TW585916B - Attenuated forms of bovine viral diarrhea virus, their preparation methods, and use - Google Patents

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585916 A7 B7 五、發明說明（2 ) 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 B V D病毒是依其所帶有的遺傳因子型（共有二種不 同的遺傳因子型）來分類的。那些帶有p "遺傳因子 型者可誘發培養細胞的細胞病變，而帶有c p 〃遺傳 因子、〃的病毒則不會（吉爾斯畢等人著之A康乃爾獸醫 學"50 : 73-79 (I960))。另外，有二種主 要的遺傳型（第I型和第I I型）已被辨識出，二種都顯 示出它們會引起很多臨床上的症候群（ >具樂林"等人著 之、、病毒學〃 203: 260 — 268 (1994) ; v 利德派斯〃等人著之、病毒學〃 2 0 5 : 6 6 - 7 4 ( 1 9 9 4 ))。 I 訂

BVD病毒的基因組約長12·5kb並且含有一個 單獨開放閱讀匡構位於5 /和3 /非經轉譯區（N T R s )之間可利特〃等人著之病毒學1 6 5 : 1 9 1 — 199 (1988))。由此開放閱讀匡構可轉譯出一段 約4 3 8 k D的多元蛋白，此多元蛋白再經由細胞和病毒 的蛋白酶處理成病毒的構造和非構造蛋白質（$塔茲"等 人著之病毒學期刊71 : 5415 — 5422 (1997 ); ''徐〃等人著之病毒學期刊7 1 : 5 3 1 2 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5322 (1997);〜艾佰〃等人著之病毒學期刊 70:4131 - 4135 (1996):和、威斯克成 〃等人著之病毒學184: 341 — 350 (1991) )。病毒酶中，參與此過程者爲蛋白酶ΝΡΓ°和NS 3。 ΝΡΓ°是第一個由病毒之開放閱讀匡構所編碼的蛋白質並 且可自行從剩餘之合成多蛋白裂解出來（ >史塔克〃等人 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -5 - 585916 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7_五、發明説明⑮) ATCC)〃 ，編號爲ATCC 203354號。 A ·以B V D d N 1減毒型病毒爲基礎的組成物和方法 首先，本發明是以一種特殊之減毒型BVD病毒種的 發展爲基礎。該病毒種是經由讓一種野生型病毒基因組產 生突變以刪除其N p ^ °蛋白酶基因而製成的，其全部序列 顯示於SEQ ID NO:1中。而第2圖中的則是從 n t 39至nt 12116。因此，本發明關於一種 病毒，它所具有的基因組序列含有所顯示出的該序列，並 且以實質上由該顯示出之序列所組成者較佳。通常’ B V D病毒的基因組爲R N A的型式。當進行選殖時，則 較常爲D N A的型式。除非另外指出，則 > 核酸〃 一詞是 指BVD病毒的DNA和RNA序列。爲了方便起見，序 列表單上只顯示出D N A序列，而其各自所相對應之 R N A序列對內行人士來說則是明白易懂的。a實質上由 ……構成〃一詞是指在構造和功能上與所指出者實質上相 同的序列。因此，本發明不僅包括明白指出之序列也包括 經由引入非實質之添加物或取代物所製出的相對序列。詳 細地說，本發明包括簡倂的核酸序列，該序列所編碼之 BVD蛋白質與SEQ ID NO:1所編碼者相同。 此特殊序列，即從n t 3 9至n t 1 2 1 1 6的 SEQ ID NO: 1，而其所編碼之相對病毒，爲了 方便起見，已被定名爲〜BVDdNl 〃基因組和病毒。 病毒可以以下列二種型式存在：①爲一種較大製品的一部 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐 1 (請先閲讀背面之注意事項再 I . 頁

、1T -8- 585916 i、發明說明（7 方法將它們分 室操作說明書 。抗體可用於 B V D存在的 另一方面 可接受之載劑 任何輔助劑和 劑量的疫苗來 保護性免疫力 ，但其它可與 可在規則的間 。本領域中所 計劃達到最好 A7 B7 離出來（見如：哈洛等人著之、抗體〃實驗 ，冷泉港實驗室，Ν·Υ· ( 1 9 8 8 )) ’尤其是’偵測生物或實驗室樣本中是否有 方法中。 ，本發明關於含B VD d Ν 1病毒及獸醫上 的疫苗。此疫苗可包括常用於此種製品中之 其它試劑。在牛體內可經由給予牛一個足夠 誘發牛產生對抗B VD病毒所引起之挑戰的 。通常，該疫苗是經腸胃道外的途徑來給予 本發明相容的給予途徑也可以。如需要時， 隔中（如：2至8週）給予二次或多次接種 廣爲人知的標準步驟可用來使免疫化的施行 的效果。 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 ¥ t 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B ·以 近 製備有 方法詳 5，5 用於B 明關於 S E Q 化型式 ，本發 B V D d 期硏究證 效的疫苗 述於（如 8 0，8 V D d N 一種包含 ID 者較佳） 明關於一

Ν 1基因組核酸爲基礎 明可經由以編碼免疫原 。用來製備和給予這些 :美國專利5，5 8 9 5 9 ;及 5，7 0 3， 1基因組核酸。因此， 了從 n t 3 9 至 n t Ν〇·· 1序列的核酸分 或者是其簡倂序列。在 種實質上由S E Q I 的組成物和方法 的核酸注射動物來 ^ D Ν Α疫苗〃的 ，4 6 6 ; 0 5 5中）並可應 在另一方面，本發 1 2 1 1 6 之 子（以實質上爲純 一種較佳的體系中 D N〇·· 1之序 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -10- 585916 Α7 ________ Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（8) 列（從n t 3 9至n t 1 2 1 1 6 )所組成的核酸分 子（以實質上爲經純化之型式者較佳）。此處所使用的a 實質上經純化的〃一詞是指一種實質上不含污染物質的所 需要之產品。例如，> 實質上經純化的"核酸分子係實質 上不含其它污染物的核酸分子且通常在樣本中含有至少8 5w t %的核酸分子，含更高比例者較佳。有一種用來·測 定核酸之純度的方法係將製品在一種母質（如：聚丙烯醯 胺或瓊脂糖）中進行電泳。純度可經由在染色後顯示出一 個單一帶來證明。其它用來評估純度的方法包括層析法和 分析離心法。 該B VD d N 1基因組核酸可以被倂入一種媒介中， 以做爲一種明確之編碼成分。 >明確之編碼成分〃一詞是 指該轉譯入病毒多肽中，且最後進入了病毒中之載體的一 部分。它很淸楚地不包含其它實質上會改變 B V D d N 1產品的轉譯成分。此載體或該 BVD dN 1核酸本身可用來轉染一種宿主細胞以製造減 毒型病毒後代。 本發明也包括經由將BVD dN 1核酸，或一種含此 核酸的載體直接注入動物體內來製造抗B V D病毒抗體的 方法。任何可製造抗體的動物都可使用，但一般而言，以 牛爲較佳者。以此種方法來製造抗體爲本發明的一部分， 且此種抗體可以從動物中純化出來並用於，如：用來測定 在培養介質或生物液中是否有B VD病毒存在的分析方法 中〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項

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-11 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 _ B7 五、發明說明（12) p VVN AD L的圖式代表。先將此質體進行突變以刪除 在開放閱讀匡構中的第一個基因，即·· Npr。蛋白酶。所 產生之突變過的質體產物p BVD dN 1圖解顯示於B格 中。第1圖中也顯示了許多其它的基因區。C代表一個編 碼構造核心蛋白質的基因，此種蛋白質將基因組RNA包 裹起來並形成病毒的病毒體。接著的是編碼三種封套糖蛋 白的基因一 E〇，E1和E2。P7編碼一種帶有未知功 能的非構造性蛋白質，後面再跟隨著一區定名爲S 2 一插入一 NS 3〃的區域。NS 2編碼一種具鋅指特性的 高度疏水性蛋白質。N S 3爲親水性且爲細胞病原性 BVD病毒的一種標示。n c p病毒在一種受感染的動物 體內的複製作用可以將該病毒轉形成c ρ生物態，這是經 由將一種多餘的病毒或細胞RNA插入N S 2和N S 3二 個編碼區之間的基因重組工作來進行的。由此基因重組作 用可釋出游離的NS 2和NS 3的蛋白質。後者，即： N S 3，是一種負責大部分進行之非結構性蛋白質工程的 蛋白酶。NS 4Α位於NS 3旁邊，它負責編碼一種關於 N S 3蛋白酶活性的輔助因子。接著N S 4Α的有二個編 碼病毒蛋白質的基因：NS4B和NS5A，它們的功能 仍未知。最後的基因，NS5B是編碼一種由RNA決定 之RN Α聚合酶並負責病毒的複製工作。顯示於Β格中之 核苷酸序列（SEQ ID NO: 9)是圍繞著 P BVD dN 1起始密碼子的序列。 第2圖顯示出質體p B VD dN 1的完整核苷酸序列 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） .ϋ ϋ I ϋ H ϋ ϋ 一-0, · ϋ n H ϋ I ·ϋ I I (請先閱讀背面之注意事項再IFk本頁) 項再士

