TW202241502A - 蛋白質封裝微凝膠之製造 - Google Patents

Abstract

本發明提供使用碳氟化合物包烴乳液製造蛋白質封裝微凝膠之方法。基於非水性乳液之微凝膠製造方法可用於封裝廣泛範圍之蛋白質及肽，包括抗體及抗體融合蛋白，以用於治療用途而易於投與。

Description

蛋白質封裝微凝膠之製造

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2020年12月17日申請之美國臨時專利申請案第63/127,033號之優先權及權益，該申請案以引用之方式併入本文中。

本發明大體上係關於藥物微凝膠、含有藥物微凝膠之調配物及使用非水性乳液系統製造藥物微凝膠之方法。

治療性蛋白質向生物相關目標之延長或持續釋放遞送對於治療醫學病狀而言係業界所需的，該等病狀諸如癌症、心血管疾病、血管病狀、骨科病症、牙科病症、創傷、自體免疫疾病、腸胃疾病及眼部疾病，因為該遞送允許需要較低投與頻率之較大劑量。減少注射次數或延長注射間隔對於患者順從性而言可為所需求的，尤其在需要醫生進行注射時，諸如在眼內治療劑之情況下。

已使用生物相容性及可生物降解聚合物及用於受控且持續遞送藥物之其他可植入遞送裝置，包括例如基於聚合物之遞送裝置，其中聚合物隨時間推移降解且治療藥物緩慢釋放。然而，當使用聚合物及基於聚合物之遞送裝置時，尤其用於遞送蛋白質治療劑時，在維持藥物穩定性方面存在各種挑戰。

治療性大分子，諸如抗體及受體Fc融合蛋白必須以不僅使分子適合於向患者投與，且亦在儲存期間及在投與部位處時維持其穩定性的方式調配。舉例而言，水溶液中之治療性蛋白質(諸如抗體或融合蛋白)易於發生降解、聚集及/或非所需化學修飾，除非該溶液經適當調配。

在調配用於持續釋放之治療性蛋白質時，必須非常小心以獲得一種調配物，其在儲存及生理溫度下隨時間推移保持穩定、含有足夠濃度之治療性蛋白質(例如抗體)且具有使該調配物能夠方便地向患者投與之其他特性。

一些延長或持續釋放調配物使用封裝方法產生，該等方法包括形成多重乳液、內相分離、界面聚合、聚電解質之逐層吸附及軟模板化技術。舉例而言，多重乳液之最常見類型為水包油包水(W/O/W)。呈W/O/W之多重乳液能夠將水性/親水性核心直接封裝於水性懸浮液中；然而，當用於將生物活性劑封裝至延長或持續釋放調配物中時，存在特定問題。舉例而言，在水相有機相界面處可出現蛋白質沈澱，伴隨蛋白質免疫反應性之降低。

在其他水性乳液系統中，水可擴散至有機相中且水解蛋白質。水解後，蛋白質小液滴開始合併且逃逸至水性環境中且聚集或沈澱。硬化後，空隙及水通道可能在蛋白質曾經存在但逃逸至水性環境中之處出現。

在另一實例中，水凝膠微粒(在本文中稱為「微凝膠」)可用於提供治療性蛋白質之延長或持續釋放調配物。微凝膠為可包含由大量水水合之交聯親水性聚合網絡的微結構。連接聚合物之交聯可使用共價、離子、親和力及/或物理基礎形成。與需要手術植入之塊狀水凝膠相比，微凝膠柔軟、可變形且可用針頭或導管投與，針頭或導管具有較小侵入性且可產生較佳治療結果。

數種合成途徑可用於製造微凝膠。分批乳液或沈澱聚合為當前基於油包水乳液或反相水包油乳液之最常見方法。在此等方法中，水相之存在 限制了親水性有效負載之封裝效率。

雖然在製造微凝膠時有許多不可混溶的溶劑對可供選擇，但通常選擇一種極性溶劑及一種非極性溶劑。然而，發現適合於合成聚合物微凝膠(在本文中有時稱為微球)的溶劑對可能係一個挑戰，因為典型可生物降解聚合物，包括例如聚(乳酸交酯-共-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)或聚(原酸酯)(poly(ortho ester)，POE)，大部分可溶於具有中等極性之溶劑，諸如氯仿、二氯甲烷或乙酸乙酯。此限制了連續相之選擇。另外，與製程之相容性、毒性、安全性及殘餘溶劑為使用彼等有機溶劑之問題，且對於用作醫藥產品應考慮。

其他製造方法，如微影、微流體聚合及電噴灑通常用作小型實驗室規模方法，且在臨床或商業製造環境中按比例擴大時可經受挑戰。已經由微流控方法製造含有碳氟化合物之各種乳液系統，諸如碳氟化合物包水(water-in-fluorocarbon，W/F)、水包碳氟化合物包水(water-in-fluorocarbon-in-water，W/F/W)雙重乳液、水/碳氟化合物/油/水(water/fluorocarbon/oil/water，W/F/O/W)三重乳液、碳氟化合物/烴/水(fluorocarbon/hydrocarbon/water，F/H/W)雙重乳液及烴/碳氟化合物/水(hydrocarbon/fluorocarbon/water，H/F/W)雙重乳液。此等乳液中之一些已用於聚合微球之合成。然而，所有此等乳液仍為基於水之乳液系統，使用水作為分散相或連續相。

因此，需要使用非水性乳液系統產生微凝膠之方法。

因此，存在對改良的聚合物及基於聚合物之遞送裝置的未滿足需求，該等遞送裝置提供延長或持續釋放調配物以在儘可能少的注射之情況下隨時間推移有效遞送藥物。在其他疾病，例如癌症及發炎疾病之情況下，需要改良的含有穩定且有效蛋白質治療劑之可植入延長或持續釋放調配物。

因此，需要提供用於產生藥物調配物之非水性乳液系統及其使用方法。亦需要提供具有改良蛋白質穩定性、穩定延長或持續釋放(持續釋放)及投與容易性之延長釋放調配物。

在不希望存在水之任何地方，非水性乳液可替代習知水性乳液。兩種類型之基於烴之非水性乳液系統為：(1)藉由嵌段共聚物穩定之兩種不可混溶的有機溶劑(例如己烷/二甲基甲醯胺)；及(2)使用現有界面活性劑替代水之與油不可混溶的極性溶劑(例如甲醯胺、乙腈)。全氟化油包水(W/F)乳液已應用於單細胞或單分子生物分析之基於小液滴的微流控中，其中PFPE-PEG-PFPE用作氟界面活性劑(FS)以便穩定碳氟化合物溶劑中之小水滴。

因此，根據本發明之一些實施例使用碳氟化合物作為非水性乳液系統中之連續相，因為其具有數種合乎需要的特性。第一，碳氟化合物既不疏水亦不親水：其與大部分有機(烴)溶劑不可混溶，使其作為烴小液滴乳液之連續相很理想。第二，碳氟化合物為蛋白質及其他親水性分子、基於烴之聚合物及有機賦形劑的非溶劑；換言之，此等類型之分子將不可溶於碳氟化合物。第三，碳氟化合物具有低黏度。第四，碳氟化合物為化學惰性的，且與常用烴溶劑相比可具有相對較低的毒性或腐蝕性。最後，碳氟化合物具有揮發性且可循環。

已開發出一種使用非水性乳液系統產生微凝膠之方法。該方法包括將至少一種可生物降解及/或可生物侵蝕之可交聯聚合物及至少一種交聯調節劑與烴溶劑組合，以形成非水第一溶液或分散相懸浮液。將第一溶液或分散相懸浮液添加至含有碳氟化合物液體及氟界面活性劑之第二溶液或連續相溶液 中。溶液混合物經由乳化方法進行乳化。藉由首先移除烴溶劑且隨後移除碳氟化合物液體，可回收微凝膠粒子之粉末。藉由將包括治療活性劑，例如治療性蛋白質之粉末懸浮於分散相懸浮液中，可產生緩釋或持續釋放治療劑或藥物微粒。

在一些例示性實施例中，根據本發明提供之藥物微粒包括由交聯聚合物微凝膠皮質包圍之活性成分(諸如蛋白質)。藉由所揭示之方法產生之藥物微粒可具有不含孔隙或通道且未穿孔之交聯聚合物微凝膠皮質。在一些例示性實施例中，藥物微粒之直徑可在約1μm與約200μm之間。

藥物微粒根據本發明使用非水性乳液系統藉由以下製備：將活性成分(例如乾燥蛋白質粉末)、一種或多種可生物降解及/或可生物侵蝕之可交聯聚合物或聚合物前驅物及交聯調節劑組合至烴溶劑中，以形成非水第一溶液或分散相懸浮液，及將第一溶液或分散相懸浮液添加至包含碳氟化合物液體及氟界面活性劑之第二溶液或連續相溶液中。溶液混合物經由乳化方法進行乳化。藉由首先移除烴溶劑且隨後移除碳氟化合物液體，可回收藥物微粒。

亦根據本發明提供含有藥物微粒之調配物。

在特定範疇中，本發明係關於一種產生微粒之方法，其包括將活性成分(例如乾燥蛋白質粉末)及一種或多種可交聯聚合物前驅物與烴溶劑組合以形成非水第一溶液之步驟。

該方法進一步包括將第一溶液添加至第二溶液中，其中第二溶液包含碳氟化合物液體及氟界面活性劑。該方法進一步包括攪拌經組合之第一及第二溶液以形成在碳氟化合物液體中具有多個乳液烴小液滴之非水性乳液。該方法進一步包括移除烴溶劑及移除碳氟化合物液體以分離微凝膠，其中微凝膠包括封裝於交聯聚合物基質內之活性成分。

在例示性實施例中，第二溶液可含有全氟C5-C18化合物。在 其他實施例中，第二溶液可含有FC-70。活性成分(例如乾燥蛋白質粉末)及一種或多種可交聯聚合物前驅物可與選自二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合之烴溶劑組合。在又其他實施例中，活性成分及一種或多種可交聯聚合物前驅物與選自二氯甲烷、乙酸乙酯或其組合之烴溶劑組合。

在例示性實施例中，將第一溶液添加至第二溶液中之步驟包括將第一溶液添加至含有全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚之第二溶液中。

在其他實施例中，與烴溶劑組合之一種或多種可交聯聚合物前驅物包括選自以下之核心：聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚環氧乙烷-共-聚環氧丙烷、共聚環氧乙烷嵌段或無規共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(胺基酸)、聚葡萄糖或其任何組合。

在例示性實施例中，與烴溶劑組合之一種或多種可交聯聚合物前驅物包括有包括親核官能基之第一可交聯聚合物前驅物及包括親電子官能基之第二可交聯聚合物前驅物。與烴溶劑組合之一種或多種可交聯聚合物前驅物可包括PEG-NH第一前驅物及PEG-NHS第二前驅物。與烴溶劑組合之PEG-NH第一前驅物或PEG-NHS第二前驅物中之至少一者可為4臂或8臂化合物中之一者。

在例示性實施例中，與烴溶劑組合之含活性物粉末為蛋白質粉末。與烴溶劑組合之蛋白質粉末可含有抗體、其抗原結合片段、融合蛋白、重組蛋白或其片段或截短形式。在其他實施例中，與烴溶劑組合之蛋白質粉末含有VEGF捕獲蛋白(VEGF-Trap protein)。與烴溶劑組合之VEGF捕獲蛋白可為VEGF捕獲蛋白之截短形式。在又其他實施例中，與烴溶劑組合之蛋白質粉末可藉由噴霧乾燥、電噴灑乾燥、可逆沈澱、噴霧冷凍、微模板化(microtemplating)或其組合進行微粉化。

在例示性實施例中，攪拌經組合之第一及第二溶液之步驟可包 括均質化、渦旋(vortexing)、音波處理(sonication)、空蝕(cavitation)、攪拌(agitation)或其組合。經分離之微粒可為持續釋放微粒。所形成之第一非水溶液可包括1.0%至30% w/v之懸浮於烴溶劑中之噴霧乾燥蛋白質，及5.0%至35% w/v之一種或多種可交聯聚合物前驅物。向其中添加第一非水溶液之第二溶液可含有0.1%至5.0% w/v之氟界面活性劑。

