JP2009519014A - 特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含むウシウイルス性下痢ウイルスであって、ＮＳ３ドメインにおける変異によって、野生型ＮＳ３に対して産生されたモノクローナル抗体による認識の減失がもたらされているが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されているウシウイルス性下痢ウイルスを対象とする。本発明は、例えば、特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチンを産生するのに、またはワクチン接種された動物と、感染動物もしくはワクチン接種されていない動物とを識別するのに有用である。
【図１】

Description

ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤウイルスまたはＢＶＤＶ）は、フラビウイルス科ペスチウイルス属の小さなＲＮＡウイルスである。それは、ヒツジのボーダー病およびブタの古典的ブタ熱の原因物質であるウイルスに近縁である。ＢＶＤＶによって引き起こされる疾患は、広範囲に及び、経済的に破壊的となりうる。ＢＶＤＶ感染は、ウシの繁殖問題をもたらしうるものであり、流産または早産を引き起こしうる。ＢＶＤＶは、妊娠中のウシの胎盤を横断することができ、持続感染した（ＰＩ）子ウシの出産をもたらしうる。上記ＰＩ子ウシは、上記ウイルスに対して免疫寛容となっており、それらの残りの生涯にわたって持続的にウイルス血症を患う（Ｍａｌｍｑｕｉｓｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１５２：７６３−７６８（１９６８年）；Ｒｏｓｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１８８：６１８−６１９（１９８６年））。感染ウシは、高温、下痢、咳、および消化器粘膜潰瘍を特徴とする「粘膜病」も示しうる（Ｏｌａｆｓｏｎら、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ．３６：２０５−２１３（１９４６年）；Ｒａｍｓｅｙら、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｖｅｔ．３４：６２９−６３３（１９５３年））。これらの持続感染動物は、粘膜病のさらなる流行をもたらす、その群れの中でのウイルス播種のための供給源となり（Ｌｉｅｓｓら、Ｄｔｓｃｈ．Ｔｉｅｒａｅｒｚｔｌ．Ｗｓｃｈｒ．８１：４８１−４８７（１９７４年））、腸疾患または肺炎を引き起こす原因となる微生物に極めて感染しやすい（Ｂａｒｂｅｒら、Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１１７：４５９−４６４（１９８５年））。

ＢＶＤウイルスは、２つのバイオタイプのうちの１つに分類される。「ｃｐ」バイオタイプのものは、培養細胞に対する細胞変性効果を誘導するが、「ｎｃｐ」バイオタイプのウイルスは誘導しない（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ．５０：７３−７９（１９６０年））。加えて、２つの主要な遺伝子型（１型および２型）が認識されており、それらは共に、様々な臨床的な症候群を引き起こすことが示されている（Ｐｅｌｌｅｒｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：２６０−２６８（１９９４年）；Ｒｉｄｐａｔｈら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５：６６−７４（１９９４年））。ＢＶＤウイルス粒子は直径４０から６０ｎｍである。ＢＶＤＶのヌクレオキャプシドは、ＲＮＡの単一分子およびキャプシドプロテインＣからなる。上記ヌクレオキャプシドは、脂質膜によって囲まれており、その中にＥ１およびＥ２という２種の糖タンパク質が係留されている。第３の糖タンパク質であるＥ^ｒｎｓは、エンベロープに緩やかに付着している。ＢＶＤＶのゲノムは、長さが約１２．５ｋｂであり、５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）の間に位置する単一のオープンリーディングフレームを含有する（Ｃｏｌｌｅｔｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６５：１９１−１９９（１９８８年））。約４３８ｋＤのポリプロテインは、このオープンリーディングフレームから翻訳され、細胞性およびウイルス性のプロテアーゼによって少なくとも１１種のウイルス性構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質にプロセシングされる（Ｔａｕｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５４１５−５４２２（１９９７年）；Ｘｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５３１２−５３２２（１９９７年）；Ｅｌｂｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４１３１−４１３５（１９９６年）；およびＷｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４：３４１−３５０（１９９１年））。ＢＶＤＶのゲノム順序は、ｐ２０／Ｎ^ｐｒｏ、ｐ１４／Ｃ、ｇｐ４８／Ｅ^ｒｎｓ、ｇｐ２５／Ｅ１、ｇｐ５３／Ｅ２、ｐ５４／ＮＳ２、ｐ８０／ＮＳ３、ｐ１０／ＮＳ４Ａ、ｐ３２／ＮＳ４Ｂ、ｐ５８／ＮＳ５Ａ、およびｐ７５／ＮＳ５Ｂである。Ｐ２０／Ｎ^ｐｒｏ（Ｓｔａｒｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：７０８８−７０９３（１９９３年）；Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、Ｖｉｒｏｌ．６５：４５０８−４５１４（１９９１年））は、それ自体を、合成されたポリプロテインの残りから切り出すシス作用性のパパイン様プロテアーゼである。キャプシドタンパク質（Ｃ）は、ｐ１４とも呼ばれ、塩基性タンパク質であり、ゲノムＲＮＡのパッケージングおよびエンベロープウイルス粒子の形成に機能する。Ｐ１４／Ｃは、様々なペスチウイルスの間で保存されている。３種のエンベロープタンパク質、すなわちｇｐ４８／Ｅ^ｒｎｓ、ｇｐ２５／Ｅ１、およびｇｐ５３／Ｅ２は、高度にグリコシル化されている。Ｅ^ｒｎｓは、ジスルフィド共有結合によって連結されたホモ２量体を形成する。疎水性膜アンカー領域の不在は、Ｅ^ｒｎｓがエンベロープに緩やかに付着していることを示唆する。Ｅ^ｒｎｓは、感染ウシで高い抗体価を誘導するが、抗血清が有するウイルス中和活性は限定的である。Ｅ１は、ウイルス粒子中で、ジスルフィド共有結合を介してｇｐ５３／Ｅ２に連結されていることが見出されている。Ｅ１は、膜内にタンパク質を係留する働きと、翻訳を開始するためのシグナルペプチドとしての働きとを有する２つの疎水性領域を含有している。Ｅ１は、有意な抗体反応を感染ウシで誘導しない。これは、それがウイルス粒子表面に露出していない可能性を示唆している。Ｅ１と同様にＥ２も、Ｃ末端に膜アンカー領域を有する。しかし、Ｅ１とは異なり、Ｅ２は抗原性が極めて高く、ＢＶＤＶにおける最も免疫優性なタンパク質の１つである。Ｅ２への抗体結合は、ウイルス感染を効果的に中和できる。これは、それがウイルスの侵入に関与している可能性を示唆している。ポリプロテインにおける、構造タンパク質の下流の領域は、非構造タンパク質をコードしており、２種のウイルス性プロテアーゼ酵素によってプロセシングされる。ＮＳ２−ＮＳ３接合部は、ＮＳ２内にコードされている亜鉛依存性プロテアーゼによって切断される。ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂをコードしている、ＢＶＤＶポリプロテインのＣ末端部分は、ＮＳ３のＮ末端ドメインによってコードされているセリンプロテアーゼによってプロセシングされる。ＮＳ３は、感染ウシがそれに対する強い体液性応答を行うので、別の主要なＢＶＤＶ免疫原である。対照的に、ＢＶＤＶに感染したウシでは、他の非構造タンパク質に対する血清抗体を見出されておらず、ＮＳ４Ａに対する弱い体液性免疫応答のみが検出されうる。

ＮＳ３は、細胞変性ＢＶＤＶ単離株でのみ見出され、このタンパク質をコードする領域は、複数のＢＶＤＶ亜型および他のペスチウイルスの間での比較に基づけば、ＢＶＤＶゲノム中で最もよく保存されている領域の１つである。ＮＳ３のＣ末端部分は、ＲＮＡ依存性のＮＴＰアーゼ／ヘリカーゼをコードし、このＢＶＤＶヘリカーゼは、高度に保存されているヘリカーゼアミノ酸モチーフの配列比較に基づいて、ヘリカーゼスーパーファミリー２（ＳＦ２）に分類されている。このスーパーファミリーの中には、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、および日本脳炎ウイルスなどのポティウイルス、フラビウイルス、およびペスチウイルス由来の類似タンパク質があり、それらには、豚コレラ（古典的ブタ熱）ウイルスＮＳ３ヘリカーゼ、および他のフラビウイルス由来のＲＮＡヘリカーゼが含まれる。ＨＣＶ ＮＳ３のプロテアーゼドメインおよびヘリカーゼドメインの分子構造が解明された（Ｙａｏら、Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．４：４６３−７（１９９７年）；ＪｉｎおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｘｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２３：４７−５３（１９９５年））。プロテアーゼ領域は、キモトリプシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーの間に一般的にみられる二重βバレル折りたたみ構造を含有している。上記ヘリカーゼドメインは、構造的に関連した２つのβ−α−βサブドメインと、通常はヘリカーゼのα−ヘリックスサブドメインと呼ばれる、７本のヘリックスおよび３本の短いβストランドの第３のサブドメインとを含有している。ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮＡ結合部位、およびヘリカーゼ活性部位は表面に露出しており、一方、プロテアーゼ活性部位は露出しておらず、ヘリカーゼドメインに面した方向性を有する。プロテアーゼドメインおよびヘリカーゼドメインは、表面に露出した短いストランドによって共有結合で連結されており、広い表面積（約９００Å^２）にわたって相互作用している。しかし、ヘリカーゼ活性部位は、この相互作用領域から離れた方向性を有する。

現在利用可能なＢＶＤＶワクチンには、化学的に不活化された野生型ウイルスを含有するものが含まれる（ＭｃＣｌｕｒｋｉｎら、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．５８：１１９（１９７８年）；Ｆｅｒｎｅｌｉｕｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３３：１４２１−１４３１（１９７２年）；Ｋｏｌａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３３：１４１５−１４２０（１９７２年））。これらのワクチンは通常、多重用量の投与を必要とし、短命な免疫応答をもたらす。また、それらは胎児へのウイルスの移動に対しても防御しない（Ｂｏｌｉｎ、Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．Ｆｏｏｄ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．１１：６１５−６２５（１９９５年））。ヒツジでは、精製されたＥ２タンパク質をベースとしたサブユニットワクチンが報告されている（Ｂｒｕｓｃｈｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ １５：１９４０−１９４５（１９９７年））。このワクチンは、胎児が感染することから保護するようにみえるが、防御が相同株のウイルスのみに限定されており、抗体価と防御との間には相関関係がない。