-15- 585916 Α7 ___ Β7 五、發明說明（13) 。：BVDdNl的基因組序列是由核苷酸3 9至1 2， 1 1 6來代表。 第3圖是證明牛體內對給予BVD dN 1病毒後產生 反應之血淸轉形的數據。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

本發明的 A · B V 本發 減毒的B 且由 ''減 九細胞株 製速率遠 B V D d 細胞（B 染了野生 B V D d 了它在動 B V D d 以在牛R 因體是由 轉殖。需 包括了由 其相對應 B V 詳細說明 D d N 1和編碼該病毒之核酸的製備方法 明關於一種經由將其ΝΡΓ°蛋白酶基因刪除後來 VD病毒。此種病毒已被定名爲BVDdNl， 毒型〃一詞可知，它在感受性細胞株（如：牛睪 (R D )，或 低於其相似野 N 1在胎牛的 丁一 2 )中並 型病毒後所發 N 1在許多不 物體內之減毒 N 1爲遺傳上 D細胞中持續 R N A組成， 了解的是，此 病毒R N A序 之R N A本身 D d N 1病毒 牛腎細胞株（ 生型在體內的 氣管細胞（E 不會引起生育 生的生育性感 同的牛細胞株 情形具有廣泛 穩定的，因爲 到至多1 0代 但它可以被逆 處所提及的核 列所衍生來的 M D B K ))內的複 複製速率。另外， Β Τ ]：)或牛鼻甲骨 性感染，這與牛在感 染相反。 中的慢生長速率提示 組織趨性。 Ν ρ ^ °的缺失情形可 。雖然天然病毒的基 轉錄成DNA並進行 酸和Β V D病毒序列 逆轉錄D Ν Α序列和 基因組的完整核苷酸序列顯示於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 Μ 貪 I I I 祖 I訂

-16- 585916 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（14) SEQ ID N〇：l*(&nt 39 至 nt 12116)。需了解的是本發明不僅包括帶有所顯示之 確實序列的基因組，也包括了其它實質上在構造或功能上 沒什麼不同的序列，包括，如：那些其所編碼之蛋白質與 S E Q I D NO : 1所編碼之BVD蛋白質相同並以 遺傳密碼的簡倂性爲基礎的序列。另外，如：經由位置來 主導誘變之類的技術可用來將變異引入核酸構造中。經由 此種方法或類似方法所引入之B VD病毒核酸序列中的突 變，或以本領域中所已知之任意誘變法所引入的突變都包 含在本發明中，而其先決條件是它們所產生之病毒中至少 有一種主要的特徵實質上仍與其所衍生而來之病毒相同。 詳細地說，實質上不會改變與B V D d N 1之感染性有關 的特徵突變都包含在本發明的範圍內。 該突變的B VD d N 1核酸是由國家動物疾病實驗室 (NADL) BVD菌種（從美國型培養收集處取得）所 衍生得來的。依下述實施例中的說明經由選擇性P C R和 再接合作用，將此段核酸嵌入載體中並將整段ΝΡΓ°蛋白 酶基因刪除。雖然此步驟可用來取得病毒基因組，甚至是 病毒本身，但含完整之BVD dN 1基因組序列的質體（ 稱爲 pBVDdNl，以 ATCC 號 203354 存放） 是用於分離步驟中的較佳來源。標準方法學可用來繁殖和 純化質體並將其轉染入可支持病毒繁殖的宿主細胞中。大 腸桿菌STBL2細胞（可自Gibco B R L 、吉可 BRL〃取得）是用於質體繁殖中的較佳原核宿主細胞。 (請先閱讀背面之注意事項¾ i 再本頁

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -17- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 B7 五、發明說明（16) 徑給予動物。一般而言，病毒製品會包括一種輔助劑，如 :Freund (富朗德）氏完全或不完全佐劑。用於注射之合 適製品，注射計劃和此類物爲本領域中所熟知的（見，如 :哈洛等人著之 > 抗體〃 ，a實驗室操作說明"，冷泉港 實驗室，Ν·Υ· ( 1 9 8 8 ) ; a克蘭〃，'免疫學" 自身一非自身辨別科學（1 9 8 2 ))。單株抗體也可利 用標準步驟來製備（肯內特等人著，單株抗體和雜交瘤： 在生物分析中的一種新方向（1980):坎貝爾，、單 株抗體技術〃於生化學和分子生物學中的實驗室技術（ 1 9 8 4 ))。 對BVD病毒具專一反應之抗體或抗體斷片（即：對 BVD之親和性比對其它病毒至少高出1 〇 0X)可用於 許多免疫分析中。例如：在放射免疫分析或免疫測定分析 中可用抗體來偵測B V D病毒（也稱爲a雙位點〃分析或 $三明治分析〃，見”查德〃 ，v、放射免疫分析和相關技 術的導入〃，載於a生化學和分子生物學的實驗室技術〃 中，紐約美荷蘭出版公司（1978))。在典型的免疫 測定分析中，將一定量之未標示的抗體連接到一種固體支 持物上，此固體支持物需在測試流體中不會溶解（如：在 血液、淋巴液、細胞萃取物、等等中不會溶解）。在抗原 初步連接至固定的抗體上後，將一定量之可偵測的經標示 之第二抗體（此抗體可能同於或不同於第一抗體）加入其 中以進行偵測及/或將抗原定量（見，如：放射免分析法 ，可肯等人著，199一206頁，EZS利文史東，艾 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） ϋ I I ϋ ϋ 1 ϋ 一-0*· · ϋ ϋ ϋ I 1 I ϋ I (請先閱讀背面之注咅？事項再Wk本頁) 太

-19- 585916 A7 B7 五、發明說明（17) 汀堡（ 1 9 70))。本領域中已知有許多這類的分析並 可用它們來偵測B V D病毒。 D·傳統疫苗和接種疫苗的步驟 利用B V D病毒的疫苗和接種疫苗的步驟在許多參考 資料中都有討論（見，如：費內利斯等人著之Am· J· Vet Res· 33: 1421 — 1431 (1972):古樂等人 著之 Am· J. Vet· Res. 33;1415 — 1420 ( 1 9 7 2 );麥克路金等人著之、Arch· Virol· 5 8 : 1 1 9 ( 1 9 7 8 ):可金斯等人著之康乃爾Vet· 51 : 5 3 9 ( 1 9 6 1 );菲力浦等人著之八111.：[.乂61.1^5· 3 6:1 3 5 ( 1 9 7 5 ):羅佰曼等人著之Am· J·

Vet. Res. 45 : 2498 (1984);可利亞等人著之 Can.J.Comp.Med4 2 : 2 3 9 ( 1 9 7 8 );馬汀等人 著於 ''動物疾病硏究工作者會議計劃：75 : 183 ( 1 9 9 4 );及美國專利4，618，493)。通常’ 一種疫苗中會含有介於約1 X 1 06至1 X 1 〇8個病毒粒 子並加上一種獸醫學上可接受的載劑（含於約0 · 5至5 毫升之間的體積中）。製做配方時可利用在 > 雷明頓藥劑 科學（麥克出版公司，賓州伊斯頓，1 6版（1 9 8 2 ) )中所說明的方法來進行。本發明可與不同的賦形劑和輔 助劑相容，且這些試劑可依需要倂入製品中。例如：本發 明的疫苗組成物可以依可接受的傳統法利用標準的緩衝劑 、載劑、穩定劑、稀釋劑、保存劑和溶解劑來製成配方並 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ·----------—— (請先閱讀背面之注意事項再IRr本頁)

