TW526201B - Novel FT-0554 substance and its production - Google Patents

Description

經濟部中央標卑工消费合竹社卬狀 526201 Λ7 _— —__ Η 7 五、發明説明彳) 本發明的範圍是關於用來治療寄生蟲感染，尤其是蠕蟲感 染的新穎F Τ — 〇 5 5 4化合物及其製法。 先前技藝 寄生蟲病的減少是由於衛生環境的改良以及驅蠕蟲藥的進 步所產生的結果。然而，最近重要的寄生蟲病，動物性寄生蟲 '病’伺機性寄生蟲病及來自容易腐壞食物的寄生蟲病已變成盛 行而嚴重的問題。還有，寄生蟲病對於畜牧業及農業造成很大 的經濟負擔。目前，在寄生蟲病中的蠕蟲感染，可使用 '、艾佛 麥汀〃，甲苯咪唑，吡喹酮及其它藥物來治療。 要利用本發明來解決的問題。 目前所使用的驅蠕蟲藥，如： ''艾佛麥汀〃 （Avermectins )’甲苯咪唑及吡喹酮在其用途及毒性問題上並不是那麼令人 滿意，因此，對於可用來解決這些問題的驅蠕蟲藥是有非常迫 切的需要。 ， 因此，本發明提供新穎之F T - 〇 5 5 4化合物及其製法 ，此種化合物可滿足上述的需求。 用來解決問題的方法 我們硏究了蠕蟲之電子運送系統中的NADH-富馬酸鹽 還原酶（此種還原酶爲對驅蠕蟲藥之可能的標靶之一）並在微 生物培養中進行硏究檢查。我像發現到：新穎之F 丁 -0 5 5 4化合物具有N A D Η富馬酸鹽還原酶抑制活性，而本 本紙张尺度適州中國國糸打:準（CNS ) Λ4从Ί ( 210 X 29λ:Μ;·, ) 一

526201 A7 _________________]'L_—..............一^ 五、發明説明έ ) ^明也是根據此發現來完成的。 本發明的目的之一是提供式〔I〕所示之化合物所顯示之 FT — 0554化合物：

• · ·⑴ 本發明的另一個目的是提供式〔I〕所示之F T — 〇 5 5 4化合物的製法：

訂 此製法包括培養一種屬於黴菌類之微生物，它具有製造F 丁-〇 5 5 4化合物之活性，然後使F T - 〇 5 5 4化合物在介質 中累積並自介質中將此物質分離出來。 本發明的另一個目的是提供一種屬於黴菌類，並具有上述 方法中之F T - 0 5 5 4化合物製造活性的微生物-黑麯黴 F T - 〇 5 5 4。 本發明還有另一個目的是提供一種屬於黴菌類並具有F τ 一 0 5 5 4化合物之製造活性的微生物一黑麯黴F ΤΟ 5 5 4 。 -5-

本紙张尺度適用中國國家H ( CNS ) Α210x797*^ϊ ™ 5262〇ι 五、發明説明$ ) 製造FT — 〇 5 5 4化合物的微生物是指具有FT -

Q 5 5 4化合物製造活性的黴菌但不限制種類。用來製備F T ^ 〇 5 5 4之較佳的微生物實施例爲黴菌種F T - 0 5 5 4， lit黴菌種是由本發明之發明者自一種新的收集海綿中分離出來 的。 該微生物之分類學性質說明於下。 黴菌種F T — 〇 5 5 4的分類學性質。 (1 )在不同介質上的培養性質 本微生物種在2 5 °C下，培養7天後於顯微鏡下所觀察到 的結果顯示於表1中。 本紙張尺度適用中國1¾¾:枕卑（CNS ) ( )

526201 A" ΙΓ 五、發明説明4 ) 表1 經濟部中央桴枣而Η工消费合竹杜卬於 介質 介質上的 生長情況 (菌落直 徑） 菌落表面 的顏色 菌落背面 的顏色 溶解的色 素 查派克-酵 好（82毫 黑棕色 淡黃色 Μ j\ \\ 母萃取瓊脂 米）天鵝 介質 絨樣的全 部 麥芽萃取物 好（81毫 黑棕色 淡黃色 並 j\ \\ 瓊脂介質 米）天鵝 絨樣的全 部 20%蔗糖-查 好（82毫米 黑棕色 淡黃色 Μ j \ \\ 派克酵母萃 )天鵝絨樣 取瓊脂介質 的全部 馬鈴暑-右旋 好（〉85毫 黑棕色 淡黃色 Μ j \ \\ 糖瓊脂介質 米）天鵝絨 的 全部 米尤拉瓊脂 中等（40毫 黑棕色 白色 te j\w 介質 米）天鵝絨 樣的全部