ウシまたはブタ細胞内での反復継代によって（Ｃｏｇｇｉｎｓら、Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｖｅｔ．５１：５３９（１９６１年）；およびＰｈｉｌｌｉｐｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．３６：１３５（１９７５年））、またはウイルスに温度感受性表現型を与える化学的に誘導された変異によって（Ｌｏｂｍａｎｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４５：２４９８（１９８４年）；およびＬｏｂｍａｎｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．４７：５５７−５６１（１９８６年））弱毒化されたウイルスを用いて、改変生ウイルス（ＭＬＶ）ＢＶＤＶワクチンが産生されている。感染からの防御を提供するには、単回用量のＭＬＶ ＢＶＤＶワクチンで十分であることが判明しており、ワクチン接種されたウシでは、免疫の期間が何年間も持続しうる（Ｃｏｒｉａら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｏｎ．Ｍｅｄ．４２：２３９（１９７８年））。加えて、ＭＬＶワクチンを用いた交差防御が報告されている（Ｍａｒｔｉｎら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」中、７５：１８３（１９９４年））。しかし、これらの改変生ウイルスワクチンの使用に関しては、安全性考察−胎児へのワクチン株の移動を含める−が主要な懸念である（Ｂｏｌｉｎ、Ｖｅｔ．Ｃｌｉｎ．ＮｏｒｔｈＡｍ．Ｆｏｏｄ Ａｎｉｍ．Ｐｒａｃｔ．１１：６１５−６２５（１９９５年））。

上記に基づいて、ＢＶＤＶの伝搬を制御する新規かつより効果的なワクチンの必要性が存在することは明らかである。そのようなワクチンは、将来における国家または地域ＢＶＤＶ根絶プログラムで非常に貴重なものとなりうるであろう。また、そのようなワクチンは、他の特徴化ウシワクチンと併用することもできるであろう。これらは畜産業における実質的な進歩である。そのようなワクチンの１つが「特徴化」ワクチンである。そのようなワクチンでは、野生型ウイルスに存在する抗原決定基が欠失している。野生型ウイルスに感染している動物は「特徴化」免疫原決定基に対する免疫応答を開始するが、未感染のワクチン接種動物は、上記決定基が特徴化ワクチン中に存在していないことの結果として、免疫応答を開始しない。特徴化決定基を対象とした免疫学的アッセイの使用を通して、ワクチン接種された非感染動物から感染動物を識別できるであろう。感染動物を選り除くことによって、その群れは、長期間にわたってＢＶＤ無含有となりうるであろう。ＢＶＤ疾患の脅威が排除される利益に加えて、その群れがＢＶＤ無含有であるという証明は、交易の自由という直接的経済的利益を有する。

本発明は、少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含むウシウイルス性下痢ウイルスであって、ＮＳ３ドメインにおける変異によって、野生型ＮＳ３に対して産生されたモノクローナル抗体による認識の減失がもたらされているが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されているウシウイルス性下痢ウイルスを対象とする。

本発明は、少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を有するウシウイルス性下痢ウイルスを含む新規の特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチンであって、例えば２０．１０．６、１．１１．３、２１．５．８、および２４．８などの、ＮＳ３に対する標準的モノクローナル抗体によってＮＳ３が認識されないが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されている特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチンも対象とする。

本発明は、動物がワクチン接種されているか、ワクチン接種されていないか、またはＢＶＤＶに感染しているか判定するアッセイも対象とする。

本発明の一実施形態では、少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含み、ＮＳ３のヘリカーゼドメインにおける変異によって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルス由来のＮＳ３に対して産生されたモノクローナル抗体による認識の減失がもたらされているが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されているウシウイルス性下痢ウイルスを提供する。

本発明の別の実施形態では、少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含み、ＮＳ３に対するモノクローナル抗体によってＮＳ３が認識されず、上記ＮＳ３抗体が、２０．１０．６、１．１１．３、２１．５．８、および２４．８からなる群から選択され、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されているウシウイルス性下痢ウイルスを提供する。

本発明の別の実施形態では、上記ウイルスワクチンが単一のヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウイルスワクチンがＩＧＲループ内にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４１にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４３にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４５にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＫＨＰループ内にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＫＨＰループ内のアミノ酸残基１８６７にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＫＨＰループ内のアミノ酸残基１８６８にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＫＨＰループ内のアミノ酸残基１８６９にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＳＥＳループ内にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＳＥＳループ内のアミノ酸残基１９３９にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＳＥＳループ内のアミノ酸残基１９４２にヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが２、３、または４つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが２つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内に２つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４３および１８４５に２つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＳＥＳループ内に２つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＳＥＳループ内のアミノ酸残基１９３９および１９４２に２つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが３つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内に３つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスがＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８６７、１８６８、および１８６９に３つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが、ＩＧＲループおよびＳＥＳループ内のアミノ酸残基１８４５、１８６８、および１９３９に３つのヘリカーゼドメイン変異を含む。

本発明の特に好ましい一実施形態では、少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含むウシウイルス性下痢ウイルスを含む特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチンであって、ＮＳ３のヘリカーゼドメインにおける変異によって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルス由来のＮＳ３に対して産生されたモノクローナル抗体による認識の減失がもたらされているが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されている特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチンを提供する。

本発明の別の実施形態では、ウシ下痢ウイルスワクチンでワクチン接種された動物からウシ下痢ウイルスに感染している動物を識別する方法を提供する。この実施形態では、上記ウシ下痢ウイルスワクチンが少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む特徴化ワクチンであり、上記方法は、
試験動物から試験試料を取得するステップと、
上記試験試料中にウシ下痢ウイルスを検出するステップと、
上記ウシ下痢ウイルスが上記変異を含有しているかどうか決定するステップと
を含む。

本発明の別の実施形態では、上記ウシ下痢ウイルスを検出する方法が、少なくとも１つのモノクローナル抗体の使用を利用する。

好ましい方法は、ＮＳ３のヘリカーゼドメインに特徴化ワクチンヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

例えば、この識別アッセイの実施形態は、
試験動物から得た体液を含有する試験試料に、野生型ウシ下痢ウイルスを検出できる標識抗体、または変異型ウシ下痢ウイルスを検出できる標識抗体を添加するステップと、
上記野生型ウシ下痢ウイルスまたは上記変異型ウシ下痢ウイルスに少なくとも１つのモノクローナル抗体を接触させることによって、上記野生型ウシ下痢ウイルスまたは上記変異型ウシ下痢ウイルスに対する上記標識抗体の結合親和性を測定するステップと、
野生型ＢＶＤＶと変異型ＮＳ３を有するＢＶＤＶに対して産生されたモノクローナル抗体を用いた結合親和性の結果を比較することによって、試験動物のワクチン接種状態を決定するステップと
を含みうる。

好ましい方法は、
変異型ＮＳ３以外のドメインに対して産生された第１の標識抗体を添加するステップと、
ＮＳ３の変異部分に対して産生された第２の標識抗体を添加するステップと
を含む。

この方法の一実施形態では、上記第１の抗体が野生型ウイルスに対して産生されたものである。

この方法の別の実施形態では、上記第２の抗体がＮＳ３の変異部分に対して産生されたものである。

この方法の別の実施形態では、上記第２の抗体が、ＮＳ３に対して産生されたものであり、かつ２０．１０．６、１．１１．３、２１．５．８、および２４．８からなる群から選択される。

上記方法の別の実施形態では、上記第２の抗体が、ＩＧＲループ、ＫＨＰループ、およびＳＥＳループからなる群から選択された、ＮＳ３の少なくとも１つの変異部分に対して産生される。

この方法の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが、ＩＧＲループ内の１８４１、１８４３、および１８４５からなる群から選択されたアミノ酸残基に少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

上記方法の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが、ＫＨＰループ内の１８６７、１８６８、および１８６９からなる群から選択されたアミノ酸残基に少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

上記方法の別の実施形態では、上記ウシウイルス性下痢ウイルスが、ＳＥＳループ内の１９３９および１９４２からなる群から選択されたアミノ酸残基に少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

上記方法の別の実施形態では、前記ウシウイルス性下痢ウイルスが、ＩＧＲループおよびＳＥＳループ内のアミノ酸残基１８４５、１８６８、および１９３９に少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む。

これらおよび他の、本発明の特徴、態様、および利点を、下記の説明、添付されている特許請求の範囲、および付随の図を参照して例証する。

定義
本発明の実施形態の記述に使用される用語には、以下の定義が適用されうる。以下の定義は、参照により本明細書に組み込まれている個々の参考文献それぞれに含有されているいかなる矛盾する定義にも取って代わるものである。

本明細書中で別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者に一般的に解釈される意味を有するものとする。さらに、前後関係によって別段に必要とされない限り、単数形の用語には複数が含まれるものとし、複数形の用語には単数が含まれるものとする。

「アミノ酸」という用語は、本明細書で使用される場合、天然存在のアミノ酸および合成アミノ酸に加えて、天然存在のアミノ酸に類似した様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然存在のアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに後で修飾されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。２０種の通常アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非通常アミノ酸も、本発明のポリペプチドの適した成分でありうる。非通常アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の同様なアミノ酸およびイミノ酸が含まれる。アミノ酸類似体は、天然存在のアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、すなわち、１原子の炭素に、１原子の水素、１個のカルボキシル基、１個のアミノ基、および１個のＲ基が結合している化合物を指す。例示的なアミノ酸類似体には、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、およびメチオニンメチルスルホニウムが含まれる。そのような類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチドバックボーンを有するが、天然存在のアミノ酸と同じ必須化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なった構造を有するが、天然存在のアミノ酸と同様な様式で機能する化学化合物を指す。

本明細書では、アミノ酸を、それらの一般的に知られている３文字記号によって指示することも、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されている１文字記号によって指示することもある。

本明細書で使用される場合、「動物対象」という用語には、ウシ、ヒツジ、ブタなど、ＢＶＤＶ感染を患う可能性のあるいかなる動物も含まれるものとする。「治療する」または「ワクチン接種する」によって、ＢＶＤＶの毒性株による感染の危険性を防止もしくは低減すること、ＢＶＤＶ感染の症候を寛解させること、またはＢＶＤＶ感染からの回復を加速させることを意味する。

ＢＶＤ「ウイルス」、「ウイルス単離株」、または「ウイルス株」は、本明細書で使用される場合、ウイルスゲノム、付随タンパク質、および他の化学的構成成分（脂質などの）からなるＢＶＤウイルスを指す。通常、ＢＶＤウイルスは、ＲＮＡ形態のゲノムを有する。クローニングに使用するには、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写することができる。したがって、本明細書における核酸およびＢＶＤウイルス配列への言及は、ウイルスＲＮＡ配列に由来するウイルスＲＮＡ配列およびＤＮＡ配列の両方を包含する。便宜上、下記の配列表に示すＢＶＤのゲノム配列は、ポリペプチド配列と、例示的変異を導入する際に使用されるプライマーＤＮＡ配列とを指す。それぞれに対応するＲＮＡ配列は、当業者には容易に明らかとなるものである。

多数のＩ型およびＩＩ型ＢＶＤウイルスが当業者に知られており、例えばＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手できる。

