JP2003259885A - 弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は弱毒型のウシウィルス性下痢性ウィ
ルスの提供を課題とする。 【解決手段】 本発明はＮ^pro プロテアーゼ遺伝子を突
然変異させることにより弱毒型のウシウィルス性下痢性
（ＢＶＤ）ウィルスを生産する方法を提供する。本発明
はこの方法により作った弱毒型ウィルス、これらのウィ
ルスにより作製した抗体、並びに反芻動物を免疫するた
めに使用できるワクチンも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は弱毒型のウシウィル
ス性下痢性（ＢＶＤ）ウィルスを、ウィルスゲノム内の
特定の遺伝子を不活性化させることにより生産する方法
に関する。この弱毒化ウィルス又はその突然変異ウィル
スゲノムはＢＶＤウィルスに対する抗体を生産するため
又は反芻動物（ｃａｔｔｌｅ）をウィルス感染症から守
るようにデザインされたワクチンにおいて使用できる。

【０００２】

【従来の技術】ウシウィルス性下痢性（ＢＶＤ）ウィル
スはペスチウィルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）属及びフ
ラビウィルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科に分類さ
れる。それはヒツジ及び古典型的なブタ熱病における周
辺疾患（ｂｏｒｄｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）を惹起するウ
ィルスに近似する。感染した反芻動物は、高熱、下痢、
せき及び消化器官粘膜の潰瘍を特徴とする「粘膜疾患」
を示す（Olafson ら、Cornell Vet. 36 : 205-213 (194
6) ; Ramsey ら、North Am. Vet. 34 : 629-633(1953))
。ＢＶＤウィルスは妊娠した反芻動物の胎盤を横断す
ることができ、そして永続感染（Ｐ１）した子ウシ等の
誕生を招いてしまうことがある（Malmquist, J. Am. Ve
t. Assoc. 152 : 763-768 (1968) ; Ross ら、J. Am. V
et. Med. Assoc. 188 : 618-619 (1986)) 。これらの子
ウシはこのウィルスに対して免疫寛容となっており、そ
してその残りの命の間永続的ウィルス血症（ｖｉｒｅｍ
ｉｃ）を有する。これらは粘膜病の突発の起源を司り
（Liess ら、Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81 : 481-487
(1974))、そして肺炎又は腸内疾患の如き疾患の原因と
なる微生物による感染に極めてかかり易くなる（Barber
ら、Vet. Rec. 117 : 459-464 (1995)) 。

【０００３】ＢＶＤウィルスは２通りの生物型の一方を
有するものとして分類される。「ｃｐ」生物型のものは
培養細胞において細胞病理作用を誘導し、一方「ｎｃ
ｐ」生物型のウィルスはそのようでない（Gillespie
ら、Cornell Vet. 50 : 73-79 (1960)) 。更に、２種類
のゲノタイプ（Ｉ型及びII型）が認められており、共に
様々な臨床症候群を惹起することが示されている（Pell
erinら、Virology 203 : 260-268 (1994) ; Ridpath
ら、Virology 205 : 66-74 (1994))。

【０００４】ＢＶＤウィルスのゲノムは長さ約１２．５
kbであり、そしてその５′及び３′非翻訳領域（ＮＴ
Ｒ）の間に位置する単一のオープンリーディングフレー
ムを含む（Collett ら、Virology 165 : 191-199 (198
8))。約４３８kDのポリタンパク質がこのオープンリー
ディングフレームから翻訳され、そして細胞及びウィル
スプロテアーゼによってウィルス構造及び非ウィルス構
造タンパク質へとプロセシングされる（Tautz ら、J. V
irol. 71 : 5415-5422 (1997) ; Xuら、J. Virol.71 :
5312-5322 (1997) ; Elbersら、J. Virol. 70 : 4131-4
135 (1996) ; 及びWiskerchenら、Virology 184 : 341-
350 (1991))。ウィルス酵素のうちでこのプロセシング
に関与するものはとりわけプロテアーゼＮ^pro 及びＮＳ
３である。Ｎ ^pro はウィルスオープンリーディングフレ
ームによりコードされる第一のタンパク質であり、そし
てそれ自体を合成ポリタンパク質の残りから切断する
（Starkら、J. Virol. 67 : 7088-7093 (1993) ; Wiske
rchenら、Virol. 65 : 4508-4514 (1991)) 。

【０００５】ＢＶＤワクチンのうちで現状有用なものは
ウィルスが化学的に不活性化されたものである（McClur
kin ら、Arch. Virol. 58 : 119 (1978) ; Fernelius
ら、Am. J. Vet. Res. 33 : 1421-1431 (1972)；及びKo
lar らAm. J. Vet. Res. 33 :1415-1420 (1972)) 。こ
のようなワクチンは典型的には一次免疫を達成するため
に複数回の投与を必要とし、短期間の免疫力を供し、そ
して胎児伝染に対する保護を供しない（Bolin, Vet. Cl
in. North Am. Food Anim. Pract. 11 : 615-625(199
5))。ヒツジにおいて、精製されたＥ２タンパク質を基
礎とするサブユニットワクチンが報告されている（Brus
chkeら、Vaccine 15 : 1940-1945 (1997))。残念なが
ら、かかるワクチンのうちの一つのみが胎児を感染から
保護し、そしてこの保護は同族ウィルスのうちの１つの
株に限られている。抗体力価とウィルス感染症からの保
護との間での相関はない。

【０００６】更に、ＢＶＤウィルスを利用して修飾型生
存ウィルス（ＭＬＶ）ワクチンが作られているが、それ
はウシ又はブタ細胞内での反復継代により弱毒化される
（Coggins ら、Cornell Vet. 51 : 539 (1961)；及びPh
illipsら、Am. J. Vet. Res.36 : 135 (1975)) 、又は
このウィルスに温度感受性表現型を供与する化学誘導修
飾により弱毒化されてしまう（Lobmann ら、Am. J. Ve
t. Res. 45 : 2498 (1984) ; 及びLobmann ら、Am. J.
Vet. Res. 47 : 557-561 (1986)) 。ＭＬＶワクチンの
一回の投与が免疫のために十分であることが証明され、
そして免疫力の持続期間は腫痘を受けた反芻動物におい
て何年も延長できうる（Coria ら、Can. J. Con. Med.
42 : 239 (1978))。更に、ＭＬＶ型ワクチンで腫痘の施
された子ウシから交差保護が報告されている（Martin
ら、Proceedings of the ConferenceRes. Workers' Ani
m. Dis. 75 : 183 (1994)) 。しかしながら、安全性の
問題、例えばウィルスの胎児伝染の可能性がこのような
ワクチンの利用に関する大きな問題となっている（Boli
n. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 : 615
-625 (1995))。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ＢＶＤウィルスの流布
を制御するための新規且つ有効なワクチンについての明
確なニーズがある。このウィルスにより惹起される疾患
が反芻動物の最も世界中に広がった且つ経済的に重要な
ものの一つとなっているため、かかるワクチンは牧場に
おける著しい進歩を供するであろう。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は弱毒型ＢＶＤウ
ィルスがＮ^pro プロテアーゼ遺伝子の欠失又は不活性化
により生産できるという発見に基づく。このようなウィ
ルスはウシ細胞系におけるその野生型対応物よりもはる
かに感染性が弱く、そして反芻動物のためのワクチンに
おける使用に適当である。一のかかる弱毒化ウィルスの
安全ゲノム配列を本明細書において開示し、そしてこの
ウィルスをコードするプラスミド、即ちｐＢＶＤｄＮ１
がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ＴＣＣ）にＡＴＣＣ No. ２０３３５４として寄託され
ている。

【０００９】Ａ．ＢＶＤｄＮ１弱毒化ウィルスを基礎と
する組成物及び方法 第一の観点において、本発明は特異的に弱毒化したＢＶ
Ｄウィルス株の開発を基礎とする。この株は野生型ウィ
ルスゲノムを突然変異させてＮ^pro プロテアーゼ遺伝子
を欠失させることにより作られ、そしてその全長配列は
SEQ ID NO : １及び図２〜２４に示すnt３９〜nt１２１
１６である。かくして、本発明はそこに示すゲノム配列
を有するウィルス、そして好ましくはそれから本質的に
成るウィルスに関する。通常、ＢＶＤウィルスはＲＮＡ
の形態におけるゲノムを有する。クローニングすると、
これはより典型的にはＤＮＡの形態となるであろう。何
らかのことわりのない限り、「核酸」なる語はＢＶＤウ
ィルス性ＤＮＡ及びＲＮＡ配列の双方を意味する。便宜
上、添付の配列表はＤＮＡ配列のみを示しているが、各
々の対応のＲＮＡ配列は当業者にとって容易に明らかと
なるであろう。「から本質的に成る」とは配列が構造及
び機能の双方の点で特定した配列と実質的に同じである
ことを意味する。かくして、本発明は表示の配列のみな
らず、非実体的な１もしくは複数個のヌクレオチドの付
加又は置換（あるいは欠失）を導入することにより作製
した対応の配列も含む。特に、本発明はSEQ ID NO : １
と同じＢＶＤタンパク質をコードする縮重核酸配列を含
む。この特定の配列、即ちSEQID NO : １のnt３９〜nt
１２１１６及びそれがコードする対応のウィルスは、便
宜上「ＢＶＤｄＮ１」ゲノム及びウィルスと命名した。
ウィルスは大きな調製物の一部として、又は実質的に純
粋な形態で、即ち、任意のその他のウィルス型のものを
本質的に含まない態様で提供されうる。

【００１０】本発明は本発明のＢＶＤｄＮ１核酸分子を
担持する宿主細胞を含む。「宿主細胞」とはＢＶＤｄＮ
１核酸分子を担持する任意の原核細胞、及びＢＶＤｄＮ
１核酸分子を担持するウィルス又は何らかのもので感染
された任意の真核細胞を含むことを意味する。原核細胞
に関して、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＳＴＢＬ ２株
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）がこのプラスミドの増幅に関し
て最良の結果を供することが認められ、そして一般的に
好ましいとされる。真核細胞に関しては、哺乳動物細
胞、例えばＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２）及
びＲＤ細胞（安定な形質転換精巣細胞）が一般的に好ま
しい。しかしながら、その他の培養細胞が同様に利用で
きうる。本発明は更にかかる宿主細胞において生産され
た子孫ウィルスを含む。

