ · <5 Τ細胞活性増強物質は、副作用がないことから、安全に使用でき、大きな産業上の利用可能性が期待できる。

また、細菌感染および Ζまたはウィルス感染を引き起こした家畜について使用する場合にも、現在使用されている治療薬、たとえば抗生物質などの使用量を減少することができ、それに伴って飼育コストを低下することができる。さらに、抗生物質を使用しないため、生産物を出荷することができない期間をより短くすることができるというさらなる効果もある。

Claims

請求の範囲

•菌糸体抽出物を含む、 τ δΤ細胞活性増強物質。

2. シィタケ菌糸体抽出物、および薬剤的に許容できる担体を含む、医薬または獣医薬用のァ δΤ細胞活性増強物質。

3. 経口投与用である、請求項 1または 2のァ δΤ細胞活性増強物質。

4. 食品である、請求項 1のァ（5 Τ細胞活性増強物質。

5. 飲料である、請求項 1のァ δΤ細胞活性増強物質。

6. 飼料である、請求項 1のァ細胞活性増強物質。

7. 注射用または経皮吸収用である、請求項 1または 2のァ細胞活性増強物質。

8. 被検体から採取したァ（5Τ細胞を in vitroにおいて活性化するための、請求項 1の _r δ τ細胞活性増強物質。

9. 腫瘍の治療に用いる、請求項 1〜 8のいずれか 1項のァ 5T 細胞活性増強物質。

1 0. 細菌感染またはウィルス感染の予防または治療に用いる、請求項 1〜 8のいずれか 1項のァ δΤ細胞活性増強物質。

1 1. 請求項 9に記載のァ 6Ί 細胞活性増強物質を生体に投与することによる、被検体の腫瘍の治療方法。

1 2. 請求項 10に記載のァ 6Ί 細胞活性増強物質を生体に投与することによる、被検体の細菌感染またはウィルス感染の予防または治療方法。

1 3. r 5T 細胞活性増強物質の製造のための、シィタケ菌糸体抽出物の使用。