I ·1 ϋ ϋ ϋ n 1_1-^0，_ ϋ i-i ϋ ϋ I ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -20- 585916 A7 B7 五、發明說明（18) 且也可製成幫助持續釋出的配方。稀釋劑可包括：水、右 旋糖、生理食鹽水、乙醇、甘油及此類物。用於等張性的 添加劑包括：氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇、及 乳糖等。穩定劑包括：白蛋白，及其它。輔助劑之非限制 性實施例有：R I B I輔助劑系統（Ribi a利畢"公司） 、礬、氫氧化鋁凝膠、水色油乳液，油色水乳液如：" Freund's 〃（富朗德氏）完全和不完全輔助劑，成塊共聚物 (CytRx，喬治亞州亞特蘭大市），S A F — M ( Chiron ( 奇隆），加州，艾墨利市），> AMPHIGEN ®輔助劑，皂 角苷，QuilA (奎A) ，QS - 2 1 (康橋生物技術公司， 麻州康橋），或其它皂角苷分液，單磷醯類脂A，Avddine (艾利汀）類脂-胺輔助劑，來自大腸桿菌之熱不穩定的 內毒素（重組的或其它），霍亂毒素或胞壁醯二肽，以及 其它。疫苗中還可含有一或多種其它免疫調節劑，如：間 白素、干擾素、或其它細胞素。一般來說，疫苗被設計成 經由腸胃道外途徑給予，不過：本發明與其它的給予形式 也相容如：經由口服、鼻內、肌肉內、淋巴結內、皮內、 腹膜內、皮下、肛門或陰道途徑給予，或組合途徑。內行 人士可根據所選擇的途徑來製備疫苗組成物的配方。 利用本領域中所熟知的步驟可使疫苗步驟達到最好的 效果。可以以單一劑量的方式給予動物，或者是，將劑量 分成二或多次，在2至1 0週的期間內爲動物接種疫苗。 如需要時，可自接種的動物收集血淸並測試對抗BVD病 毒之抗體的存在與否。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------ί (請先閱讀背面之注意事項再本頁)

n n ϋ 一：0, · —Ml I I I I I I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -21 - 585916 A7 __ B7 五、發明說明（w) '"誘發免疫反應〃 一詞及其類似詞，在此是用來包括 在牛體內誘發或增加任何對疫苗接種所產生之以免疫爲基 礎的反應，這些反應包括或者是一種抗體反應或者是由細 胞促成的免疫反應，或者是同時包括此二種反應，這些反 應可用來保護受接種之動物對抗B V D病毒。此處所使用 的 >保護性免疫〃，>保護性免疫反應〃，>保護〃及此 類詞並不侷限於對牛體內之牛病毒性下痢的完全保護，或 對牛體內之B VD病毒感染的完全保護，也包括將病原所 引起之感染做任何程度的降低或減少其機率，或將由病原 所引起之感染所造成的疾病或症狀的嚴重度減低（此處所 指的減低是與受感染控制之未經接種的動物所發生的情況 相比較）。 E · D N A疫苗 說明利用核酸（DNA或mRNA)之疫苗及疫苗接 種法的參考資料包括美國專利號5，703，055、美 國專利號5，580，859、美國專利號 5，589 ，466、國際專利文獻W 0 98/ 35562及不同的科學文獻，包括：、雷沙等人著之 1997，免疫學的細胞生物學75 : 360 — 363" ; ''戴維斯，1 9 9 7，生物技術的現代觀點·· 8 : 635 - 640)"、曼尼肯等人著之1997，免疫學 的標準回顧17: 139 — 154";、羅賓遊， 1997,疫苗 15 (8) ； 7 8 5 - 7 8 7 "; ’羅賓 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂--------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 B7 五、發明說明（21)

實施例 實施例1 分析和實驗方法 D N A 感染性之全長無性繁殖系p VVNAD L以圖形顯示 於第1A圖中。此質體含有一衍生自pGEM4 (〜普洛 美格〃 Promega公司）的CoIEl複製子且其長度爲 14，578bp (維斯來夫等人著，病毒學期刊71 : 471 - 478 (1997) ) 。丁7 RNA 聚合酶啓 動因子插入於B VD病毒基因組的上游且此啓動因子可指 示病毒RNA的合成。BVD病毒基因組的序列係衍生自 BVD 病毒的 NADL 菌種（ATCC VR - 534) 〇 大腸桿菌中之p VVNAD L的擴大 一般而言，將大場桿菌中之全長pVVNADL無性 繁殖系加以擴大是很困難的。在大腸桿菌中，長疫病病毒 c D N A s和全長無性繁殖系在繁殖期間的毒性放果以前 並沒有被注意到（莫耳曼等人著，病毒學期刊7 0 : 763 - 770 (1996);路格利等人著，病毒學期 刊 70 : 3478 — 3487 (1996))。在包括下 列幾種的宿主內測試P V V N A D L的穩定性：大腸桿菌 JM109 (、'史特達金’ Stratagene ) ;DH5a (、吉 布可〃 GibcoBRL );及STBL2細胞（、吉布可夕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） »|--------y---·11111--訂- !! (請先閱讀背面之注意事項再|^本頁>

-24 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 B7 五、發明說明（22)

GibcoBRL )。在將質體DNA轉形入各菌種中後，監測群 落的大小並以限制圖譜來分析大略的質體構造。以 S T B L 2細胞可得到較佳的結果。在受限的生長環境下 (30 °C，不超過20小時），將pVVNADL轉形入 這些細胞中可製造相當均勻的小群落族群（沒有DN A重 組的跡象）及合理的D N A產量。 玻管內轉錄及R NA的轉染作用 利用MEGA script試劑（安畢旺，Ambi on )根據製造者 的說明書，以T7 RNA聚合酶在玻管內合成RNA轉 錄物將pVVNADL DNA模版以Sa c I I使之直 線化並以T 4 D N A聚合酶處理之以移除3 /的伸出物 。轉錄反應產物是以凝膠電泳法來進行分析。將1至5微 克的轉錄R N A加入含6微克脂非汀（lipofectin )(吉布 可 BRL)的 Opt i— MEM(吉布可 BRL) 200 微升中並將RNA/脂質樣品在室溫下溫育1 0至1 5分 鐘。在這段時間中，將在6凹槽盤（3 5毫米直徑）中生 長的MDBK (馬丁達比（Madin Darby )牛腎細胞（無性 繁殖系6號）的衍生物或RD (—種穩定的經轉形的牛睪 九細胞株）單層細胞以不含R N a s e的P B S淸洗二次 ，〇p t i — MEM洗一次。在最後一次淸洗完畢後，將 轉染混合物加入各凹槽中，然後，在室溫下溫育1 0分鐘 並一邊溫和地搖動。在凹槽中加入〇P t i — MEM1毫 升並在3 7 °C下再溫育3小時。將含5 %胎馬血淸（用於 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -I / / I ϋ ϋ ·ϋ 一-0, I 1 ϋ 1· .^1 I (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -25- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 B7 五、發明說明（23) RD細胞）或含5%胎牛血淸（用於MDBK細胞）的 〇p t i — MEM3毫升加入各凹槽中。在3 7°C下溫育 1至4天後，以8 0 %丙酮來固定細胞並進行免疫組織化 學分析以幫忙預測B V D病毒溶菌斑。 實施例2 建構經刪除N p ^ °基因的B V D病毒無性繁殖系 爲了製造一種其NPΓ°基因已自基因組中刪除的 B VD病毒，先製造三種DNA斷片，然後再將它們接合 。確實步驟說明於下。 P C R斷片I的製浩 C R斷片I 〃是設計成含有一段刪除之Npr。編 碼序列。在製造此斷片時會牽涉到三次P C R擴大作用。 首先，用5NTR3 ( + )和5NTR4 ( -）來擴大 Npr°編碼序列之5 #NTR區上游的一半。該5 >正意 義引子5NTR3 ( + )的序列爲：5<— AAAGGT CTCGAGATGCCACG— 3一 （寡核苷酸 218 一 237，SEQ ID N0:2)。該 3 / 負意義引 子5NTR4 (―)具有的序列爲·· 5>—GTCTGA CATGTGCCATGTACAGCAGAGATTT TTAGTAGC — 3'(寡核苷酸 895 - 890 + 388—356，SEQ ID N〇：3)。二種引子 都位於病毒基因組的5/NTR 且該引子5NTR3 ( 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I ·ϋ 1·— ϋ I ϋ ϋ I β— ^1 —Hi ϋ 1 I (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -26 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 ____ B7 五、發明說明（24) + )含有一個獨特之限制處Xho 1。引子5NTR4 ( -）在它的5 >端含有6個額外的寡核苷酸，它們與 BVD病毒C蛋白質的編碼序列的5 /端爲同源。PCR 的擴大作用是利用下列各項物質來進行的：最後濃度爲 〇· 5微莫耳濃度的引子，做爲模版的質體 p V V N A D L DAN 10 毫微克，及 Pfu D N A聚合酶2 · 5單位（史特達金，加州拉荷亞市）。 在下列條件下進2 5個循環的擴大作用：在9 4 °C下變性 3 0秒；在5 5 t：下煉1分鐘；在7 2 °C下擴增2分鐘。 在以瓊脂糖凝膠電泳法加以純化之後，將所產生之含 1 7 7個氮基對的斷片（斷片A)再次懸浮於TE緩衝液 中。

