CN1254756A

CN1254756A - 减毒型牛病毒性腹泻病毒

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Publication number: CN1254756A
Application number: CN99123522A
Authority: CN
Inventors: X·M·曹; M·G·舍帕德
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: CN1510130A; US20030165520A1; US6410032B1; US6916477B2; JP3602759B2; BR9905352A; AR019250A1; US6168942B1; EP1013757A2; EP1013757A3; AU765792B2; TW585916B; HK1067383A1; JP3602841B2; NZ500925A; JP2003259885A; JP2000139482A; US6410299B1; ZA997011B; CA2287775A1

Abstract

本发明涉及一种使N^pro蛋白酶基因突变以获得牛病毒性腹泻病毒(BVD)的减毒形式的方法。该发明包括用该方法获得的减毒病毒,用这些病毒产生的抗体,及可用来对牛进行免疫的疫苗。

Description

减毒型牛病毒性腹泻病毒

本发明涉及通过使病毒基因组中一个特定基因失活而产生减毒型牛病毒性腹泻(BVD)病毒的方法。该减毒型病毒或突变的病毒基因组可用来产生抗BVD病毒抗体或作为疫苗防止牛发生病毒感染。

牛病毒性腹泻(BVD)病毒属于瘟病毒属和黄病毒类。它与可引起绵羊border病和猪典型性发热的病毒密切相关。被感染的牛可表现出“粘膜病”，其特征有体温升高、腹泻、咳嗽及消化道粘膜产生溃疡(Olafson等人，Cornell Vet.36：205-213(1946)；Ramsey等人，北美兽医学(North Am.Vet)34：629-633(1953))。BVD病毒可穿过孕牛胎盘，导致产生持续感染的新生小牛(Malmquist美国兽医医学联合会杂志(J.Am.Vet.Med.Assoc.188：618-619(1986))。这些小牛对病毒发生免疫耐受，一生都将产生持续的病毒血症。这些小牛易爆发粘膜病(Liess等人，Dtsch.Tieraerztl.wschr.81：481-487(1974))并极易受到导致如肺类、肠炎等疾病的微生物感染(Barker等人，兽医(Vet.Rec.)117：459-464(1985))。

按照带有两种不同生物类型将BVD病毒分类。有“cp”生物类型的病毒可诱导培养细胞发生细胞病变，而“ncp”生物类型病毒不具备此效应(Gillespie等人，Cornell Vet 50：73-79(1960))。另外，已识别两种主要的基因型(I型和II型)，二者都可产生一系列临床症状(Pellerin等人，病毒学(Virology)203：260-268(1994)；Ridpath等人，病毒学，205：66-74(1994))。

BVD基因组长约12.5kb，含有一个开放阅读框架，该框架位于5’和3’非翻译区(NTR)之间(Collet等人，病毒学165：191-199(1988))。从该框架可翻译约438KD的多聚蛋白，并在细胞和病毒蛋白酶作用下将其加工成病毒的结构和非结构蛋白(Tautz等人，病毒学杂志(J.virol)71：5415-5422(1977)；Xu等人，病毒学杂志，5312-71：5322(1977)；Elber等人，病毒学杂志，70：4131-4135(1996)；和Wiskerchen等人，病毒学184：341-350(1991)。参与该加工的病毒酶系有N^pro和NS3蛋白酶。N^pro是病毒开放阅读框架编码的第一个蛋白，可将自身从其余合成的多聚蛋白中切除(Stark等人，病毒学杂志67：7088-7093(1993)；Wiskerchen等人，病毒学65：4508-4514(1991))。

现有的BVD疫苗中的病毒是用化学方法灭活的(Mcclukin等人，Arch.Virol.58：119(1978)；Fernelius等人，美国兽医研究杂志(Am.J.Vet.Res.)33：1421-1431(1972)；和Kolar等人，美国兽医学研究杂志，33：1415-1420(1972)。一般需多次剂量给予这些疫苗以产生初级免疫，所产生的免疫效应作用短暂且不能防止胎体感染(Bolin，Vet.Clin.North.Am.Food Anim.Pract.11：615-625(1995))。曾有报道在绵羊中制备出以纯化的E2蛋白为基础的亚基疫苗(Bruschke等人，疫苗(vaccine)15：1940-1945(1997))。但是，只有一种此类疫苗可保护胎体免受感染，且该保护仅仅针对一株同源病毒。抗体效价与抗病毒感染力之间没有联系。

另外，可用BVD病毒来获得修饰过的活病毒(MLV)，通过在牛或猪细胞中反复传代(Coggins等人，Cornell Vet 51：539(1961)；和Pillips等人，美国兽医研究杂志，36：135(1975))或用化学诱变产生温度敏感的病毒表型达到使BVD病毒减毒之目的(Lobmann等人，美国兽医研究杂志，45：2498(1984)和(Lobmann等人，美国兽医研究杂志47：557-561(1986))。已证明单次剂量MLV疫苗在经接种的牛体内足以产生免疫效应，维持期可以是数年(Coria等人，Can.J.Con.Med.42：239(1978))。另外，有报道表明MLV型疫苗接种的小牛可产生交叉保护效应(Martin等人，动物疾病研究者大会论文(Proceedings of the Conference Res.Workers’Anim.Dis，)75：183(1994))。但是，使用这些疫苗有一主要问题就是安全性问题，比如病毒可能会转移到胎体(Bolin，Vet.Clin.North Am.Food Amim.Pract 11：615-625(1995))。

显然需要新的有效疫苗控制BVD病毒的传播。考虑到该病毒所致疾病是牛群中传播性最强、也最影响经济价值的疾病之一，此类疫苗在畜牧业中有重要意义。

本发明建立在下述发现基础上，该发现是使N^pro蛋白酶基因缺失或失活可得到减毒型BVD病毒。在牛细胞系中这些病毒比相应野生型病毒的感染力小得多，适于用作牛疫苗。在此公开了一个此类减毒病毒的全部基因组序列，以保藏号ATCC 203354号于美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏一种可编码该病毒的质粒即p BVDdN1。A.以BVDdN1减毒病毒为基础的组合物和方法