【００１１】ＢＶＤｄＮ１ウィルスは動物を有効用量
で、即ち、抗体生産を誘導するのに十分高い用量で感染
させることによって抗体の生産を誘導するのに利用でき
うる。この抗体はこの目的のために通常利用されている
任意の動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ又はヒツジ）
において作られることができるが、好ましくは抗体は反
芻動物で作られるであろう。本明細書で用いる「ＢＶＤ
ウィルスに対する抗体」とは、任意のその他の非ＢＶＤ
ウィルスと比べＢＶＤウィルスの株に対して少なくとも
１００倍超の親和力を有するという観点で優先的に反応
する抗体を意味する。好適とはされないが、ウィルスは
動物に抗体する前にホルマリン、パラホルムアルデヒ
ド、フェノール、ラクトプロピオネート、プソラレン、
プラチナ錯体、オゾン又はその他の殺ウィルス剤を利用
して更に不活性化してよい。このような手順により作製
した抗体はそれ自体本発明の範囲に含まれ、そして当業
界において周知の技術を利用して単離できる（例えば、
Harlowら、Antibodies : A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)を参照のこ
と）。このような抗体はとりわけ、生物学又は実験室サ
ンプル中のＢＶＤの存在を検定するようにデザインされ
た方法において利用できる。

【００１２】別の観点において、本発明はＢＶＤｄＮ１
ウィルス及び獣医学的に許容される担体を含んで成るワ
クチンに関する。このワクチンは任意のアジュバント及
びかかる調製物において典型的に使用されるその他の試
薬を含みうる。免疫応答はこのワクチンを、ＢＶＤウィ
ルスによるその後の負荷に対する保護免疫力を誘導する
のに十分な用量で投与することにより反芻動物において
誘導できうる。典型的には、このワクチンは非経口的に
投与するが、その他の投与ルートも本発明に適応する。
必要なら、２回以上の接種を規則的な間隔を置いて、例
えば２〜８週間置いて付与することができる。当業界に
おいて周知の標準的な手順を免疫プロトコールを最適化
するために利用できる。

【００１３】Ｂ．ＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸を基礎とする
組成物及び方法 最近の研究は動物に免疫原をコードする核酸を注射する
ことによって有効なワクチンを調製することが可能であ
ることを実証している。このような「ＤＮＡワクチン」
を作製及び投与するための方法は詳細に発表されており
（例えば米国特許第５，５８９，４６６；同５，５８
０，８５９号；及び同５，７０３，０５５号を参照のこ
と）、そしてＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸に適用できる。か
くして、別の観点において、本発明はSEQ ID NO : １の
配列のnt３９〜nt１２１１６又はその縮重変異体を含ん
で成る好ましくは実質的に純粋な形態の核酸分子に関す
る。好適な態様において、本発明はSEQ ID NO : １の配
列のnt３９〜nt１２１１６から本質的に成る好ましくは
実質的に純粋な形態の核酸分子に関する。本明細書でい
う「実質的に純粋な」核酸分子とは、他の夾雑核酸分子
を本質的に含まず、そして典型的にはサンプル中に少な
くとも８５重量％の当該核酸分子を含んで成り、更に高
いパーセンテージが好適とされる。核酸の純度を決定す
るための一の方法は調製物をポリアクリルアミド又はア
ガロースの如きマトリックスで電気泳動することによ
る。純度は染色の後の単一バンドの出現により証明され
る。純度を評価するためのその他の方法にはクロマトグ
ラフィー及び分析遠心分離が挙げられる。

【００１４】ＢＶＤｄＮ１ゲノム核酸は独立のコード要
素としてベクターに組込むことができる。「独立のコー
ド要素」とはウィルス性ポリペプチドへと翻訳されるベ
クターの部分を意味し、そして事実上はウィルスであ
る。それはＢＶＤｄＮ１生成物を実質的に改変してしま
う任意のその他の翻訳された要素を含まない点で独立で
ある。このベクター又はＢＶＤｄＮ１核酸自体は子孫弱
毒化ウィルスを生成するために宿主細胞をトランスフェ
クションするのに利用できる。

【００１５】本発明は更に、ＢＶＤｄＮ１核酸、又はこ
の核酸を含むベクターを動物に直接注射することによる
ＢＶＤウィルスに対する抗体の生産方法も含む。抗体を
作ることのできる任意の動物を利用してよいが、反芻動
物が一般的に好ましい。このようにして作った抗体は本
発明の一部を構成し、そして動物から精製することがで
き、そして例えば培養培地又は生物学的流体中のＢＶＤ
ウィルスの存在を検定するようにデザインされたアッセ
イに利用されうる。

【００１６】反芻動物に投与するためのワクチンは獣医
学的に許容される担体との組合せにおいてＢＶＤｄＮ１
ゲノム核酸に基づいて調製でき（前述の文献を参照のこ
と）、そしてその後のウィルス感染に対する保護免疫力
を誘導するために最適化された免疫プロトコールに利用
される。

【００１７】Ｃ．野生型ＢＶＤゲノムを突然変異させる
方法 より一般的な観点において、本発明はゲノムを実質的に
純粋な野生型ＢＶＤウィルスからそれをワクチンにおけ
る使用のために適当なものとするように修飾する方法に
関する。これとの関連で使用する「実質的に純粋」と
は、好ましくは単一のＢＶＤウィルス株から成り、その
他のタイプのウィルスが存在しないウィルス調製品を意
味する。この手順の主たる際立った特徴はゲノム核酸が
突然変異されてＮ^pro プロテアーゼ遺伝子が不活性化さ
れている点にある。これとの関連で、遺伝子は、生成物
ができない（例えばこの遺伝子が欠失している）、又は
でき上がった生成物がもはやその正常な生物学的機能を
もたない（例えばタンパク質分解切断）、又はでき上が
った生成物がその正常な生物学的機能をもつが著しく低
まった割合となっている場合のいずれかのときに不活性
化されていると考える。Ｎ^pro プロテアーゼの不活性化
をもたらす任意の方法を利用してよい。例えば、ゲノム
ＲＮＡを野生型ＢＶＤウィルスから単離し、逆転写させ
てｃＤＮＡを形成し、次いで標準の手順を利用してクロ
ーニングすることができる。次いで突然変異をＮ^pro プ
ロテアーゼ遺伝子の中に、例えばポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）、部位特異的突然変異誘発、Ｎ^pro が部分的
もしくは完全に消失するようにＤＮＡフラグメントを合
成及びライゲーションさせること、又は当業界に公知の
化学突然変異原もしくは放射線に対する曝露等を含むラ
ンダム突然変異誘発技術の如き手順により、又はかかる
手順の組合せにより導入することができる。

【００１８】ＢＶＤウィルスゲノムをＮ^pro 遺伝子が不
活性化されるように修飾できたら、それを適当なベクタ
ーの中にクローニングし、そして大量生産することがで
きる。前述の通り、ベクターはＢＶＤ配列を独立要素と
して、突然変異させた野生型ウィルスを含んで成る配列
又はそれから本質的に成る配列を伴って含むべきであ
る。突然変異されたＢＶＤゲノム又はそのゲノムを含ん
で成るベクターを、大量のウィルス性核酸又はウィルス
自体を生産する目的で宿主細胞に形質転換又はトランス
フェクションすることができる。

【００１９】ＢＶＤｄＮ１ゲノムＤＮＡとの関連で前述
した通り、ＢＶＤウィルスに対する抗体は、前述したよ
うに状況で突然変異させた任意の野生型ＢＶＤウィルス
ゲノムを投与することによって動物において生産されう
る。一般に、抗体生産は反芻動物において行われるのが
好ましいが、その他の動物も同様に利用できる。

【００２０】突然変異したＢＶＤゲノム核酸の組込まれ
たワクチンは標準のＤＮＡ免疫手順（例えば、米国特許
第５，５８９，４６６；５，５８０，８５９；及び５，
７０３，０５５号に論ぜられているもの）を利用して生
産し、そして反芻動物における免疫応答を誘導するのに
利用できる。ここに論ぜられている方法により作られた
ワクチン、抗体及び核酸は本発明の全体を構成する。

【００２１】Ｄ．弱毒化ＢＶＤウィルスの作製方法 ＢＶＤウィルスの核酸をＮ^pro プロテアーゼ遺伝子が不
活性化されるように突然変異させると、細胞培養におい
てはるかに弱い感染能の弱毒化ウィルスが生産されるこ
とが発見された。このような弱毒化ウィルスの比較的遅
い複製は、急速増幅する野生型ウィルスでは可能でない
状況で動物がその免疫防御を発揮することを可能にす
る。かくして、ＢＶＤｄＮ１について前述した突然変異
したウィルスゲノムを生産するための方法は、ワクチン
において使用するのに適当なものとなるようにＢＶＤウ
ィルスを弱毒化する一般的方法に直接結びつく。一般
に、この手順は野生型ＢＶＤウィルスを単離し、そのゲ
ノム核酸をクローニングし；そのクローニングした核酸
を突然変異させてＮ^pro プロテアーゼ遺伝子を不活性化
し；次いでこの突然変異させた核酸を宿主に形質転換又
はトランスフェクションさせて弱毒化ウィルスを供する
ことを包括する。突然変異を施すための上記の任意の方
法が利用されるが、好適な方法はＮ^pro プロテアーゼ遺
伝子の全体又は一部の欠失であろう。

【００２２】本発明は弱毒化ウィルスを作るための方法
のみならず、そのウィルス自体、このウィルスにより感
染された宿主細胞、及びこのような宿主細胞により生産
された子孫ウィルスも包括する。弱毒化ウィルスに対す
る抗体は動物、好ましくは反芻動物を有効用量で感染さ
せることにより作ることができる。このようにして作っ
た抗体は本発明の一部を構成し、そして単離して診断手
順、又は細胞培養物におけるＢＶＤの存在の検定のため
に利用されうる。

【００２３】ＢＶＤｄＮ１ウィルスとの関連で論じた通
り、不活性化Ｎ^pro プロテアーゼ遺伝子を特徴とする弱
毒化ウィルスをワクチンに組込み、そして反芻動物にお
ける免疫応答を誘導するために利用されうる。用量及び
免疫プロトコールは、動物の接種がその後のウィルス負
荷に対する保護免疫力をもたらすように最適化されう
る。

【００２４】

【発明の実施の形態】Ａ．ＢＶＤｄＮ１及び当該ウィル
スをコードする核酸の生産 本発明はＮ^pro プロテアーゼ遺伝子の欠失により弱毒化
されたＢＶＤウィルスに関する。このウィルスはＢＶＤ
ｄＮ１と命名し、そして「弱毒化」する語で示唆されて
いる通り、それは感受性細胞系（例えばウシ精巣細胞系
（ＲＤ）、ウシ腎細胞系（ＭＤＢＫ））において、その
野生型対応物よりもｉｎ ｖｉｖｏではるかに遅い速度
で複製することが認められた。更に、ＢＶＤｄＮ１は胎
芽ウシ気管細胞（ＥＢＴｒ）又はウシ鼻甲介細胞（ＢＴ
−２）において生産性感染を引き起こさず、このことは
野生型ウィルスによる感染を経て引き起こさせる生産性
感染とは対照的でありうる。いく通りかの異なるウシ細
胞系におけるＢＶＤｄＮ１ウィルスの遅い増殖力は動物
における広域な組織向性弱毒化を示唆する。ＢＶＤｄＮ
１は遺伝子的に安定であり、なぜならＮ^pro 欠失はウシ
ＲＤ細胞において１０回の継代まで維持されるからであ
る。天然ウィルスのゲノムはＲＮＡから成るが、これを
ＤＮＡへ逆転写させ、そしてクローニングすることがで
きる。本明細書における核酸及びＢＶＤウィルス配列に
ついての言及はウィルス性ＲＮＡ配列に由来する逆転写
ＤＮＡ配列及びその対応のＲＮＡ自体の双方を包括する
ことが理解されるであろう。