第二個P C R擴大作用是利用寡核苷酸NAD L C 6 (+ )和SeQ23 ( —）來做爲引子，以用來擴大一個 N p ^ °編碼序列之下流斷片。該5 >正意義引子 NADLC6 ( + )的序列爲：5，一 CACATGTC

AGACACGGAAAGAAGAGGGAGC - 3 / (寡核苷酸 383 — 388 + 890 — 913，SEQ ID N〇：4)。該3 /負意義引子Seci23 (―) 的序列爲：— CAGGTTTGCAATCCAAG TGCCC — (寡核苷酸 2480 — 2459， SEQ ID N〇··5)。引子NADLC6位於蛋白 質C的N —端，它含有3個與5 > NTR之3 >端同源的 額外寡核苷酸，而起始密碼子位於其5 /端。引子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —1 ϋ 1 1 «I 一-口、· ϋ ϋ ϋ 1 1 ϋ ι (請先閱讀背面之注意事項再Ifk本頁) 項再太

-27- 585916 A7 B7 五、發明説明)

SeQ23 (—）位於靠近蛋白質E2的N—端。質體 P VVNAD L做爲擴大反應中的模版且反應條件與上述 內容相同。所產生之DNA斷片（斷片B )再以瓊脂糖凝 膠電泳法來進行純化，其大小爲1 5 9 6個氮基對。

第三次擴大作用是利用下列各項來進行··以濃度爲 〇 · 5微莫耳濃度之5，NTR3 ( + ) (SEQ ID N〇：2)及 SeQ23( — ) (SEQ ID N〇： 5 )做爲引子，以斷片a和b做爲模版（0 · 5微克）， 以及Pfu DNA聚合酶2 · 5單位（史特達金，加州 拉荷亞）。在前四個擴大作用的循環中，其作用條件爲： 在9 4 °C下簡倂3 0秒；在4 0 °C下煉1分鐘；在7 2 °C

下擴增2分鐘。接著再進行2 0個循環，其作用條件爲： 在9 4 °C下簡倂3 0秒；在6 0 °C下煉1分鐘；在7 2 °C 下擴增2分鐘。此產品爲最後的產品，命名爲> P C R斷 片1〃 ，其大小爲1767氮基對。在用於接合作用之前 ，先以X h ο I和P v u I來消化此斷片以形成一大小爲 1175氮基對的斷片。 P C R斷片I I的製造方法__

利用寡核苷酸Seq2(+)和Seq24(―)爲 引子來製造、、PCR斷片I 1〃該5 >正意義引子 Seq2 ( + )的序列如下：5' — GGAGCATAC GCTGCTTCCCC — 3’ （寡核脊酸 1865 — 1884，SEQ ID NO:6) °該3一負意義引 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦） (請先閱讀背面之注意事 項 )

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -28- 585916 A7 B7 五、發明說明（26) 子 Seq24 (―)的序列爲·· 5/ — GCCTTGCC TATGAGGGAATGG — (寡核苷酸 2963 (請先閱讀背面之注意事項再 一 2942，SEQ ID Ν〇··7)。寡核苷酸 S e Q 2 ( + )位於靠近Ε 1的Ν -端而寡核苷酸 SeQ24 ( -）位於靠近E2區的中間。擴大作用是利 用質體P VVNAD L做爲模版，於上述內容中與利用斷 片A和B來進行之擴大作用有關的條件下進行的。所產生 之斷片（命名爲>PCR斷片I I")的大小爲1098 氮基對。在用於接合作用之前，先以Pvu I和 Rs r I I來消化此斷片以形成一大小爲9 2 9氮基對的 斷片。 斷片I I I的製造方法 以X h ο I和R s r I I來消化大小爲1 4 5 7 9氮 基對的質體PVVNADL以產生大小爲1 1 9 7 4氮基 對的斷片。此斷片被命名爲>媒介斷片II1〃 。 質體pBVDdNl的製造方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將PCR斷片I、 I I和載體斷片I I I以莫耳比例 2 : 2 : 1的濃度混合在一起，並在1 6 °C下以2 0 0單 位的T4 DNA接合酶進行連接一整夜（T4 DNA接合酶：曼海姆，色林格公司）。然後，將連接的 產物轉形入大腸桿菌STBL2細胞中，並以迷你一 D N A純化作用以及特殊限制酶的消化作用來篩檢異源的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 29- 585916 A7 B7 五、發明說明（27) 群落。將具有期望大小（1 4 0 7 9氮基對）的質體以序 列分析法來做進一步分析。所產生之質體p B VD d N 1 顯示於第1 B圖中，而此質體中也包含了期望中之來自 B VD病毒基因組之ΝΡΓ°蛋白酶基因的刪除段。 p BVD dN 1的媒介背景與適用於pVVNADL的媒 介背景相同。 實施例3 經刪除ΝΡΓ°基因之B VD病毒無性繁殖系的特徵 經刪除Ν ρ ^ °基因之Β V D病毒無性繁殖系 pBVDdNl的感染件 依前述方法在玻管內合成來自P BVD dN 1和 pVVNADL (陽性對照組）的RNA，並在RD單層 細胞上利用 > 脂非汀（lipofectin ) 〃來進行RNA轉染。 在轉染後的第48、 72、 96小時收集來自轉染細胞的 上淸液並用來重新感染新鮮的RD單層細胞。以8 0%丙 酮固定轉染的細胞然後利用a維他伊利特A B C套組〃( Vectastain Elite ABC Kit，維克實驗室）來進行免疫組織化 學分析以檢測這些細胞。用於偵測B V D -專一的病毒蛋 白質的單株抗體爲15C5 (E0專用）及CA3 (E2 專用）（輝瑞藥廠），但也可利用標準技術來製備其它對 抗這些抗原的單株抗體，並將它們用於這些相同的步驟中 。這些抗體的使用濃度爲1:1000稀釋液。在以衍生 自母病毒進行轉染後的第2 4小時可偵測到封套蛋白質 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再Wk本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -30- 585916 A7 _B7 五、發明說明（28) E0和E2，而病毒也開始製造了。相對的，病毒蛋白質 E 〇和E 2是在以衍生自p BVD dN 1的RNA來轉染 細胞後的4 8小時才於細胞中測得。B V D d N 1病毒則 是在轉染後的7 2小時才長成。 表現型的分析 將BVDdNl病毒貯存菌的早期後代（第3代）接 種到RD和MD B K單層細胞。將這些細胞與那些以母病 毒接種的對照組相比較。在轉染後的2 0小時（R D細胞 )或24小時（MDBK細胞），以80%丙酮固定這些 單層細胞。然後，利用濃度爲1 : 1 0 0 0倍稀釋的E 2 -專一的單株抗體CA 3，經由免疫組織化學方法來分析 固定好的細胞並在顯微鏡下進行檢査。結果發現：在二種 細胞型態中，母病毒的複製率明顯快於B V D d N 1病毒 所顯現的複製率。 基因型的分析 利用、艾特拉派克T M R N A試劑〃 （UltraspecTM RNA reagent，拜爾泰克公司）依照製造者的指示將母病毒和 BVDdNl (第3代）二者的RNA從受感染之RD單 層細胞中加以純化。利用RT — PCR株子（法摩西•拜 爾泰克公司）及寡核苷酸NADLE07 (―)和 5NTR3 ( + )來進行 RT/PCR 實驗。5NTR3 (+)寡核苷酸的序列和位置在上述內容中已有說明。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -31 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 B7 五、發明說明（29) NADLE0 7 ( —）的寡核苷酸序列如下：5 / — CA CTTGCATCCATCATACC-3 "(負意義， 寡核苷酸 1379 — 1361，SEQ ID N 0 ： 8 )。此寡核苷酸位於距離E0之N端約150個氮基對處 。結果發現：來自母RNA的P T/P CR可產生大小爲 1162氮基對的斷片。來自BVDdNl RNA的 RT/P CR可產生大小爲6 6 1氮基對的斷片。這與預 期中之具有刪除之Npr°蛋白酶基因的斷片相同。決定由 母RNA和BVDdNl RNA所產生的RT/PCR 斷片的序列後發現在二種情況中，所得到之序列正如原本 所預期者，且相當於第1圖中所顯示之成分的排列方式。 BVDdNl的完整序列顯示於SEQ ID N 0 ： 1 (從 nt 39 至 nt 12116)中。 實施例4 BVDdNl效力的硏究 本硏究的目的是評估含有BVD dN 1之疫苗引起小 牛體內之血淸轉形的能力。將1 5隻動物（有1 0隻爲接 種二個劑量的疫苗，5隻爲前哨動物）隨意地分配至第一 個房間。將1 0隻其它動物隨意地分配至第2個房間（接 種一個劑量的疫苗，沒有前哨動物。經皮下途徑給予動物 BVD dN 1病毒，使用劑量爲1 〇7TC I D5Q/動物 且此劑量是含在2·〇毫升之MDBK細胞溶胞物中。在 免疫期間內，將5隻指定之前哨動物移出它們的房間。剩 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格m〇 X 297公釐） ·---*----------I----訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再IRr本頁)