首先一个方面，本发明是以研究一种特定减毒BVD病毒株为基础的。野生型病毒基因组突变缺失N^pro蛋白酶基因后得到该株，其全长序列见SEQ ID NO：1和图2自第39～12116核苷酸所示。因此，本发明涉及一种病毒，该病毒基因组包括如所示序列并优选为基本上由所示序列组成。一般地，BVD具有RNA形式的病毒基因组。克隆后一般形式为DNA。除非特别指出，术语“核酸”指BVD病毒DNA和RNA序列。方便起见，序列表只列出DNA序列，对本领域技术人员而言相应RNA序列不难推及。术语“基本上由…组成”是指基本上与结构和功能均已明确的序列一样的序列。因此，本发明不仅包括明确表述的序列，也包括增加有非必需序列或导入非必需取代序列的相应序列。具体地，本发明包括编码与SEQ ID NO：1相同的BVD蛋白的简并核酸序列。方便起见，该序列，即SEQ ID NO：1自第39～12116核苷酸，及其编码的相应病毒被称为“BVDdN1”基因组和病毒。病毒可以是较粗制品的一部分，也可以基本上为纯化形式，即基本上无任何其它病毒类型的形式。

本发明包括携带有本发明中BVDdN1核酸分子的宿主细胞。术语“宿主细胞”包括任何带有BVDdN1核酸分子的原核细胞，及任何感染过病毒或带有BVDdN1核酸分子的真核细胞。原核细胞中，发现大肠杆菌(E.Coli)的STBL2株(GibcoBRL)扩增质粒效果最佳，一般优选该菌株。真核细胞中哺乳动物细胞的MDBK细胞(ATCC CCL-22)和RD细胞(稳定转化的牛睾丸细胞)一般为优选。然而也可用其它培养的细胞。本发明还包括此类宿主细胞产生的子代病毒。

可用有效剂量BVDdN1病毒感染动物诱导其产生抗体，该有效剂量是指可刺激抗体产生的足够剂量。正常用于此目的的任何动物类型(如小鼠、免、山羊、绵羊)都可产生此抗体，但优选在牛体内产生该抗体。在此所用的术语“抗BVD病毒抗体”是指与BVD病毒株的亲和力比任何其它非BVD病毒株高至少100倍的抗体。尽管非优选，还可在将病毒注入动物之前进行化学处理灭活病毒，包括如福尔马林、多聚甲醛、苯酚、乳丙酸盐、补骨脂素、铂复合体、臭氧或其它杂病毒剂。这些方法产生的抗体本身属于本发明范围内，可以用该领域已熟知的方法分离出抗体(见如：Harlow等人，抗体：实验手册(Antibodieo：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1988))。可把该抗体用于检测生物或实验室样本中的BVD的方法中。

另一方面，本发明涉及包含BVDdN1病毒和兽医可接受的载体的一种疫苗。该疫苗可包含一般用于该制品的任何佐剂及其它试剂。一定剂量下给牛施用该疫苗可诱导免疫反应，此剂量应足以诱导产生针对其后BVD病毒感染的保护性免疫反应。一般地，用非肠道途径施用疫苗，但其它给药方式也适合本发明。需要的话，定期如每隔2至8周进行两次或多次接种。可用本领域熟知的标准方法优化免疫步骤。B以BVDdN1基因组核酸为基础的组合物和方法

近来的工作表明，将编码免疫原的核酸注入动物体内来制备有效的疫苗是可能的。制备和施用这些“DNA疫苗”的方法已有详述(见如美国专利第5,589,466、5,580,859和5,703,055号专利)，而且可用于BVDdN1基因组核酸。因此，另一方面，本发明涉及一种核酸分子，优选为基本上纯的形式，该分子包括SEQID NO：1中自第39至12116核苷酸之间的序列，或其简并的变异体。在优选实施方案中，本发明涉及一种核酸分子，优选基本上纯的形式，该分子基本上由SEQ ID：NO：1中自第39至12116核苷酸之间的序列组成。如此处所述，“基本上纯的”是指所需产物基本上无杂质。例如，一种“基本上纯的”的核酸分子是指样品中基本上无其它杂质核酸分子，而且一般包括至少85％(重量)该核酸分子，优选更高的百分比。测定核酸纯度的一个方法是将制备物在基质如聚丙烯酰胺或琼脂糖中电泳。染色后若只出现单一区带则证明该分子是纯的。其它分析纯度的方法包括色谱法及分析离心。

可将BVDdN1基因组核酸作为独立密码元件连接到载体上。短语“独立的密码元件”指可翻译成病毒多肽且最终成为病毒的该载体上的一部分。它的独立在于它不包括任何其它可实质上改变BVDdN1产物的翻译元件。可用该载体，或BVDdN1核酸本身转染宿主细胞以获得减毒的子代病毒。

本发明还包括诱导抗BVD抗体产生的方法，该方法是通过将BVDdN1核酸或含有该核酸的载体直接注射入动物中。可用能产生抗体的任何动物，一般优选牛。此法制备的抗体属于本发明的一部分，而且可自动物中纯化并用于，如检测培养基或生物液体中是否存在BVD病毒的方法中。

在BVDdN1基因组核酸的基础上结合兽医可接受的载体可制备施用于牛的疫苗(见上述引用的参考文献)，在优化的免疫方案中用其诱导产生抗继后病毒感染的保护性免疫。C野生型BVD基因组突变方法