【００２５】ＢＶＤｄＮ１ウィルス性ゲノムの完全ヌク
レオチド配列はSEQ ID NO : １のnt３９〜nt１２１１６
において示す。本発明はまさに示している配列を有する
ウィルスゲノムのみならず、構造又は機能の点で実体的
に相違しないその他の配列、例えば遺伝子コードの縮重
に基づきSEQ ID NO : １と同じＢＶＤタンパク質をコー
ドする配列も含む。更に、例えば部位特異的突然変異誘
発の如き技術が核酸の構造の中に変異を導入するために
利用できることが周知である。この方法もしくはその他
の似かよった方法によって又は当業界に公知のランダム
突然変異誘発によって導入されたＢＶＤウィルス核酸内
の突然変異誘発は、得られるウィルスの少なくとも一の
主要生物学的特徴がそれが誘導されたウィルスのそれと
実質的に同一である限り、本発明に包括される。詳しく
は、感染力の観点でＢＶＤｄＮ１の特徴を実質的に改変
しない突然変異は本発明の範囲に属する。

【００２６】突然変異させたＢＶＤｄＮ１核酸はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションから得られた
ＢＶＤのナショナル・アニマル・ディシーズ・ラボラト
リー（国立動物疾患研究所）（ＮＡＤＬ）株（ＶＲ−５
３４）に由来する。これを下記の実施例に記載の通りに
してベクターの中に組込み、そして全長Ｎ^pro プロテア
ーゼ遺伝子を選択的ＰＣＲにより欠失させ、そして再ラ
イゲーションさせる。この手順はウィルスゲノム及び最
終的にはウィルス自体を得るために利用できるか、ｐＢ
ＶＤｄＮ１と命名した完全ＢＶＤｄＮ１ゲノム配列を含
むプラスミドをＡＴＣＣ No. ２０３３５４として寄託
し、そしてこれが単離手順のための好適な起源とされ
る。標準的な方法論がプラスミドを増幅及び精製し、そ
してそれをウィルス生産を支持できる宿主細胞にトラン
スフェクションするのに利用できる。プラスミド増幅の
ために好適な原核宿主細胞はＥ．コリＳＴＢＬ２細胞
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬより入手可能）であるが、その他
の細胞タイプも利用できうる。このウィルスは真核細
胞、例えばＲＤ又はＭＤＢＫ細胞において生産されるこ
とができ、公知の技術、例えばスクロース勾配遠心分離
を利用して高度に精製された形態でそれから単離でき、
そしてワクチンにおいて又は抗体を作製するために利用
される。他方、ＢＶＤｄＮ１ゲノム配列を単離するため
にプラスミドを使用でき、そしてこれは抗体又はワクチ
ンの作製に直接使用できる。

【００２７】Ｂ．その他の弱毒化ＢＶＤウィルス株の作
製 ＢＶＤｄＮ１ウィルス及びゲノム核酸を作製するために
利用する同じ基本的な手順をＢＶＤのその他の野生型株
に関して利用できる。各ケースにおいて、野生型ウィル
スを単離し、そして弱毒化はＮ^pro プロテアーゼ遺伝子
の不活性化により成し遂げられる。これは好ましくはＢ
ＶＤｄＮ１について本明細書の中で論ずるＰＣＲベース
戦略を利用して全体遺伝子を欠失させることにより成し
遂げられる。しかしながら、例えば配列の一部の欠失又
はランダムにもしくは特定の部位での突然変異の導入に
より遺伝子を不活性化させるその他の方法も利用できう
る。全てのケースにおいて、その目的は感染後ゆっくり
とした速度で増幅する突然変異ウィルスの提供にある。
実施例の欄に記載の通り、ウィルスの感染力はＢＶＤウ
ィルスに特異的なモノクローナル抗体を利用する免疫組
織化学の実施によりｉｎ ｖｉｔｒｏで決定できうる。

【００２８】Ｃ．弱毒化ＢＶＤウィルスに対する抗体の
作製 ＢＶＤウィルスに対する抗体は抗体の生産のために一般
的に利用されている任意の動物、例えばマウス、ウサギ
等において生産されうる。しかしながら、抗体は反芻動
物において生産するのが好ましい。当該ウィルスを含む
組成物は動物に任意のルートにより投与してよいが、典
型的には動物に筋肉的、皮下又は静脈内注射する。一般
に、ウィルス調製物はアジュバント、例えばフロインド
の完全又は不完全アジュバントを含むであろう。注射の
ために適当な調製物、注射のスケジュール等は当業界に
おいて周知であり、そして採用されうる（例えば、Harl
owら、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, N.Y.(1988) ; Klein, Immunology
: The Science of Self-Nonself Discrimination(198
2) を参照のこと。モノクローナル抗体は標準の手順を
利用しても調製できる（Kennett ら、Monoclonal Antib
odies and Hybridomas : A New Dimension in Biologic
al Analyses (1980) ; Campbell,「Monoclonal Antibod
y Technology」Laboratory Techniques in Biochemistr
y and Molecular Biology (1984)) 。

【００２９】ＢＶＤウィルスに対して特異性をもって反
応する抗体又は抗体のフラグメント（即ち、任意のその
他のタイプのウィルスと比べＢＶＤに対して１００倍以
上の親和力を有するもの）が任意の様々なイムノアッセ
イに利用できる。例えば、抗体は「二部位」又は「サン
ドイッチ」アッセイとしても知られるラジオイムノアッ
セイ又はイムノメトリーアッセイにおいてＢＶＤウィル
スを検定するために利用できる（Chard 「An Introduct
ion to Radioimmune Assay and Related Techniques 」
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecula
r Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (197
8)を参照のこと）。典型的なイムノメトリーアッセイに
おいて、所定量の未ラベル抗体を検査する流体、例えば
血液、リンパ液、細胞エキス等の中で不溶性である固相
支持体に結合させる。固定化抗体に対する抗原の一次結
合の後、所定量の検出可能式にラベルした第二抗体（こ
れは最初のものと同一でもそうでなくてもよい）を加
え、抗原の検出及び／又は定量を行う（例えば、Radioi
mmune Assay Methods, Kirkhamら編 pp.199-206, E &S
Livingstone Edinburgh (1970) 参照のこと）。このよ
うなタイプのアッセイの数多くの変法が当業界において
公知であり、そしてＢＶＤウィルスの検定のために採用
できうる。

【００３０】Ｄ．汎用ワクチン及び種痘手順 ＢＶＤウィルスを利用するワクチン及び種痘手順は数多
くの文献において論じられている（例えば、Fernelius
ら、Am. J. Vet. Res. 33 : 1421-1431 (1972); Kolar
ら、Am. J. Vet. Res. 33 : 1415-1420 (1972) ; McClu
rkinら、Arch.Virol. 58 : 119 (1978) ; Cogginsら、C
ornell Vet. 51 : 539 (1961) ; Phillips ら、Am. J.
Vet. Res. 36 : 135 (1975) ; Lobmannら、Am. J. Vet.
Res. 45 : 2498 (1984) ; Coria ら、Can. J. Comp. M
ed. 42 : 239 (1978) ; Martinら、Proceedings of the
Conference Res. Workers Anim. Dis. 75 : 183 (199
4) ; 及び米国特許第４，６１８，４９３号参照のこ
と）。典型的には、ワクチンは０．５〜５mlの容量にお
いて約１×１０⁶ 〜約１×１０⁸ 個のウィルス粒子を獣
医学的に許容される担体と共に含むであろう。処方は例
えばRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publ
ishing Co., Easton, Pa、第16版、(1982)）に記載の方
法を利用して実施することができる。本発明は様々な賦
形剤及びアジュバントに適応し、そしてこれらは所望す
るなら調製物の中に組込んでよい。例えば、本発明のワ
クチン組成物は標準のバッファー、担体、安定剤、希釈
剤、保存剤及び可溶化剤を利用して許容の方式に従って
処方でき、そしてまた持放性を促進するために処方でき
うる。希釈剤には水、食塩水、デキストロース、マンニ
トール、ソルビトール及びラクトースがとりわけ挙げら
れる。安定剤にはとりわけアルブミンが挙げられる。ア
ジュバントの非限定的な例にはＲＩＢＩアジュバント系
（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、みょうばん、水酸化アルミニ
ウムゲル、水中油エマルション、油中水エマルション、
例えばフロインドの安全及び不完全アジュバント、ブロ
ックコポリマー（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ Ｇ
Ａ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌ
ｅ ＣＡ）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバン
ト、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉ
ｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅ ＭＡ）又はその他のサポニン画分、モノホスホリル
脂質Ａ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバント、
Ｅ．コリ由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換体
等）、コレラ毒素又はムラミルジペプチドがとりわけ挙
げられる。このワクチンは更に１又は複数種のその他の
免疫調節因子、例えばインターロイキン、インターフェ
ロン又はその他のサイトカインを含んで成ってよい。ワ
クチンは一般に非経口投与のためにデザインされるであ
ろうが、本発明はその他の投与方式、例えば経口、鼻
内、筋肉内、リンパ節内、皮内、腹腔内、皮下、直腸も
しくは経膣投与による、又は併合ルートによる投与方式
にも適応する。当業者は選定のルートに従ってワクチン
組成物を容易に処方できるであろう。

【００３１】免疫化手順は当業界に周知の手順を利用し
て最適化できる。一回の投与を動物に対して施してよい
が、又は２〜１０日の間隔をあけて２回以上の接種をワ
クチンで施してもよい。所望するなら、接種を施した動
物から血清を集め、そしてＢＶＤウィルスに対する抗体
の存在について検査してよい。「免疫応答の誘導」なる
語等は本明細書では広義に、種痘に応答する反芻動物に
おける任意の免疫を基礎とする応答、例えば抗体もしく
は細胞媒介型免疫応答、又はその両者であってＢＶＤウ
ィルスに対する種痘を施した動物の保護を担うものを含
む。「保護免疫」、「保護免疫応答」、「保護」等の語
は反芻動物におけるウシウィルス性下痢の絶対的予防、
又はＢＶＤウィルスによる反芻動物の感染症の絶対的予
防のみならず、種痘を施していない感染コントロール動
物において認められるものと比較して、病原体による感
染の度合もしくは率の任意の低下、又は病原体による感
染に由来する病気の症度もしくは任意の症状もしくは状
況の任意の低下をも意味する。