-32- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 A7 |~-___ B7 五、發明說明（3〇) 餘的1 0隻小牛則接種以BVD dN 1病毒疫苗。約在進 行免疫後的2 4小時，將前哨動物送回處理室中。在給予 第一個劑量後約2 8天，以類似方法給予此1 0隻動物第 2個疫苗。 在第—1，0(接種疫苗前），1，2，3，4，5 ，6’7，8，9，10天及第27，28，29，30 ’ 31 ’32，33，34，35，36，37 和 38( 適用於接種2個劑量的動物群）天時測量肛溫。在第〇天 和之後每週一次（即，在第7，14，21，28，35 ’42，49，56，63，70，77，84 和 91 天 )自接種2個劑量的群體中收集血液樣本。在第〇，7， 14，21，28，35，42，49，56和63天時 ，自接種1個劑量的群體中收集血液樣本。 經由SN分析（利用適用於第I型的BVD病毒分離 物5960，及適用於第I I型之分離物890來進行） 來偵測血淸中和的抗體以監視預期之同源和異源的保護作 用。 在一般觀察或肛溫測量上沒有觀察到二型間有明顯的 差異。前哨動物中沒有任何一隻在硏究期間內有血淸轉形 情形。 經由型態I血淸中和分析的測量可發現所有經接種 B VD d N 1病毒疫苗的動物都有血淸轉形的現象。在經 過單一劑量接種後，有60%的動物在第2 8天達到1 : 8陽性效價或更高；有9 0 %的動物在第3 5天達到1 : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） .·1 i_i I ^1 ϋ I ·1 )a,1 · I 1 n ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再9本頁) -33- 585916 A7 _B7_ 五、發明說明（32 ) 內行人士而言是很明白易懂的。此類改良也在附屬之申請 專利範圍的範疇內。 (請先閱讀背面之注意事項再 i 再本頁

ϋ· ϋ ϋ I n ϋ 1 一δ,1 I n 1 ϋ n ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -35-

Claims (1)