大体上，本发明涉及一种方法，以修饰来自基本上纯的野生型BVD病毒的基因组使之适于用作疫苗。此处所用术语“基本上纯”是指病毒制品，其优选地由单一BVD病毒株组成而无其它类型病毒存在。本方法主要突出的特点是使基因组突变以失活N^pro蛋白酶基因。本文中，如果没有产物产生(如基因缺失)，或产生的产物不再能行使正常生物功能(如蛋白水解切割)，或产生的产物虽有正常生物功能但效率明显下降的话，均被视为基因失活。可使用的能使N^pro蛋白酶失活的任何方法。例如，用标准方法从野生型BVD病毒分离出基因组RNA，逆转录形成cDNA后进行克隆。再用一些方法使N^pro蛋白酶基因引入突变，比如聚合酶链反应(PCR)、定点突变方法、合成及连接DNA片段以使N^pro部分或全部消除、或随机诱变技术包括，如接触本领域已知的化学诱变剂或射线，或者这些方法的组合。

一旦修饰BVD病毒基因组使N^pro基因失活，可将其克隆到合适的载体上并大量扩增。如上所述，载体应含有BVD序列，该序列作为一独立元件包含突变的野生型病毒序列，或基本上由突变野生型病毒序列组成。可将突变的BVD基因组或含有该基因组的载体转化或转染入宿主细胞，用于病毒核酸或病毒本身大量扩增。

如上有关BVDdN1基因组DNA所述，向动物施用由上述方法突变的任何野生型BVD病毒基因组可以获得抗BVD病毒抗体。一般地，优选在牛体内产生抗体，但也可使用其它动物。

已获得包含有突变BVD基因组核酸的疫苗，并按照标准的DNA免疫方法用其在牛体内诱导产生免疫反应(如美国专利第5,589,466、5,580,859和5,703,055号中所述)。用在此谈及的方法所得到的疫苗、抗体及核酸均属于本发明的一部分。D产生减毒BVD病毒的方法

已发现当BVD病毒核酸突变以使N^pro蛋白酶基因失活时，可以产生对培养细胞的感染力大大降低的减毒病毒。这些减毒病毒的复制速率相对较慢，可使动物以一定方式调动起其免疫防御机制，这在迅速增殖的野生型病毒感染的情况中是不可能的。因此，如上所述产生BVDdN1突变病毒基因组的方法直接导致了一种产生减毒BVD病毒的普遍方法，使之适合用作疫苗。大体上该方法包括分离野生型BVD病毒、克隆其基因组核酸、突变克隆的核酸以使N^pro蛋白酶基因失活、再将已突变的核酸转化或转染入宿主以产生减毒病毒。尽管可使用上面所述可产生突变的任何方法，优选使N^pro蛋白酶基因全部/部分缺失的方法。

本发明不仅包括产生减毒病毒的方法，还包括病毒本身、病毒感染的宿主细胞和这些宿主细胞产生的子代病毒。用有效剂量的减毒型BVD病毒感染动物，优选牛，可以产生针对减毒BVD病毒的抗体。用该方法产生的抗体属于本发明的一部分，可分离这些抗体并把其用于诊断或检测细胞培养物中的BVD是否存在。

如上述有关BVDdN1所述，可将特征为N^pro蛋白酶基因失活的减毒病毒掺入到疫苗中，用于诱导牛的免疫反应。可优化剂量与免疫方法以使接种过的动物产生抗继后病毒感染的保护性免疫反应。

图1(A组和B组)：A组是质粒pVVNADL图解说明。该质粒经突变使开放阅读框架中的第一个基因，即N^pro蛋白酶，缺失。产生的突变质粒为p BVDdN1，见B组图解。图1还显示了几个其它基因区。C代表编码包装基因组RNA及形成病毒颗粒的核心结构蛋白的基因。紧接着是编码三个包膜糖蛋白-E0、E1和E2的基因。P7编码未知功能的非结构蛋白，紧接着是名为“NS2-插入区-NS3”的区域。NS2编码含有一个锌指基序的高疏水性蛋白。NS3为高亲水性，是致细胞病变性BVD病毒的标志。ncp病毒在被感染动物体内复制时通过基因重组可转化成cp生物型，该重组过程包括在NS2和NS3编码区之间插入附加的病毒或细胞RNA序列。该重组的结果是释放出游离的NS2和NS3蛋白。后者，即NS3，是负责多数非结构蛋白质加工的蛋白酶。NS4A紧挨NS3，已知其编码涉及NS3蛋白酶活性的辅因子。紧挨NS4A的是编码病毒蛋白质NS4B和NS5A的两个基因，蛋白质功能未知。最后一个基因是NS5B，编码RNA依赖的RNA聚合酶，负责病毒复制。B组所示核苷酸序列(SEQ ID NO：9)为p BVDdN1起始密码周围序列。

图2所示为质粒p BVDdN1的全部核苷酸序列。BVDdN1基因组序列为自第39至12116核苷酸之间的序列。

图3数据显示了施用BVDdN1病毒后牛体内血清转化的情况。A BVDdN1和编码该病毒的核酸的制备

本发明涉及因缺失N^pro蛋白酶基因而被减毒的BVD病毒。该病毒命名为BVDdN1，并且如术语“减毒”所指，它在易感细胞系体内(如牛睾丸细胞系(RD)、或牛肾细胞系(MDBK))中的复制速率比野生型病毒慢得多。另外，BVDdN1不会在胎牛气管细胞(EBTr)或牛鼻甲细胞(BT-2)中引起产毒性感染，这与野生型病毒感染后可导致产毒性感染形成对比。BVDdN1病毒在不同的牛细胞系中的缓慢生长，提示其在动物中组织趋向性减毒作用广泛。BVDdN1遗传稳定，在牛RD细胞系中传至10代仍能保持N^pro缺失。尽管自然界中病毒基因组为RNA，可以将其逆转录后再进行克隆。应当理解的是，此处提及的核酸和BVD病毒序列不仅包括自病毒RNA序列逆转录而来的DNA序列，也包括相应的RNA本身。