在例示性實施例中，該方法可進一步包括將微粒懸浮於醫藥學上可接受之賦形劑中的步驟。微粒可懸浮於pH緩衝生理食鹽水中。

在另一實施例中，本發明係關於一種用於產生聚合或經聚合物塗佈之微球的方法，其包括以下步驟：將包括1.0%至30.0% w/w之懸浮於第一非水烴溶液中之總固體噴霧乾燥蛋白質的分散相組合至連續相中，以形成分散相之乳液小液滴，其中第一非水烴溶液包含5.0%至35% w/v PEG-NH及1.0%至15% w/v PEG-NH。連續相可包括包含0.1%至5.0% w/v氟界面活性劑之第二非水碳氟化合物溶液。該方法進一步包括藉由移除烴液體來硬化乳液小液滴以形成硬化聚合物或聚合物塗佈之微球的步驟。

在一些例示性實施例中，根據本發明產生水凝膠微粒之方法包含(a)將至少一種可交聯聚合物、至少一種交聯調節劑及包括至少一種蛋白質之粉末與烴溶劑組合以形成分散相懸浮液；(b)將該分散相懸浮液添加至連續相溶液中，其中該溶液包含碳氟化合物液體及氟界面活性劑，以形成經組合之分散相懸浮液及連續相溶液；(c)向該經組合之分散相懸浮液及連續相溶液施加摻合力以形成非水性乳液，該非水性乳液具有多個烴小液滴，該等烴小液滴在碳氟化合物液體中包括該至少一種可交聯聚合物及進一步包括至少一種蛋白質之該粉末；及(d)自該非水性乳液中移除烴溶劑及碳氟化合物液體以形成經分離之水凝膠微粒，其中該等水凝膠微粒包括封裝於該交聯聚合物之基質內的該至少一種蛋白質。

在一個範疇中，至少一種交聯調節劑為非官能化線性PEG聚合物。在另一範疇中，分散相中至少一種交聯調節劑之濃度在約5.0%與約35% w/v之間。

在一個範疇中，碳氟化合物液體為高黏度碳氟化合物。在另一範疇中，連續相溶液包含全氟C5-C18化合物。在又另一範疇中，連續相溶液包含FC-70或全氟三戊胺。

在一個範疇中，烴溶劑選自由以下組成之群組：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃及其組合。在另一範疇中，連續相溶液包含全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。

在一個範疇中，至少一種可交聯聚合物包括選自由以下組成之群組的核心：聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚環氧乙烷-共-聚環氧丙烷、共聚環氧乙烷嵌段或無規共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(胺基酸)、聚葡萄糖及其任何組合。

在一個範疇中，至少一種可交聯聚合物包含包括至少一個親核官能基之第一可交聯聚合物，及包括至少一個親電子官能基之第二可交聯聚合物。在一特定範疇中，至少一個親核官能基與至少一個親電子官能基之莫耳比在約1：1與約1：2之間。在另一特定範疇中，至少一種可交聯聚合物包含PEG-NH第一前驅物及PEG-NHS第二前驅物。在又一特定範疇中，PEG-NH第一前驅物或PEG-NHS第二前驅物為4臂或8臂化合物。

在一個範疇中，至少一種蛋白質為抗體、其抗原結合片段、融合蛋白、重組蛋白或其片段或截短形式。在一特定範疇中，至少一種蛋白質為VEGF捕獲蛋白。在又一特定範疇中，VEGF捕獲蛋白為VEGF捕獲蛋白之截短形式。

在一個範疇中，至少一種蛋白質選自由以下組成之群組：阿柏 西普(aflibercept)、利納西普(rilonacept)、阿利庫單抗(alirocumab)、度匹魯單抗(dupilumab)、賽瑞單抗(sarilumab)、賽咪單抗(cemiplimab)、抗伊波拉(Ebola)抗體及抗SARS-CoV-2抗體。

在一個範疇中，經分離之水凝膠微粒之直徑在約1μm與約200μm之間。在另一範疇中，粉末藉由噴霧乾燥、電噴灑乾燥、可逆沈澱、噴霧冷凍、微模板化或其組合進行微粉化。在又一範疇中，摻合力包含均質化、渦旋、音波處理、空蝕、攪拌或其組合。

在一個範疇中，水凝膠微粒為持續釋放微粒。

在一個範疇中，分散相懸浮液中粉末之濃度在約1.0%與約30% w/v之間。在另一範疇中，分散相懸浮液中至少一種可交聯聚合物之濃度在約5.0%與約35% w/v之間。在又另一範疇中，連續相溶液中氟界面活性劑之濃度在約0.1%與約5.0% w/v之間。

在一個範疇中，方法進一步包含將經分離之水凝膠微粒懸浮於醫藥學上可接受之調配物中。在另一範疇中，調配物包含pH緩衝生理食鹽水、水溶液或非水溶液。

在一個範疇中，粉末進一步包含至少一種賦形劑。

本發明亦提供水凝膠微粒。在一些例示性實施例中，水凝膠微粒藉由前述方法中之任一者產生。

當結合以下描述及附圖考慮時，將更好地瞭解及理解本發明之此等及其他範疇。以下描述儘管指示各種實施例及其多個具體細節，但僅作為例證給出，而不作為限制。可在本發明之範圍內作出許多取代、修改、添加或重排。

藉由結合附圖之圖式參考以下描述，可獲得對本發明所揭示之概念及說明性實施例的更完整理解。

圖1A說明根據例示性實施例經由基於碳氟化合物包烴(hydrocarbon in fluorocarbon，H/F)之(非水)本體乳液產生空白交聯PEG微凝膠的製程。

圖1B展示根據例示性實施例之Fluorinert^TM FC-70(Millipore Sigma)(全氟三戊胺)的化學結構。

圖1C展示根據例示性實施例，氟界面活性劑PFPE-PEG-PFPE(Sphere Fluidics,Pico-Surf^TM 1)，一種全氟聚醚/聚(乙二醇)三嵌段共聚物之化學結構。

圖2說明根據例示性實施例之空白交聯PEG微凝膠的合成途徑。

圖3說明根據例示性實施例製備具有封裝於交聯PEG微凝膠中之噴霧乾燥蛋白質(SDP)之藥物微粒的製程。

圖4A展示懸浮於FC-70中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的明場顯微法影像。

圖4B展示懸浮於FC-70中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的螢光顯微法影像。

圖5A展示懸浮於FC-70中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的明場顯微法影像。

圖5B展示懸浮於FC-70中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的螢光顯微法影像。

圖6A展示懸浮於水中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的明場顯微鏡影像。

圖6B展示懸浮於水中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的螢光顯微法影像。

圖7展示懸浮於水中之根據例示性實施例之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠的螢光顯微法影像。

應瞭解，本發明不限於本文所描述之材料、組合物及方法或所描述之實驗條件，因為此類材料、組合物、方法及/或條件可改變。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述某些實施例之目的且不意欲為限制性的。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域之一般技術者通常所理解相同之含義。可使用類似或等效於本文所描述之組合物、方法及材料的任何組合物、方法及材料來實踐或測試本文所描述之實施例的各個範疇。

除非本文另外指示或與上下文明顯矛盾，否則在描述本文所呈現之實施例的各個範疇的上下文中(尤其在申請專利範圍之上下文中)使用術語「一」及「該」及類似指示物應解釋為涵蓋單數及複數兩者。

除非本文另外指示，否則本文中值範圍的敍述僅僅意欲充當個別提及屬於該範圍的各單獨值的簡寫方法，且各單獨值併入本說明書中，如同在本文中個別地敍述一般。

術語「約」意欲描述高於或低於所述值大約+/- 10%之範圍內的值；在其他例示性實施例中，值範圍可為高於或低於所述值大約+/- 5%之範圍內的值；在其他例示性實施例中，值範圍可為高於或低於所述值大約+/- 2%之範圍內的值；在其他例示性實施例中，值範圍可為高於或低於所述值大約+/- 1%之範圍內的值。前述範圍意欲由上下文闡明，且不暗示進一步限制。

除非本文另外指示或另外與上下文明顯矛盾，否則本文所描述之所有方法均可以任何適合順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅意欲更好地闡明本文所描述之實施例的各個範疇，且並不對本發明之範圍形成限制。本說明書中之任何語言均不應理解為指示任何未主張之要素係實施本文所描述之實施例的各個範疇必不可少的。

術語「蛋白質」係指包括藉由肽鍵彼此接合之兩個或更多個胺基酸殘基的分子。蛋白質包括多肽及肽，且亦可包括修飾，諸如醣基化、脂質附著、硫酸化、麩胺酸殘基之γ-羧化、烷基化、羥基化及ADP核糖基化。蛋白質可具有科學或商業價值，包括基於蛋白質之藥物，且蛋白質尤其包括酶、配位體、受體、抗體及嵌合或融合蛋白。蛋白質可使用熟知細胞培養方法由各種類型之重組細胞產生，且一般可藉由遺傳工程技術(例如編碼嵌合蛋白之序列或密碼子最佳化序列、無內含子序列等)引入至細胞中，在細胞中其可以游離基因體形式存在或整合至細胞之基因體中。

術語「抗體」係指由四條多肽鏈，亦即藉由二硫鍵互連之兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈組成的免疫球蛋白分子。各重鏈具有重鏈可變區(HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區含有三個域，CH1、CH2及CH3。各輕鏈具有輕鏈可變區及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區由一個域(CL)組成。VH及VL區可進一步細分成被稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插有被稱為構架區(FR)之較保守區。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語「抗體」包括對屬於任何同型或子類之醣基化及非醣基化免疫球蛋白兩者的參考。術語「抗體」包括藉由重組手段製備、表現、產生或分離之抗體分子，諸如自經轉染以表現抗體之宿主細胞中分離的抗體。術語抗體亦包括 雙特異性抗體，其包括可結合至超過一個不同抗原決定基之異源四聚體免疫球蛋白。雙特異性抗體一般描述於美國專利案第8,586,713號中，其以引用之方式併入本申請案中。

術語「Fc融合蛋白」包括不另外在自然界中發現在一起之兩種或更多種蛋白質的部分或全部，該等蛋白質中之一者為免疫球蛋白分子之Fc部分。包括與抗體衍生之多肽之各種部分(包括Fc域)融合的某些異源多肽之融合蛋白的製備已例如由Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535,1991；Byrn等人，Nature 344：677,1990；及Hollenbaugh等人，「免疫球蛋白融合蛋白之構築(Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins)」，在Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1至10.19.11頁，1992中描述。「受體Fc融合蛋白」包括與Fc部分偶合之受體的一個或多個細胞外域，Fc部分在一些實施例中包括鉸鏈區，隨後為免疫球蛋白之CH2及CH3域。在一些實施例中，Fc融合蛋白包括結合至一個或多個配位體之兩條或更多條相異受體鏈。舉例而言，Fc融合蛋白可為捕獲蛋白，諸如IL-1捕獲蛋白或VEGF捕獲蛋白。在一些例示性實施例中，本發明所使之Fc融合蛋白可為VEGF捕獲蛋白，諸如阿柏西普。

術語「微粉化蛋白質粒子」或「蛋白質粒子」係指含有多個蛋白質分子之粒子，其具有低、極低或接近於零之量的水(例如<3重量%之水)。如本文所用，微粉化蛋白質粒子一般為球形，且具有在約2微米至約35微米範圍內之等效圓直徑(ECD)。微粉化蛋白質粒子不限於任何特定蛋白質實體，且適合於製備及遞送治療性蛋白質。常見治療性蛋白質包括尤其抗原結合蛋白，諸如可溶性受體片段、抗體(包括IgG)及抗體之衍生物或片段、其他含Fc之蛋白質，包括Fc融合蛋白及受體-Fc融合蛋白，包括捕獲型蛋白(Huang,C.,Curr.Opin.Biotechnol.20：692-99(2009))，諸如VEGF捕獲蛋白。

