JP3602841B2 - 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス - Google Patents

弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス Download PDF

Info

Publication number
JP3602841B2
JP3602841B2 JP2003022253A JP2003022253A JP3602841B2 JP 3602841 B2 JP3602841 B2 JP 3602841B2 JP 2003022253 A JP2003022253 A JP 2003022253A JP 2003022253 A JP2003022253 A JP 2003022253A JP 3602841 B2 JP3602841 B2 JP 3602841B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
virus
bvd
sequence
protease gene
wild
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2003022253A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2003259885A (ja
Inventor
カオ クエメイ
ジョージ シェパード マイケル
Original Assignee
ファイザー・プロダクツ・インク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ファイザー・プロダクツ・インク filed Critical ファイザー・プロダクツ・インク
Publication of JP2003259885A publication Critical patent/JP2003259885A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3602841B2 publication Critical patent/JP3602841B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12Antivirals
    • A61P31/14Antivirals for RNA viruses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525Virus
    • A61K2039/5254Virus avirulent or attenuated
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552Veterinary vaccine
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24311Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24311Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011Details
    • C12N2770/24011Flaviviridae
    • C12N2770/24311Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は弱毒型のウシウィルス性下痢性(BVD)ウィルスを、ウィルスゲノム内の特定の遺伝子を不活性化させることにより生産する方法に関する。この弱毒化ウィルス又はその突然変異ウィルスゲノムはBVDウィルスに対する抗体を生産するため又は反芻動物(cattle)をウィルス感染症から守るようにデザインされたワクチンにおいて使用できる。
【0002】
【従来の技術】
ウシウィルス性下痢性(BVD)ウィルスはペスチウィルス(Pestivirus)属及びフラビウィルス(Flaviviridae)科に分類される。それはヒツジ及び古典型的なブタ熱病における周辺疾患(border disease)を惹起するウィルスに近似する。感染した反芻動物は、高熱、下痢、せき及び消化器官粘膜の潰瘍を特徴とする「粘膜疾患」を示す(Olafson ら、Cornell Vet. 36 : 205−213 (1946) ; Ramsey ら、North Am. Vet. 34 : 629−633 (1953)) 。BVDウィルスは妊娠した反芻動物の胎盤を横断することができ、そして永続感染(P1)した子ウシ等の誕生を招いてしまうことがある(Malmquist, J. Am. Vet. Assoc. 152 : 763−768 (1968) ; Ross ら、J. Am. Vet. Med. Assoc. 188 : 618−619 (1986)) 。これらの子ウシはこのウィルスに対して免疫寛容となっており、そしてその残りの命の間永続的ウィルス血症(viremic)を有する。これらは粘膜病の突発の起源を司り(Liess ら、Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81 : 481−487 (1974))、そして肺炎又は腸内疾患の如き疾患の原因となる微生物による感染に極めてかかり易くなる(Barberら、Vet. Rec. 117 : 459−464 (1995)) 。
【0003】
BVDウィルスは2通りの生物型の一方を有するものとして分類される。「cp」生物型のものは培養細胞において細胞病理作用を誘導し、一方「ncp」生物型のウィルスはそのようでない(Gillespie ら、Cornell Vet. 50 : 73−79 (1960)) 。更に、2種類のゲノタイプ(I型及びII型)が認められており、共に様々な臨床症候群を惹起することが示されている(Pellerinら、Virology 203 : 260−268 (1994) ; Ridpath ら、Virology 205 : 66−74 (1994))。
【0004】
BVDウィルスのゲノムは長さ約12.5kbであり、そしてその5′及び3′非翻訳領域(NTR)の間に位置する単一のオープンリーディングフレームを含む(Collett ら、Virology 165 : 191−199 (1988))。約438kDのポリタンパク質がこのオープンリーディングフレームから翻訳され、そして細胞及びウィルスプロテアーゼによってウィルス構造及び非ウィルス構造タンパク質へとプロセシングされる(Tautz ら、J. Virol. 71 : 5415−5422 (1997) ; Xuら、J. Virol. 71 : 5312−5322 (1997) ; Elbersら、J. Virol. 70 : 4131−4135 (1996) ; 及びWiskerchenら、Virology 184 : 341−350 (1991))。ウィルス酵素のうちでこのプロセシングに関与するものはとりわけプロテアーゼNpro 及びNS3である。Npro はウィルスオープンリーディングフレームによりコードされる第一のタンパク質であり、そしてそれ自体を合成ポリタンパク質の残りから切断する(Stark ら、J. Virol. 67 : 7088−7093 (1993) ; Wiskerchenら、Virol. 65 : 4508−4514 (1991)) 。
【0005】
BVDワクチンのうちで現状有用なものはウィルスが化学的に不活性化されたものである(McClurkin ら、Arch. Virol. 58 : 119 (1978) ; Ferneliusら、Am. J. Vet. Res. 33 : 1421−1431 (1972);及びKolar らAm. J. Vet. Res. 33 : 1415−1420 (1972)) 。このようなワクチンは典型的には一次免疫を達成するために複数回の投与を必要とし、短期間の免疫力を供し、そして胎児伝染に対する保護を供しない(Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 : 615−625 (1995))。ヒツジにおいて、精製されたE2タンパク質を基礎とするサブユニットワクチンが報告されている(Bruschkeら、Vaccine 15 : 1940−1945 (1997))。残念ながら、かかるワクチンのうちの一つのみが胎児を感染から保護し、そしてこの保護は同族ウィルスのうちの1つの株に限られている。抗体力価とウィルス感染症からの保護との間での相関はない。
【0006】
更に、BVDウィルスを利用して修飾型生存ウィルス(MLV)ワクチンが作られているが、それはウシ又はブタ細胞内での反復継代により弱毒化される(Coggins ら、Cornell Vet. 51 : 539 (1961);及びPhillipsら、Am. J. Vet. Res. 36 : 135 (1975)) 、又はこのウィルスに温度感受性表現型を供与する化学誘導修飾により弱毒化されてしまう(Lobmann ら、Am. J. Vet. Res. 45 : 2498 (1984) ; 及びLobmann ら、Am. J. Vet. Res. 47 : 557−561 (1986)) 。MLVワクチンの一回の投与が免疫のために十分であることが証明され、そして免疫力の持続期間は腫痘を受けた反芻動物において何年も延長できうる(Coria ら、Can. J. Con. Med. 42 : 239 (1978))。更に、MLV型ワクチンで腫痘の施された子ウシから交差保護が報告されている(Martinら、Proceedings of the Conference Res. Workers’ Anim. Dis. 75 : 183 (1994)) 。しかしながら、安全性の問題、例えばウィルスの胎児伝染の可能性がこのようなワクチンの利用に関する大きな問題となっている(Bolin. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 : 615−625 (1995))。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
BVDウィルスの流布を制御するための新規且つ有効なワクチンについての明確なニーズがある。このウィルスにより惹起される疾患が反芻動物の最も世界中に広がった且つ経済的に重要なものの一つとなっているため、かかるワクチンは牧場における著しい進歩を供するであろう。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明は弱毒型BVDウィルスがNpro プロテアーゼ遺伝子の欠失又は不活性化により生産できるという発見に基づく。このようなウィルスはウシ細胞系におけるその野生型対応物よりもはるかに感染性が弱く、そして反芻動物のためのワクチンにおける使用に適当である。一のかかる弱毒化ウィルスの安全ゲノム配列を本明細書において開示し、そしてこのウィルスをコードするプラスミド、即ちpBVDdN1がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)にATCC No. 203354として寄託されている。