1. 58591^

   六、申請專利範圍 附件四：第88119594號專利申請案 修正後無劃線之中文申請專利範圍替換本 民國92年12月15日呈 (請先閱·#背面之注意事項再填寫本頁) 1 · 一種減毒型牛病毒性下痢（Β D )病毒，其中 野生型Β V D病毒基因組之Ν ρ ^。蛋白酶基因已經被修飾 且該減毒型B V D病毒之基因組核酸序列係由S ' E Q ID NO: 1中自核苷酸39至核苷酸12116之序 列或其簡倂序列所構成。. cacgcgtatc gatgaatteg ttaataegae tcactatagt atscgagaat tagaaaaggc 60 actcgtatac gtattgggca attaaaaata etaattagge cragagaaca aatccctctc 120 agegaaggee gaaaagaggc tagccatgcc ettagtagga etageataat gaggggggta 180 gcaacagtgg tgagttcgtt ggatggctta agccctgagt acagggtagt cgtcagtggt 240 tcgacgcctt ggaataaagg tetegagatg ccacgtggac csgggcatgc ccaaagcaca 300 tcttaacctg agcgggggtc gcccaggtaa aagcagtttt asccgactgt tacgaataca 360 gcctgatagg gtgctgcaga ggcccactgt attgctacta asaatetetg ctgtacatgg 420 cacatgtcag acacgaaaga agagggagea acaaaaaaga aaacacagaa acccgacaga 480 ctagaaaggg ggaaaatgaa aatagtgccc aaagaatctg aaaaagacag caaaactaaa 540 cctccggatg ctacaatagt ggtggaagga gtcaaatacc aggtgaggaa gaagggaaaa 600 accaagagta aaaacactca ggacggcttg taccataaca aaaacaaacc tcaggaatca 660 cgcaagaaac tggaaaaagc attgttggcg tgggcaataa tagetatagt tttgtttcaa 720 gttacaatgg gagaaaacat aacacagtgg aacctacaag stastgggac ggaagggata 780 caacgggcaa tgttccaaag gggtgtgaat agaagtttac atggaatctg gccagagaaa 840 atctgtactg gcgtcccttc ccatctagcc accgatatag aactaaaaac aattcatggt 900 atgatggatg caagtgagaa gaccaactac acgtgttgca gacttcaacg ccatgagtgg 960' aacaagcatg gttggtgcaa ctggtacaat attgaaccct ggattctagt catgaataga 1020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 acccaagcca atctcactga gggacaacca ccaagggagt gcgcagtcac ttgtaggtat 1080 gatagggeta gtgacttaaa cgtggtaaca caagctagag atagccccac acccttaaca 1140 ggttgcaaga aaggaaagaa cttctccttt gcaggcatat tgatgcgggg cccctgcaac 1200 tttgaaatag ctgcaagtga tgtattattc aaagaacatg aacgcattag tatgttccag 1260 gataccactc tttaccttgt tgacgggttg accaactcct tagaaggtgc cagacaagga 1320 accgctaaac tgacaacctg gt.taggcaag cagctcggga tactaggaaa aaagttggaa 1380 aacaagagta agacgtggtt tggagcatac gctgcttccc cttactgtga tgtegatege 1440 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4坑格（210Χ 297公釐） 585916 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍 aaaattggct acatatggta tacaaaaaat tgcacccctg cctgcttacc caagaacaca 1500 aaaattgtcg gccctgggaa atttggcacc aatgcagagg acggcaagat attacatgag 1560 atagggggtc acttgtcgga ggtactacta ctttctttag tggtgctgtc cgacttcgca 1620 ccggaaacag ctagtgtaat gtacctaatc ctacattttt ccatcccaca aagtcacgtt 1680 gatgtaatgg attgtgataa gacccagttg aacctcacag tggaactgac aacaqctgaa 1740 qtaataccaa ggtcggtctg gsatcuaggc aaatatgtat grataagacc aaattggtga 1800 ccttatgaga caactgtagt gttggcattt gaagaagtgs gccaagtggt gaagttagtg 1860 ttgagggcsc tcagagattt aacacgcatt tggaacgcta caacaactac tgctttttta 1920 gtatgccttg ttaagatagt caggggacca gatggtacsg ggcattctgt ggctactatt 1980 gataacaggg gtacaagggc acttggattg caaacctgaa ttctcgtatg ccatagcaaa 2040 ggacgaaaga attggtcaac tgggggctga aggccttacc accacttgga aggaatactc 2100 acctggaatg aagctggaag acacaatggt cattgcttgg tgcgaagatg ggaagttaat 2160 gtacctccaa agatgcacga gagaaaccag atatctcgca atcttgcata caagagcctt 2220 gccgaccagt gtggtattca aaaaactctt tgatggacga aagcaagagg atgtagtcga 2280 aatgaacgac aactttgaat ttggactctg cccatgtgat gccaaaccca tagtaagagg 2340 gaagttcaat acaacgctgc tgaacggacc ggccttccag atggtatgcc ccataggatg 2400 gacagqgact gtaagctgta cgtcattcaa tatggacacc ttagccacaa ctgtggtacg 2460 gacatataga aggtctaaac cattccctca taggcaaggc tgtatcaccc aaaagaatct 2520 gggggaggat ctccataact gcatccttgg aggaaattgg acttgtgtgc ctggagacca 2580 actactatac aaagggggct ctattgaatc ttgcaagtgg tgtggctatc aatttaaaga 2640 gagtgaggga ctaccacact accccattgg caagtgtaaa ttggagaacg agactggtta 2700 caggctagta gacagtacct cttgcaatag agaaggtgtg gccatagtac cacaagggac 2760 attaaagtgc aagataggaa aaacasctgt acsggtcata cctatggata ccaaactcgg 2820 acctatgcct tgcagaccat atgaaatcat atcaagtgag gggcctgtaa aaaagacagc 2880 gtgtactttc aactacacta agacattaaa aaataagtat trtgagccca gagacagcta 2940 ctttcagcaa tacatgctaa aaggagagta tcaatactgg tttgacctgg aggtgactga 3000 ccatcaccgg gattacttcg ctgagtccat attagtggtg gragtagccc tcttaggtgg 3060 cagatatgta ctttggttac tggttacata cstggtctta tcagaacaga aggccttagg 3120 gattcagtst ggatcagggg aagtggtgat gstgggcaac ttgctaaccc ataacaatat 3180 tgaagtggtg acatacttct tgctgctgta ccractgctg agggaggaga gcgtaaagaa 3240 gtgggtctta ctcttatacc acatcttagt ggtacaccca atcaaatctg taattgtgat 3300 cctactgatg attggggatg tggtaaaggc cgattcaggg ggccaagagt acttggggaa 3360 aatagacctc tgttttacaa cagtagtact aatcgtcata ggtttaatca tagctaggcg 3420 tgacccaact atagtgccac tggtaacaat aatggcagca ctgagggtca ctgaactgac 3480 ccaccagcct ggagttgaca tcgctgtggc ggtcatgact ataaccctac tgatggttag 3540 ctatgtgaca gattatttta gatataaaaa atggttacag tgcattctca gcctggtatc 3600 tgcggtgttc ttgataagaa gcctaatata cctaggtaga atcgagatgc cagaggtaac 3660 tatcccaaac tggagaccac taactttaat actattatat ttgatctcaa caacaattgt 3720 aacgaggtgg aaggttgacg tggctggcct attgttgcaa tgtgtgccta tcttattgct 3780 ggtcacaacc ttgtgggccg acttcttaac cctaatactg atcctgccta cctatgaatt 3840 ggttaaatta tactatctga aaactgtitag gactgataca gaaagaagtt ggctaggggg 3900 gatagactat acaagagttg actccatcta cgacgttgat gagagtggag agggcgtata 3960 tctttttcca tcaaggcaga aagcacaggg gaatttttct atactcttgc cccttatcaa 4020 agcaacactg ataagttgcg tcagcagtaa atggcagcta atatacatga gttacttaac 4080 tttggacttt atgtactaca tgcacaggaa agttatagaa gagatctcag gaggtaccaa 4140 cataatatcc aggttagtgg cagcactcat agagctgaac tggtccatgg aagaagagaa 4200 gaacaaaggc ttaaagaagt tttatctatt gtctggaagg ttgagaaacc taataataaa 4260 acataaggta aggaatgaga ccgtagcttc ttagtacqga gaggaggaag tctacggtat 4320 ，裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 § 本紙張尺度逍用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210 X 297公釐） 585916 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 <gccaaa§atc atgactataa tcaaggccag tacactgagt aaaagcaggc actgcataat 4380 atgcactgta tgtgagggcc gagagtggaa aggtggcacc tgcccaaaat gtggacgcca 4440 taggaagccg ataacgtgtg ggatgtcgct agcagatttt gaagaaagac actataaaag 4500 aatctttata agggaaggca actttgaggg tatgtgcagc cgatgccagg gaaagcatag 4560 gaggtttgaa atagaccggg aacctaagag taccagatac tgtgctgagt gtaataggct 4 620 gcatcctgct gaggaaggtg acttttggoc agagtcgagc atgttgggcc tcasaatcac 4 680 ctactttgcg ctgatgaatg gaaaggtgta tgatatcaca gagtgggctg gatgccagcg 4140 tgtgggaatc tccccaaata cccacagagt cccttgtcsc atctcatttg gttcacggat 4800 gcctttcagg caggaataca atggctttgt acaatatacc gctagggggc aactatttct 4860 gagaaacttg cccgtactgg caactaaagt aaaaatgctc atggtaggca accttggaga 4920 agaaattggt aatctggaac atcttgggtg gstcctaagg gggcctgccg tgtgtaagaa 4980 gatcacagag cacgaaaaat gccacattaa tatactggat aaactaaccg catttttcgg 5040 gatcatgcca agggggacta cacccagagc