本紙张尺度適用中國®家打:枣（CNS ) Λ4叱怙（210χπ7.:Μ;) 526201 H7 . , - --------- ———-—— -----------------— —.一- 丨. . 一~—— ' ' _ _ 五、發明説明$ ) (2 )形態的性質 本發明的微生物在查派克—酵母（CzaPek_yeast)萃取瓊脂 介質（其中含有海水5 0 %鹽含量3 · 4 % ))，麥芽萃取瓊脂 介質，查派克-酵母萃取瓊脂介質其中含有蔗糖2 0%者）及 馬鈴薯-葡萄糖瓊脂介質上生長良好並帶有大量的頂端芽胞。 在查派克-酵母萃取瓊脂介質上生長的菌落以顯微鏡觀察 時可見到帶有中隔之透明菌絲，在基質菌體上直直生長的分生 孢子柄，其長度爲500/zm〜2 . 5mm且基底層處有足細 胞。分生孢子柄的頂端肥大且爲球形至半球形，而所形成小束 其直徑爲35〜60//m。 plural as per gill ae含有細錐體及擔子柄，其大小分別爲 8 · 4 〜1 1 _ 4x2 · 4 〜3 · 4//m及 5 · 4 〜8 · 6x 2 · 8〜3 · 3 // m小束上全部被有細錐體，形成了分節的頂 端芽胞頭’其形狀爲球形至圓筒形。頂端芽胞爲直徑3〜 4 · 5//m之球形，其表面爲平滑至粗糙。 (3 )生理學的性質 1 )理想的生長條件 本菌種理想的生長條件爲p Η 5 - 7，溫度1 6〜3 6 °C 及海水濃度1 ’ 5 0〜1〇0 %。 使用鹽濃度爲3 · 4 %的天然海水 2 )生長條件 囷種的生長範圍是pH3〜1〇 ，溫度；[2〜4 5 °C及海 水濃度2 ) 0〜1 〇 〇 %。 本紙张尺度適/π中國阀(CNS) 2丨0 χ.7ϋ ;r- ~—-............... 間讀背而之注*¥項洱填寫本頁 1Τ-

經濟部中央標工消费合竹社卬％ 526201 A7 ___ B7_ 五、發明説明（6) 2 )使用的鹽濃度爲3 · 4 %的天然海水 3 )性質：需氧的。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述中所說明的是將本微生物菌種F T — 〇 5 5 4之 培養條件，分類學性質及生理學性質與其它已知的微生物 種進行比較。本菌種經鑑定後被認爲是屬於黑麯黴菌，並 且被稱爲黑麯黴FT— 〇 5 5 4。 本微生物種以黑麯黴FT— 〇 5 5 4FERM P — 1 6 3 9 9之名於1 997年9月1日起，寄存於日本， 1 — 3 ，Higashil-chome，Tsukuba-shiIbaragi-ken，國際科 學技術部的工業科學及技術事務處之生物科學和人類技術 國家機構中。還有，本微生物菌種是在布達佩斯條約的監 督下於1998年7月31日轉移至日本1 一 3，Higashi 1-〇11011^，丁81^1^&-811丨，：^&1^§^1^11，國際科學技術部，工業科 學和技術事務處的生物科學和人類技術國家機構中，其寄 存號碼爲FERM BP - 6443，此由國際寄存當局 所指定的（亦寄存於貴國食品工業發展硏究所菌種保存及 硏究中心，寄存號碼CCRC93 002 5，1998年10月27日）。 經濟部智慧財產局R工消費合作杜印製 本發明之F T - 0 5 5 4化合物的製法可藉著下列步 驟來進行：首先，先培養具有FT - 〇 5 5 4化合物之製 造活性的黴菌類衍生物，再將該化合物分離出後加以純化 。本發明中所使用的微生物種可爲上述之微生物種，它的 變種及突變型以及所用具有F T - 〇 5 .5 4化合物之製造 活性之屬於黴菌類的菌種。 製備上述FT-05 54化合物之養分來源可以爲黴菌類所用 之營養源。氮的來源有，市售購得之腺，肉萃取物，玉米 漬汁，棉子粉，花生粉，酵母萃取物，NZ-胺，酪蛋白水解 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -9- 經濟部中央標革杓Π(工消费合竹社卬奴 526201 五、發明説明f ) 產物，硝酸鈉，硝酸銨及硫酸銨。碳的來源有，如：糖類（如 :甘油，澱粉，葡萄糖，半乳糖及甘露糖）或脂肪及油，以及 無機鹽，如··氯化鈉，磷酸鹽，碳酸鈣及硫酸鎂。這些物質可 以合倂或不合倂使用。 稀有金屬鹽及動物，植物或礦物油等被做成抗泡沫劑者如 需要時也可加入其中。有些可被該製造菌種同化並可幫助製造 F T — 〇 5 5 4化合物的物質也可使用。所有已知之用來培養 黴菌的介質都可使用。大量製造FT - 〇 5 5 4化合物時以液 態培養法較佳。培養溫度可在培養該製造微生物種及製造F 丁 - 0 5 5 4化合物的溫度範圍內。培養工作可藉著選擇適合該 F T - 〇 5 5 4化合物製造菌種之本質的條件來進行。 F T - 0 5 5 4化合物可以用與水難以混合之有機溶劑（ 如：氯仿及醋酸乙酯）自培養液中萃取出來。除了上述方·法外 ，可用來取得純化物質的還有：已知之用來分離親脂性化合物 的方法，如：吸附色層分析法，凝膠過濾色層分析法，自薄層 色層分析中剝除，離心逆流色層分析法，Η P L C及此類方法 ，這些方法可合倂或不合倂使用。 本發明之F Τ - 0 5 5 4化合物的物化性質顯示於下： (1) 本質：白色粉末或無定形 (2) 分子量：361 · 2374 (Μ + Η，高解析快速 原子衝擊質譜鏡） (3) 分子式：C22H32〇4 (4) 特定旋轉：〔u〕d25=35.3° (c=0.1 ，1 一丙醇） 本紙张尺度適用中國國掌彳1:冬(CNS ) ( 21()Χ?^7：Λ/； ) . 1〇.......