BVDdN1病毒基因组的完整核苷酸序列见SEQ ID NO：1中自第39至12116核苷酸所示。应当理解，本发明不仅包括如所示精确序列的病毒基因组，也包括与之结构或功能基本上没有差异的其它序列，包括如建立在遗传密码简并性基础上编码与SEQ IDNO：1所示的BVD蛋白质相同的序列。另外，例如，可以用已熟知的技术如定点诱变使核酸结构中引入变异。用此法或类似方法或用本领域已知的随机诱变法产生的BVD病毒核酸序列的突变也属于本发明，前提是所产生的病毒至少保留一个基本上与其所衍生自的病毒相同的主要生物特性。具体地，基本不改变BVDdN1之感染特性的突变均落入本发明的范围。

突变的BVDdN1突变核酸来自国家动物疾病实验室(NADL)的BVD株，该株获自ATCC(VR-534)。将其连接到载体上再用如下述实施例中所示的选择性PCR和再连接法使全长N^pro蛋白酶基因缺失。尽管可用该方法获得病毒基因组及最终病毒本身，已将含有完整BVDdN1基因组序列的名为BVDdN1的质粒保藏于ATCC，保藏号203354。该质粒为分离过程中的优选来源。可用标准方法扩增和纯化质粒，并将其转染入可维持病毒生产的宿主细胞。用于质粒扩增的原核宿主细胞优选大肠杆菌STBL2细胞(来自Gioco BRL)，但也可使用其它细胞类型。可以在真核细胞如RD或MDBK细胞中制备病毒，再用已知分离方法如蔗糖梯度离心以其高纯化形式从中分离出来，以用作疫苗或用来产生抗体。另外，质粒可用于分离BVDdN1基因组序列，这可直接用于产生抗体或用于疫苗。B其它减毒BVD病毒株的制备

可将产生BVDdN1病毒和基因组核酸的基本方法同样用于其它BVD野生病毒株。每种情况下，分离出野生型病毒，使N^pro蛋白酶基因失活而达到减毒目的。优选用如此处用于BVDdN1的以PCR为基础的方法，使整个基因缺失而达到减毒目的。但也可用其它使基因失活的方法，如使序列部分缺失，或者随机或于特定位置引入突变。所有情况下，目的是产生感染后低速增殖的突变病毒。如实施例部分所述，可用免疫组化的方法用特异性针对BVD病毒的单克隆抗体体外测定病毒的感染性。C抗BVD减毒型病毒的抗体的制备

可在一般用来产生抗体的任何一种动物中制备抗BVD病毒抗体，包括如小鼠、免等。但优选在牛体内产生抗体。用任意途径给予动物含有病毒的组合物，但一般途径为肌肉注射、皮下注射或静脉给药注入动物。总体上，病毒制剂包括一种佐剂如弗氏完全或不完全佐剂。有关注射用合适制剂、注射方法等等在本领域已熟知，可以使用之(见如Harlow等人，抗体：实验手册.Coldspring Harbor Lab.N.Y.(1988)；Klein，免疫学：自身-非自身识别科学(Immunology；The Science of self-Nonself Discrimination(1982))。也可用标准方法制备单克隆抗体(Kennett等人：单克隆抗体与杂交瘤：生物学分析新思维(Monoclonal Antibodies andHybridomas：A New Dimension in Biological Analyses)(1980)；Campell “单克隆抗体技术”(Monoclonal Antibody Technology)生物化学与分子生物学实验技术(Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)(1984)。

可将特异性针对BVD病毒(即与BVD亲和力比其它类型病毒至少大100倍)的抗体或抗体片段用于任何免疫学分析。例如，在放射免疫分析或免疫测量分析中(又名“两位点”或“三明治”分析)，用该抗体检测BVD病毒(见Chard“放射免疫分析及有关技术介绍”(An Introduction to Radioimmune Assay and RelatedTechniques)生物化学与分子生物学实验技术，North Holland出版有限公司.N.Y.(1978)。在一般的免疫测量分析中，一定数量的未标记抗体结合到固体支持物上，该支持物在待测液体如血液、淋巴、细胞抽提物等中是不溶的。抗原开始结合到固定的抗体上后，加入一定量可检测的第二种抗体(可与第一种抗体相同，也可不同)以检测及/或定量抗原(例如见放射免疫方法(RadioimmuneAssay Methods)Rirkham等人编辑199-206页。E & SlivingstoneEdinburgh(1970)。本领域已知许多有关此类分析的不同方法，可将之用于检测BVD病毒。D常规疫苗(制备)和接种方法

许多文献讨论过利用BVD病毒的疫苗制备与接种方法(如见Fennelius等人，美国兽医研究杂志，33：1421-1431(1972)；Kolar等人，美国兽医研究杂志33：1415-1420(1972)；McClurkin等人，病毒学文献(Arch.Virol)58：119(1978)；Coggins等人，Cornellvet.51：539(1961)；Pillips等人，美国兽医研究杂志36：135(1975)；Lobmann等人，美国兽医研究杂志，45：2498(1984)；Coria等人，Can.J.Comp.Med.42：239(1978)；Martin等人Proceedings of theconference Res workers Anim.Dis 75：183(1994)；及美国专利第4,618,493号)。一般地，一株疫苗含有约1×10⁶至1×10⁸个病毒颗粒，以及兽医可接受的载体，体积为0.5-5ml。可按Remington’s药物科学(Mack Publishing CO.Easton，Pa第16版1982)中所述方法配制。本发明包容各种赋形剂和佐剂，其可按需要掺入到制剂中。例如，本发明中的疫苗组合物可按常规用标准缓冲盐、载体、稳定剂、稀释剂、防腐剂及助溶剂来配制，也可为方便持久释放而配制。稀释剂可包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等等。等渗添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、乳糖及其它。稳定剂包括白蛋白及其它。非限制性佐剂例子有RIBI佐剂系统(Ribi Inc)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油乳剂、油包水乳剂如弗氏完全和不完全佐剂、封闭共聚物(Block co polymer)(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emery Ville CA)、AMPHIGEN^佐剂、皂苷、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.，CambridgeMA)或其它皂苷组分、单磷脂A、Avridine脂胺佐剂、大肠杆菌来源的不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素或胞壁酰二肽等。疫苗还可包括一种或更多其它免疫调节剂如白细胞介素、干扰素或其它细胞因子。疫苗一般用于非肠道途径给予，但本发明也适用于其它途径，比如口服、鼻内、肌肉内、淋巴结内、皮内、腹膜内、皮下、直肠或阴道给药，或采用联合途径给药。熟练的技术人员可按照选择的途径来配制疫苗组合物。