【0009】
A.BVDdN1弱毒化ウィルスを基礎とする組成物及び方法
第一の観点において、本発明は特異的に弱毒化したBVDウィルス株の開発を基礎とする。この株は野生型ウィルスゲノムを突然変異させてNpro プロテアーゼ遺伝子を欠失させることにより作られ、そしてその全長配列はSEQ ID NO : 1及び図2〜24に示すnt39〜nt12116である。かくして、本発明はそこに示すゲノム配列を有するウィルス、そして好ましくはそれから本質的に成るウィルスに関する。通常、BVDウィルスはRNAの形態におけるゲノムを有する。クローニングすると、これはより典型的にはDNAの形態となるであろう。何らかのことわりのない限り、「核酸」なる語はBVDウィルス性DNA及びRNA配列の双方を意味する。便宜上、添付の配列表はDNA配列のみを示しているが、各々の対応のRNA配列は当業者にとって容易に明らかとなるであろう。「から本質的に成る」とは配列が構造及び機能の双方の点で特定した配列と実質的に同じであることを意味する。かくして、本発明は表示の配列のみならず、非実体的な1もしくは複数個のヌクレオチドの付加又は置換(あるいは欠失)を導入することにより作製した対応の配列も含む。特に、本発明はSEQ ID NO : 1と同じBVDタンパク質をコードする縮重核酸配列を含む。この特定の配列、即ちSEQ ID NO : 1のnt39〜nt12116及びそれがコードする対応のウィルスは、便宜上「BVDdN1」ゲノム及びウィルスと命名した。ウィルスは大きな調製物の一部として、又は実質的に純粋な形態で、即ち、任意のその他のウィルス型のものを本質的に含まない態様で提供されうる。
【0010】
本発明は本発明のBVDdN1核酸分子を担持する宿主細胞を含む。「宿主細胞」とはBVDdN1核酸分子を担持する任意の原核細胞、及びBVDdN1核酸分子を担持するウィルス又は何らかのもので感染された任意の真核細胞を含むことを意味する。原核細胞に関して、E.コリ(E.coli)のSTBL 2株(Gibco BRL)がこのプラスミドの増幅に関して最良の結果を供することが認められ、そして一般的に好ましいとされる。真核細胞に関しては、哺乳動物細胞、例えばMDBK細胞(ATCC CCL−22)及びRD細胞(安定な形質転換精巣細胞)が一般的に好ましい。しかしながら、その他の培養細胞が同様に利用できうる。本発明は更にかかる宿主細胞において生産された子孫ウィルスを含む。
【0011】
BVDdN1ウィルスは動物を有効用量で、即ち、抗体生産を誘導するのに十分高い用量で感染させることによって抗体の生産を誘導するのに利用できうる。この抗体はこの目的のために通常利用されている任意の動物(例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ)において作られることができるが、好ましくは抗体は反芻動物で作られるであろう。本明細書で用いる「BVDウィルスに対する抗体」とは、任意のその他の非BVDウィルスと比べBVDウィルスの株に対して少なくとも100倍超の親和力を有するという観点で優先的に反応する抗体を意味する。好適とはされないが、ウィルスは動物に抗体する前にホルマリン、パラホルムアルデヒド、フェノール、ラクトプロピオネート、プソラレン、プラチナ錯体、オゾン又はその他の殺ウィルス剤を利用して更に不活性化してよい。このような手順により作製した抗体はそれ自体本発明の範囲に含まれ、そして当業界において周知の技術を利用して単離できる(例えば、Harlowら、Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)を参照のこと)。このような抗体はとりわけ、生物学又は実験室サンプル中のBVDの存在を検定するようにデザインされた方法において利用できる。
【0012】
別の観点において、本発明はBVDdN1ウィルス及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチンに関する。このワクチンは任意のアジュバント及びかかる調製物において典型的に使用されるその他の試薬を含みうる。免疫応答はこのワクチンを、BVDウィルスによるその後の負荷に対する保護免疫力を誘導するのに十分な用量で投与することにより反芻動物において誘導できうる。典型的には、このワクチンは非経口的に投与するが、その他の投与ルートも本発明に適応する。必要なら、2回以上の接種を規則的な間隔を置いて、例えば2〜8週間置いて付与することができる。当業界において周知の標準的な手順を免疫プロトコールを最適化するために利用できる。
【0013】
B.BVDdN1ゲノム核酸を基礎とする組成物及び方法
最近の研究は動物に免疫原をコードする核酸を注射することによって有効なワクチンを調製することが可能であることを実証している。このような「DNAワクチン」を作製及び投与するための方法は詳細に発表されており(例えば米国特許第5,589,466;同5,580,859号;及び同5,703,055号を参照のこと)、そしてBVDdN1ゲノム核酸に適用できる。かくして、別の観点において、本発明はSEQ ID NO : 1の配列のnt39〜nt12116又はその縮重変異体を含んで成る好ましくは実質的に純粋な形態の核酸分子に関する。好適な態様において、本発明はSEQ ID NO : 1の配列のnt39〜nt12116から本質的に成る好ましくは実質的に純粋な形態の核酸分子に関する。本明細書でいう「実質的に純粋な」核酸分子とは、他の夾雑核酸分子を本質的に含まず、そして典型的にはサンプル中に少なくとも85重量%の当該核酸分子を含んで成り、更に高いパーセンテージが好適とされる。核酸の純度を決定するための一の方法は調製物をポリアクリルアミド又はアガロースの如きマトリックスで電気泳動することによる。純度は染色の後の単一バンドの出現により証明される。純度を評価するためのその他の方法にはクロマトグラフィー及び分析遠心分離が挙げられる。
【0014】
BVDdN1ゲノム核酸は独立のコード要素としてベクターに組込むことができる。「独立のコード要素」とはウィルス性ポリペプチドへと翻訳されるベクターの部分を意味し、そして事実上はウィルスである。それはBVDdN1生成物を実質的に改変してしまう任意のその他の翻訳された要素を含まない点で独立である。このベクター又はBVDdN1核酸自体は子孫弱毒化ウィルスを生成するために宿主細胞をトランスフェクションするのに利用できる。
【0015】
本発明は更に、BVDdN1核酸、又はこの核酸を含むベクターを動物に直接注射することによるBVDウィルスに対する抗体の生産方法も含む。抗体を作ることのできる任意の動物を利用してよいが、反芻動物が一般的に好ましい。このようにして作った抗体は本発明の一部を構成し、そして動物から精製することができ、そして例えば培養培地又は生物学的流体中のBVDウィルスの存在を検定するようにデザインされたアッセイに利用されうる。
【0016】
反芻動物に投与するためのワクチンは獣医学的に許容される担体との組合せにおいてBVDdN1ゲノム核酸に基づいて調製でき(前述の文献を参照のこと)、そしてその後のウィルス感染に対する保護免疫力を誘導するために最適化された免疫プロトコールに利用される。
【0017】
C.野生型BVDゲノムを突然変異させる方法
より一般的な観点において、本発明はゲノムを実質的に純粋な野生型BVDウィルスからそれをワクチンにおける使用のために適当なものとするように修飾する方法に関する。これとの関連で使用する「実質的に純粋」とは、好ましくは単一のBVDウィルス株から成り、その他のタイプのウィルスが存在しないウィルス調製品を意味する。この手順の主たる際立った特徴はゲノム核酸が突然変異されてNpro プロテアーゼ遺伝子が不活性化されている点にある。これとの関連で、遺伝子は、生成物ができない(例えばこの遺伝子が欠失している)、又はでき上がった生成物がもはやその正常な生物学的機能をもたない(例えばタンパク質分解切断)、又はでき上がった生成物がその正常な生物学的機能をもつが著しく低まった割合となっている場合のいずれかのときに不活性化されていると考える。Npro プロテアーゼの不活性化をもたらす任意の方法を利用してよい。例えば、ゲノムRNAを野生型BVDウィルスから単離し、逆転写させてcDNAを形成し、次いで標準の手順を利用してクローニングすることができる。次いで突然変異をNpro プロテアーゼ遺伝子の中に、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、部位特異的突然変異誘発、Npro が部分的もしくは完全に消失するようにDNAフラグメントを合成及びライゲーションさせること、又は当業界に公知の化学突然変異原もしくは放射線に対する曝露等を含むランダム突然変異誘発技術の如き手順により、又はかかる手順の組合せにより導入することができる。
【0018】
BVDウィルスゲノムをNpro 遺伝子が不活性化されるように修飾できたら、それを適当なベクターの中にクローニングし、そして大量生産することができる。前述の通り、ベクターはBVD配列を独立要素として、突然変異させた野生型ウィルスを含んで成る配列又はそれから本質的に成る配列を伴って含むべきである。突然変異されたBVDゲノム又はそのゲノムを含んで成るベクターを、大量のウィルス性核酸又はウィルス自体を生産する目的で宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションすることができる。
【0019】
BVDdN1ゲノムDNAとの関連で前述した通り、BVDウィルスに対する抗体は、前述したように状況で突然変異させた任意の野生型BVDウィルスゲノムを投与することによって動物において生産されうる。一般に、抗体生産は反芻動物において行われるのが好ましいが、その他の動物も同様に利用できる。
【0020】
突然変異したBVDゲノム核酸の組込まれたワクチンは標準のDNA免疫手順(例えば、米国特許第5,589,466;5,580,859;及び5,703,055号に論ぜられているもの)を利用して生産し、そして反芻動物における免疫応答を誘導するのに利用できる。ここに論ぜられている方法により作られたワクチン、抗体及び核酸は本発明の全体を構成する。
【0021】
D.弱毒化BVDウィルスの作製方法