_ 117 ___ 526201 Λ7 五、發明説明$ ) (5)UV最大吸收（在1 一丙醇中）·弟1圖，最大吸 收在 2〇5ηπι (肩 ’ £ = 10800)及 23lnm(e = 2 1 0 0 0 )。 (6 ) I R最大吸浓（KBr Tab):第2圖，最大 吸收在 3430，2960，2920，2850，1740 ’1660，1460，1400，1380 ’1180， 1120 及 1000cm — 1 處 (7 ) 1 Η Μ N R :在次氯仿中的化學轉化（p p m )及 自旋一自旋偶合常數（Η z )在表2中。 (8 ) 1 3 C N M R :在次氯仿中的化學轉化是在第表2 中。 (9 )在溶劑中的溶解度：可在氯仿，乙醇’ 1 一丙醇 甲苯及醋酸乙酯中溶解，在水及正-己烷中爲不可溶 (1 0 )顏色反應：硫酸及碘爲陽性反應 經濟部中皮工消费合竹社卬鉍 Λ s N c -枕 因 國 I中 一用 一適 α 尺 紙 I本 X ο Λ"; 526201 五、發明説明$ ) 2 表 經濟部中央標卑局Π(工消费合竹杜卬鉍 13c Ή 170.6S 145.2d 5.79dd(lH,I = 6.915.2 138.9d 5.46dd(lH,J =7.6,15.2 137.9d 6.37dd(lH,J =10.2,15.2) 133.7d 127.Od 5.76d(lH，J = 10.9) 126.Od 6.02dd(lH，J =10.2,15.2) 124.6d 6.17dd(lH，J=10.9，15.2) 122.Od 5.48dd(lH,J =7.9,15.2) 80.2d 4.92d(lH,J = 7.9) 68.0 d 4.57s(lH) 58.5 d 3.52s(lH) 58.2 s 47.2 t 1.96dd(lH，J =7.7,13.7) 2.09dd(lH，J = 7.1，13.7) 38.6d 2.06m(lH) 34.8d 2.42m(lH) 29.8t 1.31dq(2H,J =7.1,7.3) 20.2q 0.98d(3H，J = 6.8) 19.4q 0.97d(3H，J = 6.8) 1 7.8q 1.45s(3H) 1 6.5 q 1.69s(3H) 1 1.8q 0.85t(3H，J = 7.3) 請1閱讀ff而之注&事項再别寫本·Ώ % 、-口 Γ 本紙ί民尺度適用中國國家枕卑（CNS ) AWUft ( 210/?Wd -12- 526201 _____ in —__ 五、發明説明彳0 ) 在表2中，S :單線，d :雙線’ t :三線’ q :四線’ m:多重，H:質子數，及J :自旋一自旋偶合常數（Hz) 〇 由對F T - 〇 5 5 4化合物之物化性質精密檢查及質譜數 據的結果可定出F T - 0 5 5 4化合物之化學結構如下·’