可用本领域熟知的方法优化免疫方法。可单次剂量向动物施用，或者另一种方式，每间隔2至10周给予两次或多次接种。需要的话，收集接种动物的血清，检测抗BVD病毒抗体的存在。

此处使用的术语“免疫反应的诱导”及类似用语，广义地包括牛体内对疫苗产生的任何基于免疫的反应的诱导或增加，包括保护接种动物抵抗BVD病毒的抗体或细胞介导的免疫反应，或二者兼俱。此处所用术语“保护性免疫”、“保护性免疫反应”、“保护”及类似用语不仅仅限于对牛病毒性腹泻的绝对防护，或对牛发生BVD病毒感染的绝对防护，而意在包括，与未接种过的被感染动物相比，任何病原体感染程度或感染率的下降，或病原体感染后所致疾病的严重性或任何症状或状态出现的任何缓解。E DNA疫苗

关于利用核酸(DNA或mRNA)进行疫苗制备和接种的方法之文献包括美国专利第5,703,055号、第5,580,859号、5,589,466号、国际专利公开文本WO 98/35562，及各种科学出版物包括Ramsay等人，1997，免疫细胞生物学(Immunol.Cell Biol)75：360-363；Davis，1997，生物技术当今观点(Cur.Opinion Biotech)8：635-640；Manickan等人，1997，免疫学评论性综述(Critical Rev.Immunol)17：139-154；Robinson，1997，疫苗(Vaccine)15(8)：785-787；Robinson等人，1996；AIDS Res.Hum.Retr.12(5)：455-457；Lai和Bennet，1998，免疫学评论性综述18：449-484；及Vogel和Sarver，1995，临床微生物学综述(Clin.Microbiol，Rev)8(3)：406-410，在此引用供参考。可用这些方法产生抗BVD病毒的疫苗，其中，向牛施用对应于BVDdN1核酸的核酸，或对应于通过N^pro蛋白酶基因失活而得到减毒的类似BVD病毒基因组或其简并性变异体的核酸。也可使用含有这些核酸分子的载体。以这种方式递送的免疫原一般既会激发体液免疫反应，也会激发细胞介导的免疫反应。

编码减毒BVD病毒基因组的DNA或RNA均可用作疫苗。DNA或RNA分子可以是“裸露”形式，或与促进细胞吸收的成分(如脂质体或阳离子脂)一块施用。施用方式一般是肌肉内注射约0.1至5ml疫苗。疫苗中多核苷酸总量大体上应在约0.1μg/ml至5mg/ml之间。多核苷酸可以为在悬浮液、溶液或乳剂的形式中，但一般优选水载体。通过单次接种或多次接种完成免疫过程。需要的话，收集接种动物的血清并检测抗BVD病毒抗体的存在。

下述实施例仅仅用作说明，并不意在限制本发明的范围。实施例1：分析和实验方法DNA

感染性全长pVVNADL克隆见图1A。该质粒含有一个来自于pGE₄(Promega Corp.)的ColE₁复制子，长度为14,578bp(Vassilev等人，病毒学杂志71：471-478(1997))。T7RNA聚合酶启动子被插至BVD病毒基因组上游，该启动子可指导病毒合成RNA。BVD病毒基因组序列来自BVD病毒的NADL株(ATCCVR-534)。pVVNADL在大肠杆菌中扩增

一般地，在大肠杆菌中扩增全长pVVNADL克隆是困难的。已报道在大肠杆菌中扩增长瘟病病毒cDNA和全长克隆时会产生有害效应(Moormann等人，病毒学杂志70：763-770(1996)；Rugglie等人，病毒学杂志70：3478-3487(1996))。在几种细菌宿主中检测了pVVNADL的稳定性，这些宿主包括大肠杆菌JM109(stratagene)、DH 5α(GibcoBRL)和STBL2细胞(GibcoBRL)。将质粒DNA转化入这些菌株中后，检测克隆大小并用限制性图谱分析质粒的大体结构。用STBL2细胞获得最佳结果。pVVNADL转化入这些细胞可产生相对单一的小克隆群，并在限制性生长环境中(30℃下不超过20小时)未发现DNA重排的证据，且DNA产率合理。体外转录及RNA转染

按厂家说明用MEGAscript试剂(Ambion)用T7RNA聚合酶体外合成RNA转录产物。用SacII使pVVNADL DNA模板线性化后，用T4 DNA聚合酶处理除去3’突出端。用凝胶电泳分析转录反应产物。将1至5μg的RNA转录产物加入至含有6μg脂转染试剂(GibcoBRL)的200μl Opti-MEM(GibcoBRL)中，室温下温育RNA/脂样品10至15分钟。在此期间，把在6孔板(直径35mm)上生长的单层(50～60％铺满)MDBK(来自Madin Darby牛肾细胞(克隆6))或RD(稳定转化的牛睾丸细胞系)细胞用无RNase的PBS洗两次，再用Opti-MEM洗一次。末次洗毕，每孔加入转染混合物，室温下轻摇温育10分钟。每孔再加入1ml Opti-MEM，37℃温育3小时。每孔加入3ml含5％胎马血清(RD细胞)或胎牛血清(MDBK细胞)的Opti-MEM。37℃温育1至4天后，用80％丙酮固定细胞，通过免疫组化的方法观察BVD病毒斑。实施例2：N^pro基因缺失的BVD病毒克隆的构建