【００３２】Ｅ．ＤＮＡワクチン 核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）を利用するワクチン及び種
痘手順を説明している文献には米国特許第５，７０３，
０５５号、同５，５８０，８５９号、同５，５８９，４
６６号、国際特許出願公報ＷＯ９８／３５５６２並びに
様々な科学文献、例えばRamsayら、1997, Immunol. Cel
l Biol. 75 : 360-363 ; Davis, 1997,Cur. Opinion Bi
otech. 8 : 635-640 ; Manickanら、1997, Critical Re
v. Immunol. 17 : 139-154 ; Robinson, 1997, Vaccine
15 (8) : 785-787 ; Robinsonら、1996, AIDS Res. Hu
m. Retr. 12 (5) : 455-457 ; Lai and Bennett, 1998,
Critical Rev. Immunol. 18 : 449-484；及びVogel and
Sarver, 1995, Clin.Microbiol. Rev. 8 (3) : 406-41
0 が挙げられる。これらは引用することで本明細書に組
入れる。このような手順は、核酸がＢＶＤｄＮ１核酸に
対応しているＢＶＤウィルスに対するワクチンを作るた
め、又はそのＮ^pro プロテアーゼ遺伝子もしくはその縮
重変異体の不活性により弱毒化されている類似のＢＶＤ
ウィルスゲノムを反芻動物に投与するために利用できう
る。このような核酸分子を含むベクターも利用できう
る。このようにして導入した免疫原は一般に体液及び細
胞媒介型免疫応答を誘導する。

【００３３】弱毒化ＢＶＤウィルスゲノムをコードする
ＤＮＡ又はＲＮＡをワクチンに利用できる。このＤＮＡ
又はＲＮＡ分子は「むき出し」状で存在していてよく、
又は細胞取り込みを促進する因子（例えばリポソーム又
は陽イオン脂質）と共に投与してよい。典型的な投与ル
ートは約０．１〜約５mlのワクチンの筋肉内注射であろ
う。ワクチン中の総ポリヌクレオチドは一般に約０．１
μｇ／ml〜約５．０mg／mlとすべきであろう。ポリヌク
レオチドは懸濁物、溶液又はエマルションの一部として
存在していてよいが、水性担体が一般に好ましい。免疫
は一回の接種の結果、又は複数回の接種により達成され
うる。所望するなら、血清を接種を施した動物から集
め、そしてＢＶＤウィルスに対する抗体の存在を検定し
てよい。

【００３４】以下の実施例は例示にすぎず、本発明の範
囲を限定するものではない。

【００３５】

【実施例】例１：アッセイ及び実験方法 ＤＮＡ 感染性全長クローンｐＶＶＮＡＤＬを図１に模式的に示
す。このプラスミドはｐＧＥＭ４（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ
ｏｒｐ．）由来のＣｏｌＥ１レプリコンを含み、そして
長さ１４，５７８bpである（Vassilevら、J. Virol. 71
: 471-478 (1997))。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターはＢＶＤウィルスゲノムの上流に挿入されてお
り、そしてこのプロモーターはウィルス性ＲＮＡ合成を
指令できる。ＢＶＤウィルスゲノムの配列はＢＶＤウィ
ルスのＮＡＤＬ株（ＡＴＣＣ ＶＲ−５３４）から誘導
した。

【００３６】Ｅ．コリにおけるｐＶＶＮＡＤＬの増幅 一般に、Ｅ．コリ内での全長ｐＶＶＮＡＤＬクローンの
増幅は困難であることが証明されている。Ｅ．コリ内で
の増殖の際の長いペスチウィルスｃＤＮＡ及び全長クロ
ーンの有害な効果が今まで認識されていた（Moormann
ら、J. Virol. 70: 763-770 (1996) ; Rugglie ら、J.
Virol. 70 : 3478-3487 (1996))。ｐＶＶＮＡＤＬの安
定性をＥ．コリＪＭ１０９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；
ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）；及びＳＴＢＬ２細胞
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）等のいくつかの細菌宿主で試験
した。このような株のそれぞれにおけるプラスミドＤＮ
Ａの形質転換の後、コロニーサイズをモニターし、そし
て大まかなプラスミド構造を制限マッピングにより分析
した。最良の結果はＳＴＢＬ２細胞により得られた。こ
のような細胞へのｐＶＶＮＡＤＬの形質転換は比較的均
質な小コロニー集団を供し、制限増殖条件下（３０℃で
２０時間以内）でＤＮＡ転位の徴候はなく、妥当なＤＮ
Ａ収量が得られた。

【００３７】ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及びＲＮＡトランス
フェクション ＲＮＡ転写体をＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ試薬（Ａｍｂｉｏ
ｎ）を用い、その製造者のプロトコールに従ってＴ７
ＲＮＡポリメラーゼによりｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し
た。ｐＶＶＮＡＤＬ ＤＮＡ鋳型をＳａｃIIで線形に
し、そしてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して３′突
き出しを除去した。転写反応生成物をゲル電気泳動によ
り分析した。１〜５μｇの転写ＲＮＡを６μｇのＬｉｐ
ｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含む２００μ
ｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に加え、そ
してＲＮＡ／脂質サンプルを室温で１０〜１５分インキ
ュベーションした。その間、６ウェルプレート中で増殖
させたＭＤＢＫ（ＭａｄｉｎＤａｒｂｙウシ腎細胞（ク
ローン６））又はＲＤ（安定形質転換ウシ精巣細胞系）
単層（集密度５０〜６０％）をＲＮＡ非含有ＰＢＳで２
回、そしてＯｐｔｉ−ＭＥＭで１回洗った。最後の洗浄
の後、トランスフェクション混合物を各ウェルに加え、
それを室温で１０分間軽く揺らしながらインキュベーシ
ョンした。次いでそのウェルに１mlのＯｐｔｉ−ＭＥＭ
を加え、そして３７℃で更に３時間インキュベーション
した。５％の胎児ウマ血清（ＲＤ細胞用）又は脂質ウシ
血清（ＭＤＢＫ細胞）を含む３mlの容量のＯｐｔｉ−Ｍ
ＥＭを各ウェルに加えた。３７℃で１〜４日間のインキ
ュベーションの後、細胞を８０％のアセトンで固定し、
そして免疫組織化学アッセイを実施してＢＶＤウィルス
プラークの視覚化を助長した。

【００３８】例２：Ｎ^pro 遺伝子欠失ＢＶＤウィルスク
ローンの構築 Ｎ^pro 遺伝子がそのゲノムから欠失したＢＶＤウィルス
を構築するため、まず３つのＤＮＡフラグメントを作製
し、次いで互いとライゲーションさせた。正確な手順は
下記の通りである。

【００３９】ＰＣＲフラグメントＩの作製 Ｎ^pro のコード配列の欠失を含むように「ＰＣＲフラグ
メントＩ」をデザインした。３回のＰＣＲ増幅をこのフ
ラグメントの作製に包含させた。第一の増幅において
は、プライマー５ＮＴＲ３（＋）及び５ＮＴＲ４（−）
をＮ^pro コード配列の上流の５′ＮＴＲ領域の片側を増
幅するために用いた。５′ポジティブセンスプライマー
５ＮＴＲ３（＋）は次の配列を有する：５′aaaggtctcg
agatgccacg−３′（オリゴヌクレオチド２１８−２３
７，SEQ ID NO : ２）。３′ネガティブセンスプライマ
ー５ＮＴＲ４（−）は次の配列を有する：５′−gtctga
catgtgccatgtacagcagagatttttagtagc −３′（オリゴヌ
クレオチド８９５−８９０＋３８８−３５６，SEQ ID N
O : ３）。両プライマーはウィルスゲノムの５′ＮＴＲ
領域に位置し、そしてプライマー５ＮＴＲ３（＋）は固
有の制限酵素部位ＸｈｏＩを含む。プライマー５ＮＴＲ
４（−）はその５′末端において６個の追加オリゴヌク
レオチドを含み、それはＢＶＤウィルスＣプロテインの
コード配列の５′末端と相同性である。ＰＣＲ増幅はプ
ライマーを０．５μＭの最終濃度において、鋳型として
の１０ngのプラスミドｐＶＶＮＡＤＬ ＤＮＡ及び２．
５単位のＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて実施した。
下記の条件を利用して２０サイクルの増幅を実施した：
９４℃で３０秒の変性；５５℃で１分のアニーリング；
及び７２℃で２分の伸長。アガロースゲル電気泳動によ
る精製の後、得られる１７７塩基対フラグメント（フラ
グメントＡ）をＴＥバッファーの中に再懸濁した。

【００４０】第二のＰＣＲ増幅はＮ^pro コード配列の下
流のフラグメントを増幅するためのプライマーとしてオ
リゴヌクレオチドＮＡＤＬＣ６（＋）及びＳｅｑ２３
（−）を用いて実施した。５′ポジティブセンスプライ
マーＮＡＤＬＣ６（＋）は次の配列を有する：５′−ca
catgtcagacacgaaagaagagggagc −３′（オリゴヌクレオ
チド３８３−３８８＋８９０−９１３，SEQ ID NO :
４）。３′ネガティブセンスプライマーＳｅｑ２３
（−）は次の配列を有する：５′caggtttgcaatccaagtgc
cc−３′（オリゴヌクレオチド２４８０−２４５９，SE
Q ID NO : ５）。プライマーＮＡＤＬＣ６はタンパク質
ＣのＮ末端に位置する。それは５′ＮＴＲの３′末端に
相同性な３個の追加のヌクレオチドを含み、そして開始
コドンＡＴＧは５′末端に位置する。プライマーＳｅｑ
２３（−）はタンパク質Ｅ２のＮ末端付近に位置する。
プラスミドｐＶＶＮＡＤＬを増幅反応における鋳型とし
て用い、そして条件は前述のものと同じとした。得られ
るＤＮＡフラグメント（フラグメントＢ）はアガロース
ゲル電気泳動により精製し、そして１５９６bpのサイズ
を有した。

【００４１】第三の増幅はオリゴヌクレオチド５′ＮＴ
Ｒ３（＋）（SEQ ID NO : ２）及びＳｅｑ２３（−）
（SEQ ID NO : ５）をプライマーとして０．５μＭの濃
度で、鋳型としてフラグメントＡ及びＢ（０．５μ
ｇ）、並びに２．５単位のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を
用いて実施した。最初の４サイクルの増幅については条
件は次の通りとした：９４℃で３０秒の変性、４０℃で
１分のアニーリング；及び７２℃で２分の伸長。これに
次の条件の２０回のサイクルを続けた：９４℃で３０秒
の変性；６０℃で１分のアニーリング；及び７２℃で２
分の伸長。これは１７６７bpのサイズを有する「ＰＣＲ
フラグメントＩ」と命名する最終生成物を供した。この
フラグメントをＸｈｏＩ及びＰｖｕＩで消化し、ライゲ
ーションの前に利用する１１７５bpのフラグメントを形
成した。