術語「水凝膠微粒」(微凝膠)係指包含親水性聚合網絡之微結構。聚合物之網絡藉由交聯連接，交聯可具有共價、離子、親和力或物理基礎。微凝膠已顯現為用於控制釋放治療性蛋白質之潛在遞送媒劑。與需要手術植入之塊狀水凝膠相比，柔軟、可變形的微凝膠可用針頭或導管向患者遞送，針頭或導管具有較小侵入性且可產生較佳治療結果。使用本文所描述之製程，微粉化蛋白質粒子(亦即，蛋白質粉末之微粉化形式，例如噴霧乾燥VEGF捕獲蛋白粉末)可懸浮於含有可交聯聚合物之烴溶液中。經歷用於交聯之化學反應的可交聯聚合物亦可稱為聚合物前驅物。添加交聯劑後，可立即將懸浮液(在本文中亦稱為第一溶液或分散相懸浮液)添加至含有氟界面活性劑之碳氟化合物連續相中。烴相經由乳化方法快速分散。由於碳氟化合物連續相將可交聯聚合物及噴霧乾燥蛋白質粉末限制在烴小液滴內，因此乳液小液滴中之聚合物交聯且隨後硬化成個別微凝膠。

使用烴-碳氟化合物乳液產生水凝膠微粒

基於油及基於水之乳液系統通常用於聚合微粒或奈米粒子合成，其中疏水性聚合物材料溶解於有機相中且分散於水性連續相中。然而，對於水溶性聚合物，例如PEG或羧甲基纖維素(CMC)，及在水存在下容易水解之聚合物，例如聚酸酐、具有短中間嵌段之脂族聚酯(如聚乳酸)及某些聚(胺基酸)(如聚(麩胺酸))，習知基於水之乳液系統並不理想。除水溶性聚合物溶解於水性連續相中之不希望的作用之外，諸如PEG-NHS之官能化交聯聚合物可與水反應，使得交聯之反應動力學變得極不利於微凝膠形成。

另外，使用水性乳液系統產生之醫藥調配物可在產生期間將藥物，例如蛋白質藥物自乳液小液滴洩漏至水性連續相中。此種藥物自乳液小液滴之洩漏導致封裝功效低。諸如蛋白質藥物之水溶性藥物可溶解於水性連續相 中，阻止藥物自微凝膠中逐漸持續釋放。

提供使用無水或非水性乳液系統調配醫藥組合物之系統及方法。所揭示之無水乳液方法克服了上文所描述之現有水性乳液系統的問題。

本文所描述之非水基乳液方法封裝藥物分子，包括但不限於親水性藥物，諸如蛋白質，其中相對於水性乳液系統封裝功效提高，原始蛋白質微粒結構滯留增加或其組合。所揭示之無水乳液系統及方法可藉由本體方法(例如攪拌、均質化或音波處理)及其他習知方法產生經封裝之藥物調配物。本文所揭示之系統及方法亦可應用於廣泛範圍之聚合物材料、固態有效負載及乳化方法。

碳氟化合物包烴包固體(Solid-in-Hydrocarbon-in-Fluorocarbon，S/H/F)乳液

例示性非水S/H/F乳液方法包括以下步驟：將乾燥蛋白質粉末、一種或多種可生物降解及/或可生物侵蝕之可交聯聚合物或聚合物前驅物及一種或多種交聯調節劑組合至烴溶劑中，以形成非水第一溶液或分散相懸浮液，及將第一溶液或分散相懸浮液添加至含有碳氟化合物液體及氟界面活性劑之第二溶液或連續相溶液中。第一溶液或分散相懸浮液與第二溶液或連續相溶液之組合以形成在碳氟化合物液體中含有多個乳液烴小液滴之非水性乳液的方式進行，例如藉由施加摻合力，諸如攪拌、音波處理、空蝕、均質化或渦旋。

本發明之方法進一步包括移除烴溶劑及移除碳氟化合物液體以分離具有一個或多個微粉化蛋白質之核心及交聯可生物降解聚合物之皮質的水凝膠微粒。

在一些例示性實施例中，攪拌乳液，且在環境條件下或在真空下蒸發烴及碳氟化合物液體。在一些例示性實施例中，可將氫氟醚(HFF)添加至碳氟化合物以幫助將烴自分散相萃取至碳氟化合物連續相中。可視情況洗 滌所得微粒以移除烴溶劑、碳氟化合物液體、氟界面活性劑或其組合。可使用本體乳液技術形成乳液。移除烴及碳氟化合物液體硬化微粒，其可隨後收集。

在一些例示性實施例中，微粒可藉由過濾收集。藉由本發明非水性乳液方法產生之持續釋放微粒含有封裝於交聯可生物降解及/或可生物侵蝕聚合物之基質內之蛋白質。在一些例示性實施例中，微粒具有單個核心-外殼結構。在其他例示性實施例中，微粒具有分散於聚合物內之多個核心。

在再其他例示性實施例中，微粒群包括具有由聚合物皮質封裝之單核心結構的微粒及在聚合物皮質中具有多核心結構的微粒兩者。碳氟化合物液體可為高黏度碳氟化合物，諸如全氟C5-C18化合物，包括但不限於FC-40或FC-70(全氟三戊胺)，且烴溶液可包括選自乙酸乙酯、氯仿、甲苯、四氫呋喃及二氯甲烷或其組合之烴溶劑。在一些例示性實施例中，氟界面活性劑為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，其可以Pico-Surf^TM 1商購。

在一些例示性實施例中，連續相溶液中氟界面活性劑之濃度可為約0.1%與約10% w/v之間、約0.1%與約5% w/v之間、約1%與約10% w/v之間、約1%與約5% w/v之間，約0.1% w/v、約0.2% w/v、約0.3% w/v、約0.4% w/v、約0.5% w/v、約0.6% w/v、約0.7% w/v、約0.8% w/v、約0.9% w/v、約1% w/v、約1.5% w/v、約2% w/v、約2.5% w/v、約3% w/v、約3.5% w/v、約4% w/v、約4.5% w/v、約5% w/v或約10% w/v。

可交聯聚合物及聚合物前驅物

適合於產生本發明之水凝膠微粒之交聯聚合物皮質的前驅物通常為多官能的，意謂其包括兩個或更多個親電子或親核官能基，使得一個前驅物上之親核官能基可與另一前驅物上之親電子官能基反應以形成共價鍵。前驅物可包括超過兩個官能基，使得作為親電子-親核反應之結果，前驅物組合形成 交聯聚合產物。此類反應稱為「交聯反應」。在一些例示性實施例中，可採用多於一種前驅物，其中第一前驅物為聚合物前驅物(含有例如親電子基團)，且第二前驅物為低分子量化合物(含有例如親核基團)。應理解，視皮質之所需特徵而定，可採用一種、兩種、三種、四種或更多種不同前驅物，其限制條件為前驅物中之至少一者為聚合的。

在一些例示性實施例中，各前驅物僅包括親核官能基或僅包括親電子官能基，只要親核前驅物及親電子前驅物均在交聯反應中使用即可。因此，舉例而言，若交聯劑(具有相對低分子量)具有親核官能基，諸如胺，則功能性聚合物(具有相對高分子量)可具有親電子官能基，諸如N-羥基丁二醯亞胺。另一方面，若交聯劑具有親電子官能基，諸如磺基丁二醯亞胺，則功能性聚合物可具有親核官能基，諸如胺。因此，可使用諸如蛋白質、聚(烯丙基胺)或胺封端之二官能或多官能聚(乙二醇)(「PEG」)之功能性聚合物。

在一些例示性實施例中，第一前驅物中親核基團之數目可為約2-30、約2-25、約2-20、約2-15、約2-10、約5-30、約5-20、約5-15、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個。

在一些例示性實施例中，第二前驅物中親電子基團之數目可為約2-30、約2-25、約2-20、約2-15、約2-10、約5-30、約5-20、約5-15、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29或約30個。

可交聯聚合物或聚合物前驅物可具有生物惰性及水溶性核心。在分支聚合物之情況下，核心係指分子之連續部分，其與自該核心延伸之臂接 合，其中各臂之末端具有官能基。當核心為水溶性聚合區時，可使用之適合聚合物包括聚醚，例如聚環氧烷，諸如聚乙二醇(「PEG」)；聚環氧乙烷(「PEO」)；聚環氧乙烷-共-聚環氧丙烷(「PPO」)；共聚環氧乙烷嵌段或無規共聚物及聚乙烯醇(「PVA」)；聚(乙烯基吡咯啶酮)(「PVP」)；聚(胺基酸)；聚葡萄糖；及其類似物。當核心本質上為小分子時，可使用多種親水性官能基中之任一者來使前驅物可溶於水。舉例而言，可使用水溶性官能基，如羥基、胺、磺酸酯及羧酸酯來使前驅物可溶於水。另外，辛二酸之N-羥基丁二醯亞胺(「NHS」)酯不溶於水，但藉由將磺酸酯基添加至丁二醯亞胺環中，可使辛二酸之NHS酯可溶於水，而不影響其對胺基之反應性。

為了提供可生物降解或可吸收之生物相容性交聯聚合物，可使用一種或多種在官能基之間存在可生物降解鍵聯之前驅物。可生物降解鍵聯亦可視情況充當一種或多種前驅物之水溶性核心。在替代方案中，或另外，可選擇前驅物之官能基，使得其之間的反應產物產生可生物降解鍵聯。對於各方法，可選擇可生物降解鍵聯，使得所得可生物降解、生物相容性交聯聚合物將在所需時段內降解或吸收。可選擇在生理條件下降解成無毒產物之可生物降解鍵聯。

可生物降解鍵聯可為可化學或酶促水解或可吸收的。可化學水解之可生物降解鍵聯的實例包括乙交酯、dl-乳酸交酯、l-乳酸交酯、己內酯、二氧環己酮及碳酸三亞甲酯之聚合物、共聚物及寡聚物。可酶促水解之可生物降解鍵聯的實例包括可藉由金屬蛋白酶及膠原蛋白酶裂解之肽鍵。可生物降解鍵聯之額外實例包括聚(羥基酸)、聚(原碳酸酯)、聚(酸酐)、聚(內酯)、聚(胺基酸)、聚(碳酸酯)及聚(膦酸酯)之聚合物及共聚物。

某些官能基，諸如醇或羧酸，在生理條件(例如pH 7.2-11.0，37℃)下通常不與其他官能基，諸如胺反應。然而，可藉由使用活化基團，諸如 N-羥基丁二醯亞胺來使此類官能基更具反應性。用於活化此類官能基之數種方法為此項技術中已知的。適合之活化基團包括羰基二咪唑、磺醯氯、芳基鹵化物、磺基丁二醯亞胺酯、N-羥基丁二醯亞胺酯、丁二醯亞胺酯、環氧化物、醛、順丁烯二醯亞胺、醯亞胺酯及其類似物。N-羥基丁二醯亞胺酯或N-羥基磺基丁二醯亞胺基團為適合於交聯蛋白質或胺官能化聚合物，諸如胺基封端之聚乙二醇(aminoterminated polyethylene glycol，「APEG」)的基團。

來自具有能夠原位反應及交聯之親電子及親核基團之水溶性前驅物的適合生物相容性交聯聚合物，以及其製備及使用方法揭示於例如美國申請案號專利第8,535,70號中，其以引用之方式併入本文中。在一些例示性實施例中，可生物侵蝕、可交聯聚合物前驅物為PEG-NHS。

在一些例示性實施例中，代替可使用化學反應交聯之聚合物前驅物，可使用利用物理相互作用交聯之可交聯聚合物。如本文所用，術語「可交聯聚合物」涵蓋聚合物前驅物及物理相互作用可交聯聚合物，其中任一者可適合於本發明之方法。

治療劑之釋放持續時間及釋放曲線視諸如以下因素而定：聚合物皮質中之交聯密度、蛋白質自基質中之擴散及基質自身之溶解。聚合物皮質之特性可經由數種因素調整，包括可交聯聚合物之分支(4臂或8臂)、可交聯聚合物之臂長及-NHS基團與-NH基團之莫耳比率(MR)。

親核基團與親電子基團之莫耳比率可決定交聯密度。莫耳比率為1產生最高交聯密度。與莫耳比率為一相比，大於或小於1之莫耳比率可產生較低交聯密度。交聯密度隨莫耳比率增加而增大，直至莫耳比率達到值1，隨後交聯密度隨莫耳比率增加超過值1而減小。當交聯密度較低時，嵌入於水凝膠中之藥物可較快釋放。因此，藉由調整親核基團與親電子基團之莫耳比率，可調整藥物之釋放動力學。

莫耳比率可有效調節交聯密度(形成網絡之共價交聯之數目)及水凝膠基質內之網絡孔徑兩者。藉由減小交聯密度，基質之有效孔徑可增大，使得藥物通過基質之擴散較快。另外，減小交聯密度可增加水凝膠中之域，在該等域中蛋白質粒子周圍之交聯聚合物的局部濃度不足以在水合時將蛋白質保持為固態，引起突釋以及以質量計之擴散速率的增加。因此，在莫耳比率增加時，擴散控制體系中之突釋及釋放動力學均可增加。