为了获得基因组中缺失N^pro基因的病毒，先制备3个DNA片段，再连接之。确切过程如下所述。获得PCR片段1

“PCR片段1”含有N^pro编码序列的缺失。得到该片段需三个PCR扩增反应。首先，用5NTR3(+)和5NTR4(-)为引物扩增N^pro编码序列上游5’NTR区域的一半。5’正性有义引物5’NTR3(+)序列为：5’-AAAGGTCTCGAGATGCCACG-3’(寡核苷酸218-237，SEQ ID NO：2)。3’负性反义引物5’NTR4(-)序列为5’-GTCTGACATGTGCCATGTACAGCAGAGATTTTTAGTAGC-3’(寡核苷酸895-890。+388-356，SEQ ID NO：3)。两引物均位于病毒基因组的5’NTR区，5NTR3(+)引物包含一个单一Xhol限制性酶切位点。5NTR4(-)引物5’端包含6个附加寡核苷酸，后者与BVD病毒C蛋白编码序列的5’端同源。PCR扩增反应中，采用终浓度为0.5μM的引物，10ng质粒pVVNADL的DNA模板，Pfu DNA聚合酶2.5U(Stratagene，La Jolla，CA)。用下述条件进行20次扩增循环：94℃变性30秒；55℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。琼脂糖凝胶电泳纯化后产生的177碱基对的片段(片段A)重悬于TE缓冲液中。

用寡核苷酸NADLC6(+)和Seq23(-)作引物进行另一个PCR扩增反应，扩增N^pro编码序列的下游片段。5’正义引物NADLC6(+)序列为：5’-CACATGTCAGACACGAAAGAAGAGGGAGC-3’(寡核苷酸383-388+890-913，SEQ ID NO：4)。3’反义引物Seq 23(-)序列为：5’-CAGGTTTGCAATCCAAGTGCCC-3’(寡核苷酸2480-2459，SEQ ID NO：5)。引物NADLC6位于蛋白质C的N端，包括与5’NTR的3’端同源的3个附加核苷酸，其5’端有一个起始密码ATG。引物Seq 23(-)靠近E2蛋白质N端。扩增反应中用质粒pVVNADL作模板，反应条件同上所述。用琼脂糖凝胶电泳纯化得到的DNA片段(片段B)，该片段长1596bp。

第三个扩增反应用0.5μM浓度的寡核苷酸5’NTR3(+)(SEQID NO：2)和Seq 23(-)(SEQ ID NO：5)作引物，片段A和片段B为模板，再加上2.5U Pfu DNA聚合酶(Stratagone，La folla，CA)。扩增过程中前四个循环条件为：94℃变性30秒；40℃退火1分钟；72℃延伸2分钟。紧接着20个循环的条件为：94℃变性30秒；60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟。如此获得终产物为“PCR片段1”，长1767bp。其用于连接前先用XhoI和PvuI酶切该片段形成长1175bp的片段。获得PCR片段II

用寡核苷酸Seq 2(+)和Seq 24(-)作引物得到“PCR片段II”。5’正义引物Seq 2(+)序列如下：5’-GGAGCATACGCTGCTTCCCC-3’(寡核苷酸1865-1884，SEQID NO：6)。3’反义引物Seq 24(-)序列为：5’-GCCTTGCCTATGAGGGAATGG-3’(寡核苷酸2963-2942，SEQID NO：7)。寡核苷酸Seq 2(+)靠近E1N端处，寡核苷酸Seq 24(-)靠近E2区域中间。用质粒pVVNADL DNA作为模板进行扩增，反应条件如上有关用A和B片段进行扩增反应所述。产生的片段称“PCR片段II”，长1098bp。其用于连接前用PvuI和RsrII酶切形成929 bp的片段。获得载体片段III

用XhoI和RsrII酶切长14579bp的质粒pVVDADL，得到长11974bp的片段，称为“载体片段III”。获得质粒pBVDdN1

以2∶2∶1的分子比混合PCR片段I和II和载体片段III，用200单位T4 DNA连接酶(Boehringer Mannheim)连接，16℃下过夜。将连接产物转化入大肠杆菌STBL2细胞，用小量DNA纯化和特异性限制酶切法筛选异源克隆。对带有预期长度(14079bp)的质粒进一步进行序列分析。产生的p BVDdN1质粒示于图1，其包含有来自BVD病毒基因组的N^pro蛋白酶基因的缺失。pBVDdN1载体背景与pVVNADL相同。实施例3：N^pro基因缺失的BVD病毒克隆之表征N^pro基因缺失的BVD病毒克隆p BVDdN1的感染性

如前所述体外合成p BVDdN1和pVVNADL(阳性对照)的RNA，用脂质转染试剂于RD单层细胞上进行RNA转染。转染后48、72和96小时，收集已转染细胞的上清液，用其重感染新鲜RD单细胞层。用80％丙酮固定被转染细胞，用Vectastain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories)进行免疫组化分析。用于检测BVD特异性病毒的单克隆抗体是15C5(特异性针对E0)和CA3(特异性针对E2)(Pfizer inhouse)，也可用标准方法制备针对这些抗原的其它单克隆抗体，并用于同样的方法中。使用时这些抗体稀释度为1∶1000。用来自亲代病毒RNA转染后24小时可检出E0和E2包膜蛋白及产生病毒。与之不同的是，用p BVDdN1的RNA转染后48小时细胞中才检出E0和E2蛋白。直到转录后72小时才产生BVDdN1病毒。表型分析

用早期传代(第3代)的BVDdN1病毒株接种RD和MDBK单层细胞。将这些细胞与接种了亲代病毒的对照细胞比较。转染后20小时(RD细胞)或24小时(MDBK细胞)用80％丙酮固定单层细胞。用1∶1000稀释的E2特异性单克隆抗体CA3对固定细胞进行免疫组化分析，并在显微镜下镜检。两种细胞类型中均发现亲代病毒复制速率比BVDdN1病毒复制速率快得多。基因型分析