【００４２】ＰＣＲフラグメントIIの作製 「ＰＣＲフラグメントII」はプライマーとしてオリゴヌ
クレオチドＳｅｑ２（＋）及びＳｅｑ２４（−）を用い
て作製した。５′ポジティブセンスプライマーＳｅｑ２
（＋）の配列は下記の通りである：５′−ggagcatacgct
gcttcccc−３′（オリゴヌクレオチド１８６５−１８８
４，SEQ ID NO : ６）。３′センスプライマーＳｅｑ２
４（−）は次の配列を有する：５′gccttgcctatgagggaa
tgg −３′（オリゴヌクレオチド２９６３−２９４２，
SEQ ID NO : ７）。オリゴヌクレオチドＳｅｑ２（＋）
はＥ１のＮ末端付近に位置し、そしてオリゴヌクレオチ
ドＳｅｑ２４（−）はＥ２領域の中央付近に位置する。
増幅は鋳型としてプラスミドｐＶＶＮＡＤＬ ＤＮＡを
用い、フラグメントＡ及びＢを利用する増幅との関連で
上記した条件で実施した。「ＰＣＲフラグメントII」と
命名する得られるフラグメントは１０９８bpのサイズを
有した。それをＰｖｕＩ及びＲｓｒIIで消化し、ライゲ
ーションの前に利用する長さ９２９bpのフラグメントを
形成した。

【００４３】ベクターフラグメントIII の作製 １４５７９bpのプラスミドｐＶＶＮＡＤＬをＸｈｏＩ及
びＲｓｒIIで消化し、長さ１１９７４bpのフラグメント
を得た。これを「ベクターフラグメントIII 」と命名し
た。

【００４４】プラスミドｐＢＶＤｄＮ１の作製 ＰＣＲプラスミドＩ及びII並びにベクターフラグメント
III を２：２：１の分子比で一緒に混合し、そして２０
０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で１６℃で一夜かけてライゲーシ
ョンした。このライゲーション生成物を次にＥ．コリＳ
ＴＢＬ２細胞に形質転換し、そして異種コロニーをミニ
ーＤＮＡ精製及び特異的制限酵素分析によりスクリーニ
ングした。予測のサイズ（１４０７９bp）を有するプラ
スミドを配列分析により更に分析した。得られるプラス
ミドｐＢＶＤｄＮ１を図１Ｂに示し、そしてＢＶＤウィ
ルスゲノムからのＮ^pro プロテアーゼ遺伝子の予測の欠
失を含んだ。ｐＢＶＤｄＮ１についてのベクターバック
グランドはｐＶＶＮＡＬについてのそれと同じである。

【００４５】例３：Ｎ^pro 遺伝子欠失ＢＶＤウィルスク
ローンの特性決定 Ｎ^pro 遺伝子欠失ＢＶＤウィルスクローンｐＢＶＤｄＮ
１の感染能 ｐＢＶＤｄＮ１及びｐＶＶＮＡＤＬ（陽性コントロー
ル）由来のＲＮＡを前述の通りにしてｉｎ ｖｉｔｒｏ
で合成し、そしてＲＮＡトランスフェクションをＲＤ細
胞単層に対してＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎを用いて実施し
た。トランスフェクションして４８，７２及び９６時間
後、上清液をトランスフェクション化細胞から集め、そ
して新たなＲＤ単層を再感染するのに用いた。トランス
フェクション化細胞を８０％のアセトンで固定し、次い
でＶｅｃｔａｓｔａｉｎ ＥｌｉｔｅＡＢＣキット（Ｖ
ｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて免疫
組織化学アッセイを実施した。ＢＶＤ特異的ウィルスタ
ンパク質を検定するために用いたモノクローナル抗体は
１５Ｃ５（ＥＯに対して特異的）及びＣＡ３（Ｅ２に対
して特異的）（ファイザー社内）としたが、これらの抗
原に対して生起させたその他のモノクローナル抗体が標
準の技術により調製でき、そしてこれらと同じ手順に用
いることができる。これらの抗体は１：１０００の希釈
率で使用した。エンベロープタンパク質Ｅ０及びＥ２が
検出され、そしてウィルスは親ウィルスに由来するＲＮ
Ａによるトランスフェクションの２４時間後に生産され
た。対照的に、ウィルスタンパク質Ｅ０及びＥ２はｐＢ
ＶＤｄＮ１に由来するＲＮＡで処理した細胞においてト
ランスフェクション後４８時間目にはじめて検出され
た。ＢＶＤｄＮ１ウィルスはトランスフェクション後７
２時間まで取り出すことができなかった。

【００４６】表現型分析 早期継代ＢＶＤｄＮ１ウィルスストック（３継代目）を
ＲＤ及びＭＤＢＫ細胞単層の接種のために用いた。これ
らの細胞を親ウィルスを接種したコントロールと比較し
た。細胞単層をトランスフェクション後２０時間（ＲＤ
細胞）目又はトランスフェクション後２４時間（ＭＤＢ
Ｋ細胞）目において８０％のアセトンで固定した。固定
細胞を次にＥ２特異的モノクローナル抗体ＣＡ３により
１：１０００の希釈率で免疫組織化学により分析し、そ
して顕微鏡観察した。両方の細胞タイプについて、親ウ
ィルス複製がＢＶＤｄＮ１ウィルスにより示される複製
速度よりも有意に速いことが認められた。

【００４７】ゲノタイプ分析 親ウィルス及びＢＶＤｄＮ１（３継代目）の双方のＲＮ
ＡをＵｌｔｒａｓｐｅｃ（商標）ＲＮＡ試薬（Ｂｉｏｔ
ｅｃｔ）を用い、その製造業者の仕様書に従って感染Ｒ
Ｄ単層から精製した。ＲＴ／ＰＣＲ実験をＲＴ−ＰＣＲ
ビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）並びに
オリゴヌクレオチドＮＡＤＬＥ０７（−）及び５ＮＴＲ
３（＋）を用いて実施した。５ＮＴＲ３（＋）オリゴヌ
クレオチドの配列及び位置は前述の通りである。オリゴ
ヌクレオチドＮＡＤＬＥ０７（−）の配列は下記の通り
である：５′−cacttgcatccatcatacc −３′（ネガティ
ブセンス、オリゴヌクレオチド１３７９−１３６１，SE
Q ID NO : ８）。このオリゴヌクレオチドはＥＯのＮ′
末端から約１５０bpに位置する。親ＲＮＡ由来のＲＴ／
ＰＣＲはサイズが１１６２bpのフラグメントを生み出す
ことが認められた。ＢＶＤｄＮ１ ＲＮＡ由来のＲＴ／
ＰＣＲはサイズ６６１bpのフラグメントを生み出し、こ
れはＮ^pro プロテアーゼ遺伝子が欠失したフラグメント
について予想された通りである。親及びＢＶＤｄＮ１
ＲＮＡの双方から作製したＲＴ／ＰＣＲフラグメントを
配列決定した。双方のケースにおいて、得られた配列は
予測通りであり、そして図１に示す要素の配位と対応し
た。ＢＶＤｄＮ１の完全配列をSEQ ID NO : １において
nt３９〜１２１１６で示す。

【００４８】例４：ＢＶＤｄＮ１効能研究 本研究の目的はＢＶＤｄＮ１を含んで成るワクチンの子
ウシにおけるセロコンバーションを及ぼす能力の評価に
ある。１５頭の動物（１０頭は２投与種痘、そして５頭
は対照（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ））をランダムに第一室に割
り当てた。他に１０頭の動物を第二室に割り当てた（１
投与種痘、対照なし）。ＢＶＤｄＮ１ウィルスを動物
に、２．０mlのＭＤＢＫ細胞リゼート中で１０⁷ ＴＣＩ
Ｄ₅₀／動物の用量にて皮下投与した。免疫する日に、５
頭の表示した対照動物をそれらの室から取り出した。残
りの１０頭の子ウシによりＢＶＤｄＮ１ウィルスに種痘
した。免疫後約２４時間してから、対照動物を処置室に
もどした。２回目のワクチン投与を最初の１０頭の動物
に、１回目の投与の約２８日後に同じようにして施し
た。

【００４９】直腸温度を−１，０（種痘前），１，２，
３，４，５，６，７，８，９，１０日目（全グループ）
に、そして２７，２８，２９，３０，３１，３２，３
３，３４，３５，３６，３７及び３８日目（２投与グル
ープの動物）においてとった。血液サンプルを２投与グ
ループの動物から０日目並びにその後毎週（７，１４，
２１，２８，３５，４２，４９，５６，６３，７０，７
７，８４及び９１日目）採取した。１投与グループの動
物からは血液サンプルを０，７，１４，２１，２８，３
５，４２，４９，５６及び６３日目に採取した。

【００５０】期待の同族及び異種性保護を追跡するた
め、血清中和抗体をＳＮアッセイにより検定した（Ｉ型
についてはＢＶＤウィルス単離５９６０、そしてII型に
ついては単離体８９０）。

【００５１】一般観察又は直腸体温のいずれについても
有意な変動は認められなかった。どの対照動物も研究の
間セロコンバーションしなかった（データーは示さな
い）。

【００５２】ＢＶＤｄＮ１ウィルス種痘動物は全て、Ｉ
型血清中和アッセイによる決定に従い、セロコンバーシ
ョンした。一回の投与種痘の後、６０％の動物が２８日
目に１：８以上の陽性力価に達し；そして９０％の動物
が３５日目に１：８以上の陽性力価に達し、その後高力
価を保った（図２５Ａ）。II型血清中和アッセイにおい
ては、７０％の動物が種痘後６３日目に陽性に達した
（データーは示さない）。２投与種痘の後、動物は全て
Ｉ型血清中和アッセイにより示される通り７日目に１：
６４以上の陽性力価に達し、そしてその後類似のセロコ
ンバーションレベルを維持した（図２５Ａ）。II型血清
中和アッセイに関しては、ほとんどの動物が２回目の種
痘後７日目において陽性力価を有し、そして６０％以上
の動物が２８日目に１：８以上の陽性力価に達した（図
２５Ｂ）。これらの結果はＢＶＤｄＮ１ウィルスが反芻
動物において複製でき、そして１型及び２型ウィルスの
双方に関して陽性中和血清を誘導できることを示唆し、
これはこのウィルスのＢＶＤＶ予防のための種痘剤とし
ての利用を裏付する。