BVDウィルスの核酸をNpro プロテアーゼ遺伝子が不活性化されるように突然変異させると、細胞培養においてはるかに弱い感染能の弱毒化ウィルスが生産されることが発見された。このような弱毒化ウィルスの比較的遅い複製は、急速増幅する野生型ウィルスでは可能でない状況で動物がその免疫防御を発揮することを可能にする。かくして、BVDdN1について前述した突然変異したウィルスゲノムを生産するための方法は、ワクチンにおいて使用するのに適当なものとなるようにBVDウィルスを弱毒化する一般的方法に直接結びつく。一般に、この手順は野生型BVDウィルスを単離し、そのゲノム核酸をクローニングし;そのクローニングした核酸を突然変異させてNpro プロテアーゼ遺伝子を不活性化し;次いでこの突然変異させた核酸を宿主に形質転換又はトランスフェクションさせて弱毒化ウィルスを供することを包括する。突然変異を施すための上記の任意の方法が利用されるが、好適な方法はNpro プロテアーゼ遺伝子の全体又は一部の欠失であろう。
【0022】
本発明は弱毒化ウィルスを作るための方法のみならず、そのウィルス自体、このウィルスにより感染された宿主細胞、及びこのような宿主細胞により生産された子孫ウィルスも包括する。弱毒化ウィルスに対する抗体は動物、好ましくは反芻動物を有効用量で感染させることにより作ることができる。このようにして作った抗体は本発明の一部を構成し、そして単離して診断手順、又は細胞培養物におけるBVDの存在の検定のために利用されうる。
【0023】
BVDdN1ウィルスとの関連で論じた通り、不活性化Npro プロテアーゼ遺伝子を特徴とする弱毒化ウィルスをワクチンに組込み、そして反芻動物における免疫応答を誘導するために利用されうる。用量及び免疫プロトコールは、動物の接種がその後のウィルス負荷に対する保護免疫力をもたらすように最適化されうる。
【0024】
【発明の実施の形態】
A.BVDdN1及び当該ウィルスをコードする核酸の生産
本発明はNpro プロテアーゼ遺伝子の欠失により弱毒化されたBVDウィルスに関する。このウィルスはBVDdN1と命名し、そして「弱毒化」する語で示唆されている通り、それは感受性細胞系(例えばウシ精巣細胞系(RD)、ウシ腎細胞系(MDBK))において、その野生型対応物よりもin vivoではるかに遅い速度で複製することが認められた。更に、BVDdN1は胎芽ウシ気管細胞(EBTr)又はウシ鼻甲介細胞(BT−2)において生産性感染を引き起こさず、このことは野生型ウィルスによる感染を経て引き起こさせる生産性感染とは対照的でありうる。いく通りかの異なるウシ細胞系におけるBVDdN1ウィルスの遅い増殖力は動物における広域な組織向性弱毒化を示唆する。BVDdN1は遺伝子的に安定であり、なぜならNpro 欠失はウシRD細胞において10回の継代まで維持されるからである。天然ウィルスのゲノムはRNAから成るが、これをDNAへ逆転写させ、そしてクローニングすることができる。本明細書における核酸及びBVDウィルス配列についての言及はウィルス性RNA配列に由来する逆転写DNA配列及びその対応のRNA自体の双方を包括することが理解されるであろう。
【0025】
BVDdN1ウィルス性ゲノムの完全ヌクレオチド配列はSEQ ID NO : 1のnt39〜nt12116において示す。本発明はまさに示している配列を有するウィルスゲノムのみならず、構造又は機能の点で実体的に相違しないその他の配列、例えば遺伝子コードの縮重に基づきSEQ ID NO : 1と同じBVDタンパク質をコードする配列も含む。更に、例えば部位特異的突然変異誘発の如き技術が核酸の構造の中に変異を導入するために利用できることが周知である。この方法もしくはその他の似かよった方法によって又は当業界に公知のランダム突然変異誘発によって導入されたBVDウィルス核酸内の突然変異誘発は、得られるウィルスの少なくとも一の主要生物学的特徴がそれが誘導されたウィルスのそれと実質的に同一である限り、本発明に包括される。詳しくは、感染力の観点でBVDdN1の特徴を実質的に改変しない突然変異は本発明の範囲に属する。
【0026】
突然変異させたBVDdN1核酸はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られたBVDのナショナル・アニマル・ディシーズ・ラボラトリー(国立動物疾患研究所)(NADL)株(VR−534)に由来する。これを下記の実施例に記載の通りにしてベクターの中に組込み、そして全長Npro プロテアーゼ遺伝子を選択的PCRにより欠失させ、そして再ライゲーションさせる。この手順はウィルスゲノム及び最終的にはウィルス自体を得るために利用できるか、pBVDdN1と命名した完全BVDdN1ゲノム配列を含むプラスミドをATCC No. 203354として寄託し、そしてこれが単離手順のための好適な起源とされる。標準的な方法論がプラスミドを増幅及び精製し、そしてそれをウィルス生産を支持できる宿主細胞にトランスフェクションするのに利用できる。プラスミド増幅のために好適な原核宿主細胞はE.コリSTBL2細胞(Gibco BRLより入手可能)であるが、その他の細胞タイプも利用できうる。このウィルスは真核細胞、例えばRD又はMDBK細胞において生産されることができ、公知の技術、例えばスクロース勾配遠心分離を利用して高度に精製された形態でそれから単離でき、そしてワクチンにおいて又は抗体を作製するために利用される。他方、BVDdN1ゲノム配列を単離するためにプラスミドを使用でき、そしてこれは抗体又はワクチンの作製に直接使用できる。
【0027】
B.その他の弱毒化BVDウィルス株の作製
BVDdN1ウィルス及びゲノム核酸を作製するために利用する同じ基本的な手順をBVDのその他の野生型株に関して利用できる。各ケースにおいて、野生型ウィルスを単離し、そして弱毒化はNpro プロテアーゼ遺伝子の不活性化により成し遂げられる。これは好ましくはBVDdN1について本明細書の中で論ずるPCRベース戦略を利用して全体遺伝子を欠失させることにより成し遂げられる。しかしながら、例えば配列の一部の欠失又はランダムにもしくは特定の部位での突然変異の導入により遺伝子を不活性化させるその他の方法も利用できうる。全てのケースにおいて、その目的は感染後ゆっくりとした速度で増幅する突然変異ウィルスの提供にある。実施例の欄に記載の通り、ウィルスの感染力はBVDウィルスに特異的なモノクローナル抗体を利用する免疫組織化学の実施によりin vitroで決定できうる。
【0028】
C.弱毒化BVDウィルスに対する抗体の作製
BVDウィルスに対する抗体は抗体の生産のために一般的に利用されている任意の動物、例えばマウス、ウサギ等において生産されうる。しかしながら、抗体は反芻動物において生産するのが好ましい。当該ウィルスを含む組成物は動物に任意のルートにより投与してよいが、典型的には動物に筋肉的、皮下又は静脈内注射する。一般に、ウィルス調製物はアジュバント、例えばフロインドの完全又は不完全アジュバントを含むであろう。注射のために適当な調製物、注射のスケジュール等は当業界において周知であり、そして採用されうる(例えば、Harlowら、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988) ; Klein, Immunology : The Science of Self−Nonself Discrimination (1982) を参照のこと。モノクローナル抗体は標準の手順を利用しても調製できる(Kennett ら、Monoclonal Antibodies and Hybridomas : A New Dimension in Biological Analyses (1980) ; Campbell,「Monoclonal Antibody Technology」Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (1984)) 。
【0029】
BVDウィルスに対して特異性をもって反応する抗体又は抗体のフラグメント(即ち、任意のその他のタイプのウィルスと比べBVDに対して100倍以上の親和力を有するもの)が任意の様々なイムノアッセイに利用できる。例えば、抗体は「二部位」又は「サンドイッチ」アッセイとしても知られるラジオイムノアッセイ又はイムノメトリーアッセイにおいてBVDウィルスを検定するために利用できる(Chard 「An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques 」Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)を参照のこと)。典型的なイムノメトリーアッセイにおいて、所定量の未ラベル抗体を検査する流体、例えば血液、リンパ液、細胞エキス等の中で不溶性である固相支持体に結合させる。固定化抗体に対する抗原の一次結合の後、所定量の検出可能式にラベルした第二抗体(これは最初のものと同一でもそうでなくてもよい)を加え、抗原の検出及び/又は定量を行う(例えば、Radioimmune Assay Methods, Kirkhamら編 pp.199−206, E & S Livingstone Edinburgh (1970) 参照のこと)。このようなタイプのアッセイの数多くの変法が当業界において公知であり、そしてBVDウィルスの検定のために採用できうる。
【0030】
D.汎用ワクチン及び種痘手順
BVDウィルスを利用するワクチン及び種痘手順は数多くの文献において論じられている(例えば、Fernelius ら、Am. J. Vet. Res. 33 : 1421−1431 (1972) ; Kolarら、Am. J. Vet. Res. 33 : 1415−1420 (1972) ; McClurkinら、Arch. Virol. 58 : 119 (1978) ; Cogginsら、Cornell Vet. 51 : 539 (1961) ; Phillips ら、Am. J. Vet. Res. 36 : 135 (1975) ; Lobmannら、Am. J. Vet. Res. 45 : 2498 (1984) ; Coria ら、Can. J. Comp. Med. 42 : 239 (1978) ; Martin ら、Proceedings of the Conference Res. Workers Anim. Dis. 75 : 183 (1994) ; 及び米国特許第4,618,493号参照のこと)。典型的には、ワクチンは0.5〜5mlの容量において約1×10 〜約1×10 個のウィルス粒子を獣医学的に許容される担体と共に含むであろう。処方は例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa、第16版、(1982))に記載の方法を利用して実施することができる。本発明は様々な賦形剤及びアジュバントに適応し、そしてこれらは所望するなら調製物の中に組込んでよい。例えば、本発明のワクチン組成物は標準のバッファー、担体、安定剤、希釈剤、保存剤及び可溶化剤を利用して許容の方式に従って処方でき、そしてまた持放性を促進するために処方できうる。希釈剤には水、食塩水、デキストロース、マンニトール、ソルビトール及びラクトースがとりわけ挙げられる。安定剤にはとりわけアルブミンが挙げられる。アジュバントの非限定的な例にはRIBIアジュバント系(Ribi Inc.)、みょうばん、水酸化アルミニウムゲル、水中油エマルション、油中水エマルション、例えばフロインドの安全及び不完全アジュバント、ブロックコポリマー(CytRx,Atlanta GA)、SAF−M(Chiron,Emeryville CA)、AMPHIGEN(登録商標)アジュバント、サポニン、QuilA、QS−21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)又はその他のサポニン画分、モノホスホリル脂質A、Avridine脂質−アミンアジュバント、E.コリ由来の熱不安定性エンテロトキシン(組換体等)、コレラ毒素又はムラミルジペプチドがとりわけ挙げられる。このワクチンは更に1又は複数種のその他の免疫調節因子、例えばインターロイキン、インターフェロン又はその他のサイトカインを含んで成ってよい。ワクチンは一般に非経口投与のためにデザインされるであろうが、本発明はその他の投与方式、例えば経口、鼻内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下、直腸もしくは経膣投与による、又は併合ルートによる投与方式にも適応する。当業者は選定のルートに従ってワクチン組成物を容易に処方できるであろう。