另外，Chen等人(美國專利申請公開案第US2020/0038328A1號，其以引用之方式併入本文中)觀測到溶解控制體系中釋放曲線之斜率隨莫耳比率增加而增大。此可藉由交聯程度隨莫耳比率增加而降低來解釋，因為可供反應及交聯之親核基團及親電子基團之數目之間的存在更大的不匹配。生長速率由交聯之水解速率決定，使得水凝膠溶脹增加且伴隨交聯聚合物之局部濃度降低，其引起蛋白質粒子之額外溶解。水凝膠之溶脹亦與水凝膠孔隙率相關，孔隙率隨著蛋白質溶解發生而提高。在莫耳比率增加及水合時蛋白質溶解增加時，水凝膠之有效孔隙率因此將提高，引起溶解控制體系中之較多溶脹、較快水解及較快生長速率。此外，確定擴散控制體系與溶解控制體系之間轉變的反曲點將與莫耳比率反相關。由於有效擴散速率隨莫耳比率增加而提高，因此擴散增加至其不再為速率限制步驟所需的時間縮短，且藉此使反曲點移至較早時間點。綜合考慮，單獨改變莫耳比率可允許視所需結果而定，將釋放曲線自接近線性調節至S形(sigmoidal)。

在一些例示性實施例中，親核基團與親電子基團之莫耳比率大於1。在其他例示性實施例中，親核基團與親電子基團之莫耳比率小於1。在其他例示性實施例中，親核基團與親電子基團之莫耳比率可在約0.1至3.0範圍內，例如約0.1至0.9、約0.1至0.8、約0.1至0.7、約0.1至0.6、約0.2至0.9、約0.2至3.0、約0.2至2.8、約0.2至2.5、約0.5至2.5、約0.5至2.0、約 0.8至2.5、約0.8至2.0、約1.1至2.0、約1.1至2.5、約1.1至3.0、約1.5至3.0、約1.5至2.5、約1.5至2.0或約1.3至1.8範圍內。在一些例示性實施例中，親核基團與親電子基團之莫耳比率可為約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9或約3.0。

與莫耳比率相關，第一前驅物中親核基團之數目及/或第二前驅物中親電子基團之數目亦可決定交聯密度。一般而言，在給定莫耳比率下，親核或親電子基團之數目愈高，交聯密度愈高。在一些實施例中，方法包含選擇8臂PEG NH及8臂PEG NHS試劑用於60天或更長之釋放期。在一些實施例中，方法包含選擇4臂PEG NH及4臂PEG NHS試劑用於小於60天之釋放期。

可用於調節水凝膠微粒之釋放動力學的另一參數為第一及/或第二可交聯聚合物之分子量。在給定莫耳比率下，可交聯聚合物之分子量愈低，網絡孔徑愈小。第一及第二可交聯聚合物之分子量對釋放曲線具有非連續或離散的影響。如本文所用，術語「非連續」或「離散」意謂無法在層級之間進行內插。舉例而言，具有預定分子量之第一及第二可交聯聚合物(例如PEG試劑)的組合可界定一系列可能的釋放期。諸如莫耳比率之其他因素可用於微調釋放曲線或釋放期。

可用於調節釋放動力學之另一參數為藥物及賦形劑與水凝膠之重量比率。藥物及賦形劑與水凝膠之重量比率在本文中亦稱為「固體負載」。此係指藥物及賦形劑與構成藥物負載水凝膠之藥物、賦形劑及聚合物之總重量的重量比率。增加固體負載可改變釋放曲線之形狀，主要係由於反曲點之前的初始擴散階段期間釋放更快。溶解階段起始(反曲點)與固體負載之間亦有可 能存在反相關。以不受理論約束為前提，隨著固體負載增加，預期在初始擴散階段期間釋放更快，因為在藥物溶解度受限較少之可交聯聚合物濃度相對低的微環境中將存在更大量的藥物。此類區中之藥物可在基質初始水合時溶解，從而提高濃度依賴性擴散速率。另外，對於呈蛋白質粒子形式之藥物，初始水合時溶解之蛋白質粒子增加將在基質內產生空隙且引起基質孔隙率提高。更多孔之基質亦將提高通過本體基質的有效擴散速率且在藥物到達表面時釋放。以不受理論約束為前提，反曲點與固體負載之間的反相關亦可假設地藉由隨著固體負載增加觀測到之擴散速率提高來解釋。反曲點表示擴散控制體系與溶解控制體系之間的轉變。隨著固體負載增加，擴散速率在開始時較高且更快速地提高，使得速率受擴散限制之持續時間較短。在擴散控制體系中，溶解藥物通過基質之擴散為藥物釋放之速率限制步驟。隨著更多蛋白質粒子溶解，基質內產生空隙且基質之孔隙率提高，引起擴散速率提高。在溶解控制體系中，通過基質之擴散不再為速率限制步驟。隨著固體負載增加，更快到達此點。

在一些例示性實施例中，分散相懸浮液中可交聯聚合物或聚合物前驅物之濃度可為約1%與約50% w/v之間、約1%與約35% w/v之間、約1%與約20% w/v之間、約5%與約50% w/v之間、約5%與約35% w/v之間、約5%與約20% w/v之間，約1% w/v、約2% w/v、約3% w/v、約4% w/v、約5% w/v、約6% w/v、約7% w/v、約8% w/v、約9% w/v、約10% w/v、約15% w/v、約20% w/v、約25% w/v、約30% w/v、約35% w/v、約40% w/v、約45% w/v或約50% w/v。

在一些例示性實施例中，本發明提供一種用於產生經聚合物塗佈之微球的方法，藉由將(1)具有1.0%至30.0% w/v懸浮於烴溶液中之噴霧乾燥蛋白質之分散相與(2)連續相組合以形成分散相之乳液小液滴，其中烴溶液在烴溶劑中包含5.0%至35% w/v之一種或多種可交聯聚合物，其中連續相 包含含有0.1%至5.0% w/v氟界面活性劑之碳氟化合物溶液。該方法進一步包括藉由移除烴溶液來硬化乳液小液滴以形成硬化交聯聚合物塗佈之微球。

在一些例示性實施例中，碳氟化合物溶液可為高黏度碳氟化合物，諸如全氟C5-C18化合物，包括但不限於FC-40或FC-70，且烴溶液可選自包括以下之群：乙酸乙酯、氯仿、甲苯、四氫呋喃、二氯甲烷或其組合。在一些例示性實施例中，氟界面活性劑可為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，其可以Pico-Surf^TM 1商購。該方法亦可包括在真空下攪拌乳液以移除烴，添加氫氟醚(HFE)以加速微球硬化及/或過濾以移除碳氟化合物溶液。

在其他例示性實施例中，噴霧乾燥蛋白質可封裝於交聯聚乙二醇微凝膠中。PEG之交聯可經由將含有親核基團之PEG前驅物(諸如PEG-NH)與含有親電子基團之PEG前驅物(諸如PEG-NHS)混合來達成。在一些例示性實施例中，將非官能化PEG添加至反應混合物中可用於調節交聯反應速度，因為非官能化PEG維持烴相黏度同時降低官能化PEG前驅物濃度。因此，改變官能化PEG前驅物與交聯調節劑(純非官能化PEG)之比率可用於達成所需膠凝時間。

在一些例示性實施例中，分散相懸浮液中交聯調節劑之濃度可為約1%與約50% w/v之間、約1%與約35% w/v之間、約1%與約20% w/v之間、約5%與約50% w/v之間、約5%與約35% w/v之間、約5%與約20% w/v之間，約1% w/v、約2% w/v、約3% w/v、約4% w/v、約5% w/v、約6% w/v、約7% w/v、約8% w/v、約9% w/v、約10% w/v、約15% w/v、約20% w/v、約25% w/v、約30% w/v、約35% w/v、約40% w/v、約45% w/v或約50% w/v。

再其他例示性實施例提供藉由製備含有溶解可交聯聚合物及噴霧乾燥蛋白質粉末之烴溶液以產生分散相來產生經交聯聚合物塗佈之微粒的方 法。該方法進一步包括將分散相與連續相組合以在連續相中產生分散相之乳液小液滴，其中連續相包含碳氟化合物液體及0.1%至5.0% w/v之氟界面活性劑，及收集經聚合物塗佈之微粒。烴溶液可包括選自包括乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或其組合之群的烴溶劑。碳氟化合物溶液可為高黏度碳氟化合物。在例示性實施例中，碳氟化合物溶液可含有FC-40或FC-70，且氟界面活性劑可為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚，其可以Pico-Surf^TM 1商購。

烴溶劑

在一些例示性實施例中，選擇烴溶劑(亦稱為烴液體)以使得聚合材料，例如可生物降解或可生物侵蝕之可交聯聚合物可溶於烴。在一些實施例中，烴溶劑選自包括以下之群：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃或其組合。在一些實施例中，烴溶劑可含有乙腈、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、丙酮、乙醇、甲醇、戊烷、丙醇、己烷或其組合。

氟液體(fluoroliquid)

例示性氟液體為碳氟化合物液體，包括但不限於Flourinert^TM FC-40(平均MW=650g/mol)1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟-N,N-雙(1,1,2,2,3,3,4,4,4-九氟丁基)丁-1-胺、Fluorinert^TM FC-70(平均MW=821g/mol)(全氟三戊胺)或其組合。在一些例示性實施例中，碳氟化合物液體為或包含氫氟醚(HFE)。例示性HFE包括但不限於NOVEC^TM 7000(1-甲氧基七氟丙烷)、NOVEC^TM 7100(甲氧基-九氟丁烷)、NOVEC^TM 7200(乙氧基-九氟丁烷)或NOVEC^TM 7500(2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷。在再其他例示性實施例中，碳氟化合物液體包含FC-40、FC-70、Novec^TM 7500、Novec^TM 7100、Novec^TM 7000或其組合。在某些實施例中，除氟液體之外，第二溶液或連續相溶液亦包含氟界面活 性劑(FS)。例示性FS為全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚(PFPE-PEG-PFPE)三嵌段共聚物，其可以Pico-Surf^TM 1商購。在一些例示性實施例中，碳氟化合物液體或第二溶液或連續相溶液包含FC-40及Pico-Surf^TM 1。

在一些例示性實施例中，FS為：

其中

其中：n約37，x+z約6.0，y約12.5，或其中n=3.7，x+z約3.6，y約9.0。(參見Lee,M.等人，Lab Chip.,7：14(3)：509-13(2014))。

在一些例示性實施例中，HFE具有以下化學結構，對應於2-(三氟甲基)-3-乙氧基十二氟己烷：

在其他例示性實施例中，碳氟化合物液體或第二溶液或連續相溶液包含FC-70，其具有如圖1B中所示之結構。

適用於根據本發明之方法的其他HFE包括一類分子，其中所有氫原子均存在於無氟取代之碳上，且由醚氧與氟化碳隔開，亦即RfORh。HFE具有可為直鏈、分支鏈或環狀或其組合(諸如烷基環脂族)之分子結構，且較佳不含烯系不飽和性，具有總計約4至約20個碳原子。此類HFE為已知的且可容易地作為基本上純化合物或作為混合物獲得。歸因於HFE之親脂性及親氟 性，其可與碳氟化合物及烴兩者混溶。當添加至烴/碳氟化合物乳液中時，其可充當共溶劑以將烴萃取至碳氟化合物相中且加速硬化製程。

在一些例示性實施例中，烴溶劑、碳氟化合物或兩者視情況在真空下藉由蒸發移除，同時攪拌乳液。在一些例示性實施例中，藉由過濾，視情況真空過濾來收集微粒。

視不同HFE之親脂性及親氟性而定，碳氟化合物相中HFE之百分比可為0-40% v/v。增加HFE百分比提高烴萃取速率。然而，HFE之百分比不應過高，因為微粒之大小及形態可能變得更難以控制。

可侵蝕或可生物降解聚合物交聯調節劑

為了維持烴相黏度同時降低官能化可交聯聚合物濃度，可將交聯調節劑添加至烴相中。此將降低交聯反應速度且延長膠凝時間。在一些例示性實施例中，交聯調節劑為非官能化可侵蝕或可生物降解聚合物。