【００５３】生物材料の寄託 プラスミドｐＢＶＤｄＮ１はカメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）１０８０１ Ｕｎｉ
ｖｅｒｉｓｔｙ Ｂｌｖｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，
２０１１０，ＵＳＡに１９９８年１０月２０日に寄託
し、そして受託番号ＡＴＣＣ ２０３３５４が付与され
た。

【００５４】

【配列例】 SEQUENCE LISTING <110> PFIZER PRODUCTS INC <120> ATTENUATED FORMS OF BOVINE VIRAL DIARRHEA VIRUS <130> PC10435A <140> <141> <150> 60/107,908 <151> 1998-11-10 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 14078 <212> DNA <213> Bovine Viral Diarrhea Virus <400> 1 cacgcgtatc gatgaattcg ttaatacgac tcactatagt atacgagaat tagaaaaggc 60 actcgtatac gtattgggca attaaaaata ataattaggc ctagggaaca aatccctctc 120 agcgaaggcc gaaaagaggc tagccatgcc cttagtagga ctagcataat gaggggggta 180 gcaacagtgg tgagttcgtt ggatggctta agccctgagt acagggtagt cgtcagtggt 240 tcgacgcctt ggaataaagg tctcgagatg ccacgtggac gagggcatgc ccaaagcaca 300 tcttaacctg agcgggggtc gcccaggtaa aagcagtttt aaccgactgt tacgaataca 360 gcctgatagg gtgctgcaga ggcccactgt attgctacta aaaatctctg ctgtacatgg 420 cacatgtcag acacgaaaga agagggagca acaaaaaaga aaacacagaa acccgacaga 480 ctagaaaggg ggaaaatgaa aatagtgccc aaagaatctg aaaaagacag caaaactaaa 540 cctccggatg ctacaatagt ggtggaagga gtcaaatacc aggtgaggaa gaagggaaaa 600 accaagagta aaaacactca ggacggcttg taccataaca aaaacaaacc tcaggaatca 660 cgcaagaaac tggaaaaagc attgttggcg tgggcaataa tagctatagt tttgtttcaa 720 gttacaatgg gagaaaacat aacacagtgg aacctacaag ataatgggac ggaagggata 780 caacgggcaa tgttccaaag gggtgtgaat agaagtttac atggaatctg gccagagaaa 840 atctgtactg gcgtcccttc ccatctagcc accgatatag aactaaaaac aattcatggt 900 atgatggatg caagtgagaa gaccaactac acgtgttgca gacttcaacg ccatgagtgg 960 aacaagcatg gttggtgcaa ctggtacaat attgaaccct ggattctagt catgaataga 1020 acccaagcca atctcactga gggacaacca ccaagggagt gcgcagtcac ttgtaggtat 1080 gatagggcta gtgacttaaa cgtggtaaca caagctagag atagccccac acccttaaca 1140 ggttgcaaga aaggaaagaa cttctccttt gcaggcatat tgatgcgggg cccctgcaac 1200 tttgaaatag ctgcaagtga tgtattattc aaagaacatg aacgcattag tatgttccag 1260 gataccactc tttaccttgt tgacgggttg accaactcct tagaaggtgc cagacaagga 1320 accgctaaac tgacaacctg gttaggcaag cagctcggga tactaggaaa aaagttggaa 1380 aacaagagta agacgtggtt tggagcatac gctgcttccc cttactgtga tgtcgatcgc 1440 aaaattggct acatatggta tacaaaaaat tgcacccctg cctgcttacc caagaacaca 1500 aaaattgtcg gccctgggaa atttggcacc aatgcagagg acggcaagat attacatgag 1560 atggggggtc acttgtcgga ggtactacta ctttctttag tggtgctgtc cgacttcgca 1620 ccggaaacag ctagtgtaat gtacctaatc ctacattttt ccatcccaca aagtcacgtt 1680 gatgtaatgg attgtgataa gacccagttg aacctcacag tggagctgac aacagctgaa 1740 gtaataccag ggtcggtctg gaatctaggc aaatatgtat gtataagacc aaattggtgg 1800 ccttatgaga caactgtagt gttggcattt gaagaggtga gccaggtggt gaagttagtg 1860 ttgagggcac tcagagattt aacacgcatt tggaacgctg caacaactac tgctttttta 1920 gtatgccttg ttaagatagt cagggggcca gatggtacag ggcattctgt ggctactatt 1980 gataacaggg gtacaagggc acttggattg caaacctgaa ttctcgtatg ccatagcaaa 2040 ggacgaaaga attggtcaac tgggggctga aggccttacc accacttgga aggaatactc 2100 acctggaatg aagctggaag acacaatggt cattgcttgg tgcgaagatg ggaagttaat 2160 gtacctccaa agatgcacga gagaaaccag atatctcgca atcttgcata caagagcctt 2220 gccgaccagt gtggtattca aaaaactctt tgatgggcga aagcaagagg atgtagtcga 2280 aatgaacgac aactttgaat ttggactctg cccatgtgat gccaaaccca tagtaagagg 2340 gaagttcaat acaacgctgc tgaacggacc ggccttccag atggtatgcc ccataggatg 2400 gacagggact gtaagctgta cgtcattcaa tatggacacc ttagccacaa ctgtggtacg 2460 gacatataga aggtctaaac cattccctca taggcaaggc tgtatcaccc aaaagaatct 2520 gggggaggat ctccataact gcatccttgg aggaaattgg acttgtgtgc ctggagacca 2580 actactatac aaagggggct ctattgaatc ttgcaagtgg tgtggctatc aatttaaaga 2640 gagtgaggga ctaccacact accccattgg caagtgtaaa ttggagaacg agactggtta 2700 caggctagta gacagtacct cttgcaatag agaaggtgtg gccatagtac cacaagggac 2760 attaaagtgc aagataggaa aaacaactgt acaggtcata gctatggata ccaaactcgg 2820 acctatgcct tgcagaccat atgaaatcat atcaagtgag gggcctgtag aaaagacagc 2880 gtgtactttc aactacacta agacattaaa aaataagtat tttgagccca gagacagcta 2940 ctttcagcaa tacatgctaa aaggagagta tcaatactgg tttgacctgg aggtgactga 3000 ccatcaccgg gattacttcg ctgagtccat attagtggtg gtagtagccc tcttgggtgg 3060 cagatatgta ctttggttac tggttacata catggtctta tcagaacaga aggccttagg 3120 gattcagtat ggatcagggg aagtggtgat gatgggcaac ttgctaaccc ataacaatat 3180 tgaagtggtg acatacttct tgctgctgta cctactgctg agggaggaga gcgtaaagaa 3240 gtgggtctta ctcttatacc acatcttagt ggtacaccca atcaaatctg taattgtgat 3300 cctactgatg attggggatg tggtaaaggc cgattcaggg ggccaagagt acttggggaa 3360 aatagacctc tgttttacaa cagtagtact aatcgtcata ggtttaatca tagctaggcg 3420 tgacccaact atagtgccac tggtaacaat aatggcagca ctgagggtca ctgaactgac 3480 ccaccagcct ggagttgaca tcgctgtggc ggtcatgact ataaccctac tgatggttag 3540 ctatgtgaca gattatttta gatataaaaa atggttacag tgcattctca gcctggtatc 3600 tgcggtgttc ttgataagaa gcctaatata cctaggtaga atcgagatgc cagaggtaac 3660 tatcccaaac tggagaccac taactttaat actattatat ttgatctcaa caacaattgt 3720 aacgaggtgg aaggttgacg tggctggcct attgttgcaa tgtgtgccta tcttattgct 3780 ggtcacaacc ttgtgggccg acttcttaac cctaatactg atcctgccta cctatgaatt 3840 ggttaaatta tactatctga aaactgttag gactgataca gaaagaagtt ggctaggggg 3900 gatagactat acaagagttg actccatcta cgacgttgat gagagtggag agggcgtata 3960 tctttttcca tcaaggcaga aagcacaggg gaatttttct atactcttgc cccttatcaa 4020 agcaacactg ataagttgcg tcagcagtaa atggcagcta atatacatga gttacttaac 4080 tttggacttt atgtactaca tgcacaggaa agttatagaa gagatctcag gaggtaccaa 4140 cataatatcc aggttagtgg cagcactcat agagctgaac tggtccatgg aagaagagga 4200 gagcaaaggc ttaaagaagt tttatctatt gtctggaagg ttgagaaacc taataataaa 4260 acataaggta aggaatgaga ccgtggcttc ttggtacggg gaggaggaag tctacggtat 4320 gccaaagatc atgactataa tcaaggccag tacactgagt aagagcaggc actgcataat 4380 atgcactgta tgtgagggcc gagagtggaa aggtggcacc tgcccaaaat gtggacgcca 4440 tgggaagccg ataacgtgtg ggatgtcgct agcagatttt gaagaaagac actataaaag 4500 aatctttata agggaaggca actttgaggg tatgtgcagc cgatgccagg gaaagcatag 4560 gaggtttgaa atggaccggg aacctaagag tgccagatac tgtgctgagt gtaataggct 4620 gcatcctgct gaggaaggtg acttttgggc agagtcgagc atgttgggcc tcaaaatcac 4680 ctactttgcg ctgatggatg gaaaggtgta tgatatcaca gagtgggctg gatgccagcg 4740 tgtgggaatc tccccagata cccacagagt cccttgtcac atctcatttg gttcacggat 4800 gcctttcagg caggaataca atggctttgt acaatatacc gctagggggc aactatttct 4860 gagaaacttg cccgtactgg caactaaagt aaaaatgctc atggtaggca accttggaga 4920 agaaattggt aatctggaac atcttgggtg gatcctaagg gggcctgccg tgtgtaagaa 4980 gatcacagag cacgaaaaat gccacattaa tatactggat aaactaaccg catttttcgg 5040 gatcatgcca agggggacta cacccagagc cccggtgagg ttccctacga gcttactaaa 5100 agtgaggagg ggtctggaga ctgcctgggc ttacacacac caaggcggga taagttcagt 5160 cgaccatgta accgccggaa aagatctact ggtctgtgac agcatgggac gaactagagt 5220 ggtttgccaa agcaacaaca ggttgaccga tgagacagag tatggcgtca agactgactc 5280 agggtgccca gacggtgcca gatgttatgt gttaaatcca gaggccgtta acatatcagg 5340 atccaaaggg gcagtcgttc acctccaaaa gacaggtgga gaattcacgt gtgtcaccgc 5400 atcaggcaca ccggctttct tcgacctaaa aaacttgaaa ggatggtcag gcttgcctat 5460 atttgaagcc tccagcggga gggtggttgg cagagtcaaa gtagggaaga atgaagagtc 5520 taaacctaca aaaataatga gtggaatcca gaccgtctca aaaaacagag cagacctgac 5580 cgagatggtc aagaagataa ccagcatgaa caggggagac ttcaagcaga ttactttggc 5640 aacaggggca ggcaaaacca cagaactccc aaaagcagtt atagaggaga taggaagaca 5700 caagagagta ttagttctta taccattaag ggcagcggca gagtcagtct accagtatat 5760 gagattgaaa cacccaagca tctcttttaa cctaaggata ggggacatga aagaggggga 5820 catggcaacc gggataacct atgcatcata cgggtacttc tgccaaatgc ctcaaccaaa 5880 gctcagagct gctatggtag aatactcata catattctta gatgaatacc attgtgccac 5940 tcctgaacaa ctggcaatta tcgggaagat ccacagattt tcagagagta taagggttgt 6000 cgccatgact gccacgccag cagggtcggt gaccacaaca ggtcaaaagc acccaataga 6060 ggaattcata gcccccgagg taatgaaagg ggaggatctt ggtagtcagt tccttgatat 6120 agcagggtta aaaataccag tggatgagat gaaaggcaat atgttggttt ttgtaccaac 6180 gagaaacatg gcagtagagg tagcaaagaa gctaaaagct aagggctata actctggata 6240 ctattacagt ggagaggatc cagccaatct gagagttgtg acatcacaat ccccctatgt 6300 aatcgtggct acaaatgcta ttgaatcagg agtgacacta ccagatttgg acacggttat 6360 agacacgggg ttgaaatgtg aaaagagggt gagggtatca tcaaagatac ccttcatcgt 6420 aacaggcctt aagaggatgg ccgtgactgt gggtgagcag gcgcagcgta ggggcagagt 6480 aggtagagtg aaacccggga ggtattatag gagccaggaa acagcaacag ggtcaaagga 6540 ctaccactat gacctcttgc aggcacaaag atacgggatt gaggatggaa tcaacgtgac 6600 gaaatccttt agggagatga attacgattg gagcctatac gaggaggaca gcctactaat 6660 aacccagctg gaaatactaa ataatctact catctcagaa gacttgccag ccgctgttaa 6720 gaacataatg gccaggactg atcacccaga gccaatccaa cttgcataca acagctatga 6780 agtccaggtc ccggtcctat tcccaaaaat aaggaatgga gaagtcacag acacctacga 6840 aaattactcg tttctaaatg ccagaaagtt aggggaggat gtgcccgtgt atatctacgc 6900 tactgaagat gaggatctgg cagttgacct cttagggcta gactggcctg atcctgggaa 6960 ccagcaggta gtggagactg gtaaagcact gaagcaagtg accgggttgt cctcggctga 7020 aaatgcccta ctagtggctt tatttgggta tgtgggttac caggctctct caaagaggca 7080 tgtcccaatg ataacagaca tatataccat cgaggaccag agactagaag acaccaccca 7140 cctccagtat gcacccaacg ccataaaaac cgatgggaca gagactgaac tgaaagaact 