cccggtgagg ttccctacga gcttactaaa 5100 agtgaggagg ggtctggaga ctgcctgggc ttacacacac caaggcggga taagttcagt 5160 cgaccatgta accgccggaa aagatctact ggtctgtgac agcatgggac gaactagagt 5220 ggtttgccaa agcaacaaca ggttgaccga tgagacagag tstggcgtca agactgactc 5280 agggtgccca gacggtgcca gatgttatgt gttaaatcca gaggccgtta acatatcagg 5340 atccaaaggg gcagtcgrtc acctccaaaa gacaggtgga gaattcacgt gtgtcaccgc 5400 atcaggcaca ccggctttct tcgacctaaa aaacttgaaa ggatagtcag gcttgcctat 5460 atttgaagcc tccagcggga gggtggttgg cagagtcaaa gtagggaaga atgaagagtc 5520 taaacctaca aaaataatga gtggaatcca gaccgtctca aaaaacagag cagacctgac 5580 cgagatggtc aagaagataa ccagcatgaa caggggagac ttcaagcaga tractttggc 5640 aacaggggca ggcaaaacca cagaactccc aaaagcagtt atagaggaga taggaagaca 5700 caagagagta ttagttctta taccattaag ggcagcggca gagtcagtct sccagtatat 5760 gagattgaaa cacccaagca tctcttttaa cctaaggata ggggacatga aagaggggga 5820 catggcascc gggataacct atgcatcata cgggtacttc rgccaaatgc ctcaaccaaa 5880 gctcagagct gctatggtag aatactcata catattctta gatgaatacc attgtgccac 5940 tcctgaacaa ctggcaatta tcgggaagat ccacagattt tcagagagta taagggttgt 6000 cgccatgact gccacgccag cagggtcggt gaccacaaca ggtcaaaagc acccaatage 6060 ggaattcata gccccccagg taatgaaagg ggaggatctt gatagtcagt tccttgatst 6120 agcagggtta aaaataccag tggatgagat gaaaggcaat atgttggttt ttgtaccaac 6180 gagaaacatg gcagtagagg tagcaaagaa gctaaaagct aagggctata actctggata 6240 ctattacagt ggagaggatc cagccaatct gagagttgtg acatcacaat ccccctatgt 6300 aatcgtggct acaaatgcta ttgaatcagg agtgacacta ccagatttgg acacggttat 6360 agacacgggg ttgaaatgtg aaaagagggt gaggg.tatca tcaaagatac ccttcatcgt 6420 aacaggcctt aagaggatgg ccgtgactgt gggtgagcag gcgcagcgta ggggcagagt 6480 aggtagagtg aaacccggga ggtattatag gagccaggaa acagcaacag ggtcaaagga 6540 ctaccactat gacctcttgc aggcacaaag atacgggatt gaggatggaa tcaacgtgac 6600 gaaatccttt agggagatga attacgattg gagcctatac gaggaggaca gcctactaat 6660 aacccagctg gaaatactaa ataatctact catctcagaa gacttgccag ccgctgttaa 6720 gaacataatg gccaggactg atcacccaga gccaatccaa cttgcataca acagctatga 6780 agtccaggtc ccggtcctat tcccaaaaat aaggaatgga gaagtcacag acacctacga 6840 aaattactcg tttctaaatg ccagaaagtt aggggaggat gtgcccgtgt atatctacgc 6900 tactgaagat gaggatctgg cagttgacct cttagggcta gactggcctg atcctgggaa 6960 ccagcaggta gtggagactg gtaaagcact gaagcaagtg accgggttgt cctcggctga 7020 aaatgcccta ctagtggctt tatttgggta tgtgggrttac caggctctct caaagaggca 7080 tgtcccaatq ataacagaca tatataccat cgaggaccag agactagaag acaccaccca 7140 ccrccagtat ocacccaacg ccataaaaac cgatgggaca gagactgaac tgsaagaact 7200 _______-3- _ 太紙法尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：Z97公釐） 袭-- (請先閱囀背面之注意事項再填寫本頁) 、*5't»+ Φ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 AB-CD 申請鲁利範圍 g^cgtcgggt gacgtggaaa aaatcatggg agccatttca gattatgcag ctgggggact 7260 ggagtttgtt aaatcccaag cagaaaagat aaaaacagct cctttgttta aagaaaacgc 7320 agaagccgca aaagggtatg tccaaaaatt cattgactca ttaattgaaa ataaagaaga 7380 aataatcaga tatggtttgt ggggaacaca cacagcacta tacaaaaaca tagctgcaag 7440 actggggcat gaaacagcgt ttgccacact agtgttaaag tagctagctt ttggagggga 1500 (請先閱背背面之注意事項再填寫本頁) atcagtgtca gaccacgtca agcaggcggc agttgattia gtggtctatt atgtgatgaa 7560 taagccttcc ttcccaggtg actccgagac ecagcaagaa gggaggcgat tcgtcgcaag 1620 cctgttcatc tccgcactgg caacctacac atacaaaacr tggaattacc acaatctetc 1680 taaagtggtg gaaccagccc tggcttacct cccctatgct accaacgcat taaaaatgtt 7740 caccccaacg cggctggaga gcgtggtgat actgagcacc aegatatata aaacatacct 7800 ctctataagg aagggg.aaga gtgatggatt gctgggtacg gggataagtg cagccatgga 78 60 aatcctgtca caaaacccag tateggtagg tatatctgtg atgttggggg taggggcaat 7920 cgctgcgcac aacgctattg agtccagtga acagaaaagg accctactta tgaaggtgtt 7980 tgtaaagaac ttcttggatc aggctgcaac agatgagetg gtaaaagaaa acccagaaaa 8040 aattat'aatg gccttatttg aagcagtcca gacaattggt aaccccctga gactaatata .8100 ccacctgtat ggggtttact acaaaggttg ggaggccaag gaactatctg agaggacagc 8160 aggcagaaac ttattcacat tgataatgtt tgaageette gagtta.ttag ggatggactc 8220 acaagggaaa ataaggaacc tgtccggaaa ttacattttg gatttgatat acggcctaca 8280 caagcaaatc aacagagggc tgaagaaaat ggtactgggg tgggcccctg caccctttag 8340 ttgtgactgg acccctagtg aegagaggat cagattgcca acagacaact atttgagggt 8400 agaaaccagg tgcccatgtg getatgagat gaaagctttc aaaaatgtag gtggcaaact 8460 taccaaagtg gaggagageg ggcctttcct atgtaaaaac agacctggta ggggaccagt 8520 caactacaga gtcaccaagt attaegatga caacctcaga oagataaaac cagtagcaaa 8580 gttggaagga caggtagagc actactacaa aggggtcaca gcaaaaattg actacagtaa 8640 aggaaaaatg ctcttggcca ctgacaagtg ggaggtggaa catgctgtcs taaccaggtt 8700 agetaagaga tatactggag tcgggttcaa tggtgcatac ttaggtgacg agcccaatca 8760 ccgtgctcta gtggagaggg actgtgcaac tataaccaaa ascacagtac agtttctiaaa 8820 aatgaagaag gggtgtgcgt tcacctatga cctgaccatc tccaatctga ccaggctcat 8880 cgaactagta cacaggaaca atettgaaga gaaggaaata cccaccgcta cggtcaccac 8940 atggetaget tacaccttcg tgsatgaaga cgtagggact ataaaaccag tactaggaga 9000 gagagtaatc cccgaccctg tagttgatat caatttacaa ccagaggtgc aagtggacac 9060 gtcagaggtt gggatcacaa taattggaag ggaaaccctg atgacaacgg gagtgacacc 9120 tgrtcttggaa aaagtagage ctgacgccag cgacaaccaa aactcggtga agatcgggtt 9180 ggatgagggt aattacccag ggcctggaat acagacacat acactaacag aagaaatiaca 9240 caacagggat gcgaggccct tcatcatgat cctgggctca aggaattcca tatcaaatag 9300 ggcaaagact getagaaata taaatctgta cacaggaaat gaccccaggg aaataegaga 9360 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ettgatgget gcagggcgca tgttagtagt agcactgagg gatgtcgacc ctgagctgtc 9420 tgaaatggtc gatttcaagg ggactttttt agatagggag gccctggagg ctctaagtct 9480 cgggcaacct aaaccgaagc aggttaccaa ggaagctgtt aggaatttga tagaacagaa 9540 aaaagatgtg gagatcccta actggtttgc atcagatgac ccagtatttc tggaagrtggc 9600 cttaaaaaat gataagtact aettagtagg agatgttgga gagctaaaag atcaagctaa 9660 agcacttggg gccacggatc agacaagaat tataaaggag gtaggctcaa ggacgtatgc 9720 catgaagcta tctagctggt tcctcaaggc atcaaacaaa cagatgagtt taactccact 9780 grtttgaggaa ttgttgctac ggtgcccacc tgcaactaag agcaataagg ggcacatggc 984 0 atcagcttac caattggcac agggtaactg ggagcccctc ggttgcgggg tgcacctagg 9900 tacaatacca gccagaaggg tgaagataca cccatatgaa gcttacctga agttgaaaga 分960 tttcatagaa gaagaagaga agaaacctag ggttaaggat acagtaataa gagagcacaa：10020 caaatggata cttaaaaaaa taaggtttcs aggaaacctc aacaccaaga aaatgctoaa 10080 • 4_ 本纸法尺度適用中國國家標準（CNS ) A4坑格（21〇X 297公釐） 585916 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 cccagggaaa ctatctgaac agttggacag ggaggggcgc aagaggaaca tctacaacca 10140 ccagattggt actataatgt.caagtgcagg cataaggctg gagaaattgc caatagtgag 10200 ggcccaaacc gacaccaaaa cctttcatga ggcaataaga gataagatag acaagagtga 10260 aaaccggcaa aatccagaat *tgcacaacaa attgttggag attrtccaca cgatagccca 