在例示性實施例中，交聯調節劑為選自包含以下之群組的聚合物：分支或線性聚乙二醇(PEG)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚-D,L-乳酸交酯-共-乙交酯(PLGA)、PLGA-環氧乙烷反丁烯二酸酯、酯化至聚乙二醇1000之PLGA-α-生育酚丁二酸酯(PLGA-TGPS)、聚酸酐聚[1,6-雙(對羧基苯氧基)己烷](pCPH)、聚(羥基丁酸-共羥基戊酸)(PHB-PVA)、聚乙二醇-聚(乳酸)共聚物(PEG-PLA)、聚-ε-己內酯(PCL)、聚-烷基-氰基-丙烯酸酯(PAC)、聚(乙基)氰基丙烯酸酯(PEC)、氰基丙烯酸聚異丁酯、聚-N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺(聚(HPMA))、聚-β-R-羥基丁酸酯(PHB)、聚-β-R-羥基烷酸酯(PHA)、聚-β-R-蘋果酸、磷脂-膽固醇聚合物、2-二油醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼/聚乙二醇-二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DOPC/PEG-DSPE)/膽固醇、多醣、纖維素、乙基纖維素、甲基纖維素、 海藻酸鹽、聚葡萄糖及聚葡萄糖水凝膠聚合物、直鏈澱粉、菊糖、果膠及瓜爾豆膠、聚葡萄胺糖、幾丁質、肝素、玻尿酸、基於環糊精(CD)之聚輪烷(polyrotaxane)及聚準輪烷(polypseudorotaxane)、聚天冬胺酸、聚麩胺酸、聚白胺酸、白胺酸-麩胺酸共聚物、聚丁二酸丁二醇酯、明膠、膠原蛋白、血纖維蛋白、絲蛋白、聚原酸酯、聚原酸酯-聚醯胺共聚物、聚原酸酯-二胺共聚物、併有潛酸之聚原酸酯、聚(乙二醇)/聚(對苯二甲酸丁二醇酯)共聚物，及其組合及共聚物。

如本文所用，術語「聚合物」係指含有由共價化學鍵連接之重複單體的大分子。在一些例示性實施例中，聚合物可為生物相容性、可生物降解及/或可生物侵蝕的。生物相容性及/或可生物降解聚合物可為天然或合成的。

在一些例示性實施例中，可侵蝕或可生物降解聚合物可為由交聯連接之聚合物網絡的一部分。交聯可具有共價、離子、親和力或物理基礎。根據本發明之例示性實施例中存在的共價交聯可利用具有多個反應性官能基之聚合物或聚合物前驅物，該等反應性官能基經混合及觸發以彼此反應形成基質。對於使用H/F乳液製備水凝膠微粒(微凝膠)，交聯反應應主要在乳化製程後起始，且在烴乳液小液滴內進行，以形成穩定交聯且獨特的微凝膠粒子。因此，控制交聯反應動力學或膠凝速率有助於產生具有所需特徵之獨特的交聯微凝膠粒子。

蛋白質藥物

一般而言，任何活性成分可併入本發明之微粒中。在一些例示性實施例中，活性成分為藥物。在特定例示性實施例中，活性成分為蛋白質。此類蛋白質可包括但不限於抗體、受體、融合蛋白、拮抗物、抑制子、酶(諸 如酶替代療法中所用之酶)、因子及輔因子、細胞介素、趨化介素、阻遏子、活化子、配位體、報導蛋白、選擇蛋白、蛋白質激素、蛋白質毒素、結構蛋白、貯藏蛋白、運輸蛋白、神經傳遞質及收縮性蛋白。通常，蛋白質例如藉由噴霧乾燥、電噴灑乾燥、可逆沈澱、噴霧冷凍、微模板化或其組合進行微粉化。在一些例示性實施例中，蛋白質為VEGF捕獲蛋白或其截短形式。可用於所揭示之方法之蛋白質的其他實例描述於下文中。

在一些例示性實施例中，藉由所揭示之無水乳液方法及系統產生之微粒調配物包括藥物。例示性藥物包括但不限於蛋白質、融合蛋白及其片段、抗體及其抗原結合片段。在一些例示性實施例中，蛋白質為VEGF捕獲蛋白(例如阿柏西普，其含有VEGF受體Flt1之Ig域2與VEGF受體Flk1之Ig域3與hIgG1之Fc的融合體，例如如美國專利第7,087,411號、第7,279,159號及第8,144,840號中所描述，該等專利以全文引用之方式併入本文中)。在一些例示性實施例中，VEGF捕獲蛋白為如美國專利第7,396,664號中所描述之VEGF捕獲蛋白的截短形式，該專利以全文引用之方式併入。

抗體(亦稱為「免疫球蛋白」)為具有多條多肽鏈及大量轉譯後修飾之蛋白質的實例。典型免疫球蛋白蛋白質(例如IgG)包含四條多肽鏈-兩條輕鏈及兩條重鏈。各輕鏈經由半胱胺酸二硫鍵連接至一條重鏈，且兩條重鏈經由兩個半胱胺酸二硫鍵彼此結合。哺乳動物系統中產生之免疫球蛋白亦在各種殘基處(例如在天冬醯胺殘基處)經各種多醣醣基化，且可在物種間不同，此可影響治療性抗體之抗原性。Butler及Spearman，「哺乳動物細胞宿主之選擇及醣基化工程之可能性(The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering)」,Curr.Opin.Biotech.30：107-112(2014)。

抗體重鏈恆定區包含三個域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域 CL。VH及VL區可進一步細分成被稱為互補決定區(CDR)之高變區，穿插有被稱為構架區(FR)之較保守區。各VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列之三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈CDR可縮寫為HCDR1、HCDR2及HCDR3；輕鏈CDR可縮寫為LCDR1、LCDR2及LCDR3。術語「高親和力」抗體係指如藉由表面電漿子共振，例如BIACORE^TM或溶液親和ELISA所量測，與其目標之結合親和力為至少10-9M、至少10-10M；至少10-11M；或至少10-12M之抗體。

抗體輕鏈包括來自任何生物體之免疫球蛋白輕鏈恆定區序列，且除非另外說明，否則包括人類κ及λ輕鏈。除非另外說明，否則輕鏈可變(VL)域通常包括三個輕鏈CDR及四個構架(FR)區。一般而言，全長輕鏈自胺基端至羧基端包括VL域，其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；及輕鏈恆定域。可與此等發明一起使用之輕鏈包括不選擇性結合由抗原結合蛋白選擇性結合之第一或第二抗原的輕鏈。適合之輕鏈包括可藉由篩選現有抗體庫(濕庫或電腦模擬)中最常用之輕鏈來鑑別的輕鏈，其中該等輕鏈實質上不干擾抗原結合蛋白之抗原結合域的親和力及/或選擇性。適合之輕鏈包括可結合由抗原結合蛋白之抗原結合區結合之一個或兩個抗原決定基的輕鏈。

抗體可變域包括免疫球蛋白輕鏈或重鏈(視需要經修飾)之胺基酸序列，該輕鏈或重鏈以自N端至C端之順序包含以下胺基酸區(除非另外指示)：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。「可變域」包括能夠摺疊成具有雙β褶板結構之典型域(VH或VL)的胺基酸序列，其中β褶板經第一β褶板之殘基與第二β褶板之殘基之間的二硫鍵連接。

抗體互補決定區(「CDR」)包括由生物體免疫球蛋白基因之核酸序列編碼的胺基酸序列，其通常(亦即，在野生型動物中)出現在免疫球蛋白分子(例如抗體或T細胞受體)輕鏈或重鏈之可變區中的兩個構架區之間。 CDR可由例如生殖系序列或經重排或未經重排序列編碼，且例如藉由原始或成熟B細胞或T細胞編碼。在某些情況下(例如對於CDR3)，CDR可由兩個或更多個不連續(例如在尚未經重排之核酸序列中)但在B細胞核酸序列中連續的序列(例如生殖系序列)編碼，例如由於剪接或連接該等序列(例如V-D-J重組以形成重鏈CDR3)。

以上抗體組分中之各者可根據本發明之方法產生。

雙特異性抗體包括能夠選擇性結合兩個或更多個抗原決定基之抗體。雙特異性抗體一般包含兩條不同重鏈，其中各重鏈特異性結合兩種不同分子(例如抗原)上或同一分子上(例如同一抗原上)之不同抗原決定基。若雙特異性抗體能夠選擇性結合兩種不同抗原決定基(第一抗原決定基及第二抗原決定基)，則第一重鏈對第一抗原決定基之親和力一般將比第一重鏈對第二抗原決定基之親和力低至少一個至兩個、三個或四個數量級，且反之亦然。由雙特異性抗體識別之抗原決定基可在相同或不同目標上(例如在相同或不同蛋白質上)。雙特異性抗體可例如藉由組合識別相同抗原之不同抗原決定基的重鏈來製得。舉例而言，編碼識別相同抗原之不同抗原決定基之重鏈可變序列的核酸序列可與編碼不同重鏈恆定區之核酸序列融合，且此類序列可在表現免疫球蛋白輕鏈之細胞中表現。典型雙特異性抗體具有兩條重鏈，其各自具有三個重鏈CDR，隨後為(N端至C端)CH1域、鉸鏈、CH2域及CH3域；及免疫球蛋白輕鏈，其不賦予抗原結合特異性但可與各重鏈締合，或可與各重鏈締合且可結合一個或多個由重鏈抗原結合區結合之抗原決定基，或可與各重鏈締合且使得一條或兩條重鏈能夠與一個或兩個抗原決定基結合，且可根據本發明產生。

舉例而言，對於抗體實施例，本發明適合於基於所有主要抗體類別，亦即IgG、IgA、IgM、IgD及IgE之診斷學及治療學的研究及生產用 途。IgG為較佳類別，諸如IgG1(包括IgG1λ及IgG1κ)、IgG2及IgG4。待根據本發明產生之例示性抗體包括阿利庫單抗、阿替韋單抗(Atoltivimab)、瑪替韋單抗(Maftivimab)、奧西韋單抗(Odesivimab)、奧西韋單抗-ebgn、卡瑞單抗(Casirivimab)、依德單抗(Imdevimab)、賽咪單抗、賽普利單抗-rwlc(Cemplimab-rwlc)、度匹魯單抗、恩維納單抗(Evinacumab)、恩維納單抗-dgnb、法斯單抗(Fasimumab)、內斯瓦庫單抗(Nesvacumab)、特里沃單抗(Trevogrumab)、利努蘇單抗(Rinucumab)及賽瑞單抗。

在一些例示性實施例中，微粒調配物中之蛋白質為抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、單株抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、抗原結合抗體片段、單鏈抗體、雙功能抗體、三功能抗體或四功能抗體、雙特異性四價類免疫球蛋白G分子(稱為雙重可變域免疫球蛋白(dual variable domain immunoglobulin，DVD-IG))、IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgG抗體、IgG1抗體、IgG2抗體、IgG3抗體或IgG4抗體。在一些例示性實施例中，抗體為IgG1抗體。在一些例示性實施例中，抗體為IgG2抗體。在再其他例示性實施例中，抗體為IgG4抗體。在其他例示性實施例中，抗體包括嵌合鉸鏈。在再其他例示性實施例中，抗體包括嵌合Fc。在其他例示性實施例中，抗體為嵌合IgG2/IgG4抗體。在其他例示性實施例中，抗體為嵌合IgG2/IgG1抗體。在一些例示性實施例中，抗體為嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗體。