7200 ggcgtcgggt gacgtggaaa aaatcatggg agccatttca gattatgcag ctgggggact 7260 ggagtttgtt aaatcccaag cagaaaagat aaaaacagct cctttgttta aagaaaacgc 7320 agaagccgca aaagggtatg tccaaaaatt cattgactca ttaattgaaa ataaagaaga 7380 aataatcaga tatggtttgt ggggaacaca cacagcacta tacaaaagca tagctgcaag 7440 actggggcat gaaacagcgt ttgccacact agtgttaaag tggctagctt ttggagggga 7500 atcagtgtca gaccacgtca agcaggcggc agttgattta gtggtctatt atgtgatgaa 7560 taagccttcc ttcccaggtg actccgagac acagcaagaa gggaggcgat tcgtcgcaag 7620 cctgttcatc tccgcactgg caacctacac atacaaaact tggaattacc acaatctctc 7680 taaagtggtg gaaccagccc tggcttacct cccctatgct accagcgcat taaaaatgtt 7740 caccccaacg cggctggaga gcgtggtgat actgagcacc acgatatata aaacatacct 7800 ctctataagg aaggggaaga gtgatggatt gctgggtacg gggataagtg cagccatgga 7860 aatcctgtca caaaacccag tatcggtagg tatatctgtg atgttggggg taggggcaat 7920 cgctgcgcac aacgctattg agtccagtga acagaaaagg accctactta tgaaggtgtt 7980 tgtaaagaac ttcttggatc aggctgcaac agatgagctg gtaaaagaaa acccagaaaa 8040 aattataatg gccttatttg aagcagtcca gacaattggt aaccccctga gactaatata 8100 ccacctgtat ggggtttact acaaaggttg ggaggccaag gaactatctg agaggacagc 8160 aggcagaaac ttattcacat tgataatgtt tgaagccttc gagttattag ggatggactc 8220 acaagggaaa ataaggaacc tgtccggaaa ttacattttg gatttgatat acggcctaca 8280 caagcaaatc aacagagggc tgaagaaaat ggtactgggg tgggcccctg caccctttag 8340 ttgtgactgg acccctagtg acgagaggat cagattgcca acagacaact atttgagggt 8400 agaaaccagg tgcccatgtg gctatgagat gaaagctttc aaaaatgtag gtggcaaact 8460 taccaaagtg gaggagagcg ggcctttcct atgtagaaac agacctggta ggggaccagt 8520 caactacaga gtcaccaagt attacgatga caacctcaga gagataaaac cagtagcaaa 8580 gttggaagga caggtagagc actactacaa aggggtcaca gcaaaaattg actacagtaa 8640 aggaaaaatg ctcttggcca ctgacaagtg ggaggtggaa catggtgtca taaccaggtt 8700 agctaagaga tatactgggg tcgggttcaa tggtgcatac ttaggtgacg agcccaatca 8760 ccgtgctcta gtggagaggg actgtgcaac tataaccaaa aacacagtac agtttctaaa 8820 aatgaagaag gggtgtgcgt tcacctatga cctgaccatc tccaatctga ccaggctcat 8880 cgaactagta cacaggaaca atcttgaaga gaaggaaata cccaccgcta cggtcaccac 8940 atggctagct tacaccttcg tgaatgaaga cgtagggact ataaaaccag tactaggaga 9000 gagagtaatc cccgaccctg tagttgatat caatttacaa ccagaggtgc aagtggacac 9060 gtcagaggtt gggatcacaa taattggaag ggaaaccctg atgacaacgg gagtgacacc 9120 tgtcttggaa aaagtagagc ctgacgccag cgacaaccaa aactcggtga agatcgggtt 9180 ggatgagggt aattacccag ggcctggaat acagacacat acactaacag aagaaataca 9240 caacagggat gcgaggccct tcatcatgat cctgggctca aggaattcca tatcaaatag 9300 ggcaaagact gctagaaata taaatctgta cacaggaaat gaccccaggg aaatacgaga 9360 cttgatggct gcagggcgca tgttagtagt agcactgagg gatgtcgacc ctgagctgtc 9420 tgaaatggtc gatttcaagg ggactttttt agatagggag gccctggagg ctctaagtct 9480 cgggcaacct aaaccgaagc aggttaccaa ggaagctgtt aggaatttga tagaacagaa 9540 aaaagatgtg gagatcccta actggtttgc atcagatgac ccagtatttc tggaagtggc 9600 cttaaaaaat gataagtact acttagtagg agatgttgga gagctaaaag atcaagctaa 9660 agcacttggg gccacggatc agacaagaat tataaaggag gtaggctcaa ggacgtatgc 9720 catgaagcta tctagctggt tcctcaaggc atcaaacaaa cagatgagtt taactccact 9780 gtttgaggaa ttgttgctac ggtgcccacc tgcaactaag agcaataagg ggcacatggc 9840 atcagcttac caattggcac agggtaactg ggagcccctc ggttgcgggg tgcacctagg 9900 tacaatacca gccagaaggg tgaagataca cccatatgaa gcttacctga agttgaaaga 9960 tttcatagaa gaagaagaga agaaacctag ggttaaggat acagtaataa 10010 gagagcacaa caaatggata cttaaaaaaa taaggtttca aggaaacctc 10060 aacaccaaga aaatgctcaa cccagggaaa ctatctgaac agttggacag 10110 ggaggggcgc aagaggaaca tctacaacca ccagattggt actataatgt 10160 caagtgcagg cataaggctg gagaaattgc caatagtgag ggcccaaacc 10210 gacaccaaaa cctttcatga ggcaataaga gataagatag acaagagtga 10260 aaaccggcaa aatccagaat tgcacaacaa attgttggag attttccaca 10310 cgatagccca acccaccctg aaacacacct acggtgaggt gacgtgggag 10360 caacttgagg cgggggtaaa tagaaagggg gcagcaggct tcctggagaa 10410 gaagaacatc ggagaagtat tggattcaga aaagcacctg gtagaacaat 10460 tggtcaggga tctgaaggcc gggagaaaga taaaatatta tgaaactgca 10510 ataccaaaaa atgagaagag agatgtcagt gatgactggc aggcagggga 10560 cctggtggtt gagaagaggc caagagttat ccaataccct gaagccaaga 10610 caaggctagc catcactaag gtcatgtata actgggtgaa acagcagccc 10660 gttgtgattc caggatatga aggaaagacc cccttgttca acatctttga 10710 taaagtgaga aaggaatggg actcgttcaa tgagccagtg gccgtaagtt 10760 ttgacaccaa agcctgggac actcaagtga ctagtaagga tctgcaactt 10810 attggagaaa tccagaaata ttactataag aaggagtggc acaagttcat 10860 tgacaccatc accgaccaca tgacagaagt accagttata acagcagatg 10910 gtgaagtata tataagaaat gggcagagag ggagcggcca gccagacaca 10960 agtgctggca acagcatgtt aaatgtcctg acaatgatgt acggcttctg 11010 cgaaagcaca ggggtaccgt acaagagttt caacagggtg gcaaggatcc 11060 acgtctgtgg ggatgatggc ttcttaataa ctgaaaaagg gttagggctg 11110 aaatttgcta acaaagggat gcagattctt catgaagcag gcaaacctca 11160 gaagataacg gaaggggaaa agatgaaagt tgcctataga tttgaggata 11210 tagagttctg ttctcatacc ccagtccctg ttaggtggtc cgacaacacc 11260 agtagtcaca tggccgggag agacaccgct gtgatactat caaagatggc 11310 aacaagattg gattcaagtg gagagagggg taccacagca tatgaaaaag 11360 cggtagcctt cagtttcttg ctgatgtatt cctggaaccc gcttgttagg 11410 aggatttgcc tgttggtcct ttcgcaacag ccagagacag acccatcaaa 11460 acatgccact tattattaca aaggtgatcc aataggggcc tataaagatg 11510 taataggtcg gaatctaagt gaactgaaga gaacaggctt tgagaaattg 11560 gcaaatctaa acctaagcct gtccacgttg ggggtctgga ctaagcacac 11610 aagcaaaaga ataattcagg actgtgttgc cattgggaaa gaagagggca 11660 actggctagt taagcccgac aggctgatat ccagcaaaac tggccactta 11710 tacatacctg ataaaggctt tacattacaa ggaaagcatt atgagcaact 11760 gcagctaaga acagagacaa acccggtcat gggggttggg actgagagat 11810 acaagttagg tcccatagtc aatctgctgc tgagaaggtt gaaaattctg 11860 ctcatgacgg ccgtcggcgt cagcagctga gacaaaatgt atatattgta 11910 aataaattaa tccatgtaca tagtgtatat aaatatagtt gggaccgtcc 11960 acctcaagaa gacgacacgc ccaacacgca cagctaaaca gtagtcaaga 12010 ttatctacct caagataaca ctacatttaa tgcacacagc actttagctg 12060 tatgaggata cgcccgacgt ctatagttgg actagggaag acctctaaca 12110 gcccccgcgg atctagagga gcatgcgacg tcaggtggca cttttcgggg 12160 aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 12210 tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 12260 aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 12310 ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 12360 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 12410 ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 12460 ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 12510 cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 12560 cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 12610 tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 12660 acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta 12710 accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 12760 ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 12810 tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 12860 cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 12910 agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 12960 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca 13010 ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 13060 gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 13110 cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 13160 ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 13210 gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 13260 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 13310 cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 13360 accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 13410 aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg 13460 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 13510 cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 13560 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 13610 cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 13660 gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 13710 cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 13760 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 13810 ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 13860 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 13910 tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 13960 tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 14010 ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc 14060 gaggaagcgg aagagcgc 14078 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 aaaggtctcg agatgccacg 20 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 3 gtctgacatg tgccatgtac agcagagatt tttagtagc 39 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 cacatgtcag acacgaaaga agagggagc 29 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 caggtttgca atccaagtgc cc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 ggagcatacg ctgcttcccc 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 gccttgccta tgagggaatg g 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 cacttgcatc catcatacc 19 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Bovine Viral Diarrhea Virus <400> 9 tgtacatggc acatgtcaga cacgaaa 27