「保存性アミノ酸置換」という用語は、本明細書で使用される場合、通常、それらの側鎖が関連しているアミノ酸ファミリー内で行われるものである。詳細には、保存性アミノ酸置換は、本明細書で使用される場合、野生型由来のペプチドと比較して、所与のペプチドの抗体認識に影響のないものである。遺伝学的にコードされているアミノ酸は、概ね４つの群に分割される。すなわち、（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、併せて、芳香族アミノ酸としても分類される。

したがって、「非保存性アミノ酸置換」という用語は、本明細書で使用される場合、異なった特性を有する可能性の高いもの、とりわけ抗体認識に関してそうであるものである。それゆえ、非保存性アミノ酸置換は、例えば、野生型由来のペプチドに対して産生された抗体による認識の減失など、示差的な免疫応答を喚起するであろう。

「免疫原性」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｉ型もしくはＩＩ型ＢＶＤウイルスに対して、またはＩ型およびＩＩ型ＢＶＤウイルスの両方に対して、動物体内で免疫応答を引き起こす変異型または野生型ＢＶＤウイルスの能力を意味する。免疫応答は、主として細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される細胞性免疫応答、または主としてヘルパーＴ細胞によって媒介され、それが次にＢ細胞性を活性化して抗体産生へと導く液性免疫応答でありうる。

本明細書で使用される場合、「裸のＤＮＡ」という用語は、本発明の薬剤をコードするヌクレオチド配列を、その産生を制御する短いプロモーター領域と共に含むプラスミドを指す。それは、上記プラスミドがいかなる送達媒体中にも保持されていないので、「裸」のＤＮＡと呼ばれる。そのようなＤＮＡプラスミドが、真核細胞などの宿主細胞内に入った場合、それがコードしているタンパク質がその細胞内で転写および翻訳される。

「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、発現可能な遺伝子をコードするいかなる核酸も指し、それには、線状の核酸も、環状の核酸も、そして２本鎖の核酸も、１本鎖の核酸も含まれる。上記核酸は、ＤＮＡでも、ＲＮＡでもよく、修飾ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含んでいてもよく、メチル化、または保護基、キャップ構造、もしくはテール構造の包含などの手段によって化学的に修飾されていてもよい。

「ワクチン」という用語は、本明細書で使用される場合、感染の危険性を防止もしくは低減する組成物、または感染の症候を寛解させる組成物を指す。病原体に対するワクチン組成物の防御効果は、通常、細胞性免疫応答もしくは液性免疫応答、または両者の組合せのいずれかである免疫応答を対象で誘導することによって得られる。一般的に言って、感染対象におけるＢＶＤＶ感染発生の停止もしくは減少、症候の寛解、またはウイルスの加速度的消失によって、ワクチン組成物の防御効果が示される。本発明のワクチン組成物は、ＢＶＤウイルスによって引き起こされる感染に対する防御効果を与える。

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、ある環境から別の環境への核酸の導入を可能または容易にする手段を意味する。一例として、本発明によれば、組換えＤＮＡ技法で使用される一部のベクターは、核酸を複製させるため、および／または核酸によってコードされているタンパク質を発現させるために、宿主細胞または標的細胞内にＤＮＡセグメント（異種ＤＮＡセグメントなど、例えば異種ｃＤＮＡセグメント）などの核酸を導入するのを可能にする。組換えＤＮＡ技法で使用されるベクターの例には、プラスミド、染色体、人工染色体、およびウイルスが含まれるが、これらに限定されない。

当業者が本発明を実施するのを補助するために、以下の詳細な説明を提供する。そうだとしても、当業者は本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱せずに、本明細書に論じた実施形態を改変および変形させることができるので、本発明を過度に限定するようにこの詳細な説明を解釈するべきでない。

本明細書に引用されている各参考文献の内容は、これらの一次参考文献内に引用されている参考文献の内容も含めて、参照により本明細書に組み込む。

標準手順を用いて、本発明で有用なプラスミドを増殖および精製することができる。プラスミド増殖用の好ましい原核宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧＭ２１６３細胞系であるが、他の一部の細胞型も使用できる。プラスミドから転写されたＲＮＡは、ＭＤＢＫ細胞など、ウイルス産生を支持できる真核宿主細胞内に形質移入によって導入することができる。ウイルスは、そのような宿主細胞内で産生させ、そこから、ショ糖密度勾配遠心法などの既知な分離技法を用いて高度に精製された形態に単離することができる。

一実施形態では、本発明は、上述の変異体ＢＶＤウイルスのうちの１つまたは複数が含まれている免疫原性組成物を提供する。

本発明の別の実施形態は、上述の変異体ＢＶＤウイルスの単離されたゲノム核分子を対象とする。ここで使用される核酸分子には、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方が包含される。

この実施形態では、ＢＶＤウイルスの単離されたゲノム核分子は、ＮＳ３ドメインの少なくとも一部がヘリカーゼドメインで変異導入されているＩ型ウイルスのゲノム配列を含有している。

別の実施形態では、本発明は、本明細書に上述されているＢＶＤウイルスのゲノム核酸配列がそのなかに組み込まれているベクターを提供する。そのようなベクターは、上記ゲノム核酸分子の大量産生のため、または子孫変異体ＢＶＤウイルスの産生のために、適した宿主細胞内に導入することができる。上記ベクターは、ベクターの増殖、単離、およびサブクローニングを容易にする他の配列エレメント、例えば、細菌および宿主細胞内での増殖および選択を可能にする選択マーカー遺伝子および複製起点を含有していてもよい。本発明の特に好ましいベクターはｐ１５ａＤＩである（図５参照）。

本発明のさらに別の実施形態は、本発明の変異型ＢＶＤウイルスのゲノム核酸分子がそのなかに導入されている宿主細胞を対象とする。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」には、変異型ＢＶＤウイルスのゲノム核酸分子で形質転換されたいかなる原核細胞も含まれ、上記核酸分子は、適したベクターによって提供されることが好ましい。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」には、変異型ＢＶＤウイルスに感染しているか、または他の方法で変異型ＢＶＤウイルスのゲノム核酸分子を保持しているいかなる真核細胞も含まれる。プラスミド増殖用の好ましい原核宿主細胞は、大腸菌ＧＭ２１６３細胞系であるが、他の細胞型も使用できる。好ましい真核宿主細胞には、ＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２２）などの哺乳類細胞が含まれる。しかし、他の培養細胞も使用できる。本発明には、そのような宿主細胞内で産生された子孫ウイルスもさらに含まれる。

本発明の別の実施形態では、化学的な不活性化によって、または細胞培養物中での連続継代によって、免疫原性組成物中で使用する前に、上記ウイルスが弱毒化されていてもよい。弱毒化の方法は当業者によく知られている。

本発明の免疫原性組成物は、ＢＶＤＶに対する他の免疫原性組成物、例えば、同時係属中の米国特許出願第０８／１０７９０８号、米国特許第６０６０４５７号、第６０１５７９５号、第６００１６１３号、および第５５９３８７３号明細書に記載のものなどの追加活性成分も含有でき、これらの開示はすべて、参照により全体として本明細書に組み込む。

加えて、本発明の免疫原性組成物は、１または複数種の獣医学的に許容できる担体を含有しうる。本明細書で使用される場合、「獣医学的に許容できる担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌薬、抗真菌薬、等張剤、および吸収遅延薬剤などが含まれる。希釈剤には、水、食塩水、ブドウ糖、エタノール、およびグリセロールなどが含まれうる。等張剤には、とりわけ、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれうる。安定化剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。アジュバントには、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ社）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油型乳剤、油中水型乳剤、例えばフロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバントなど、ブロックコポリマー（Ｂｌｏｃｋ ｃｏ ｐｏｌｙｍｅｒ）（ＣｙｔＲｘ社、米国ジョージア州アトランタ（Ａｔｌａｎｔａ）所在）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ社、米国カリフォルニア州エマリービル（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）所在）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）所在）、もしくは他のサポニン画分、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換え体または非組換え体）、コレラトキシン、またはムラミルジペプチドが含まれるが、これらに限定されない。上記免疫原性組成物は、例えば、インターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインなど、他の１または複数種の免疫調節剤をさらに含有しうる。

本発明の免疫原性組成物は、投与経路に応じて、様々な形態で調製できる。例えば、上記免疫原性組成物は、注射での使用に適した無菌水溶液または分散液の形態で作ることも、凍結乾燥技法を用いて凍結乾燥された形態で作ることもできる。凍結乾燥された免疫原性組成物は、通常、約４℃に維持され、アジュバントの存在下または非存在下で、安定化溶液中、例えば食塩水および／またはＨＥＰＥＳ中で再構成させることができる。

本発明の免疫原性組成物は、ＢＶＤウイルスに対する免疫応答を誘導するために、動物対象に投与することができる。したがって、本発明の別の実施形態は、上述した本発明の免疫原性組成物を動物対象に有効量投与することによって、ＢＶＤウイルスに対する免疫応答を刺激する方法を提供する。

本発明の方法によれば、動物対象に投与するのに好ましい免疫原性組成物には、変異型ＢＶＤウイルスが含まれる。変異型ウイルス、好ましくは化学的な不活性化によって、または培養物中での連続継代によって弱毒化されている変異型ウイルスを含有している免疫原性組成物は、ウシに、好ましくは非経口経路で投与されるが、例えば、経口、鼻腔内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下、直腸、もしくは膣投与によるもの、または複数の経路の併用によるものなど、他の投与経路も使用できる。

免疫化プロトコールは、当技術分野でよく知られている手順を用いて最適化できる。動物には単回用量を投与することもでき、または代わりに、２から１０週間の間隔で２回以上の接種を行うこともできる。ウシ体内で誘導される免疫応答の程度および性質は、様々な技法を用いることによって評価できる。例えば、接種された動物から血清を収集し、ＢＶＤウイルスに特異的な抗体が存在するかどうかを、例えば従来のウイルス中和アッセイで試験することができる。細胞性免疫応答の誘導を示す、リンパ組織内で応答しているＣＴＬの検出は、Ｔ細胞増殖などのアッセイによって行うことができる。関連技法は、当技術分野において、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社（１９９４年）に詳細に記載されている。

本発明の別の実施形態は、ワクチン組成物を対象とする。

一実施形態では、本発明のワクチン組成物は、上述した１または複数種の変異型ＢＶＤウイルスを有効量含有している。精製された変異型ウイルスをワクチン組成物中で直接用いることもでき、化学的な不活性化によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの連続継代によって、変異型ウイルスをさらに弱毒化することもできる。通常、ワクチンは、０．５から５ｍｌまでの間の容積中に、約１×１０^６から約１×１０^８までの間のウイルス粒子を、獣医学的に許容できる担体と共に含有する。熟練した獣医ならば、防御効果を与えるのに有効な、ワクチン組成物中のウイルスの正確な量を決定することができる。ワクチン組成物中での使用に適した獣医学的に許容できる担体は、本明細書で上述したもののうちの任意のものでありうる。