【0031】
免疫化手順は当業界に周知の手順を利用して最適化できる。一回の投与を動物に対して施してよいが、又は2〜10日の間隔をあけて2回以上の接種をワクチンで施してもよい。所望するなら、接種を施した動物から血清を集め、そしてBVDウィルスに対する抗体の存在について検査してよい。
「免疫応答の誘導」なる語等は本明細書では広義に、種痘に応答する反芻動物における任意の免疫を基礎とする応答、例えば抗体もしくは細胞媒介型免疫応答、又はその両者であってBVDウィルスに対する種痘を施した動物の保護を担うものを含む。「保護免疫」、「保護免疫応答」、「保護」等の語は反芻動物におけるウシウィルス性下痢の絶対的予防、又はBVDウィルスによる反芻動物の感染症の絶対的予防のみならず、種痘を施していない感染コントロール動物において認められるものと比較して、病原体による感染の度合もしくは率の任意の低下、又は病原体による感染に由来する病気の症度もしくは任意の症状もしくは状況の任意の低下をも意味する。
【0032】
E.DNAワクチン
核酸(DNA又はmRNA)を利用するワクチン及び種痘手順を説明している文献には米国特許第5,703,055号、同5,580,859号、同5,589,466号、国際特許出願公報WO98/35562並びに様々な科学文献、例えばRamsayら、1997, Immunol. Cell Biol. 75 : 360−363 ; Davis, 1997, Cur. Opinion Biotech. 8 : 635−640 ; Manickanら、1997, Critical Rev. Immunol. 17 : 139−154 ; Robinson, 1997, Vaccine 15 (8) : 785−787 ; Robinson ら、1996, AIDS Res. Hum. Retr. 12 (5) : 455−457 ; Lai and Bennett, 1998, Critical Rev. Immunol. 18 : 449−484;及びVogel and Sarver, 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8 (3) : 406−410 が挙げられる。これらは引用することで本明細書に組入れる。このような手順は、核酸がBVDdN1核酸に対応しているBVDウィルスに対するワクチンを作るため、又はそのNpro プロテアーゼ遺伝子もしくはその縮重変異体の不活性により弱毒化されている類似のBVDウィルスゲノムを反芻動物に投与するために利用できうる。このような核酸分子を含むベクターも利用できうる。このようにして導入した免疫原は一般に体液及び細胞媒介型免疫応答を誘導する。
【0033】
弱毒化BVDウィルスゲノムをコードするDNA又はRNAをワクチンに利用できる。このDNA又はRNA分子は「むき出し」状で存在していてよく、又は細胞取り込みを促進する因子(例えばリポソーム又は陽イオン脂質)と共に投与してよい。典型的な投与ルートは約0.1〜約5mlのワクチンの筋肉内注射であろう。ワクチン中の総ポリヌクレオチドは一般に約0.1μg/ml〜約5.0mg/mlとすべきであろう。ポリヌクレオチドは懸濁物、溶液又はエマルションの一部として存在していてよいが、水性担体が一般に好ましい。免疫は一回の接種の結果、又は複数回の接種により達成されうる。所望するなら、血清を接種を施した動物から集め、そしてBVDウィルスに対する抗体の存在を検定してよい。
【0034】
以下の実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【0035】
【実施例】
例1:アッセイ及び実験方法
DNA
感染性全長クローンpVVNADLを図1に模式的に示す。このプラスミドはpGEM4(Promega Corp.)由来のColE1レプリコンを含み、そして長さ14,578bpである(Vassilevら、J. Virol. 71 : 471−478 (1997))。T7 RNAポリメラーゼプロモーターはBVDウィルスゲノムの上流に挿入されており、そしてこのプロモーターはウィルス性RNA合成を指令できる。BVDウィルスゲノムの配列はBVDウィルスのNADL株(ATCC VR−534)から誘導した。
【0036】
E.コリにおけるpVVNADLの増幅
一般に、E.コリ内での全長pVVNADLクローンの増幅は困難であることが証明されている。E.コリ内での増殖の際の長いペスチウィルスcDNA及び全長クローンの有害な効果が今まで認識されていた(Moormannら、J. Virol. 70 : 763−770 (1996) ; Rugglie ら、J. Virol. 70 : 3478−3487 (1996))。pVVNADLの安定性をE.コリJM109(Stratagene);DH5α(Gibco BRL);及びSTBL2細胞(Gibco BRL)等のいくつかの細菌宿主で試験した。このような株のそれぞれにおけるプラスミドDNAの形質転換の後、コロニーサイズをモニターし、そして大まかなプラスミド構造を制限マッピングにより分析した。最良の結果はSTBL2細胞により得られた。このような細胞へのpVVNADLの形質転換は比較的均質な小コロニー集団を供し、制限増殖条件下(30℃で20時間以内)でDNA転位の徴候はなく、妥当なDNA収量が得られた。
【0037】
in vitro転写及びRNAトランスフェクション
RNA転写体をMEGAscript試薬(Ambion)を用い、その製造者のプロトコールに従ってT7 RNAポリメラーゼによりin vitroで合成した。pVVNADL DNA鋳型をSacIIで線形にし、そしてT4 DNAポリメラーゼで処理して3′突き出しを除去した。転写反応生成物をゲル電気泳動により分析した。1〜5μgの転写RNAを6μgのLipofectin(Gibco BRL)を含む200μlのOpti−MEM(Gibco BRL)に加え、そしてRNA/脂質サンプルを室温で10〜15分インキュベーションした。その間、6ウェルプレート中で増殖させたMDBK(MadinDarbyウシ腎細胞(クローン6))又はRD(安定形質転換ウシ精巣細胞系)単層(集密度50〜60%)をRNA非含有PBSで2回、そしてOpti−MEMで1回洗った。最後の洗浄の後、トランスフェクション混合物を各ウェルに加え、それを室温で10分間軽く揺らしながらインキュベーションした。次いでそのウェルに1mlのOpti−MEMを加え、そして37℃で更に3時間インキュベーションした。5%の胎児ウマ血清(RD細胞用)又は脂質ウシ血清(MDBK細胞)を含む3mlの容量のOpti−MEMを各ウェルに加えた。37℃で1〜4日間のインキュベーションの後、細胞を80%のアセトンで固定し、そして免疫組織化学アッセイを実施してBVDウィルスプラークの視覚化を助長した。
【0038】
例2: pro 遺伝子欠失BVDウィルスクローンの構築
pro 遺伝子がそのゲノムから欠失したBVDウィルスを構築するため、まず3つのDNAフラグメントを作製し、次いで互いとライゲーションさせた。正確な手順は下記の通りである。
【0039】
PCRフラグメントIの作製
pro のコード配列の欠失を含むように「PCRフラグメントI」をデザインした。3回のPCR増幅をこのフラグメントの作製に包含させた。第一の増幅においては、プライマー5NTR3(+)及び5NTR4(−)をNpro コード配列の上流の5′NTR領域の片側を増幅するために用いた。5′ポジティブセンスプライマー5NTR3(+)は次の配列を有する:5′aaaggtctcgagatgccacg−3′(オリゴヌクレオチド218−237,SEQ ID NO : 2)。3′ネガティブセンスプライマー5NTR4(−)は次の配列を有する:5′−gtctgacatgtgccatgtacagcagagatttttagtagc −3′(オリゴヌクレオチド895−890+388−356,SEQ ID NO : 3)。両プライマーはウィルスゲノムの5′NTR領域に位置し、そしてプライマー5NTR3(+)は固有の制限酵素部位XhoIを含む。プライマー5NTR4(−)はその5′末端において6個の追加オリゴヌクレオチドを含み、それはBVDウィルスCプロテインのコード配列の5′末端と相同性である。PCR増幅はプライマーを0.5μMの最終濃度において、鋳型としての10ngのプラスミドpVVNADL DNA及び2.5単位のPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて実施した。下記の条件を利用して20サイクルの増幅を実施した:94℃で30秒の変性;55℃で1分のアニーリング;及び72℃で2分の伸長。アガロースゲル電気泳動による精製の後、得られる177塩基対フラグメント(フラグメントA)をTEバッファーの中に再懸濁した。
【0040】