【図面の簡単な説明】

【図１】パネルＡはプラスミドｐＶＶＮＡＤＬの模式図
を示す。このプラスミドは突然変異され、オープンリー
ディングフレームの第一遺伝子、即ち、Ｎ^pro プロテア
ーゼの遺伝子が欠失されている。得られる突然変異した
プラスミド生成物ｐＢＶＤｄＮ１をパネルＢに模式的に
示す。いくつかのその他の遺伝子領域も示す。Ｃはゲノ
ムＲＮＡをパッケージングし、そしてウィルス性ビリオ
ンを形成する構造コアタンパク質をコードする遺伝子を
表わす。これに３つのエンベロープ糖タンパク質をコー
ドする遺伝子、Ｅ０，Ｅ１及びＥ２が続く。Ｐ７は未知
の機能をもつ非構造タンパク質をコードし、それに「Ｎ
Ｓ２−挿入−ＮＳ３」と命名する領域が続く。ＮＳ２は
亜鉛フィンガーモチーフを有する高度に疎水性なタンパ
ク質をコードする。ＮＳ３は親水性であり、そして細胞
病理ＢＶＤウィルスのマーカーである。感染動物におけ
るｎｃｐウィルスの複製は、ＮＳ２とＮＳ３コード領域
との間での追加のウィルス性又は細胞性ＲＮＡ配列の挿
入が関与する遺伝子組換を通じてｃｐ生物型へとウィル
スを変換させることができる。組換の結果、遊離のＮＳ
２及びＮＳ３タンパク質が放出される。後者ＮＳ３は、
行われるほとんどの非構造タンパク質プロセシングを司
るプロテアーゼである。ＮＳ４ＡはＮＳ３の隣りに位置
し、そしてＮＳ３プロテアーゼ活性のための補因子をコ
ードすることで知られる。ＮＳ４Ａの後に、機能の未知
なウィルスタンパク質をコードする２種類の遺伝子ＮＳ
４Ｂ及びＮＳ５Ａがある。最後の遺伝子ＮＳ５ＢはＲＮ
Ａ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、そしてウィル
ス複製を司る。パネルＢに示すヌクレオチド配列（SEQ
ID NO : ９）はｐＢＶＤｄＮ１の開始コドンの周囲配列
である。

【図２】プラスミドｐＢＶＤｄＮ１の完全ヌクレオチド
配列の第１部である。ＢＶＤｄＮ１のゲノム配列はヌク
レオチド３９〜１２，１１６で示されている。

【図３】図２の続き。

【図４】図３の続き。

【図５】図４の続き。

【図６】図５の続き。

【図７】図６の続き。

【図８】図７の続き。

【図９】図８の続き。

【図１０】図９の続き。

【図１１】図１０の続き。

【図１２】図１１の続き。

【図１３】図１２の続き。

【図１４】図１３の続き。

【図１５】図１４の続き。

【図１６】図１５の続き。

【図１７】図１６の続き。

【図１８】図１７の続き。

【図１９】図１８の続き。

【図２０】図１９の続き。

【図２１】図２０の続き。

【図２２】図２１の続き。

【図２３】図２２の続き。

【図２４】図２３の続き。

【図２５】ＢＶＤｄＮ１ウィルスの投与に応答する反芻
動物におけるセロコンバーションを実証するデーター。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/19 1/21 1/21 7/04 5/10 15/00 ＺＮＡＡ 7/04 5/00 Ａ (72)発明者 マイケル ジョージ シェパード アメリカ合衆国，コネチカット 06359, ノースストニントン，キングスウッド ド ライブ 29 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA01 CA11 DA02 DA06 DA11 EA02 EA04 GA11 GA25 HA08 4B065 AA01X AA26X AA57X AA87X AA90X AA95Y AB01 AC20 BA02 BA16 BA24 CA45 4C085 AA03 AA13 BA51 BB11 CC23 DD62 GG01 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08 GG10

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ワクチンにおける使用のために適当なも
   のとするように単離された野生型ＢＶＤウィルスゲノム
   を修飾する方法であって、当該単離された野生型ウィル
   スのゲノム核酸を突然変異させてＮ^pro プロテアーゼ遺
   伝子を不活性化させることを含んで成る方法。
2. 【請求項２】 前記Ｎ^pro プロテアーゼ遺伝子の前記不
   活性化が ａ）前記野生型ＢＶＤウィルス由来のゲノムＲＮＡを逆
   転写させてｃＤＮＡを形成し； ｂ）段階ａ）のｃＤＮＡをクローニングし； ｃ）段階ｂ）でクローニングしたｃＤＮＡ内のＮ^pro プ
   ロテアーゼ遺伝子を突然変異させて当該遺伝子が完全に
   活性な遺伝子生成物を生産できなくなるようにし；そし
   て ｄ）段階ｃ）で突然変異させたｃＤＮＡをクローニング
   する；段階を含んで成る手順により達成される、請求項
   １記載の方法。
3. 【請求項３】 前記Ｎ^pro プロテアーゼ遺伝子を、前記
   野生型ＢＶＤウィルスゲノムからその配列の全て又はそ
   の一部を欠失させることにより不活性化させる、請求項
   ２記載の方法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の方法により作製したＢＶ
   Ｄウィルスゲノム。
5. 【請求項５】 請求項４記載のＢＶＤウィルスゲノムか
   ら本質的に成る独立の配列要素を含んで成るベクター。
6. 【請求項６】 請求項４記載のウィルスゲノム又は請求
   項５記載のベクターによりトランスフェクションされた
   宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項６記載の宿主細胞により生産され
   た子孫ＢＶＤウィルス。
8. 【請求項８】 請求項４記載のウィルスゲノム及び獣医
   学的に許容される担体を含んで成るワクチン。
9. 【請求項９】 ワクチンにおける使用のために適当なも
   のとするように野生型ＢＶＤウィルスを弱毒化する方法
   であって、当該ウィルスのゲノム核酸を突然変異させて
   Ｎ^pro プロテアーゼ遺伝子を不活性化させることを含ん
   で成る方法。
10. 【請求項１０】 前記弱毒化が ａ）前記野生型ＢＶＤウィルスを単離する； ｂ）段階ａ）で単離したウィルスのゲノム核酸をクロー
    ニングする； ｃ）段階ｂ）でクローニングしたゲノム核酸を突然変異
    させ、前記Ｎ^pro プロテアーゼ遺伝子を不活性化させ
    る；そして ｄ）段階ｃ）で突然変異させた核酸を宿主細胞に形質転
    換又はトランスフェクションして弱毒化ウィルスを供す
    る；段階を含んで成る手順により達成される、請求項９
    記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記Ｎ^pro プロテアーゼ遺伝子を、前
    記野生型ＢＶＤウィルスゲノムからその配列の全て又は
    その一部を欠失させることにより不活性化させる、請求
    項１０記載の方法。
12. 【請求項１２】 請求項９記載の方法により作製した弱
    毒化ＢＶＤウィルス。
13. 【請求項１３】 請求項１２記載の弱毒化ウィルスで感
    染された宿主細胞。
14. 【請求項１４】 前記宿主細胞がＭＤＢＫ細胞（ＡＴＣ
    Ｃ ＣＣＬ−２２）である、請求項１３記載の感染され
    た宿主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１４記載の宿主細胞により生産
    された子孫ウィルス。
16. 【請求項１６】 請求項１２記載の弱毒化ウィルス及び
    獣医学的に許容される担体を含んで成るワクチン。
17. 【請求項１７】 反芻動物（ｃａｔｔｌｅ）において免
    疫応答を誘導する方法であって、請求項８又は１６記載
    のワクチンをＢＶＤウィルスによるその後の感染に対す
    る保護免疫力を誘導するのに十分な用量で前記反芻動物
    に投与することを含んで成る方法。
18. 【請求項１８】 前記保護免疫力が体液性及び細胞媒介
    型免疫応答の双方に由来する、請求項１７記載の方法。
19. 【請求項１９】 抗体生産可能なヒトを除く動物におい
    てＢＶＤウィルスに対する抗体の生産を誘導する方法で
    あって、（ａ）請求項４記載のウィルスゲノム；（ｂ）
    請求項５記載のベクター；又は（ｃ）請求項１２記載の
    弱毒化ウィルスを当該抗体生産を誘導するのに有効な用
    量で当該動物に投与することを含んで成る、方法。
20. 【請求項２０】 前記抗体を反芻動物において生産させ
    る、請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記動物から前記抗体を単離すること
    を更に含んで成る、請求項１９記載の方法。