按厂家说明用Ultraspec^TMRNA试剂(biotect)从被感染的RD单层细胞中纯化亲本病毒和BVDdN1(3代)的RNA。用RT-PCR玻珠(Pharmacia Biotech)和寡核苷酸NADLE 07(-)和5NTR3(+)进行RT/PCR反应。5NTR3(+)寡聚核苷酸序列与位置如上所述。NADLE07(-)寡核苷酸序列为：5’-CACTTGCATCCATCATACC-3’(反义，寡核苷酸1379-1361，SEQ ID NO：8)。该寡聚核苷酸位于距E0的N末端约150bp处。发现RT/PCR自亲代病毒RNA可得到1162bp大小的片段。RT/PCR自BVDdN1的RNA可得到661bp大小的片段，这与预期的缺失N^pro蛋白酶基因的片段大小相同。对自亲代病毒和BVDdN1的RNA获得的RT/PCR片段测序，两种情况中，所得序列均如预期，相应于图1所示元件的排列。BVDdN1的完整序列见SEQ ID NO：1中第39至12116核苷酸所示。实施例4：BVDdN1功效研究

本研究目的是评价含BVDdN1的疫苗使小牛发生血清转化的能力。15头动物被随机分至一个房间(10头进行双剂量接种，5头作为观察对照)。另外10头动物随机分至另一房间(单剂量接种，无观察对照)。将2.0mlMDBK细胞裂解液中的BVDdN1病毒以10⁷TCID₅₀/动物的剂量皮下施予动物。进行免疫时，让5头被指定为观察对照的动物离开房间。剩下的10头小牛接种BVDdN1病毒。免疫后约24小时，使观察对照动物返回接种房间。首次剂量后约28天用同样方式给前10头动物接种第二次剂量的疫苗。

在第-1、0(接种前)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天(所有组动物)和第27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37和38天(双剂量组动物)测量直肠温度。在第0天收集双剂量组动物的血样，以后每周收集一次(即在第7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84和91天)。在第0、7、14、21、28、35、42、49、56和63天收集单剂量组动物的血样。

用SN分析法检测血清中和抗体(I型用BVD病毒分离物5960，II型用分离物890)，以监测是否存在预期的同源和异源保护效应。

总体的观察或直肠温度均未观察到明显差异。研究期间观察对照动物均未观察到血清转化现象(数据未列)。

I型血清中和分析发现，所有接种过BVDdN1病毒的动物发生了血清转化。单次剂量接种后第28天，60％的动物中出现了1∶8或更高的阳性效价，第35天90％的动物中出现1∶8或更高的阳性效价，且以后维持在高效价水平(图3A)。II型血清中和分析发现，接种后63天70％的动物是阳性(数据未列)。双剂量接种后，I型血清中和分析表明，所有动物在第7天出现1∶64或更高的阳性效价，以后维持在类似的血清转化水平(图3A)。II型血清中和分析发现，多数动物第二次接种后7天出现阳性效价，在第28天至少60％动物出现1∶8或更高的阳性效价(图3B)。这些结果表明，BVDdN1病毒可以在牛体内复制，并诱导产生抗I型和II型病毒的阳性中和血清，说明该病毒可被用来作为抗BVD病毒的疫苗。生物材料保藏

质粒p BVDdN1于1988年10月20日在美国Manassas，VA，20110的10801大学Blvd，美国典型培养物保藏中心(ATCC)进行保藏，保藏号为ATCC203354。

上面提及的所有专利、专利申请及出版物在此全部引入供参考。

本发明中的实施例仅仅表述了本发明的一个方面，本发明范围并不限于此。同样功能的组合物与方法在本发明范围之内。事实上，对本领域技术人员而言，根据前面的描述不难推及除在此提及内容以外的多种修饰方法。此类修饰应落入所附权利要求的范围。

序列表<110>辉瑞产品公司<120>减毒型牛病毒性腹泻病毒<130>PC10435A<140><141><150>60/107,908<151>1998-11-10<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>14078<212>DNA<213>牛减毒型腹泻病毒<400>1cacgcgtatc gatgaattcg ttaatacgac tcactatagt atacgagaat tagaaaaggc 60actcgtatac gtattgggca attaaaaata ataattaggc ctagggaaca aatccctctc 120agcgaaggcc gaaaagaggc tagccatgcc cttagtagga ctagcataat gaggggggta 180gcaacagtgg tgagttcgtt ggatggctta agccctgagt acagggtagt cgtcagtggt 240tcgacgcctt ggaataaagg tctcgagatg ccacgtggac gagggcatgc ccaaagcaca 300tcttaacctg agcgggggtc gcccaggtaa aagcagtttt aaccgactgt tacgaataca 360gcctgatagg gtgctgcaga ggcccactgt attgctacta aaaatctctg ctgtacatgg 420cacatgtcag acacgaaaga agagggagca acaaaaaaga aaacacagaa acccgacaga 480ctagaaaggg ggaaaatgaa aatagtgccc aaagaatctg aaaaagacag caaaactaaa 540cctccggatg ctacaatagt ggtggaagga gtcaaatacc aggtgaggaa gaagggaaaa 600accaagagta aaaacactca ggacggcttg taccataaca aaaacaaacc tcaggaatca 660cgcaagaaac tggaaaaagc attgttggcg tgggcaataa tagctatagt tttgtttcaa 720gttacaatgg 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ctttctttag tggtgctgtc cgacttcgca 1620ccggaaacag ctagtgtaat gtacctaatc ctacattttt ccatcccaca aagtcacgtt 1680gatgtaatgg attgtgataa gacccagttg aacctcacag tggagctgac aacagctgaa 1740gtaataccag ggtcggtctg gaatctaggc aaatatgtat gtataagacc aaattggtgg 1800ccttatgaga caactgtagt gttggcattt gaagaggtga gccaggtggt gaagttagtg 1860ttgagggcac tcagagattt aacacgcatt tggaacgctg caacaactac tgctttttta 1920gtatgccttg ttaagatagt cagggggcca gatggtacag ggcattctgt ggctactatt 1980gataacaggg gtacaagggc acttggattg caaacctgaa ttctcgtatg ccatagcaaa 2040ggacgaaaga attggtcaac tgggggctga aggccttacc accacttgga aggaatactc 2100acctggaatg aagctggaag acacaatggt cattgcttgg tgcgaagatg ggaagttaat 2160gtacctccaa agatgcacga gagaaaccag atatctcgca atcttgcata caagagcctt 2220gccgaccagt gtggtattca aaaaactctt tgatgggcga aagcaagagg atgtagtcga 2280aatgaacgac aactttgaat ttggactctg cccatgtgat gccaaaccca tagtaagagg 2340gaagttcaat acaacgctgc tgaacggacc ggccttccag atggtatgcc ccataggatg 2400gacagggact gtaagctgta cgtcattcaa tatggacacc 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29<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5caggtttgca atccaagtgc cc 22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6ggagcatacg ctgcttcccc 20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>7gccttgccta tgagggaatg g 21<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>8cacttgcatc catcatacc 19<210>9<211>27<212>DNA<213>牛减毒型腹泻病毒<400>9tgtacatggc acatgtcaga cacgaaa 27