第二のPCR増幅はNpro コード配列の下流のフラグメントを増幅するためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドNADLC6(+)及びSeq23(−)を用いて実施した。5′ポジティブセンスプライマーNADLC6(+)は次の配列を有する:5′−cacatgtcagacacgaaagaagagggagc −3′(オリゴヌクレオチド383−388+890−913,SEQ ID NO : 4)。3′ネガティブセンスプライマーSeq23(−)は次の配列を有する:5′caggtttgcaatccaagtgccc−3′(オリゴヌクレオチド2480−2459,SEQ ID NO : 5)。プライマーNADLC6はタンパク質CのN末端に位置する。それは5′NTRの3′末端に相同性な3個の追加のヌクレオチドを含み、そして開始コドンATGは5′末端に位置する。プライマーSeq23(−)はタンパク質E2のN末端付近に位置する。プラスミドpVVNADLを増幅反応における鋳型として用い、そして条件は前述のものと同じとした。得られるDNAフラグメント(フラグメントB)はアガロースゲル電気泳動により精製し、そして1596bpのサイズを有した。
【0041】
第三の増幅はオリゴヌクレオチド5′NTR3(+)(SEQ ID NO : 2)及びSeq23(−)(SEQ ID NO : 5)をプライマーとして0.5μMの濃度で、鋳型としてフラグメントA及びB(0.5μg)、並びに2.5単位のPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene,La Jolla,CA)を用いて実施した。最初の4サイクルの増幅については条件は次の通りとした:94℃で30秒の変性、40℃で1分のアニーリング;及び72℃で2分の伸長。これに次の条件の20回のサイクルを続けた:94℃で30秒の変性;60℃で1分のアニーリング;及び72℃で2分の伸長。これは1767bpのサイズを有する「PCRフラグメントI」と命名する最終生成物を供した。このフラグメントをXhoI及びPvuIで消化し、ライゲーションの前に利用する1175bpのフラグメントを形成した。
【0042】
PCRフラグメント II の作製
「PCRフラグメントII」はプライマーとしてオリゴヌクレオチドSeq2(+)及びSeq24(−)を用いて作製した。5′ポジティブセンスプライマーSeq2(+)の配列は下記の通りである:5′−ggagcatacgctgcttcccc−3′(オリゴヌクレオチド1865−1884,SEQ ID NO : 6)。3′センスプライマーSeq24(−)は次の配列を有する:5′gccttgcctatgagggaatgg −3′(オリゴヌクレオチド2963−2942,SEQ ID NO : 7)。オリゴヌクレオチドSeq2(+)はE1のN末端付近に位置し、そしてオリゴヌクレオチドSeq24(−)はE2領域の中央付近に位置する。増幅は鋳型としてプラスミドpVVNADL DNAを用い、フラグメントA及びBを利用する増幅との関連で上記した条件で実施した。「PCRフラグメントII」と命名する得られるフラグメントは1098bpのサイズを有した。それをPvuI及びRsrIIで消化し、ライゲーションの前に利用する長さ929bpのフラグメントを形成した。
【0043】
ベクターフラグメント III の作製
14579bpのプラスミドpVVNADLをXhoI及びRsrIIで消化し、長さ11974bpのフラグメントを得た。これを「ベクターフラグメントIII 」と命名した。
【0044】
プラスミドpBVDdN1の作製
PCRプラスミドI及びII並びにベクターフラグメントIII を2:2:1の分子比で一緒に混合し、そして200単位のT4 DNAリガーゼ(Boehringer Mannheim)で16℃で一夜かけてライゲーションした。このライゲーション生成物を次にE.コリSTBL2細胞に形質転換し、そして異種コロニーをミニーDNA精製及び特異的制限酵素分析によりスクリーニングした。予測のサイズ(14079bp)を有するプラスミドを配列分析により更に分析した。得られるプラスミドpBVDdN1を図1Bに示し、そしてBVDウィルスゲノムからのNpro プロテアーゼ遺伝子の予測の欠失を含んだ。pBVDdN1についてのベクターバックグランドはpVVNALについてのそれと同じである。
【0045】
例3: pro 遺伝子欠失BVDウィルスクローンの特性決定
pro 遺伝子欠失BVDウィルスクローンpBVDdN1の感染能
pBVDdN1及びpVVNADL(陽性コントロール)由来のRNAを前述の通りにしてin vitroで合成し、そしてRNAトランスフェクションをRD細胞単層に対してLipofectinを用いて実施した。トランスフェクションして48,72及び96時間後、上清液をトランスフェクション化細胞から集め、そして新たなRD単層を再感染するのに用いた。トランスフェクション化細胞を80%のアセトンで固定し、次いでVectastain EliteABCキット(Vector Laboratories)を用いて免疫組織化学アッセイを実施した。BVD特異的ウィルスタンパク質を検定するために用いたモノクローナル抗体は15C5(EOに対して特異的)及びCA3(E2に対して特異的)(ファイザー社内)としたが、これらの抗原に対して生起させたその他のモノクローナル抗体が標準の技術により調製でき、そしてこれらと同じ手順に用いることができる。これらの抗体は1:1000の希釈率で使用した。エンベロープタンパク質E0及びE2が検出され、そしてウィルスは親ウィルスに由来するRNAによるトランスフェクションの24時間後に生産された。対照的に、ウィルスタンパク質E0及びE2はpBVDdN1に由来するRNAで処理した細胞においてトランスフェクション後48時間目にはじめて検出された。BVDdN1ウィルスはトランスフェクション後72時間まで取り出すことができなかった。
【0046】
表現型分析
早期継代BVDdN1ウィルスストック(3継代目)をRD及びMDBK細胞単層の接種のために用いた。これらの細胞を親ウィルスを接種したコントロールと比較した。細胞単層をトランスフェクション後20時間(RD細胞)目又はトランスフェクション後24時間(MDBK細胞)目において80%のアセトンで固定した。固定細胞を次にE2特異的モノクローナル抗体CA3により1:1000の希釈率で免疫組織化学により分析し、そして顕微鏡観察した。両方の細胞タイプについて、親ウィルス複製がBVDdN1ウィルスにより示される複製速度よりも有意に速いことが認められた。
【0047】
ゲノタイプ分析
親ウィルス及びBVDdN1(3継代目)の双方のRNAをUltraspec(商標)RNA試薬(Biotect)を用い、その製造業者の仕様書に従って感染RD単層から精製した。RT/PCR実験をRT−PCRビーズ(Pharmacia Biotech)並びにオリゴヌクレオチドNADLE07(−)及び5NTR3(+)を用いて実施した。5NTR3(+)オリゴヌクレオチドの配列及び位置は前述の通りである。オリゴヌクレオチドNADLE07(−)の配列は下記の通りである:5′−cacttgcatccatcatacc −3′(ネガティブセンス、オリゴヌクレオチド1379−1361,SEQ ID NO : 8)。このオリゴヌクレオチドはEOのN′末端から約150bpに位置する。親RNA由来のRT/PCRはサイズが1162bpのフラグメントを生み出すことが認められた。BVDdN1 RNA由来のRT/PCRはサイズ661bpのフラグメントを生み出し、これはNpro プロテアーゼ遺伝子が欠失したフラグメントについて予想された通りである。親及びBVDdN1 RNAの双方から作製したRT/PCRフラグメントを配列決定した。双方のケースにおいて、得られた配列は予測通りであり、そして図1に示す要素の配位と対応した。BVDdN1の完全配列をSEQ ID NO : 1においてnt39〜12116で示す。
【0048】
例4:BVDdN1効能研究
本研究の目的はBVDdN1を含んで成るワクチンの子ウシにおけるセロコンバーションを及ぼす能力の評価にある。15頭の動物(10頭は2投与種痘、そして5頭は対照(Sentinel))をランダムに第一室に割り当てた。他に10頭の動物を第二室に割り当てた(1投与種痘、対照なし)。BVDdN1ウィルスを動物に、2.0mlのMDBK細胞リゼート中で10 TCID50/動物の用量にて皮下投与した。免疫する日に、5頭の表示した対照動物をそれらの室から取り出した。残りの10頭の子ウシによりBVDdN1ウィルスに種痘した。免疫後約24時間してから、対照動物を処置室にもどした。2回目のワクチン投与を最初の10頭の動物に、1回目の投与の約28日後に同じようにして施した。
【0049】
直腸温度を−1,0(種痘前),1,2,3,4,5,6,7,8,9,10日目(全グループ)に、そして27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37及び38日目(2投与グループの動物)においてとった。血液サンプルを2投与グループの動物から0日目並びにその後毎週(7,14,21,28,35,42,49,56,63,70,77,84及び91日目)採取した。1投与グループの動物からは血液サンプルを0,7,14,21,28,35,42,49,56及び63日目に採取した。
【0050】
期待の同族及び異種性保護を追跡するため、血清中和抗体をSNアッセイにより検定した(I型についてはBVDウィルス単離5960、そしてII型については単離体890)。
【0051】
一般観察又は直腸体温のいずれについても有意な変動は認められなかった。どの対照動物も研究の間セロコンバーションしなかった(データーは示さない)。
【0052】
BVDdN1ウィルス種痘動物は全て、I型血清中和アッセイによる決定に従い、セロコンバーションした。一回の投与種痘の後、60%の動物が28日目に1:8以上の陽性力価に達し;そして90%の動物が35日目に1:8以上の陽性力価に達し、その後高力価を保った(図25A)。II型血清中和アッセイにおいては、70%の動物が種痘後63日目に陽性に達した(データーは示さない)。2投与種痘の後、動物は全てI型血清中和アッセイにより示される通り7日目に1:64以上の陽性力価に達し、そしてその後類似のセロコンバーションレベルを維持した(図25A)。II型血清中和アッセイに関しては、ほとんどの動物が2回目の種痘後7日目において陽性力価を有し、そして60%以上の動物が28日目に1:8以上の陽性力価に達した(図25B)。これらの結果はBVDdN1ウィルスが反芻動物において複製でき、そして1型及び2型ウィルスの双方に関して陽性中和血清を誘導できることを示唆し、これはこのウィルスのBVDV予防のための種痘剤としての利用を裏付する。
【0053】
生物材料の寄託
プラスミドpBVDdN1はカメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)10801 Univeristy Blvd,Manassas,VA,20110,USAに1998年10月20日に寄託し、そして受託番号ATCC 203354が付与された。
【0054】
【配列例】
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841
Figure 0003602841