如上述所顯示的，F T - 〇 5 5 4化合物的物化性質已做 了詳細的解釋，然而，目前並沒有發現任何化合物具有相同的 性質。因此，F T - 0 5 5 4化合物可被定義爲一種新穎之化 合物。 本發明之FT — 0 5 5 4的NADH -富馬酸鹽還原酶抑 制活性說明於下。 經濟部中皮標準趵Β二消贽合竹社卬於 將豬蛔蟲的肌肉在1 2 0 m Μ磷酸鈉溶液（p Η 7 ·〇） 中加以均化並於3 0 0 X g下離心1 〇分鐘以收集上淸液。然 後，將上淸液在1 0 0 0 0 X g下進一步離心2 〇分鐘以收集 沉澱物。將沉澱物懸浮於1 2 0 m Μ磷酸鈉溶液（p Η 7 · 0 )中以取得粒線體分液。 將1 0 // 1之測試樣本溶於5 〇 %二甲基亞硕溶液後再將 此溶液加入9 6凹槽的微培養盤中，然後加入含有〇 . 3 5 mM NADN，7.2mM富馬酸二鈉及18mg/j牛血 本紙iR尺度適用中國®家彳( CNS ) (Ι ίΟχΤϋ/厂; —：—— ---- 526201 A 7 117 五、發明説明彳1 ) 淸白蛋白之1 2 0 m Μ磷酸鈉溶液（p Η 7 . 0 )中將此盤在 微培養盤讀計ELx808 (Bio—Tek工業公司）中， 於3 7 °C下預先溫育5分鐘。 將豬蛔蟲的粒線體分液1 0 // 1 (蛋白質含量〇 . 3 m g )加入其中並在3 7 t下溫育1 0分鐘。每1 5秒鐘在3 4 0 n m處測量一次N A D Η的吸收。N A D Η —富馬酸鹽還原酶 活性的定量測量是以在3 4. 0 n m處之吸收斜線的下降程度來 表示，5 0 %之N A D Η —富馬酸鹽還原酶活性受到抑制是發 生在FT — 0554化合物爲2 · 8//m時。因此到，FT -0 5 5 4化合物可用來做爲蠕蟲病之治療或預防藥物。 本發明之F T - 0 5 5 4化合物的抗微生物活性如下。 將本發明之化合物的氯仿溶液（1 mg / ml ) 1 0 // 1滴 在濾紙盤上（艾德凡泰克公司（Advantek Co.，） ’直徑6 m m )，並使之在空氣中乾燥以移去溶劑。將乾燥的盤放在含有測 試生物的瓊脂培養盤上於3 7 t或2 7 °C下溫育2 4小時並測 量紙盤周圍之抑制區的直徑。結果顯示於表3。 (对先閱讀背而之注f Τ項寫本页 、\=0