Claims

1.一种减毒型牛病毒性腹泻(BVD)病毒，其中该病毒基因组核酸序列包括SEQ ID NO：1中自第39至12116核苷酸之间的序列，或其简并性变异体。

2.权利要求1的减毒BVD病毒，其中该病毒基因组核酸序列基本上由SEQ 1D NO：1中自第39至12116核苷酸之间的序列或其简并性变异体组成。

3.权利要求1的病毒，其为基本上纯的形式。

4.一种用权利要求1的病毒感染的宿主细胞。

5.权利要求4的宿主细胞产生的子代病毒。

6.一种包括权利要求1的减毒BVD病毒和兽医可接受的载体的疫苗。

7.一种核酸分子，包括SEQ ID NO：1中自第39至12116核苷酸之间的序列，或其简并性变异体。

8.权利要求7的核酸分子，其基本上由SEQ ID NO：1中自第39至12116核苷酸之间的序列或其简并性变异体组成。

9.权利要求7的核酸分子，其为基本上纯的形式。

10.一种包含一个基本上由权利要求7的核酸分子组成的独立密码元件的载体。

11.权利要求10的载体，即p BVDdN1质粒(ATCC No.203354)。

12.一种用权利要求7的核酸分子或权利要求10中的载体转化或转染的宿主细胞。

13.用权利要求12的宿主细胞产生的子代BVD病毒。

14.一种包含权利要求7的核酸分子及兽医可接受的载体的疫苗。

15.一种修饰已分离的野生型BVD病毒基因组以使之适用作疫苗的方法，包括使所述已分离的野生型BVD病毒基因组核酸突变导致N^pro蛋白酶基因失活。

16.权利要求15的方法，其中使所述N^pro蛋白酶基因失活是用下列方法实现的，包括：

a)将该野生型BVD病毒基因组RNA逆转录成cDNA；

b)克隆a)步骤中的cDNA；

c)使b)步骤中克隆的cDNA中的N^pro蛋白酶基因突变，从而该基因无法产生具有完全活性的基因产物；并且

d)克隆c)步骤中突变的cDNA。

17.权利要求16的方法，其中通过删除所述野生型BVD病毒基因组的全部或部分N^pro蛋白酶基因序列使该基因失活。

18.一种用权利要求15的方法获得的BVD病毒基因组。

19.一种载体，其包括一个基本上由权利要求18的BVD病毒基因组组成的独立序列元件。

20.一种用权利要求18的病毒基因组或权利要求19的载体转染的宿主细胞。

21.用权利要求20的宿主细胞产生的子代BVD病毒。

22.一种包含权利要求18的病毒基因组和兽医可接受的载体的疫苗。

23.一种使野生型BVD病毒减毒以便适用于疫苗的方法，包括使该病毒基因组核酸突变导致N^pro蛋白酶基因失活。

24.权利要求23的方法，其中减毒通过下列方法实现，包括：

a)分离所述野生型BVD病毒；

b)克隆a)步骤中已分离病毒的基因组核酸；

c)使b)步骤中克隆的基因组核酸突变导致N^pro蛋白酶基因失活；并且

d)将c)步骤中突变的核酸转化或转染入宿主细胞以获得减毒病毒。

25.权利要求24的方法，其中通过从所述野生型BVD病毒基因组中缺失全部或部分N^pro蛋白酶基因使该基因失活。

26.一种用权利要求23的方法获得的减毒BVD病毒。

27.一种用权利要求26的减毒病毒感染的宿主细胞。

28.权利要求27的被感染宿主细胞，其中该宿主细胞为MDBK细胞(ATCC CCL-22)。

29.用权利要求28的宿主细胞获得的子代病毒。

30.一种包含权利要求26的BVD减毒病毒和兽医可接受的载体的疫苗。

31.一种诱导牛体内免疫反应的方法，包括以一定剂量将权利要求6、14、22或30的疫苗施予所述牛，该剂量应足以诱导产生针对继后BVD病毒感染的保护性免疫反应。

32.权利要求31的方法，其中保护性免疫既来自体液免疫反应也来自细胞介导的免疫反应。

33.一种在可产生抗体的动物体内诱导抗BVD病毒抗体的产生的方法，包括以一定剂量施予所述动物：(a)权利要求1的病毒；(b)权利要求7的核酸分子；(c)权利要求10的载体；(d)权利要求18的病毒基因组；(e)权利要求19的载体；或(f)权利要求26的减毒病毒，该剂量应能有效诱导上述抗体的产生。

34.权利要求33的方法，其中所述抗体在牛体内产生。

35.权利要求33的方法，其还包括从所述动物中分离该抗体。

36.用权利要求33的方法制备的抗体。