在一些例示性實施例中，抗體選自包含以下之群組：抗計劃性細胞死亡1抗體(例如，如美國專利第9,987,500號中所描述之抗PD1抗體)、抗計劃性細胞死亡配位體1抗體(例如，如美國專利第9,938,345號中所描述之抗PD-L1抗體)、抗Dll4抗體、抗血管生成素2抗體(例如，如美國專利第9,402,898號中所描述之抗ANG2抗體)、抗類血管生成素3抗體(例如，如美國專利第9,018,356號中所描述之抗AngPtl3抗體)、抗血小板衍生生長因子受 體抗體(例如，如美國專利第9,265,827號中所描述之抗PDGFR抗體)、抗Erb3抗體、抗泌乳素受體抗體(例如，如美國專利第9,302,015號中所描述之抗PRLR抗體)、抗補體抗體(例如，如美國專利第9,795,121號中所描述之抗C5抗體)、抗TNF抗體、抗表皮生長因子受體抗體(例如，如美國專利第9,132,192號中所描述之抗EGFR抗體或如美國專利第9,475,875號中所描述之抗EGFRvIII抗體)、抗前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶克新(Kexin)-9抗體(例如，如美國專利第8,062,640號或美國專利第9,540,449號中所描述之抗PCSK9抗體)、抗生長及分化因子8抗體(例如，抗GDF8抗體，亦稱為抗肌肉抑制素抗體，如美國專利第8,871,209號或第9,260,515號中所描述)、抗升糖素受體抗體(例如，如美國專利第9,587,029號或第9,657,099號中所描述之抗GCGR抗體)、抗VEGF抗體、抗IL1R抗體、抗介白素4受體抗體(例如，如美國專利申請公開案第US2014/0271681A1號或美國專利第8,735,095號或第8,945,559號中所描述之抗IL4R抗體)、抗介白素6受體抗體(例如，如美國專利第7,582,298號、第8,043,617號或第9,173,880號中所描述之抗IL6R抗體)、抗IL1抗體、抗IL2抗體、抗IL3抗體、抗IL4抗體、抗IL5抗體、抗IL6抗體、抗IL7抗體、抗介白素33(例如，如美國專利第9,453,072號或第9,637,535號中所描述之抗IL33抗體)、抗呼吸道融合細胞病毒抗體(例如，如美國專利第9,447,173號及第10,125,188號及美國專利申請公開案第US2019/0031741A1號中所描述之抗RSV抗體)、抗分化簇3抗體(例如，如美國專利第9,657,102號中所描述之抗CD3抗體)、抗分化簇抗體(例如，如美國專利第9,657,102號及第US20150266966A1號以及美國專利第7,879,984號中所描述之抗CD20抗體)、抗CD19抗體、抗CD28抗體、抗分化簇48抗體(例如，如美國專利第9,228,014號中所描述之抗CD48抗體)、抗Fel d1抗體(例如，如美國專利第9,079,948號中所描述)、SARS-CoV-2治療劑(REGN- COV^TM，包含抗SARS-CoV-2抗體卡瑞單抗及依德單抗)、抗SARS-CoV-2抗體、抗中東呼吸道症候群病毒抗體(例如，如美國專利第9,718,872號中所描述之抗MERS抗體)、針對伊波拉之抗體混合物(REGN-EB3，包含阿替韋單抗、瑪替韋單抗及奧西韋單抗-ebgn(INMAZEB®))、抗伊波拉病毒抗體(例如，如美國專利第9,771,414號中所描述)、抗茲卡病毒(Zika virus)抗體、抗淋巴球活化基因3抗體(例如，抗LAG3抗體或抗CD223抗體)、抗神經生長因子抗體(例如，如美國專利申請公開案第US2016/0017029號及美國專利第8,309,088號及第9,353,176號中所描述之抗NGF抗體)、抗活化素A抗體及抗蛋白Y抗體。

在一些例示性實施例中，雙特異性抗體可選自包含以下之群組：抗CD3×抗CD20雙特異性抗體(如美國專利第9,657,102號及第US20150266966A1號中所描述)、抗CD3×抗黏蛋白16雙特異性抗體(例如抗CD3×抗Muc16雙特異性抗體)及抗CD3×抗前列腺特異性膜抗原雙特異性抗體(例如抗CD3×抗PSMA雙特異性抗體)。

在一些例示性實施例中，蛋白質可選自包含以下之群組：阿昔單抗(abciximab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿達木單抗-atto、ado-曲妥珠單抗(ado-trastuzumab)、阿柏西普、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿利庫單抗、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝利單抗(belimumab)、苯拉組單抗(benralizumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝佐洛單抗(bezlotoxumab)、布林莫單抗(blinatumomab)、本妥昔單抗維多汀(brentuximab vedotin)、布羅達單抗(brodalumab)、布羅盧西珠單抗(brolucizumab)、卡那單抗(canakinumab)、卡羅單抗噴地肽(capromab pendetide)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、賽咪單抗、西妥昔單抗(cetuximab)、德諾單抗(denosumab)、迪奴 圖單抗(dinutuximab)、度匹魯單抗、德瓦魯單抗(durvalumab)、艾庫組單抗(eculizumab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、艾美賽珠單抗-kxwh(emicizumab-kxwh)、阿利庫單抗艾坦辛(emtansinealirocumab)、恩維納單抗、依伏庫單抗(evolocumab)、法神單抗(fasinumab)、戈利木單抗(golimumab)、古賽庫單抗(guselkumab)、替伊莫單抗替歇坦(ibritumomab tiuxetan)、依達賽珠單抗(idarucizumab)、英利昔單抗(infliximab)、英利昔單抗-abda、英利昔單抗-dyyb、伊匹單抗(ipilimumab)、伊科奇單抗(ixekizumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、萊西單抗(necitumumab)、內斯瓦庫單抗、納武單抗(nivolumab)、奧托昔單抗(obiltoxaximab)、阿托珠單抗(obinutuzumab)、奧克珠單抗(ocrelizumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧拉單抗(olaratumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、蘭比珠單抗(ranibizumab)、蘭希班單抗(raxibacumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利努蘇單抗、利妥昔單抗(rituximab)、賽瑞單抗、塞庫金單抗(secukinumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、托西利單抗(tocilizumab)、托西利單抗、曲妥珠單抗(trastuzumab)、特里沃單抗、烏司奴單抗(ustekinumab)及維多珠單抗(vedolizumab)。

抗體衍生物及片段適合於根據本發明產生，且包括但不限於：抗體片段(例如ScFv-Fc、dAB-Fc、半抗體)、多特異性體(例如IgG-ScFv、IgG-dab、ScFV-Fc-ScFV、三特異性體)及Fc融合蛋白(例如Fc融合體(N端)、Fc融合體(C端)、單Fc融合體、雙特異性Fc融合體)。片語「含Fc蛋白」包括抗體、雙特異性抗體、含有Fc之抗體衍生物、含有Fc之抗體片段、Fc融合蛋白、免疫黏附素及包含免疫球蛋白CH2及CH3區之至少功能部分的 其他結合蛋白。「功能部分」係指可結合Fc受體(例如FcyR；或FcRn(新生兒Fc受體)及/或可參與補體活化之CH2及CH3區。若CH2及CH3區含有缺失、取代及/或插入或使其無法結合任何Fc受體且亦無法活化補體之其他修飾，則CH2及CH3區不具功能性。

具有非天然形式之抗原結合分子(ABM)及ABM結合物，諸如呈非天然組態之Fab域可根據本發明表現，且揭示於WO 2021/026409 A1中。多特異性結合分子(MBM)及MBM結合物可根據本發明產生，且揭示於WO 2021/091953A1及WO 2021/030680 A1中。

含Fc蛋白可包含免疫球蛋白域中之修飾，包括其中修飾影響結合蛋白之一種或多種效應功能(例如影響FcyR結合、FcRn結合及因此半衰期及/或CDC活性之修飾)。此類修飾包括但不限於以下修飾及其組合，參考免疫球蛋白恆定區之EU編號：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438及439。

舉例而言，而非作為限制，結合蛋白可為含Fc蛋白且展現增強之血清半衰期(與不具有所述修飾之相同含Fc蛋白相比)且具有位置250(例如E或Q)；250及428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)及256(例如S/R/Q/E/D或T)處之修飾；或428及/或433(例如L/R/SI/P/Q或K)及/或434(例如H/F或Y)處之修飾；或250及/或428處之修飾；或307或308(例如308F、V308F)及434處之修飾。在另一實例中， 修飾可包含428L(例如M428L)及434S(例如N434S)修飾；428L、2591(例如V259I)及308F(例如V308F)修飾；433K(例如H433K)及434(例如434Y)修飾；252、254及256(例如252Y、254T及256E)修飾；250Q及428L修飾(例如T250Q及M428L)；307及/或308修飾(例如308F或308P)。

如上文所陳述，本發明亦適合於產生其他分子，包括融合蛋白。此等蛋白質可包含兩種或更多種蛋白質之部分或全部，蛋白質之一為免疫球蛋白分子之Fc部分，該等蛋白質在其天然狀態下未融合。Fc融合蛋白包括Fc融合體(N端)、Fc融合體(C端)、單Fc融合體及雙特異性Fc融合體。包含與抗體衍生之多肽之各種部分(包括Fc域)融合的某些異源多肽之融合蛋白的製備已例如由Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：10535-39(1991)；Byrn等人，Nature 344：677-70,1990；及Hollenbaugh等人，「免疫球蛋白融合蛋白之構築」，在Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1至10.19.11頁(1992)中描述。含受體Fc蛋白亦描述於C.Huang，「受體Fc融合治療劑、捕獲蛋白及MFMETIBODY技術(Receptor-Fc fusion therapeutics,traps,and MFMETIBODY technology)」,20(6)Curr.Opin.Biotechnol.692-9(2009)中。

受體Fc融合蛋白包含與Fc部分偶合之受體的一個或多個細胞外域中之一者或多者，其在一些實施例中包含鉸鏈區，隨後為免疫球蛋白之CH2及CH3域。在一些實施例中，Fc融合蛋白含有結合至單一或超過一個配位體之兩條或更多條相異受體鏈。一些受體Fc融合蛋白可含有多個不同受體之配位體結合域。

在一些例示性實施例中，蛋白質可為含有Fc部分及另一域之重組蛋白(例如Fc融合蛋白)。在其他例示性實施例中，Fc融合蛋白為受體Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之受體的一個或多個細胞外域。在其他例示 性實施例中，Fc部分包括鉸鏈區，隨後為IgG之CH2及CH3域。在又其他例示性實施例，受體Fc融合蛋白含有結合至單一配位體或多個配位體之兩條或更多條相異受體鏈。

舉例而言，Fc融合蛋白為捕獲蛋白，諸如IL-1捕獲蛋白(例如利納西普，其含有IL-1RAcP配位體結合區與Il-1R1細胞外區與hIgG1之Fc的融合體；參見美國專利第6,927,004號，其以全文引用之方式併入本文中)或VEGF捕獲蛋白(例如阿柏西普或塞維-阿柏西普(ziv-aflibercept)，其包含VEGF受體Flt1之Ig域2與VEGF受體Flk1之Ig域3與hIgG10之Fc的融合體)。在其他例示性實施例中，Fc融合蛋白可為ScFv-Fc融合蛋白，其含有與Fc部分偶合之抗體的一個或多個抗原結合域，諸如可變重鏈片段及可變輕鏈片段。

微型捕獲蛋白為使用多聚化組分(multimerizing component，MC)代替Fc部分之捕獲蛋白，且揭示於例如美國專利第7,279,159號及第7,087,411號中，且可根據本發明產生。

在例示性實施例中，初始蛋白質呈乾粉，例如微粉化乾粉形式。在一些例示性實施例中，蛋白質為噴霧乾燥粉末(SDP)。使用噴霧乾燥蛋白質代替蛋白質溶液具有微粒中蛋白質負載較高及在封裝製程期間蛋白質穩定性較好之優點。

在一些例示性實施例中，在整個封裝製程及儲存條件期間，乾燥蛋白質分子保持固態且由穩定劑或其他賦形劑包圍。蛋白質粉末中之賦形劑可包括已知改良儲存期間之蛋白質穩定性的任何賦形劑，例如山梨糖醇、甘油、甘露糖醇、海藻糖、蔗糖、精胺酸、丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸、白胺酸、組胺酸、氯化鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚乙二醇或磷酸鹽緩衝劑。

在例示性實施例中，經封裝之噴霧乾燥蛋白質展現高回收率及低聚集，此可能係由於僅一小部分表面蛋白質暴露於界面而使表面相互作用降至最低。在又其他例示性實施例中，蛋白質在封裝之前經微粉化。

水凝膠微粒(微凝膠)

在其他例示性實施例中，提供使用所揭示之非水性乳液系統產生的醫藥組合物。在其他例示性實施例中，醫藥組合物包含具有聚合物皮質及微粉化蛋白質核心之微凝膠。在又其他例示性實施例中，微凝膠包含大致為球形之微粒。