10320 acccaccctg aaacacacct acggtgaggt gacgtgggag caacttgagg cgggggtaaa 10380 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) tagaaagggg gcagcaggct tcctggagaa gaagaacatc ggagaagtat tggattcaga 10440 aaagcacctg gtagaacaat tggtcaggga tctgaaggcc gggagaaaga taaaatatta 10500 tgaaactgca ataccaaaaa atgaaaagag agatgtcagt gatgactggc aggcagggga 10560 cctggtggtt gagasgaggc caagagttat ccaataccct gaagccaaga caaggctaac 10620 catcactaag gtcatgtata actgggtgaa acagcagccc gttgtgattc caggatatga 10680 aggaaagacc cccttgttca acatctttga taaagtgaga aaogaatggg actcgttcaa 10740 tgagccagtg gccgtaagtt ttgacaccaa agcctgggac actcaagtga ctagtaagga 10800 tctgcaactt attggagaaa tccagaaata ttactataaa aaggagtggc acaagttcat 10860 tgacaccatc accgaccaca tgacagaagt accagttata acaacagatg gtgaagtata 10920 tataagaaat gggcagagag ggagcggcca gccagacaca agtgctggca acagcatgtt 10980 aaatgtcctg acaatgatgt acggcttctg cgaaagcaca·ggggtaccgt acaagagttt 11040 caacagggtg gcaaggatcc acgtctgtgg ggatgatggc ttcttaataa ctgaaaaagg 11100 -gtta^gggctg aaatttgcta acaaagggat gcagattctt cataaagcag gcaaacctca 11160 gaagataacg gaaggggaaa agatgaaagt tgcctataga tttgaggata tagagttctg 11220 ttctcatacc ccagtccctg ttaggtggtc cgacaacacc agtagtcaca tggccgggag 11280 agacaccgct gtgatactat caaagatggc aacaagattg gattcaagrg gagagagggg 11340 taccacagca tatgaaaaag cggtagcctt cagtttcttg ctgatgtatt cctggaaccc 11400 gcttgttagg aggatttgcc tgttggtcct ttcgcaacag ccagagacag acccatcaaa 11460 acatgccact tattattaca aaggtgatcc aataggggcc tataaagatg taataggtcg 11520 gaatctaagt g〇actgaaga gaacaggctt tgagaaattg acaaatctaa acctaagcct 11580 gtccacgttg ggggtctgga ctaagcacac aagcaaaaga ataattcagg actgtgttgc 11640 cattgggaaa gaagagggcs actgactsgt taagcccgac aggctgatat ccagcaaaac 11700 tggccactta tacatacctg ataaaggctt zacattacaa ggsaagcatt atgagcaact 11*7 60 gcagctaaga acagagacaa acccggtcat gggggttggg sctgagagat acaagttagg 11820 tcccatagtc aatctgctgc tgagaaggtt gasaattcrg ctcatgacgg ccgtcggcgt 11880 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 cagcagctga gacaaaatgt atatattgta aataaattaa tccatgtaca tagtgtatat 11940 aaatatagtt gggaccgtcc acctcaagaa gacgacacgc ccaacacgca cagctaaaca 12000 gtagtcaaga ttatctacct caagataaca ctacatttaa tgcacacagc actttagctg 12060 tatgaggata cgcccgacgt ctatagttgg actagagaag acctctaaca- gcccccgcgg 12120 atctagagga gcatgcgacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 12180 tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacsa taaccctgat 12240 aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 12300 ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 12360 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 12420 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 12480 ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 12540 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 12600 atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 12660 acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 12720 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 12780 ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 12840 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata aactggatgg 12900 aggcagatsa agttgcagga ccacttctgc gctcagccct tccggctggc tagtttattg 12960 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 585916 A8 B8 C8 D8 申請專利私圍 ctgataaatc tggagccgqt gagcgtaggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 13020 atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 13080 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 13140 accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 13200 tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 13260 tccactgagc gtcagacccc gtiagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 13320 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 13380 cagatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaaa gcgcagatac 13440 csaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 13500 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 13560 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 13620 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 13680 acctacagcg tgagctatga aaaagcgcca cgcttcccga agggsgaaag gcggacaggt 13740 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 13800 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 13860 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 13920 tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 13980 tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcaccgcagc cgaacgaccg 14040 agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgc 14078 2 . —種經申請專利範圍第1項之病毒感染的宿主細 胞，其中該宿主細胞係大腸桿菌、M D B K或R D細胞。 3 · —種由申請專利範圍第2項之宿主細胞所製造的 子代病毒。 4·一種載體，其包含本質上由SEQ ID NO :1中自核苷酸3 9至核苷酸1 2 1 1 6之序列或其簡倂 序列所構成之明確編碼元件。 5 .如申請專利範圍第4項之載體，其是質體 pBVDdNl (ATCC2 0 3354 及 CCRC 9 4 0 2 7 4 )。 6 · —種經申請專利範圍第4項之載體轉形或轉染之 宿主細胞，其中該宿主細胞係大腸桿菌、M D B K或R D 細胞。 7 · —種由申請專利範圍第6項之宿主細胞所製造的 ____ ._；_._> 6 -_；___ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規洛（210X 297公釐） ~' .裝-- (請先閱背背面之注意事項再填寫本頁) 訂 Φ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 585916 ABCD 六、申請專利範圍 B V D子代病毒。 (諸先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8 · —種修飾經分離之野生型B V D病毒基因組的方 法，其包含藉由下述之步驟突變該經分離之野生型病毒的 基因組核酸以使N p ^ °蛋白酶基因去活性： a )逆轉錄該野生型B V D病毒基因組R N A以生成 c D N A ； b )選殖步驟a )之c D N A ; ' c )藉由刪除N p ^ °蛋白酶基因之所有或部分之序列 以突變步驟b )之經選殖的c D N A中之Ν μ ° 蛋白酶基因；及 d )選殖步驟c )之突變的cDNA。 9 · 一種藉由申請專利範圍第8項的方法所製造之 B V D病毒基因組。 1 0 · —種載體，其包含本質上由申請專利範圍第9 項之B V D病毒基因組所構成之明確序列元件。 1 1 . 一種經申請專利範圍第9項之病毒基因組或申 請專利範圍第1 0項之載體轉染的宿主細胞，其中該宿主 細胞係大腸桿菌、M D B K或R D細胞。 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製 1 2 · —種由申請專利範圍第1 1項之宿主細胞所製 造的Β V D子代病毒。 1 3 · —種減毒野生型Βλ/D病毒之方法，其包含藉 由下述之步驟突變該病毒之基因組核酸以使Ν ρ 1 ◦蛋白酶 基因去活性= a )分離該野生型Β V D病毒； 本紙張尺&逍用中國國家標準（〇奶）入#見格（210父297公釐） ~ 〜 585916 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 _ b )選殖步驟a )之經分離的病毒之基因組核酸； c )藉由刪除所有或部分之N ◦蛋白酶基因序列以 突變步驟b )之經選殖的基因組核酸；及 d )轉形或轉染步驟c )之突變的核酸至宿主細胞中 以產製減毒之病毒。 1 4 · 一種由申請專利範圍第1 3項之方法所製造的 減毒型B V D病毒。 ' 1 5 . —種經申請專利範圍第1 4項之減毒型病毒感 染的宿主細胞，其中該宿主細胞係大腸桿菌、M D B κ或 R D細胞。 i 6 .如申請專利範圍第1 5項之經感染的宿主細胞 ，其中該宿主細胞是M D B K細胞（A T C C C C L -2 2)。 1 7 · —種由申請專利範圍第1 6項的宿主細胞.所製 造的病毒子代。 1 8 · —種對抗B V D病毒之抗體，其係藉由在能製 造抗體之動物體內誘發其製造對抗B V D病毒抗體的方法 所製得，該方法包含給予該動物有效劑量的下述物質以誘 發該抗體的產生：（a )申請專利範圍第1項之病毒；（ b )申請專利範圍第4項之載體；（c )申請專利範圍第 9項之病毒基因組；（d )申請專利範圍第1 0項之載體 :或（e )申請專利範圍第1 4項之減毒型病毒。 1 9 .如申請專利範圍第1 8項之抗體，其中該抗體 是在牛隻體內製造。 (請先閲讀背面之注意事 4 項再填· 裝—— 寫本頁) 、1T 本紙乐尺度通用中國國家標準（CNS ) A4洗格（210X 297公釐） 585916 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍2 0 .如申請專利範圍第1 8項之抗體 進一步包含從該動物體內分離該抗體。 其中該方法 •裝------訂 (請先閣囀背面之注意事項再填寫本頁) 4 了項再填办 Φ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）