別の実施形態では、本発明のワクチン組成物は、変異型ウイルスの核酸分子を含有している。ワクチンには、上記ＢＶＤウイルスゲノムのすべてまたは一部をコードするＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のいずれかを使用できる。上記ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、「裸」の形態で存在でき、または細胞内取り込みを促進させる薬剤（例えばリポソームまたは陽イオン性脂質）と共にそれを投与することもできる。典型的な投与経路は、約０．１から約５ｍｌのワクチンの筋肉内注射であろう。上記ワクチン中の総ポリヌクレオチド量は、通常、約０．１ｍ／ｍｌから約５．０ｍｇ／ｍｌまでの間であるべきである。ポリヌクレオチドは、懸濁液、溶液、または乳剤の一部として存在できるが、通常は水性担体が好ましい。核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を用いたワクチンおよびワクチン接種手順は、当技術分野において、例えば、米国特許第５７０３０５５号、第５５８０８５９号、第５５８９４６６号明細書に詳細に記載されており、これらの開示をすべて、参照により本明細書に組み込む。

本発明のワクチン組成物は、ＢＶＤＶに対する他のワクチン組成物、例えば、米国特許第６０６０４５７号、第６０１５７９５号、第６００１６１３号、および第５５９３８７３号明細書に記載のものなどの追加活性成分も含有できる。

ワクチン接種は、単回接種によって行うことも、複数回接種を介して行うこともできる。望ましい場合には、接種をされた動物から血清を収集し、ＢＶＤウイルスに対する抗体が存在するかどうか試験できる。

本発明の別の実施形態では、ＢＶＤＶ感染を治療する際に、上記本発明のワクチン組成物を用いる。したがって、本発明は、動物に本発明の変異型ＢＶＤウイルスを治療有効量投与することによって、動物対象でＢＤＶウイルスによって引き起こされた感染を治療する方法を提供する。

投与する前に遺伝子改変ウイルスを弱毒化する必要があるかどうか、当業者ならば容易に判定することができる。本発明の変異型ウイルスは、追加の弱毒化を行わずに直接的に動物対象に投与できる。治療上有効なウイルス量は、用いられた特定のウイルス、ウシの状態、および／または感染の程度に応じて変動しうるものであり、獣医ならば決定することができる。

この方法を実施する際、本発明のワクチン組成物は、好ましくは非経口経路でウシに投与するが、例えば、経口、鼻腔内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下、直腸、もしくは膣投与によるもの、または複数の経路の併用によるものなど、他の投与経路も使用できる。ブースト投与計画が必要である可能性があり、最適な免疫化を提供するように投与計画を調整することができる。

本発明のさらに別の態様は、以前のワクチン接種の弱毒ウイルスを、動物対象の体内に存在しているＢＶＤウイルスの発生源と判定する方法を提供する。

本発明の変異体ＢＶＤウイルスは、ゲノム組成物と発現されたタンパク質との両方において、野生型ＢＶＤ株から区別される。そのような区別は、ワクチン接種された動物と、感染動物との間での識別を可能にし、ワクチン関連である疑いのある大流行が発生した際に、上記ＢＶＤＶの同定を可能にする。例えば、特定の臨床検査でＢＶＤＶ陽性と判定された動物が、毒性または病原性のＢＶＤウイルスを保持しているのか、または単に、ワクチン接種を介して以前に接種された本発明の変異体ＢＶＤウイルスを保持しているのかに関する判定を行うことができる。

上記判定を行うために、様々なアッセイを利用することができる。例えば、ＢＶＤＶ陽性と判定された動物対象からウイルスを単離することができ、以前のワクチン接種で用いられたＢＶＤウイルスを示す変異体ＢＶＤウイルスゲノムが存在するかどうか判定するのに、核酸ベースのアッセイを用いることができる。上記核酸ベースのアッセイには、サザンブロット分析、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、および配列決定が含まれる。別法では、タンパク質ベースのアッセイを用いることができる。タンパク質ベースのアッセイでは、ＢＶＤＶ陽性と判定された動物から感染の疑いがある細胞または組織を単離することができる。そのような細胞または組織から細胞抽出物を調製することができ、それを、例えば、野生型ＢＶＤＶの存在とは反対に、以前に接種された変異体ウイルスが存在することを明確に特定しうる、ウイルスタンパク質に対する適切な抗体を用いたウェスタンブロットに供することができる。

剤形および投与
非経口投与
本発明の化合物は、血流中、筋肉内、内臓内に直接投与することもできる。非経口投与に適した手段には、静脈内、動脈内、腹腔内、髄こう内、心室内、尿管内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、皮下が含まれる。非経口投与に適した装置には、有針（顕微針を含める）注射器、無針注射器、および注入技法が含まれる。

非経口製剤は、通常、水溶液であり、それらは、塩、糖質、および緩衝剤（好ましくはｐＨ３から９）などの賦形剤を含有しうる。しかし、一部の適用には、それらは無菌非水性溶液として、または無菌の無発熱物質水などの適当な溶媒と併用する乾燥剤形として処方するのがより適している。

例えば凍結乾燥による、無菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者によく知られている標準的製薬技法を用いて容易に行うことができる。

非経口液の調製に使用される化学式Ｉの化合物の溶解性は、溶解性増強剤の取込みなど、適切な製剤技法を使用することによって増大させることができる。

非経口投与用の製剤は、即時放出性および／または徐放性となるように処方することができる。徐放性製剤には、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、放出制御型、標的指向型およびプログラム放出型が含まれる。したがって、本発明の化合物は、活性化合物の徐放をもたらす移植デポー剤として投与するための固体、準固体、またはチキソトロピー液体として処方されたものでありうる。そのような製剤の例には、薬物コーティングステント、およびポリ（ｄｌ−乳酸−グリコール酸）（ＰＧＬＡ）微粒子が含まれる。

局所投与
本発明の化合物は、皮膚または粘膜に、すなわち経皮的に（ｄｅｒｍａｌｌｙ ｏｒ ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌｌｙ）局所投与することもできる。このための典型的な製剤には、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏剤、散布剤、包帯剤、フォーム、フィルム、皮膚用パッチ剤、オブラート、インプラント、スポンジ、繊維、包帯、およびマイクロエマルションが含まれる。リポソームも使用できる。典型的な担体には、アルコール、水、ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールが含まれる。透過増強剤も組み入れることができる。例えば、ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎ（１９９９年１０月）による、「Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」、Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、８８（１０）、９５５−９５８を参照のこと。

局所投与の他の手段には、エレクトロポレーション、イオン泳動、音波泳動、超音波導入、顕微針または無針（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）など）注射による送達が含まれる。

局所投与用の製剤は、即時放出性および／または徐放性となるように処方することができる。徐放性製剤には、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、放出制御型、標的指向型およびプログラム放出型が含まれる。

吸入／鼻腔内投与
本発明の化合物は、典型的には、乾燥粉末形態で（単独で、または混合物として、例えばラクトースとの乾燥混合物中で、または混合成分粒子として、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合して）乾燥粉末吸入器から、またはエアゾール噴霧剤として加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器（好ましくは微細噴霧を産生するために電気流体力学を用いた噴霧器）、もしくはネブライザーから、１，１，１，２−テトラフルオロエタンまたは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンなどの適した噴霧剤を使用するか、または使用しないで、鼻腔投与または吸入投与することもできる。鼻腔内使用用には、上記粉末薬は、生体接着剤、例えばキトサンまたはシクロデキシトリンを含みうる。

上記加圧容器、ポンプ、スプレー、噴霧器、またはネブライザーは、本発明の化合物の溶液または懸濁液を含有し、上記溶液または懸濁液は、活性成分の分散、可溶化、または持続放出のための、例えばエタノール、水性エタノール、または適した代替物質と、溶媒としての噴霧剤と、トリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、またはオリゴ乳酸などのオプションの界面活性物質とを含む。

乾燥粉末または懸濁液製剤中で使用する前に、上記製剤は、吸入による送達に適した大きさ（通常５ミクロン未満）に微粒子化する。これは、スパイラルジェットミル粉砕、流動層ジェットミル粉砕、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧ホモジナイゼーション、または噴霧乾燥など、任意の適切な粉砕法によって実施できる。

吸入器または注入器で使用するためのカプセル剤（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）、発泡膏、およびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤と、ｌ−ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムなどの性能調節剤（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）とを含有するように処方されたものでありうる。ラクトースは、無水でも、一水和物の形態でもよいが、後者が好ましい。他の適した賦形剤には、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、ショ糖、およびトレハロースが含まれる。

微細噴霧を産生するために電気流体力学を用いた噴霧器で使用するのに適した溶液製剤は、１作動あたり１μｇから２０ｍｇの本発明の化合物を含有しうる。そして、作動容積は１μｌから１００μｌまで様々でありうる。典型的な製剤は、化学式Ｉの化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール、および塩化ナトリウムを含むものでありうる。プロピレングリコールの代わりに使用できる代替溶媒には、グリセロールおよびポリエチレングリコールが含まれる。

吸入／鼻腔内投与用に意図されている本発明の製剤に、メンソールおよびレボメントールなどの適した風味剤、またはサッカリンもしくはサッカリンナトリウムなどの甘味剤を添加することができる。

吸入／鼻腔内投与用の製剤は、例えばＰＧＬＡを用いて、即時放出性および／または徐放性となるように処方することができる。徐放性製剤には、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、放出制御型、標的指向型およびプログラム放出型が含まれる。

乾燥粉末吸入器およびエアゾールの場合には、計量された量を送達するバルブによって投与単位が決定される。本発明による装置は、通常、１０ｎｇから１００μｇまでの化学式Ｉの化合物を含有する計量投与量、すなわち「パフ」を投与するように準備する。全体の日用量は、通常、１μｇから１００ｍｇまでの範囲であろう。これは、単回用量で投与することもできるが、より通常には、その日全体を通しての分割量として投与できる。

直腸／腟内投与
本発明の化合物は、例えば、坐剤、腟坐剤、または浣腸剤の形態で、直腸投与または膣投与することができる。ココアバターは伝統的な坐剤基剤であるが、必要に応じて、様々な代替手段を使用することができる。

直腸／膣投与用の製剤は、即時放出性および／または徐放性となるように処方することができる。徐放性製剤には、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、放出制御型、標的指向型およびプログラム放出型が含まれる。

眼／耳投与
本発明の化合物は、典型的にはｐＨ調整された無菌等張食塩水の微粉懸濁液または溶液の液滴の形態で、眼または耳に直接投与することもできる。眼投与および耳投与に適した他の製剤には、軟膏剤、生分解性（例えば吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性物質（例えばシリコーン）のインプラント、オブラート、レンズ、ならびにニオソームまたはリポソームなどの微粒子または小胞系が含まれる。架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、セルロースポリマー、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、もしくはメチルセルロース、またはヘテロ多糖ポリマー、例えばジェランガムなどのポリマーを、塩化ベンザルコニウムなどの保存剤と共に組み入れることができる。そのような製剤は、イオン泳動でも送達できる。