一些微粒及蛋白質核心將接近球形，而其他微粒及蛋白質核心形狀將更不規則。因此，如本文所用，術語「直徑」意謂以下中之各者及任一者：(a)包圍微粒或蛋白質核心之球體的直徑，(b)適合微粒或蛋白質核心之限制內之最大球體之直徑，(c)(a)之外接球體與(b)之限制球體之間的任何量度，包括兩者之間的平均值，(d)微粒或蛋白質核心之最長軸的長度，(e)微粒或蛋白質核心之最短軸的長度，(f)長軸之長度(d)與短軸之長度(e)之間的任何量度，包括兩者之間的平均值，及/或(g)等效圓直徑(ECD)，如藉由微流成像(MFI)、奈米粒子追蹤分析(NTA)所確定，或如藉由光散射方法，諸如靜態光散射(SLS)、動態光散射(DLS)或雷射繞射分析得到的體積或數目平均直徑。直徑一般以微米(μm或微米)表示。直徑可藉由光學量測或掃描電子顯微法量測來確定。

藉由所揭示之非水性乳液方法產生之微粒包括具有低、極低或接近於零之量的水(例如小於3重量%水)之多個蛋白質分子。在一些例示性實施例中，微粉化蛋白質粒子之ECD可在2微米至約35微米，或2.0至50μm，或5.0至15.0μm範圍內，或為約10μm。微粉化蛋白質粒子不限於任何 特定蛋白質實體，且適合於製備及遞送包括上文所描述之蛋白質的治療性蛋白質。

舉例而言，蛋白質粒子可藉由噴霧乾燥、凍乾及研磨、噴射研磨、非溶劑中之可逆沈澱、造粒、逐步沈澱(參見美國專利第7,998,477號)、超臨界流體沈澱(參見美國專利第6,063,910號)或高壓二氧化碳誘導之粒子形成(Bustami等人，Pharma.Res.17：1360-66(2000))進行微粉化。如本文所用，片語「噴霧乾燥」係指藉由使用噴霧乾燥器自漿料或懸浮液產生含有微米級粒子之乾粉的方法。噴霧乾燥器採用霧化器或噴嘴將懸浮液或漿料分散成受控之液滴大小的噴霧。

10μm至500μm之液滴大小可藉由噴霧乾燥產生。隨著溶劑(水或有機溶劑)乾燥，蛋白質物質乾燥成微米級粒子，形成粉末狀物質；或在蛋白質-聚合物懸浮液之情況下，在乾燥期間，圍繞蛋白質負載之聚合物硬化外殼。

在一些例示性實施例中，懸浮於分散相懸浮液，例如包含烴溶液之分散相中之微粉化蛋白質粉末的濃度為約1%與約50% w/v之間、約1%與約30% w/v之間、約1%與約20% w/v之間、約1%與約10% w/v之間、約1%與約5% w/v之間、約5%與約30% w/v之間、約5%與約20% w/v之間、約5%與約10% w/v之間，約1% w/v、約2% w/v、約3% w/v、約4% w/v、約5% w/v、約6% w/v、約7% w/v、約8% w/v、約9% w/v、約10% w/v、約15% w/v、約20% w/v、約25% w/v、約30% w/v、約35% w/v、約40% w/v、約45% w/v或約50% w/v。

在一些實施例中，微粉化蛋白質為VEGF捕獲蛋白。用於形成微粉化VEGF捕獲蛋白粒子之醫藥調配物可含有約10mg/mL至約100mg/mL VEGF捕獲蛋白、約1.0至約50mg/mL蛋白質、約10mg/mL、約15mg/mL、 約20mg/mL、約25mg/mL、約30mg/mL、約35mg/mL、約40mg/mL、約45mg/mL、約50mg/mL、約55mg/mL、約60mg/mL、約65mg/mL、約70mg/mL、約75mg/mL、約80mg/mL、約85mg/mL、約90mg/mL、約95mg/mL或約100mg/mL VEGF捕獲蛋白。在一些例示性實施例中，VEGF捕獲蛋白可為適合於玻璃體內投與至眼之眼用調配物，大體上如美國專利第8,092,803號中所揭示之調配物，該專利以引用之方式併入本申請案中。

在例示性實施例中，使用所揭示之非水性乳液系統產生之微粒的直徑範圍可為約1μm至約200μm、約1μm至約150μm、約1μm至約100μm、約2μm至約70μm、約5μm至約65μm、約10μm至約60μm、約15μm至約55μm、約10μm至約50μm、約1.0μm至15μm、約20μm、約25μm或約30μm，約。大小變化在很大程度上反映了聚合物皮質之厚度，儘管蛋白質核心之直徑可在一定程度上促成大小變化。

在一些例示性實施例中，由所揭示之非水性乳液方法形成之微粒為可流動微粒組合物。所揭示之可流動微粒組合物可與醫藥學上可接受之賦形劑一起懸浮於醫藥學上可接受之調配物，例如包含pH緩衝生理食鹽水、水溶液或非水溶液之調配物中。

術語「賦形劑」包括添加至醫藥組合物中以提供所需一致性或穩定作用之任何非治療劑。適合之醫藥賦形劑包括例如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇及其類似物。可流動微粒組合物可非經腸投與，例如使用注射器，諸如具有27G針頭之注射器。微粒適用於蛋白質治療劑之限時釋放或延長釋放。

術語「調配物」包括藥物或治療劑，例如本發明之微粒與可適用於治療劑應用之任何額外組分、賦形劑或媒劑的任何組合。在一些例示性實 施例中，調配物可包括微粒及pH緩衝生理食鹽水、水溶液或非水溶液。在一些例示性實施例中，微粒調配物經玻璃體內、脈絡膜上或皮下注射。舉例而言，設想VEGF捕獲蛋白微粒適用於VEGF捕獲蛋白治療性蛋白質在例如玻璃體中之延長或持續釋放以治療血管性眼部病症，或皮下植入以便VEGF捕獲蛋白之延長或持續釋放以治療其他病症。

根據本發明之微粒在生理水性環境中在約37℃下以相對恆定速率在延長時段內釋放蛋白質，至至少60、90、120或150天(持續釋放)。

在一些例示性實施例中，提供含有使用本文所揭示之非水性乳液方法產生之微粒的組合物，其中組合物包含大於100mg噴霧乾燥蛋白質。在一些例示性實施例中，非水性乳液方法具有大於90%產率，且產生具有大於99%之純度且具有大於10% w/w負載及大於10%爆發(對於50-100μL注射體積)的微粒。

包括根據本發明製備之微粒的醫藥調配物可含於適合於儲存醫藥及其他治療性組合物之任何容器內。舉例而言，例示性醫藥調配物可含於具有限定體積之經密封及滅菌之塑膠或玻璃容器，諸如小瓶、安瓿、注射器、筒或瓶內。可使用不同類型之小瓶來容納本發明之調配物，包括例如透明及不透明(例如琥珀色)玻璃或塑膠小瓶。同樣，可使用任何類型之注射器來容納或投與本發明之醫藥調配物。

包括根據本發明製備之微粒的醫藥調配物可含於「標準鎢」注射器或「低鎢」注射器內。如一般熟習此項技術者將瞭解，製造玻璃注射器之製程一般涉及使用熱鎢棒，其用以刺穿玻璃，藉此產生可自其中抽吸液體且自注射器排出之洞。此製程導致痕量鎢沈積於注射器之內表面上。後續洗滌及其他處理步驟可用於減少注射器中之鎢之量。如本文所用，術語「標準鎢」意謂注射器含有大於或等於500十億分率(ppb)鎢。術語「低鎢」意謂注射器含 有小於500ppb鎢。舉例而言，根據本發明，低鎢注射器可含有小於約490、480、470、460、450、440、430、420、410、390、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10ppb或更少ppb鎢。

用於注射器中之橡膠柱塞及用於封閉小瓶開口之橡膠塞可經塗佈以防止注射器或小瓶之醫藥內容物污染，或保持其穩定性。因此，根據某些實施例，本發明之醫藥調配物可含於包含經塗佈之柱塞之注射器內，或含於用經塗佈之橡膠塞密封之小瓶內。舉例而言，柱塞或塞可塗佈有碳氟化合物薄膜。適合於與含有本發明之醫藥調配物之小瓶及注射器一起使用之經塗佈之塞或柱塞之實例例如在以下中提及：美國專利第4,997,423號；第5,908,686號；第6,286,699號；第6,645,635號；及第7,226,554號，該等專利之內容以全文引用之方式併入本文中。

可在本發明之上下文中使用之例示性經塗佈之橡膠塞及柱塞可以商品名「FluoroTec®」商購，購自West Pharmaceutical Services,Inc.(Lionville,Pa.)。FluroTec®係碳氟化合物塗層之一個實例，用於最大程度地減少或防止藥物產品黏附至橡膠表面。

例示性醫藥調配物可含於包含經碳氟化合物塗佈之柱塞的低鎢注射器內。

例示性醫藥調配物可藉由非經腸途徑，諸如注射(例如皮下、靜脈內、肌內、腹膜內等)或經皮、經黏膜、經鼻、經肺或經口投與向患者投與。大量可再用筆式或自動注射器式遞送裝置可用於皮下遞送本發明之醫藥調配物。實例包括但不限於Autopen®(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、Disetronic筆(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland)、Humalog® Mix75/25®筆、Humalog®筆、Humulin® 70/30筆(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,Ind.)、NovoPen® I、II及III(Novo Nordisk,Copenhagen, Denmark)、NovoPen® Junior(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、BD^TM筆(Becton Dickinson,Franklin Lakes,N.J.)、OptiPen®、OptiPen Pro®及OptiPen Starlet^TM及OptiClik®(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)。

應用於本發明之醫藥組合物之皮下遞送中之拋棄式筆式或自動注射器式遞送裝置的實例包括但不限於SoloSTAR®筆(Sanofi-Aventis)、FlexPen®(Novo Nordisk)及KwikPen^TM(Eli Lilly)、SureClike^TM自動注射器(Amgen,Thousand Oaks,Calif.)、Pelet®(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EpiPen®(Dey,L.P.)及Humira®筆(Abbott Labs,Abbott Park,Ill.)。

本文亦考慮使用微輸注器來遞送包括根據本發明製備之微粒的醫藥調配物。如本文所用，術語「微輸注器」意謂皮下遞送裝置，其經設計以在長時段(例如約10、15、20、25、30分鐘或更長)內緩慢投與大體積(例如高達約2.5mL或更多)之治療性調配物。參見例如美國專利第6,629,949號；美國專利第6,659,982號；及Meehan等人，J.Controlled Release 46：107-116(1996)。微輸注器尤其適用於遞送含於高濃度(例如約100、125、150、175、200mg/mL或更高)或黏稠溶液內之大劑量治療性蛋白質。

實例

以下非限制性實例意欲說明空白微凝膠、藥物微凝膠、含有藥物微凝膠之調配物的合成及使用非水性乳液系統製造藥物微凝膠之方法。表1包括以下實例中所使用之材料。在一例示性實施例中，噴霧乾燥螢光標記VEGF捕獲蛋白之固體組合物包含69.8% w/w VEGF捕獲蛋白、0.7% w/w Alexa 488標記之VEGF捕獲蛋白、13.1% w/w VEGF捕獲蛋白上之醣基化、2.1% w/w磷酸鈉、14.1% w/w蔗糖及0.2% w/w聚山梨醇酯80。應理解，噴霧乾燥粉末中賦形劑之濃度可改變而不影響本發明之方法的有效性，且本發明之方法 可與包含任何蛋白質以及賦形劑之任何組合的噴霧乾燥粉末一起使用。

實例1：使用非水性乳液系統合成空白交聯PEG微凝膠

如圖1A中所說明，經由H/F本體乳液(H/F bulk emulsion)，一種非水性乳液系統合成空白交聯PEG微凝膠可藉由以下進行：將包括32% w/v於二氯甲烷(DCM)中之40kDa PEG-NHS、12% w/v於DCM中之PEG-NH及35% w/v於DCM中之8kDa(非官能化線性)PEG的NHS：NH：PEG8k之儲備溶液以20μL：20μL：260μL之比在1.5mL微管中混合。隨後可將1.5mL微管之內容物快速轉移至6mL含有0.5% w/w氟界面活性劑Pico Surf^TM 1之FC-40中。隨後可經由渦旋或均質化來乳化FC-40溶液中之DCM。交聯反應在個別小液滴中繼續並完成，且移除DCM後，乳液小液滴最後硬化成PEG微凝膠。

在收集空白交聯PEG微凝膠時，大聚合物聚集體可形成且自乳液中沈澱出來。較小的小液滴可保持形狀，而較大的小液滴(約>10μm)往往會在交聯反應完成及微凝膠硬化之前絮凝且合併在一起。

為防止微凝膠之絮凝及後續聚集，可使用更黏稠之連續相來代替上文所描述之方案中的FC-40。根據史托克斯定律(Stoke's Law)，已知一種降低相分離速率之方式係提高連續相之黏度。因此，另一可商購的碳氟化合物Fluorinert^TM FC-70(全氟三戊胺)可用於微凝膠製造，該碳氟化合物具有高得多的黏度，24cP(與具有4.1cP之黏度的FC-40相比)。使用更黏稠的碳氟化合物引起較少聚集及微凝膠之成功形成(數據未顯示)。

實例2.使用交聯調節劑使膠凝速率最佳化

如實例1中所描述，交聯可經由將含有親核基團之前驅物(PEG-NH)與含有親電子基團子前驅物(PEG-NHS)混合來達成。由於反應將在混合後立即開始，因此應抑制反應速率以允許後續乳化製程有足夠時間。諸位發明人發現15kDa PEG-NHS及40k Da PEG-NH在混合後之反應為濃度依賴性的。膠凝速度在高PEG濃度下極快，且反應混合物在混合後不久可能不再能夠經微粉化。稀釋聚合物濃度降低交聯速率。然而，其亦降低分散相之黏度，此可導致形成在封裝噴霧乾燥蛋白質(SDP)方面效率較低的較小微凝膠。

因此，本發明方法之例示性實施例包括控制交聯反應速率同時保持分散相之黏度足夠高以在乳化期間產生較大的小液滴，藉此產生較大微凝膠且確保高效蛋白質封裝。在一些例示性實施例中，藉由使交聯調節劑之量最佳化來達成特性之所需平衡。在一些例示性實施例中，交聯調節劑為線性非官能化PEG，其可添加至反應混合物中以維持烴相黏度同時降低官能化PEG前驅物濃度。

為使官能化前驅物與純非官能化交聯調節劑之比率最佳化，進行實驗以評估膠凝速度，提供足夠的資料點來外推吾人之發現。首先，製備以下儲備溶液：32% w/v於DCM中之40kDa PEG-NHS、12% w/v於DCM中之PEG-NH及35% w/v於DCM中之8kDa(非官能化線性)PEG。隨後藉由渦旋在1.5mL艾本德(Eppendorf)微管中混合PEG-NH及8kDa PEG溶液。最後，添加各種PEG-NHS溶液以製得300μL混合物。渦旋以使混合物均質化且開始反應後，不斷傾斜微管以檢查混合物是否停止流動，此將指示凝膠形成。不同比之PEG-NHS：PEG-NH：PEG 8kDa的膠凝時間展示於表2中。

如下表2中所說明，降低官能化可交聯聚合物或聚合物前驅物濃度及用交聯調節劑(純非官能化線性PEG鏈)替換官能化可交聯聚合物或聚合物前驅物可延長膠凝時間，以允許後續乳化製程。

實例3.將噴霧乾燥蛋白質封裝於交聯PEG微凝膠中

在一些例示性實施例中，將噴霧乾燥蛋白質封裝於交聯PEG微凝膠中可如圖3中所說明來達成。微凝膠之產生藉由首先製備35% w/v於DCM中之20kDa PEG、32% w/v於DCM中之HGEO-400GS(PEG-NHS)及12% w/v於DCM中之HGEO-150PA(PEG-NH)的儲備溶液來進行。隨後將260μL 20kDa PEG及20μL PEG-NH混合至溶液中，之後在1.5mL微管中添加10mg微粉化蛋白質粉末(例如VEGF捕獲蛋白SDP)，渦旋且音波處理10 分鐘以製備懸浮液。隨後將20μL PEG-NHS添加至懸浮液中，之後渦旋以均質化。隨後將1.5mL微管之內容物添加至6mL含有0.5% w/w PS-1之FC-70中。隨後經由渦旋或均質化使混合物乳化。將乳液置於真空下伴隨輕緩攪拌超過3小時，以完成交聯反應且移除DCM。隨後將微凝膠真空過濾且通過0.45μm PES膜洗滌。可視需要使用真空過濾來進一步乾燥微凝膠，之後進行最終收集。將產物在真空下進一步乾燥長時段以減少殘餘溶劑。

經由以上程序製造之微凝膠粉末可容易地懸浮及分散於含有如0.1% PVA之界面活性劑的PBS中，或懸浮於諸如中鏈三酸甘油酯之非水液體媒劑中。為對負載蛋白質粒子之位置進行鑑別及視覺化，VEGF捕獲蛋白(例如阿柏西普)可用Alexa 488 TFP酯染料經由非特異性結合進行標記。隨後可將含有1% Alexa 488標記蛋白質之VEGF捕獲蛋白噴霧乾燥成SDP，使得SDP粒子使用螢光顯微法可見。

如上文所描述產生封裝包含經螢光標記之VEGF捕獲蛋白之SDP粒子的交聯PEG微凝膠，且將其懸浮於含有0.1% PVA(用於防止聚集且促進在水溶液中分散之界面活性劑)之PBS緩衝液中，或懸浮於FC-70中，且在顯微鏡下成像。

圖4A及4B展示再懸浮於FC-70中之SDP負載微凝膠之明場及螢光顯微鏡影像。觀測到大小為15μm至60μm之微凝膠分佈，其中平均大小為約26μm(經由使用Leica LAS X軟體進行影像分析)，同時亦發現一群細粒子(<5μm)。來自SDP之螢光信號與明場通道中之粒子影像良好同置，證實SDP粒子於微凝膠中之有效封裝。如圖5A及5B中所展示之較高放大率影像展示微凝膠幾乎為球形，其中SDP粒子(大小2-5μm)均勻分佈於微凝膠內。微凝膠中之SDP粒子維持其原始葡萄乾狀形狀，其表明根據本發明方法之整個封裝製程對SDP粒子之完整性具有最小影響。

圖6A、6B及7展示懸浮於PBS中之交聯PEG微凝膠之明場及螢光顯微鏡影像。此等影像展現儘管PEG為水溶性的，但交聯PEG微凝膠在水性緩衝液中維持其球形結構而未分解，表明PEG前驅物之成功交聯及微凝膠之形成。來自SDP之螢光信號與微凝膠粒子同置，其表明儘管PEG基質可能因水性緩衝液之水變為溶脹，但蛋白質仍保留在微凝膠內。此等結果表明所獲得之封裝VEGF捕獲蛋白之交聯PEG微凝膠具有潛在持續釋放應用所需的特性。

雖然在前述說明書中已關於本發明技術之某些實施例描述本發明技術之範疇，且已出於說明之目的提出許多細節，但熟習此項技術者將顯而易見，本文所揭示之概念及原理可延伸至額外實施例且本文所描述之某些細節可在不背離本發明之基本原理的情況下顯著改變。

本文所引用之所有參考文獻，包括美國專利及申請案以全文引用之方式併入本文中。本發明可在不背離本發明精神或基本屬性的情況下以其他特定形式實施，且因此，應參考所附申請專利範圍而非前述說明書來指定本發明的範圍。

Claims (27)

1. 一種產生水凝膠微粒之方法，其包含：

   (a)將至少一種可交聯聚合物、至少一種交聯調節劑及包括至少一種蛋白質之粉末與烴溶劑組合以形成分散相懸浮液；

   (b)將該分散相懸浮液添加至連續相溶液中，其中該溶液包括碳氟化合物液體及氟界面活性劑，以形成經組合之分散相懸浮液及連續相溶液；

   (c)向該經組合之分散相懸浮液及連續相溶液施加摻合力(blending force)以形成非水性乳液，該非水性乳液具有多個烴小液滴，該等烴小液滴在該碳氟化合物液體中包括該至少一種可交聯聚合物及進一步包括至少一種蛋白質之該粉末；及

   (d)自該非水性乳液中移除該烴溶劑及該碳氟化合物液體以形成經分離之水凝膠微粒，其中該等水凝膠微粒包括封裝於該交聯聚合物之基質內的該至少一種蛋白質。
2. 如請求項1之方法，其中該至少一種交聯調節劑為非官能化線性PEG聚合物。
3. 如請求項1之方法，其中該分散相懸浮液中該至少一種交聯調節劑之濃度在約5.0%與約35% w/v之間。

   【請求項3】如請求項1之方法，其中該碳氟化合物液體為高黏度碳氟化合物。
4. 如請求項1之方法，其中該連續相溶液包含全氟C5-C18化合物。
5. 如請求項1之方法，其中該連續相溶液包含FC-70或全氟三戊胺。
6. 如請求項1之方法，其中該烴溶劑係選自由以下組成之群 組：二氯甲烷、氯仿、甲苯、乙酸乙酯、四氫呋喃及其組合。
7. 如請求項1之方法，其中該連續相溶液包含全氟聚醚-b-聚乙二醇-b-全氟聚醚。
8. 如請求項1之方法，其中該至少一種可交聯聚合物包括選自由以下組成之群組的核心：聚乙二醇、聚環氧乙烷(polyethylene oxide)、聚環氧乙烷-共-聚環氧丙烷、共聚環氧乙烷嵌段或無規共聚物、聚乙烯醇、聚(乙烯基吡咯啶酮)、聚(胺基酸)、聚葡萄糖及其任何組合。
9. 如請求項1之方法，其中該至少一種可交聯聚合物包含包括至少一個親核官能基之第一可交聯聚合物，及包括至少一個親電子官能基之第二可交聯聚合物。
10. 如請求項9之方法，其中該至少一個親核官能基與該至少一個親電子官能基之莫耳比在約1：1與約1：2之間。
11. 如請求項9之方法，其中該至少一種可交聯聚合物包含PEG-NH第一前驅物及PEG-NHS第二前驅物。
12. 如請求項11之方法，其中該PEG-NH第一前驅物或該PEG-NHS第二前驅物為4臂或8臂化合物。
13. 如請求項1之方法，其中該至少一種蛋白質為抗體、其抗原結合片段、融合蛋白、重組蛋白或其片段或截短形式。
14. 如請求項13之方法，其中該至少一種蛋白質為VEGF捕獲蛋白(VEGF-Trap protein)。
15. 如請求項14之方法，其中該VEGF捕獲蛋白為VEGF捕獲蛋白之截短形式。
16. 如請求項13之方法，其中該至少一種蛋白質係選自由以下組成之群組：阿柏西普(aflibercept)、利納西普(rilonacept)、阿利庫單抗 (alirocumab)、度匹魯單抗(dupilumab)、賽瑞單抗(sarilumab)、賽咪單抗(cemiplimab)、抗伊波拉(Ebola)抗體及抗SARS-CoV-2抗體。
17. 如請求項1之方法，其中該等經分離之水凝膠微粒之直徑在約1μm與約200μm之間。
18. 如請求項1之方法，其中該粉末藉由噴霧乾燥、電噴灑乾燥、可逆沈澱、噴霧冷凍、微模板化(microtemplating)或其組合進行微粉化。
19. 如請求項1之方法，其中該等摻合力包含均質化、渦旋(vortexing)、音波處理(sonication)、空蝕(cavitation)、攪拌(agitation)或其組合。
20. 如請求項1之方法，其中該等水凝膠微粒為持續釋放微粒。
21. 如請求項1之方法，其中該分散相懸浮液中該粉末之濃度在約1.0%與約30% w/v之間。
22. 如請求項1之方法，其中該分散相懸浮液中該至少一種可交聯聚合物之濃度在約5.0%與約35% w/v之間。
23. 如請求項1之方法，其中該連續相溶液中該氟界面活性劑之濃度在約0.1%與約5.0% w/v之間。
24. 如請求項1之方法，其進一步包含將該等經分離之水凝膠微粒懸浮於醫藥學上可接受之調配物中。
25. 如請求項24之方法，其中該調配物包含pH緩衝生理食鹽水、水溶液或非水溶液。
26. 如請求項1之方法，其中該粉末進一步包含至少一種賦形劑。
27. 一種水凝膠粒子，其藉由如請求項1之方法製造。

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