經滴部中夾標準局h工消费合竹社卬装 木紙iic尺度適用中國 ΚΓϋ·?:苹（CNS ) AWUi ( 21()Χ ) - 14 - 526201 五、發明説明彳2 ) 表3 測試生物 抑制區直徑（m m ) 大腸桿菌KB2l3(NIHJ) - 大腸桿菌 KB176(NIHJ JC-2,IF〇 12734) - 綠膿桿菌P-3 KB105 + 水稻黃單胞菌KB88 - 藤黃小球菌KB-40 (PCI 1001) - 金黃葡萄球菌KB210 - 恥垢分枝桿菌KB42(ATCC 607) - 枯草芽胞桿菌KB27 (PCI 219) - 脆弱擬桿菌 KB169(ATCC 23745) - 萊氏無膽甾原體KB174 - 白色念珠菌KF1 12 啤酒酵母KF26 - 黑麯黴 KF103(ATCC 627 5 ) - Pyricularia oryzae KF180 土 總狀毛黴KF223 (IF〇 45 8 1 ) 10 經濟部中央愫革杓ΜΗ消资合竹讧印狀 如表3中所顯示的，本發明之F T - 〇 5 5 4化合物對某 些微細生物具有弱的生長抑制活性。 本發明的體系 下列實施例說明本發明，但不是用來限制本發明。 本紙张尺度適川中國因窣枕枣（CNS ) ( 210〆？叩〉> ;;·' ) _ _ 526201 ___________ Π7 五、發明説明彳3 ) 實施例 將一圏於瓊脂斜管介質中培養的黑麯黴種入液體介質（ ρΗ7 · 0)中，該介質內容有：葡萄糖2 · 0%，多腺（尼 翁賽雅固公司）0 · 5%，瓊脂〇 · 1%，酵母萃取物（東方 酵母公司）0 · 2% ’硫酸鎂七水合物〇 · 〇5%及磷酸二氫 鉀0 · 1 %而這些物質則溶於5 0 %天然海水中（使用的鹽濃 度爲3 · 4 %天然海水）。將培養的液體各分裝成1 〇 〇毫升 並培養在5 0 0 2的艾林梅錐爾瓶（Erlenmeyerflask)中，在 27 °C下，搖動培養2天。 將子培養液各取1毫升種入含馬鈴薯右旋糖肉湯（地夫可 公司）的液體介質中，此馬鈴薯右旋糖肉湯的濃度爲2 . 4% ，溶於5 0 %天然海水中（使用的鹽濃度爲3 · 4 %，天然海 水）。然後，將培養液分成各爲1 0 0毫升的樣本裝入5 0 0 i艾林美爾錐瓶中（X30個錐瓶）並在270 °C下搖動培養 9 6小時。 將培養的液體介質加以離心後以乙醇3升來萃取所得的菌 絲。在真空器中除去乙醇再以正-己烷萃取菌絲並於真空器中 加以濃縮以取得粗產物I ，1 · 9克。將此粗產物加至以正-己烷裝塡的矽膠分析柱（9 5克，默克編號7 7 3 4 )中，以 正—己烷—醋酸乙酯（1 0 : 1 )的混合物沖洗之，再以正— 己烷-醋酸乙酯（1 0 : 2 )洗提之。將洗提液在真空器中加 以濃縮以取得粗產物I I ’ 2 2 · 7毫克。將粗產物I I加至 矽膠薄層板（默克編號5 7 4 4 )上’以正一己烷一醋酸乙酯 本紙張尺度適用中國丨句家疗卑（CNS ) 'ϋ松(21 ()〆27 :Μ;.. ) . 16 . ~ 經滅部中央標^-Λπ〈工消费合竹社卬奴 526201 in 一^ 1_—咖 — 一一—— 五、發明説明彳4 ) 顯影（1 : 1 )。將活性部分剝除並以氯仿一甲醇（2 : 1 ) 洗提之。將洗提液在真空器中加以濃縮以得到粗產物I I I ， 1 3 · 4毫克。然後，將粗產物加至塞得克斯L Η - 2 0 ( Sephadex LH20 )分析柱上，以氯仿—甲醇（1 : 2 )洗提之， 並將洗提液在真空器中加以濃縮以取得F T - 0 5 5 4化合物 1 〇 · 0毫克，此爲白色粉末。 本發明的作用 如上述所說明的，本發明之F 丁 — 0 5 5 4化合物可爲一 種治療寄生蟲病之令人滿意且有用的藥品。 圖形的簡單說明 第1圖顯示出本發明之FT - 0 5 5 4化合物在1 一丙醇 溶液（5 0 // Μ )中的U V譜。 第2圖顯示出本發明之FT - 0 5 5 4化合物的I R譜（ K B r Tab.) 本紙张尺度適州中國阎家彳:?:枣（CNS ) /以( ) -17-

Claims (1)

1. 526201

   __ ..........

   六、申請專利範圍 附件A : 第87 1 1 8287號專利申請案 中.文申請專利範圍修正本 民國91年10月18日修正 式〔I〕所示之F T — 〇 5 5 4化合物··

   CH, 請 先 閲 之 注 項 再 填 頁 % 2 含了： 0 5 5 FT-0 5 5 •…⑴ • 一種用來製備FT - 〇 5 5 4化合物的方法，它包 ①在介質中培養一種屬於黴菌類並具有F T -4化合物之製造活性的微生物，②在培養介質中累積 0 5 5 4化合物，③自該培養物中將F T -4化合物分離出來。 3 ·如申請專利範圍第2項的方法，其中該屬於黴菌類 並具有F T - 〇 5 5 4化合物之製造活性的微生物爲黑麯黴 F T - 〇 5 5 4。 4 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該屬於黴菌類 並具有FT - 〇5 5 4化合物製造活性之微生物是黑麯黴F T — 0554 FERM BP - 6443 (CCRC 930025)。 5 · —種含FT — 0 5 5 4化合物之NAD’ H —富馬酸 鹽還原酶抑制劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製