【図面の簡単な説明】
【図1】パネルAはプラスミドpVVNADLの模式図を示す。このプラスミドは突然変異され、オープンリーディングフレームの第一遺伝子、即ち、Npro プロテアーゼの遺伝子が欠失されている。得られる突然変異したプラスミド生成物pBVDdN1をパネルBに模式的に示す。いくつかのその他の遺伝子領域も示す。CはゲノムRNAをパッケージングし、そしてウィルス性ビリオンを形成する構造コアタンパク質をコードする遺伝子を表わす。これに3つのエンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子、E0,E1及びE2が続く。P7は未知の機能をもつ非構造タンパク質をコードし、それに「NS2−挿入−NS3」と命名する領域が続く。NS2は亜鉛フィンガーモチーフを有する高度に疎水性なタンパク質をコードする。NS3は親水性であり、そして細胞病理BVDウィルスのマーカーである。感染動物におけるncpウィルスの複製は、NS2とNS3コード領域との間での追加のウィルス性又は細胞性RNA配列の挿入が関与する遺伝子組換を通じてcp生物型へとウィルスを変換させることができる。組換の結果、遊離のNS2及びNS3タンパク質が放出される。後者NS3は、行われるほとんどの非構造タンパク質プロセシングを司るプロテアーゼである。NS4AはNS3の隣りに位置し、そしてNS3プロテアーゼ活性のための補因子をコードすることで知られる。NS4Aの後に、機能の未知なウィルスタンパク質をコードする2種類の遺伝子NS4B及びNS5Aがある。最後の遺伝子NS5BはRNA依存性RNAポリメラーゼをコードし、そしてウィルス複製を司る。パネルBに示すヌクレオチド配列(SEQ ID NO : 9)はpBVDdN1の開始コドンの周囲配列である。
【図2】プラスミドpBVDdN1の完全ヌクレオチド配列の第1部である。BVDdN1のゲノム配列はヌクレオチド39〜12,116で示されている。
【図3】図2の続き。
【図4】図3の続き。
【図5】図4の続き。
【図6】図5の続き。
【図7】図6の続き。
【図8】図7の続き。
【図9】図8の続き。
【図10】図9の続き。
【図11】図10の続き。
【図12】図11の続き。
【図13】図12の続き。
【図14】図13の続き。
【図15】図14の続き。
【図16】図15の続き。
【図17】図16の続き。
【図18】図17の続き。
【図19】図18の続き。
【図20】図19の続き。
【図21】図20の続き。
【図22】図21の続き。
【図23】図22の続き。
【図24】図23の続き。
【図25】BVDdN1ウィルスの投与に応答する反芻動物におけるセロコンバーションを実証するデーター。