眼／耳投与用の製剤は、即時放出性および／または徐放性となるように処方することができる。徐放性製剤には、遅延放出型、持続放出型、パルス放出型、放出制御型、標的指向型またはプログラム放出型が含まれる。

部品キット
例えば特定の疾患または状態を治療する目的で、活性化合物を併用投与するのが望ましい限りにおいて、少なくともそのうちの１種が本発明によるワクチンを含有する２種以上の医薬組成物を、上記組成物の併用投与に適したキットの形態で組み合わせることが好都合であるということも、本発明の範囲に包含されている。

したがって、本発明のキットは、少なくともそのうちの１種が本発明によるワクチンを含有する２種以上の別々の医薬組成物と、容器、分割ボトル、またはフォイル分包（ｄｉｖｉｄｅｄ ｆｏｉｌ ｐａｃｋｅｔ）など、前記組成物を別々に保持する手段とを含む。そのようなキットの１例が、注射器および注射針などである。

本発明のキットは、別々の組成物を様々な投与間隔で投与するため、別々の組成物を相互に対して力価決定するための様々な剤形、例えば経口および非経口製剤を投与するのに特に適している。獣医を補助するために、上記キットは通常、投与のために説明書を含む。

本発明を以下の実施例によってさらに例証するが、本発明はいかなる意味でもそれらに限定されない。

（実施例１）
ＮＳ３ドメインのエピトープマッピング
１パネルのｍＡｂによって認識される、ＮＳ３タンパク質中の特異的エピトープを特定するために、エピトープマッピング法を適用した。この方法は、各試験断片のＰＣＲ増幅を引き起こし、それに続いて末端欠如したタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳を行い、最後に様々なｍＡｂとそれとの反応性を試験するものである。ＮＳ３上の抗原性領域を予備的に特定するために、上記領域に対応する７つの断片からなる１セットを増幅させた（図１）。各断片は、その５’末端にＴ７プロモーターと、それに続く開始コドンとを含有し、３’末端に終止コドンを含有する。これらのＤＮＡ断片は、ＴｎＴ（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物系（Ｐｒｏｍｅｇａ社；米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）と、放射標識されたメチオニンおよびシステインとを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳による、Ｓ^３５標識タンパク質断片の産生のための鋳型として用いた。この結果得られた翻訳タンパク質断片には、完全長ＮＳ３タンパク質、ヘリカーゼ、およびプロテアーゼ、ならびにヘリカーゼの個々のサブドメインが含まれる（プロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびヘリカーゼサブドメインの境界は、ＢＶＤＶとＨＣＶ ＮＳ３タンパク質との配列アラインメントに基づいて特定した）。ウシにおけるＢＶＤＶ感染の検出用に診断検査室で用いられるいくつかを含めた、ＢＶＤＶ ＮＳ３を認識する１２種のｍＡｂからなるパネルを用いて、上記翻訳タンパク質を免疫沈降させた。これらのモノクローナル抗体は当技術分野で知られており、Ｄｅｒｅｇｔら、「Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ＮＳ３ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ」、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００５年）、１０８（１−２）、１３−２２に「以前に調製された」と記載されている。その後、上記免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび蛍光光度分析によって分析した。

上記免疫沈降の結果を表１にまとめる。１２種のｍＡｂすべて、およびポリクローナル血清（ＰＯＬＹ）は、完全長ＮＳ３、および１つまたは複数のヘリカーゼサブドメインを認識したが、プロテアーゼ断片を認識したものはなかった。３種のｍＡｂ（１．１１．３、２１．５．８、および２４．８）は、完全長ヘリカーゼおよびドメイン１〜ドメイン２（ｄ１−ｄ２）断片の両方を免疫沈降させたが、ｄ２−ｄ３断片は免疫沈降させなかった。これは、これら３種の抗体が上記ヘリカーゼタンパク質のドメイン１を認識することを示唆している。ｍＡｂ ２１．５．８および２４．８の両方はｄ１断片に結合したが、ｍＡｂ １．１１．３は結合しなかった。これは、１．１１．３抗体は、２１．５．８ｍＡｂ抗体および２４．８ｍＡｂ抗体のいずれよりもエピトープ立体配座に感受性であったことを示唆している。ｍＡｂ ２．３２．５は、完全長ヘリカーゼを認識し、さらに、ある程度ｄ１−ｄ２断片を認識したが、ｄ２−ｄ３断片は認識しなかった。これは、それもドメイン１を認識しているかもしれないことを示唆している。ｄ１−ｄ２断片の弱い結合は、２．３２．５によって認識されるエピトープが、ｄ１−ｄ２断片と完全長ヘリカーゼとの間で異なっていることを示しているのかもしれない。ｍＡｂ ４．１１．４および１６．１．５は、完全長ＮＳ３およびヘリカーゼの両方に結合したが、ｄ１−ｄ２およびｄ２−ｄ３断片には弱くしか結合しなかった。これは、それらがヘリカーゼドメインの第２ドメイン内にあるエピトープに特異的であるかもしれないことを示唆している。５．２．１、９．１０．４、１２．７．３、および１５．１４．６の４種のｍＡｂは、完全長ＮＳ３およびヘリカーゼの両方を認識する。それらは、ｄ２−ｄ３断片にも弱く結合したが、ｄ１−ｄ２断片には結合しなかった。これは、それらがドメイン３内に位置するエピトープを認識することを示唆している。それらの中に、単一のｄ３断片に結合したものがなかったことは、ｄ３の適切な折りたたみが、他のサブドメインの非存在下では行われないかもしれないことを示唆している。ｍＡｂ １９．７．６は、ＮＳ３および完全長ヘリカーゼには結合したが、他の断片のいずれにも結合しなかった。この抗体による認識には、完全なヘリカーゼタンパク質の存在が必要なのかもしれない。ｍＡｂ ２０．１０．６は、ＮＳ３、完全長ヘリカーゼ、ならびにｄ１−ｄ２およびｄ２−ｄ３断片の両方に非常によく結合した。それは単一のｄ２断片も認識した。これは、この抗体によって認識されるドメイン２内のエピトープがドメイン１および３の不在に影響されないことを示唆している。１２種のｍＡｂの中に、完全長プロテアーゼに結合したものがなかったことは驚きではなかった。それは、本発明者の実験ではＢＶＤＶ感染ウシから得られたポリクローナル血清（ＰＯＬＹ）さえも上記プロテアーゼを認識しなかったためだが、これは、上記プロテアーゼがあまり抗原性でないことを強く示唆している。ヘリカーゼタンパク質とＮＳ４Ａタンパク質との間のプロテアーゼの配向性は、その表面構造が抗体結合を行いうる余地をほとんど残さないものであるという点で、これは、ＨＣＶにおけるプロテアーゼ、ヘリカーゼ、およびＮＳ４Ａ（プロテアーゼ補助因子）タンパク質の分子配向性の両方と整合性がある。これらの結果に基づいて、ドメイン１は、特徴化ウイルスをもたらす変異を導入するための典型的な標的である。

（実施例２）
ＢＶＤＶおよびＨＣＶヘリカーゼの配列アラインメント
ＢＶＤＶヘリカーゼのドメイン１内にある変異に基づいた特徴化ウイルスを産生するためには、このドメイン内のエピトープのさらなる精密化が望ましい。上記ヘリカーゼの機能を有意に改変することなく免疫優性エピトープを除去することが望ましい。変異導入する候補エピトープの特定を容易にするためには、ＢＶＤＶヘリカーゼの分子モデルが極めて有用であろう。ＨＣＶヘリカーゼの結晶構造は知られているので、それをモデリングの鋳型として使用することができる。ドメイン１の分子モデル作成の過程を開始するために、ＢＶＤＶヘリカーゼおよびＨＣＶヘリカーゼのドメイン１アミノ酸配列のアラインメントを行った。それらの間にある１次配列同一性は約３４％である。ＢＶＤＶへリカーゼドメイン１の２次構造を明らかにするために、様々なＢＶＤＶ単離株および他のペスチウイルスに由来する４７のＮＳ３配列のアラインメントを、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐソフトウェアパッケージ（ウィスコンシン大学、米国ウィスコンシン州マディソン所在）のＰｉｌｅｕｐプログラムを用い、プロトタイプ配列としてＮＡＤＬ ＢＶＤＶ株を用いて行った。アラインメントされた配列から多配列ファイル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｉｌｅ）（ＭＳＦ）を作成し、ＰＨＤ予測法（ＲｏｓｔおよびＳａｎｄｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５：１３−２６（１９９３年））を用いた２次構造予測のためにＪＰｒｅｄサーバー（Ｃｕｆｆら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１４：８９２−８９３（１９９８年））にサブミットした。すべての分子モデリング研究にＳｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｄｉｇｏ２ Ｉｍｐａｃｔ １００００ワークステーション（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ社、米国カリフォルニア州マウンテンビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ）所在）を用いた。分子モデリングおよび可視化には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）バージョン２００１．０１（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ社、カナダ国ケベック州モントリオール（Ｍｏｎｔｒｅａｌ）所在）およびＳＹＢＹＬ ６．７ソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社；米国ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在）を用いた。１次配列相同性および２次構造予測に基づいて、ＨＳＶ（配列番号２１）およびＢＶＤＶ（配列番号２０）のＮＳ３タンパク質に由来するドメイン１および２のアミノ酸配列のアラインメントを行った（図２）。その後、ＨＣＶタンパク質における対応領域を鋳型として用いて、ＢＶＤＶ ＮＳ３ドメイン１および２の予備的分子モデルを作成した。図３に示す通り、α１−β２（ＩＧＲループ）、α２−β３（ＫＨＰ）、β４−β５（ＤＭＡ）、およびα３−β７（ＳＥＳ）を含めた、αへリックスとβストランドとの間にいくつかのループおよびターンが存在することによって、ヘリカーゼ触媒中心およびヘリカーゼ−プロテアーゼ相互作用表面の両方から離れたところでの露出表面の形成がもたらされる。この領域は、抗原性が高い領域となる可能性を有する。特定されたループのうちの３つ、すなわちＫＨＰループ、ＩＧＰループ、およびＳＥＳループを変異導入研究の標的として選択した。

（実施例３）
スキャニング変異法によるｍＡｂ結合部位の位置決定
様々なｍＡｂが結合するドメイン１内エピトープをさらに画定するため、スキャニング変異法を用いた。簡潔には、ＰＣＲ増幅によって、ＢＶＤＶヘリカーゼドメイン１配列（配列番号２０）の短いセグメントを、対応するＨＣＶ配列（配列番号２１）で置換し、続いて、制限酵素消化およびその結果生じた断片の連結を行って、図４に示す「スキャニング変異体」を作製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写および翻訳、ならびに免疫沈降は、実施例１に記載の通りに行った。これらの変異体との様々なｍＡｂの反応性の概要を表２に示す。

（実施例４）
アラニン置換変異導入によるｍＡｂ結合部位の詳細な解明
様々なｍＡｂが結合するドメイン１内のエピトープをさらに画定するため、そして、これらの領域における、抗体結合に重要な残基を特定するために、これら３つの領域における、合計１６の単一アミノ酸（アラニン）置換変異体、すなわちＩ１８４１〜Ｒ１８４６、Ｋ１８６７〜Ｓ１８７２、およびＳ１９３８〜Ｉ１９４１を作製し、抗体結合に関して試験した。アミノ酸残基の座標は、配列番号１によるものである。したがって、「Ｉ１８４１Ａ」は、配列番号１における付番で座標１８４１において、イソロイシンがアラニンで置換されていることを表す。当然ながら、他のＢＶＤＶ単離株では、例示的配列の特定の座標に、様々な特定のアミノ酸が存在しうる。したがって、変種ＢＶＤウイルス、または変種ＢＶＤウイルスを発現するように構築されたプラスミドのヘリカーゼドメインの同一遺伝子座における変異は、変種の無修飾ウイルスペプチドに対して産生された抗体による認識の同等な減失をもたらすであろう。置換変異体は、当技術分野で知られているＰＣＲオーバーラップ伸長技法を用いて構築した（例えば、Ｈｏら、Ｇｅｎｅ、７７（１）：５１−９（１９８９年）を参照）。簡潔には、ＰＣＲを用いて、それぞれが上記ヘリカーゼのドメイン１および２をコードするアラニン置換断片を生成させた。各断片は、Ｔ７プロモーター配列および翻訳開始コドンを５’末端に、そして終止コドンを３’末端にコードしていた。最初に、置換領域の５’側および３’側半分をコードするオーバーラップした断片を生成させるために、２回の別々の反応を行った。オーバーラップ領域内では、上記ＰＣＲで使用された変異原性オリゴヌクレオチドプライマーによって、両断片の配列中に単一アラニン変異が導入された。各ＰＣＲの産物をアガロースゲル内での電気泳働によって分離し、各反応物から正しいサイズの単一バンドを精製した。精製されたＤＮＡ断片を混合し、単一の置換断片を生成させるための第２のＰＣＲの鋳型として使用した。この全手順を繰り返して、所望の置換断片のそれぞれを生成させた。各断片の配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。これらの断片を鋳型として用い、上述の通りにｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を介してＳ^３５標識タンパク質断片を生成させた。ｍＡｂを用いた免疫沈降反応と、それに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とを用いることによって、変異導入されたエピトープが依然として抗体によって認識されるかどうか判定した。

Ｅ１９３９ＡおよびＲ１９４２Ａは、ｍＡｂ １．１１．３による結合を完全に破壊した。これは、これらの２つの残基が抗体結合に重要であることを示唆している。これらの２つのアミノ酸が同じα３−β７（ＳＥＳ）ループ上にある（図３）ことは、この抗体によって認識されるエピトープがこのループによって形成されることを示唆する。Ｉ１８４１ＡおよびＫ１８６７Ａという他の２つの変異体は、ｍＡｂ ２１．５．８による結合の有意な低減を示したが、他の抗体では示さなかった。これらの変異は、ヘリカーゼ分子上における２つの分離した領域に位置している（α１−β２（ＩＧＲ）およびα２−β３（ＫＨＰ）ループ）。これらの結果から得ることができた１つの結論は、このｍＡｂによって認識されたエピトープが、天然分子内で近接して位置する２つの異なったループを包含するものであった可能性があるということであろう。これは、図３に示す分子モデルと整合性を有する。変異体Ｒ１８４３Ａは、ｍＡｂ ２４．８による結合を破壊したが、他の抗体の結合には影響がなかった。再び、これは、この残基がα１−β２（ＩＧＲ）ループ上に位置する主要エピトープの一部であることを示唆するものであろう。ｍＡｂ ２４．８の結合へのＲ１９４２Ａ変異体の部分的影響は、α３−β７（ＳＥＳ）ループがα１−β２（ＩＧＲ）ループと共に、この抗体によって認識されるエピトープを構成していることを示唆する。結論として、３種のｍＡｂによって認識されるエピトープを、ＢＶＤＶヘリカーゼのドメイン１内に正確にマッピングした。それらのエピトープ内の主要残基を特定した。それらは、一次配列の３つの別々の領域内に位置しているが、三次立体配座中では近接している。ＢＶＤＶサブウイルスレプリコンの前後関係で、これらのエピトープの機能をさらに検査した。

（実施例５）
サブウイルスＢＶＤＶレプリコンと前後関係を有するヘリカーゼドメイン１変異の構築
サブウイルスレプリコンの構築
成功したウイルスワクチンを生産するために望ましい性質は、高力価ウイルス収率を得る能力である。したがって、マーカー変異は、ウイルス複製を有意に妨げないものであるべきである。ＢＶＤＶ ＲＮＡの複製にはヘリカーゼ活性が必須であるので、本発明者らは、抗体認識の減失だけではなく、ヘリカーゼ触媒活性の保存に関しても、作製されたすべてのドメイン１点変異体を評価することを望んだ。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での完全長ＢＶＤＶプロウイルス分子クローンの増幅および遺伝操作は、増殖中にプラスミドが不安定なので困難である。したがって、変異体のスクリーニングを容易にするために、ｐ１５ａＤＩを作製した。ｐ１５ａＤＩは、ＮＳ３を発現し、かつウイルスＲＮＡ複製を支持する末端欠失サブウイルスレプリコンを含有しているが、それでもなお、ウイルスの構造遺伝子を欠失している。ｐ１５ａＤＩは、完全長ＢＶＤＶゲノムを含有する感染性プロウイルス親プラスミド（ｐＮＡＤＬｐ１５ａ）から派生したものである。構造遺伝子の大部分とＮＳ２コード領域とを欠失しており、ＮＳ３の上流に位置している唯一の配列はＮタンパク質の一部とウシユビキチンとの間の融合物からなるので、操作性がより高い（図５）。このレプリコンから発現されるＮＳ３タンパク質は、効率的なＲＮＡ複製によって転写産物の増幅が行われた結果に、ウイルスタンパク質発現が増大したときにのみ、免疫組織化学的に検出可能である。したがって、ＮＳ３の検出は、効率的なＲＮＡ複製およびヘリカーゼ触媒活性の間接的な確認として働く。

ＢＶＤＶヘリカーゼドメイン１変異体の産生
１２種の異なったヘリカーゼドメイン１変異体のセットを、サブウイルスレプリコンと前後関係を有するように作製し、ウイルスＲＮＡ複製およびエピトープ認識の減失に関して分析した。これらの変異体のうちの８種は、単一アミノ酸変化のみを含有し、それらには、ＩＧＲループ内における、Ｉ＞Ａ（アミノ酸残基１８４１）、Ｒ＞Ａ（１８４３）、およびＫ＞Ａ（１８４５）；ＫＨＰループ内における、Ｋ＞Ａ（１８６７）、Ｈ＞Ａ（１８６８）、およびＰ＞Ａ（１８６９）；ＳＥＳループ内における、Ｅ＞Ａ（１９３９）およびＲ＞Ａ（１９４２）が含まれていた。２種の変異体は、２つのアミノ酸の変化、すなわちＩＧＲループ内におけるＲ＞Ａ（１８４３）およびＫ＞Ａ（１８４５）、ならびにＳＥＳループ内における、Ｅ＞Ａ（１９３９）およびＲ＞Ａ（１９４２）を有した。２種は３つの変化、すなわちすべてＩＧＲループ内にあるＫ＞Ａ（１８６７）、Ｈ＞Ａ（１８６８）、およびＰ＞Ａ（１８６９）、ならびに複数のループに影響を有するＫ＞Ａ（１８４５）、Ｈ＞Ａ（１８６８）、およびＥ＞Ａ（１９３９）を含有した。便宜上、例示的変異ではアラニンを用いたが、非保存性アミノ酸置換を適切な変異として使用することができる。各変異体は、上述したオーバーラップＰＣＲ戦略を用いて生成させた。望ましい変異のそれぞれについて、特定のセットのオーバーラッププライマーを設計した（表４）。スクリーニングを目的とする場合には、各プライマーセットは、変異部位の近くに新規のユニークな制限酵素切断部位の生成をもたらすさらなるサイレントヌクレオチド変化も含有した。上記オーバーラップＰＣＲ断片は、２種の外側プライマーのみを用いて行われた第２ラウンドの増幅の鋳型として働いた。複数のアミノ酸変化を含有する断片を生成するには、その前の変異体断片を鋳型として用いて増幅反応を反復した。その後、ＰＣＲ過程中に生成した２箇所のユニークな制限酵素部位（ＢｓｍＢＩおよびＳｍａＩ）を用いて、完全に変異導入された断片をサブウイルスレプリコンバックボーンにクローニングした。変異体ＰＣＲ断片およびサブウイルスレプリコンバックボーンを、共にＢｓｍＢＩおよびＳｍａＩで消化し、アルカリ性ホスファターゼ（ＮＥＢ社）で処理し、アガロースゲル電気泳動法によって精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在）を用いて、終夜、１６℃で連結させた。連結された反応物のアリコートでＳＴＢＬ２大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社；米国カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在）を形質転換し、選択培地上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡの精製と、その後の制限酵素による消化とによってコロニーをスクリーニングした。予測されたサイズのプラスミドは、配列分析によってさらに確認した。

（実施例６）
変異体サブウイルスレプリコンの特性分析
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写およびＲＮＡ形質移入
ＲＮＡ転写物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼおよびＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）（Ａｍｂｉｏｎ社；米国テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）所在）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ合成した。ＤＮＡ鋳型をＫｓｐＩで線状化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して３’オーバーハングを除去した。転写反応の産物は、形質移入前にアガロースゲル電気泳動によって分析した。６μｇのリポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２００μｌに、１〜５μｇのＲＮＡを添加し、１０〜１５分間、室温でインキュベートした。同時に、６ウェルプレート（直径３５ｍｍ）内で培養したマディンダービーウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞の単層培養物（５０〜６０％集密状態）を無ＲＮアーゼのＰＢＳで２回、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗浄した。最終洗浄の後に、各ウェルに形質移入混合物を添加し、その後、穏やかに揺らしながら室温で１０分間インキュベーションした。その後、各ウェルに１ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを添加し、さらに３時間、３７℃でプレートをインキュベートした。その後、２〜３％ウシドナーコウシ血清を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ ３ｍｌを、上記ウェルのそれぞれに添加した。

ＲＮＡ複製および抗体認識の分析
３７℃で２４〜４８時間インキュベートした後に、形質移入細胞を８０％アセトンで固定し、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社；米国カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）所在）を製造業者の指示に従って使用して、それを免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）に供した。ヘリカーゼドメイン２を認識するモノクローナル抗体２０．１０．６を用いて、効率的ＲＮＡ複製の指示体として、ＮＳ３陽性の細胞を可視化させた。野生型ＢＶＤＶ ＲＮＡおよび多数の変異体レプリコンで形質移入された細胞は、ｍＡｂ ２０．１０．６による強い染色を示した。これは、それらの個々の変異体ウイルスヘリカーゼが効率的なｖＲＮＡ複製を支持したことを示す。Ｋ１８６７Ａ／Ｈ１８６８Ａ／Ｐ１８６９Ａ変異体のみが検出可能なＮＳ３タンパク質を産生しなかった。これは、このセットの変異がウイルスＲＮＡ複製を有意に妨げたことを示唆している。

野生型または変異体レプリコンで形質移入されたすべての細胞は、ｍＡｂ １．１１．３、２１．５．８、および２４．８でも試験した（表５）。各ループ内での変異によって、３種の抗体のうちの１つによる認識の減失がもたらされたので、各ループは、これら３種の抗体のうちの１つによって認識されているようであった。詳細には、ＩＧＲループ内の残基Ｒ１８４３ＡおよびＫ１８４５Ａの変異は、個別にも、共にも、ｍＡｂ ２４．８による認識の完全な減失をもたらした。同時に、ｍＡｂ ２０．１０．６、１．１１．３、および２１．５．８による認識は影響を受けなかった。ＫＨＰループ内では、変異Ｋ１８６７ＡがｍＡｂ ２１．５．８による認識を消失させたが、他の３種の抗体による認識には影響を与えなかった。また、ＳＥＳループ内における両点突然変異とも、ｍＡｂ １．１１．３による認識の減失をもたらし、二重変異体も同様であった。さらに、三重変異体（Ｋ１８４５Ａ／Ｈ１８６８Ａ／Ｅ１９３９Ａ）は、１．１１．３および２４．８ ｍＡｂの両方による認識の減失をもたらしたが、ｍＡｂ ２０．１０．６および２１．５．８による抗体認識は影響を受けなかった。

要約すると、３本のヘリカーゼループ内にある、ｍＡｂによる認識および結合の消失をもたらしたいくつかの変異を特定した。加えて、ヘリカーゼ機能をなお維持させながら、２種の抗体の認識部位を同時に破壊することが可能であることも見出した。したがって、これらの個々の変異のそれぞれ、またはそれらの組合せは、ヘリカーゼ領域内に変異を含有する特徴化ＢＶＤＶワクチンとして利用できるであろう。

（実施例７）
特徴化ウイルスの産生および分析
ウイルス複製および感染力への、ＮＳ３タンパク質内での部位特異的変異の影響を評価するためには、完全長ＢＶＤＶ配列を含有するプロウイルスプラスミド（ｐＮＡＤＬｐ１５Ａ）内に変異を移行させる必要があった。以降の研究に選択された３つの変異配列は、Ｋ１８４５Ａ−Ｈ１８６８Ａ−Ｅ１９３９Ａ、Ｒ１９４２Ａ、およびＥ１９３９Ａであった。対象とする変異配列のそれぞれを含有するＤＮＡ断片を、再び、ユニークなＢｓｍＢＩおよびＳｍａＩ制限部位を用いて、ｐＮＡＤＬｐ１５Ａ内にクローニングした。大腸菌ＧＭ２１６３細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社；米国マサチューセッツ州ビバリー所在）を連結反応混合物で形質転換させ、その後、選択培地上にプレーティングした。終夜インキュベートした後、正しい配列を含有するプラスミドが存在するものを得るために、コロニーをスクリーニングした。各変異を代表する１クローンを選択し（Ｒ１９４２Ａ、Ｅ１９３９Ａ、およびＫ−Ｈ−Ｅ）、実施例６に記載の通り、これらのクローンからウイルスＲＮＡを調製した。各ＲＮＡ調製物でＭＤＢＫ細胞に形質移入し、３７℃で６４時間インキュベートした。各変異体について、ＲＤ細胞（ＡＴＣＣ、米国メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）所在）の２つ組形質移入を準備した。１セットの形質移入細胞を、実施例６に記載の通り、ＩＨＣ染色用に固定し、第２のセットからは、細胞を播種されたフラスコからこすり落とし、将来に増殖させるための保存物として−８０℃に保存した。

上記３株のクローンによって産生されたウイルスをさらに評価するために、形質移入実験から採取された培養液を、新たなＲＤ細胞単層上に移した。吸着および終夜インキュベーションの後、細胞をＩＨＣ分析用に固定した。その分析の結果を表６に示す。野生型および変異体ウイルスの両方がｍＡｂ ２０．１０．６（対照抗体）によって認識された。野生型ウイルスは、ｍＡｂ １．１１．３および２４．８によっても認識された。変異体Ｅ１９３９Ａには、ｍＡｂ ２４．８が結合したが、１．１１．３は結合しなかった。変異体Ｋ−Ｈ−Ｅは、ｍＡｂ ２０．１０．６によってのみ認識され、１．１１．３によっても、２４．８によっても認識されなかった。変異体Ｒ１９４２Ａは、ｍＡｂ ２４．８との反応性を示したが、１．１１．３との反応性は示さなかった。

各特徴化ウイルスの増殖動態も評価した。標準的なウイルス力価測定プロトコールを用いて、それぞれの保存ウイルス力価を予め決定した。経時変化実験では、ＲＤ細胞の新たな単層培養物を、組織培養フラスコ中に播種し、終夜インキュベートし、翌日に所定の量の各ウイルスで感染させた。吸着および洗浄の後、最初のセットの試料を収集した（時間「０」）。その後、感染の１４、１９、２４、３９、４３、４７、および６５時間後に試料を収集した。ウイルス力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法（Ｈａｗｋｅｓ，Ｒ．Ａ．、「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｖｉｒａｌ， Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」、３３〜３５頁；Ｅ．Ｈ．Ｌｅｎｎｅｔｔｅ（編集）、第７版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社、米国ワシントンＤＣ所在）を用いて決定し、ＴＣＩＤ_５０／ｍｌで表した。野生型（親）ＢＶＤウイルスと比較して、すべての変異体が、野生型と同程度の速度、または一部の場合では、わずかに速い速度で増殖した（表７）。

生成された変異の一部は、免疫学的に異なる特定のエピトープの改変をもたらした。この改変は、１パネルのモノクローナル抗体によって測定された。同様な結果が、感染性ウイルス粒子に関連した抗体認識を分析した際に得られた。感染性ウイルスの産生を妨げなかったが、なおｍＡｂによる認識の減失をもたらす変異を含有するクローンは、効果的な特徴化ＢＶＤＶワクチン株として働く新規な株を表す。

（実施例８）
若年コウシモデルで試験されたワクチン効力
ＢＶＤＶ陰性の健康なコウシを入手し、複数の研究群にランダムに割り当て、担当獣医の監視下に維持する。試験ワクチンを無菌アジュバントと混合し、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）注射によって投与する。２１〜２８日の間隔をおいて、２用量のワクチンを投与する。その後、２１から２８日目に動物を攻撃し、それに続いてＢＶＤＶの１型株または２型株で最終ワクチン接種を行う。攻撃種菌は、４ｍｌ分割量、１鼻孔あたり２ｍｌで鼻腔内投与する。攻撃されていない非ワクチン接種動物および／または攻撃された非ワクチン接種動物からなる対照群は、研究期間を通して維持する。

直腸温、抑うつ、無食欲、および下痢を含めた臨床パラメータを毎日モニターする。血清中和力価は、ウシ細胞培養物中での、ＢＶＤＶ１型株または２型株と混合した血清の系列希釈を用いて、一定ウイルス−漸減血清（ｃｏｎｓｔａｎｔ−ｖｉｒｕｓ，ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ−ｓｅｒｕｍ）アッセイによって測定する。攻撃後における、ウシ細胞培養物中へのＢＶＤＶの単離を末梢血から試みる。間接免疫蛍光法によって、ＢＶＤＶ陽性細胞培養物を決定する。攻撃後における防御を実証するには、対照群に対するワクチン接種群での感染発生の低減を実証しなければならない。

（実施例９）
妊娠ウシ−コウシモデルで試験されたワクチン効力
繁殖適齢のＢＶＤＶ陰性ウシおよび若雌ウシを入手し、ワクチン接種試験群またはプラセボ（対照）群にランダムに割り当てる。筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）注射によって、ワクチンまたはプラセボのいずれかを２１から２８日の間隔をおいて２回ウシに接種する。２回目のワクチン接種の後、発情を同期させるために、すべてのウシにプロスタグランジンのＩＭ注射を行う。発情を示しているウシは、認定されたＢＶＤＶ陰性精液による人工授精によって繁殖させる。妊娠約６０日目に、直腸検査によってウシの妊娠の有無を判定する。約６週間後に、妊娠が確認されているウシを各試験群からランダムに選択する。ＢＶＤＶ１型または２型の鼻腔内接種によって、これらのウシのそれぞれを攻撃する。ＢＶＤＶを単離する目的で、攻撃の日および攻撃後に間隔をおいて複数回、血液試料を収集する。

攻撃の２８日後に、左側腹部の側腹切開を行い、各ウシから羊水を抽出する。手術の直前に、血清中和アッセイ用に、各ウシから血液試料を収集する。帝王切開の後、各胎児から血液試料を収集する。その後、胎児を安楽死させ、ＢＶＤＶを単離する目的で、組織を無菌的に収集する。自然流産が起きた場合には、流産が検出された時、およびその２週間後に、雌親から血液試料を採取する。対になった血液試料および流産胎児を血清検査およびウイルス単離に供する。ワクチン効力は、胎児感染および妊娠後期中絶がないことによって実証される。

（実施例１０）
特徴化ＢＶＤＶワクチンに関する診断アッセイ
ＮＳ３変異型（特徴化）ＢＶＤＶ弱毒化生ワクチンまたは不活性化ワクチンで、様々な年齢のウシに、提供される指示に従ってワクチン接種できる。血清試料は、ワクチン接種後の２〜３週間またはそれより後に収集することができる。特徴化ＢＶＤＶワクチンを接種されたウシと、ＢＶＤＶの野生（野生型）株に感染したウシとを相互に識別するために、血清試料を識別診断アッセイで試験することができる。エピトープ特異的アミノ酸変異を有するＮＳ３タンパク質は、特徴化ワクチンとの関連においてウシに与えられた場合、野生型ウイルス上に存在する非変異型エピトープには結合しないが、ＮＳ３タンパク質の変異型エピトープには結合するであろう特異的抗体の産生を誘発する。野生型ウイルスとの関連では、その反対、すなわち、特異的抗体は、変異型は認識しないが、ＮＳ３タンパク質上の野生型エピトープは認識しうるということが真となる。抗体結合の特異性および親和性をアッセイする方法は当技術分野でよく知られており、それらには、ＥＬＩＳＡ、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、および間接免疫蛍光アッセイなどのイムノアッセイ型式が含まれるが、これらに限定されない。

競合ＥＬＩＳＡは、間接アッセイでも、直接アッセイでもよい。直接競合アッセイの１例をここに記述する。ＮＳ３タンパク質（天然由来または合成由来）を含めた野生型ウイルス抗原全体または部分を抗原供給源として使用することができる。アルカリ性条件下にＥＬＩＳＡプレートを抗原でコーティングした後、最適希釈率のエピトープ特異的なｍＡｂと共に、ウシ血清試料およびその希釈液を添加し、３０〜９０分間、インキュベートする。結合の比色検出を可能にするため、上記ｍＡｂにはホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼのいずれかが結合している。プレートを洗浄した後、酵素特異的な発色基質を添加し、最終インキュベーションステップの後に、使用された基質に適した波長で各ウェルの光学濃度を測定する。プレートをコーティングしているＮＳ３タンパク質との、ウシ血清の反応性のレベルに応じて、標識ｍＡｂの結合を阻害することができるであろう。ｍＡｂによる結合の不在は、野生型に特異的なエピトープを認識する抗体がウシ血清中に存在することを示し、これは自然（野生型）感染を示すものである。対照的に、エピトープ特異的な変異を有する特徴化ワクチンで免疫化されたウシから得られる血清は、プレートをコーティングしているＮＳ３タンパク質に結合するであろう抗体を含有しないであろう。したがって、ｍＡｂはＮＳタンパク質に結合し、それに続いて発色が起こる結果となるであろう。

当業者ならば、以上の開示に照らして、多数の変形形態に気づくであろう。例えば、本明細書ではＮＡＤＬ株によって例示したものと同様な方法において、ＢＶＤＶの他の細胞変性株で、ＮＳ３のヘリカーゼドメインに変異導入することもできる。本明細書における例示的変異はアラニンを用いたが、他の非保存性アミノ酸置換も、または複製は保持するが、野生型ＮＳ３に対して産生された抗体による認識は減失する結果となる他の変異も、本発明の範囲に包含される。これらは単なる例にすぎない。

配列の簡単な説明
配列番号１は、ウシウイルス性下痢ウイルスのプロセシングされていない完全長ポリプロテインのペプチド配列である。この配列における残基の付番は、本明細書に記載の変異に対応している。例えば、「Ｋ１８４５Ａ」と記載される変異は、配列番号１の位置１８４５のリジン残基がアラニン残基で置換されていることを意味する。
配列番号２は、例示的変異体を生成するための、ｐ１５ａＤＩクローニング部位の５’末端に隣接するＤＮＡプラスミド断片の配列である。
配列番号３は、例示的変異体を生成するための、ｐ１５ａＤＩクローニング部位の３’末端に隣接するＤＮＡプラスミド断片の配列である。
配列番号４は、本明細書に記載のＩ１８４１Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号５は、本明細書に記載のＩ１８４１Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号６は、本明細書に記載のＲ１８４３Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号７は、本明細書に記載のＲ１８４３Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号８は、本明細書に記載のＫ１８４５Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号９は、本明細書に記載のＫ１８４５Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号１０は、本明細書に記載のＫ１８６７Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号１１は、本明細書に記載のＫ１８６７Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号１２は、本明細書に記載のＨ１８６８Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号１３は、本明細書に記載のＨ１８６８Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号１４は、本明細書に記載のＰ１８６９Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号１５は、本明細書に記載のＰ１８６９Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号１６は、本明細書に記載のＥ１９３９Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号１７は、本明細書に記載のＥ１９３９Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号１８は、本明細書に記載のＲ１９４２Ａ変異を導入するためのＤＮＡ５’プライマーの配列である。
配列番号１９は、本明細書に記載のＲ１９４２Ａ変異を導入するためのＤＮＡ３’プライマーの配列である。
配列番号２０は、翻訳されたＢＶＤＶのＮＳ３領域のドメイン１（ヘリカーゼ）およびドメイン２（ＮＴＰアーゼ）のペプチド配列である。
配列番号２１は、翻訳されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３領域のドメイン１（ヘリカーゼ）およびドメイン２（ＮＴＰアーゼ）のペプチド配列である。

ＮＳ３のドメインを示す図である。 ＢＶＤＶおよびＨＣＶのヘリカーゼドメインの配列アラインメントを示す図である。 ＢＶＤＶヘリカーゼの分子モデルを示す図である。 スキャンニング変異の位置を示す図である。 完全な完全長ＢＶＤＶ前駆体およびＢＶＤＶサブウイルスレプリコン構造のドメインマップを示す図である。

Claims (38)

1. 少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含むウシウイルス性下痢ウイルスであって、ＮＳ３のヘリカーゼドメインにおける変異によって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルス由来のＮＳ３に対して産生されたモノクローナル抗体による認識の減失がもたらされているが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されているウシウイルス性下痢ウイルス。
2. 少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含むウシウイルス性下痢ウイルスであって、ＮＳ３に対するモノクローナル抗体によってＮＳ３が認識されず、前記ＮＳ３抗体が２０．１０．６、１．１１．３、２１．５．８、および２４．８からなる群から選択されるが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されているウシウイルス性下痢ウイルス。
3. 前記ウイルスワクチンが単一のヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む、請求項１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
4. ＩＧＲループ内にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
5. ＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４１にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項４に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
6. ＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４３にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項４に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
7. ＩＧＲループ内のアミノ酸残基１８４５にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項４に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
8. ＫＨＰループ内にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
9. ＫＨＰループ内のアミノ酸残基１８６７にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項８に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
10. ＫＨＰループ内のアミノ酸残基１８６８にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項８に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
11. ＫＨＰループ内のアミノ酸残基１８６９にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項８に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
12. ＳＥＳループ内にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
13. ＳＥＳループ内のアミノ酸残基１９３９にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１２に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
14. ＳＥＳループ内のアミノ酸残基１９４２にヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１２に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
15. ２、３、または４つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む、請求項１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
16. ２つのヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１５に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
17. 前記２つのヘリカーゼドメイン変異がＩＧＲループ内にある、請求項１６に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
18. 前記ＩＧＲループ内の２つのヘリカーゼドメイン変異がアミノ酸残基１８４３および１８４５にある、請求項１７に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
19. 前記２つのヘリカーゼドメイン変異がＳＥＳループ内にある、請求項１６に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
20. 前記ＳＥＳループ内の２つのヘリカーゼドメイン変異がアミノ酸残基１９３９および１９４２にある、請求項１９に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
21. ３つのヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項１５に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
22. 前記３つのヘリカーゼドメイン変異がＩＧＲループ内にある、請求項２１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
23. 前記ＩＧＲループ内の３つのヘリカーゼドメイン変異がアミノ酸残基１８６７、１８６８、１８６９にある、請求項２２に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
24. ＩＧＲループおよびＳＥＳループ内のアミノ酸残基１８４５、１８６８、および１９３９に３つのヘリカーゼドメイン変異を含む、請求項２１に記載のウシウイルス性下痢ウイルス。
25. 少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含むウシウイルス性下痢ウイルスを含む特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチンであって、ＮＳ３のヘリカーゼドメインにおける変異によって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルス由来のＮＳ３に対して産生されたモノクローナル抗体による認識の減失がもたらされているが、ウイルスＲＮＡ複製および感染性ウイルスの産生が保持されている特徴化ウシウイルス性下痢ウイルスワクチン。
26. ウシ下痢ウイルスワクチンでワクチン接種された動物からウシ下痢ウイルスに感染している動物を識別する方法であって、前記ウシ下痢ウイルスワクチンが少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む特徴化ワクチンであり、
    試験動物から試験試料を取得するステップと、
    前記試験試料中にウシ下痢ウイルスを検出するステップと、
    前記ウシ下痢ウイルスが前記変異を含有しているかどうか決定するステップと
    を含む方法。
27. 前記ウシ下痢ウイルスを検出する方法が少なくとも１つのモノクローナル抗体の使用を利用する、請求項２６に記載の方法。
28. 前記特徴化ワクチンヘリカーゼドメインアミノ酸変異がＮＳ３のヘリカーゼドメインにある、請求項２６に記載の方法。
29. 試験動物から得た体液を含有する試験試料に、野生型ウシ下痢ウイルスを検出できる標識抗体、または変異型ウシ下痢ウイルスを検出できる標識抗体を添加するステップと、
    前記野生型ウシ下痢ウイルスまたは前記変異型ウシ下痢ウイルスに少なくとも１種のモノクローナル抗体を接触させることによって、前記野生型ウシ下痢ウイルスまたは前記変異型ウシ下痢ウイルスに対する前記標識抗体の結合親和性を測定するステップと、
    野生型ＢＶＤＶと変異型ＮＳ３を有するＢＶＤＶに対するモノクローナル抗体を用いた結合親和性の結果を比較することによって、試験動物のワクチン接種状態を決定するステップと
    を含む、請求項２７に記載の方法。
30. 変異型ＮＳ３以外のドメインに対する第１の標識抗体を添加するステップと、
    ＮＳ３の変異部分に対する第２の標識抗体を添加するステップと
    を含む、請求項２７に記載の方法。
31. 前記第１の抗体が野生型ウイルスに対するものである、請求項３０に記載の方法。
32. 前記第２の抗体がＮＳ３の変異部分に対するものである、請求項３０に記載の方法。
33. 前記第２の抗体が、ＮＳ３に対するものであり、かつ２０．１０．６、１．１１．３、２１．５．８、および２４．８からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記第２の抗体がＩＧＲループ、ＫＨＰループ、およびＳＥＳループからなる群から選択された、ＮＳ３の少なくとも１つの変異部分に対するものである、請求項３２に記載の方法。
35. 前記ウシウイルス性下痢ウイルスが、１８４１、１８４３、および１８４５からなる群から選択されたアミノ酸残基に、ＩＧＲループ内の少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ウシウイルス性下痢ウイルスが、１８６７、１８６８、および１８６９からなる群から選択されたアミノ酸残基に、ＫＨＰループ内の少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む、請求項３４に記載の方法。
37. 前記ウシウイルス性下痢ウイルスが、１９３９および１９４２からなる群から選択されたアミノ酸残基に、ＳＥＳループ内の少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む、請求項３４に記載の方法。
38. 前記ウシウイルス性下痢ウイルスが、アミノ酸残基１８４５、１８６８、および１９３９に、ＩＧＲループおよびＳＥＳループ内の少なくとも１つのヘリカーゼドメインアミノ酸変異を含む、請求項３４に記載の方法。

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