Claims (21)

  1. ワクチンにおける使用のために適当なものとするように単離された野生型BVDウィルスゲノムを修飾する方法であって、当該単離された野生型ウィルスのゲノム核酸を突然変異させてNpro プロテアーゼ遺伝子を不活性化させることを含んで成り、ここで当該不活性化されたN pro プロテアーゼ遺伝子は SEQ ID NO:1 nt39 nt12116 の配列又はその縮重配列からなる、方法。
  2. 前記Npro プロテアーゼ遺伝子の前記不活性化が
    a)前記野生型BVDウィルス由来のゲノムRNAを逆転写させてcDNAを形成し;
    b)段階a)のcDNAをクローニングし;
    c)段階b)でクローニングしたcDNA内のNpro プロテアーゼ遺伝子を突然変異させて当該遺伝子が完全に活性な遺伝子生成物を生産できなくなるようにし;そして
    d)段階c)で突然変異させたcDNAをクローニングする;
    段階を含んで成る手順により達成される、請求項1記載の方法。
  3. 前記Npro プロテアーゼ遺伝子を、前記野生型BVDウィルスゲノムからその配列の全て又はその一部を欠失させることにより不活性化させる、請求項2記載の方法。
  4. 請求項1記載の方法により作製したBVDウィルスゲノム。
  5. 請求項4記載のBVDウィルスゲノムから本質的に成る独立の配列要素を含んで成るベクター。
  6. 請求項4記載のウィルスゲノム又は請求項5記載のベクターによりトランスフェクションされた宿主細胞。
  7. 請求項6記載の宿主細胞により生産された子孫BVDウィルス。
  8. 請求項4記載のウィルスゲノム及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチン。
  9. ワクチンにおける使用のために適当なものとするように野生型BVDウィルスを弱毒化する方法であって、当該ウィルスのゲノム核酸を突然変異させてNpro プロテアーゼ遺伝子を不活性化させることを含んで成り、ここで当該不活性化されたN pro プロテアーゼ遺伝子は SEQ ID NO:1 nt39 nt12116 の配列又はその縮重配列からなる、方法。
  10. 前記弱毒化が
    a)前記野生型BVDウィルスを単離する;
    b)段階a)で単離したウィルスのゲノム核酸をクローニングする;
    c)段階b)でクローニングしたゲノム核酸を突然変異させ、前記Npro プロテアーゼ遺伝子を不活性化させる;そして
    d)段階c)で突然変異させた核酸を宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションして弱毒化ウィルスを供する;
    段階を含んで成る手順により達成される、請求項9記載の方法。
  11. 前記Npro プロテアーゼ遺伝子を、前記野生型BVDウィルスゲノムからその配列の全て又はその一部を欠失させることにより不活性化させる、請求項10記載の方法。
  12. 請求項9記載の方法により作製した弱毒化BVDウィルス。
  13. 請求項12記載の弱毒化ウィルスで感染された宿主細胞。
  14. 前記宿主細胞がMDBK細胞(ATCC CCL−22)である、請求項13記載の感染された宿主細胞。
  15. 請求項14記載の宿主細胞により生産された子孫ウィルス。
  16. 請求項12記載の弱毒化ウィルス及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチン。
  17. 反芻動物(cattle)において免疫応答を誘導する方法であって、請求項8又は16記載のワクチンをBVDウィルスによるその後の感染に対する保護免疫力を誘導するのに十分な用量で前記反芻動物に投与することを含んで成る方法。
  18. 前記保護免疫力が体液性及び細胞媒介型免疫応答の双方に由来する、請求項17記載の方法。
  19. 抗体生産可能なヒトを除く動物においてBVDウィルスに対する抗体の生産を誘導する方法であって、(a)請求項4記載のウィルスゲノム;(b)請求項5記載のベクター;又は(c)請求項12記載の弱毒化ウィルスを当該抗体生産を誘導するのに有効な用量で当該動物に投与することを含んで成る、方法。
  20. 前記抗体を反芻動物において生産させる、請求項19記載の方法。
  21. 前記動物から前記抗体を単離することを更に含んで成る、請求項19記載の方法。
JP2003022253A 1998-11-10 2003-01-30 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス Expired - Fee Related JP3602841B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10790898P 1998-11-10 1998-11-10
US60/107908 1998-11-10

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP31934099A Division JP3602759B2 (ja) 1998-11-10 1999-11-10 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003259885A JP2003259885A (ja) 2003-09-16
JP3602841B2 true JP3602841B2 (ja) 2004-12-15

Family

ID=22319107

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP31934099A Expired - Fee Related JP3602759B2 (ja) 1998-11-10 1999-11-10 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス
JP2003022253A Expired - Fee Related JP3602841B2 (ja) 1998-11-10 2003-01-30 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP31934099A Expired - Fee Related JP3602759B2 (ja) 1998-11-10 1999-11-10 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス

Country Status (12)

Country Link
US (4) US6168942B1 (ja)
EP (1) EP1013757A3 (ja)
JP (2) JP3602759B2 (ja)
CN (2) CN1231578C (ja)
AR (1) AR019250A1 (ja)
AU (1) AU765792B2 (ja)
BR (1) BR9905352A (ja)
CA (1) CA2287775A1 (ja)
HK (2) HK1026718A1 (ja)
NZ (1) NZ500925A (ja)
TW (1) TW585916B (ja)
ZA (1) ZA997011B (ja)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7179473B2 (en) * 1998-06-05 2007-02-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Attenuated pestiviruses
EP1035205A1 (en) * 1999-03-08 2000-09-13 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Non-spreading pestivirus
US7135561B2 (en) 2001-09-06 2006-11-14 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious bovine viral diarrhea virus clone
US20040229224A1 (en) * 2003-05-13 2004-11-18 Perlegen Sciences, Inc. Allele-specific expression patterns
US7572455B2 (en) 2004-05-19 2009-08-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine comprising an attenuated pestivirus
DE102004025452A1 (de) * 2004-05-19 2006-01-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vakzine enthaltend BVDV
UY29915A1 (es) * 2005-11-15 2007-06-29 Boehringer Ingelheim Vetmed Vacuna combinada que comprende un virus atenuado de la diarrea viral bovina
KR101097547B1 (ko) * 2005-12-07 2011-12-22 화이자 프로덕츠 인크. 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신
JP5775665B2 (ja) * 2006-09-22 2015-09-09 インターベット インターナショナル ベー. フェー. ワクチン用ペスチウイルス変異体
EP2130912A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
UY31930A (es) * 2008-06-25 2010-01-29 Boheringer Ingelheim Pharma Kg Pestivirus atenuados recombinantes, en particular a csfv, bvdv o bdv atenuado recombinante
US8846054B2 (en) * 2009-01-09 2014-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Method of treating pregnant cows and/or heifers
WO2012038454A1 (en) 2010-09-21 2012-03-29 Intervet International B.V. Bvdv vaccine
RU2502522C1 (ru) * 2012-07-27 2013-12-27 Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук Способ получения вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота
CN113174374B (zh) * 2021-05-19 2022-07-22 西南民族大学 一种牛病毒性腹泻病毒弱毒株及其用途
CN113403256B (zh) * 2021-06-16 2023-04-18 中国农业科学院特产研究所 一种稳定产生牛病毒性腹泻病毒抗原的细胞系及抗体胶体金检测试纸条的制备方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206163A (en) 1985-07-08 1993-04-27 Chiron Corporation DNA encoding bovine diarrhea virus protein
ZA864879B (en) 1985-07-08 1987-03-25 Wallone Region Vaccines and diagnostics derived from boving diarrhoea virus
FR2677767B1 (fr) 1991-06-11 1994-10-14 Biotechnologie Ste Europeenne Procede de detection de l'infection par le virus de la diarrhee bovine, sequence nucleotidique codant pour une proteine induite par l'infection par ce virus et proteines et antigenes recombinants s'y rapportant .
EP1104676A1 (en) 1999-11-30 2001-06-06 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Safe attenuated bovine viral diarrhea viruses for use in pregnant cows

Also Published As

Publication number Publication date
ZA997011B (en) 2001-05-09
HK1067383A1 (en) 2005-04-08
JP2000139482A (ja) 2000-05-23
NZ500925A (en) 2001-06-29
CN1254756A (zh) 2000-05-31
CN1247775C (zh) 2006-03-29
TW585916B (en) 2004-05-01
AU5837699A (en) 2000-05-11
US6916477B2 (en) 2005-07-12
US20030165520A1 (en) 2003-09-04
CN1510130A (zh) 2004-07-07
AR019250A1 (es) 2001-12-26
CN1231578C (zh) 2005-12-14
EP1013757A2 (en) 2000-06-28
JP2003259885A (ja) 2003-09-16
US6168942B1 (en) 2001-01-02
AU765792B2 (en) 2003-10-02
US6410299B1 (en) 2002-06-25
CA2287775A1 (en) 2000-05-10
EP1013757A3 (en) 2002-03-06
BR9905352A (pt) 2001-02-06
HK1026718A1 (en) 2000-12-22
US6410032B1 (en) 2002-06-25
JP3602759B2 (ja) 2004-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100908798B1 (ko) 약독화 페스티바이러스를 포함하는 백신
JP3602841B2 (ja) 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス
EP2303320B1 (en) Attenuated pestivirus
EP3146042B1 (en) Recombinant classical swine fever virus (csfv) comprising substitution in the tav epitope of the e2 protein
EP2618841B1 (en) Bvdv vaccine
KR101097547B1 (ko) 마킹된 소 바이러스성 설사 바이러스 백신
JP4662931B2 (ja) 安全な突然変異ウイルスワクチン
KR100909846B1 (ko) Bvdv 바이러스-유사 입자
CA2363493C (en) Attenuated forms of bovine viral diarrhea virus
WO2008034857A1 (en) Pestivirus mutant for use in a vaccine
US6974575B2 (en) Generation of type I/type II hybrid form of bovine viral diarrhea virus for use as vaccine
EP4305156A1 (en) Bovine viral diarrhea virus immunogenic compositions and methods of use thereof
MXPA06001146A (en) Safe mutant viral vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20040127

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20040426

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20040430

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20040727

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20040824

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20040924

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081001

Year of fee payment: 4

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees